Abstrakt
Til að kanna samverkandi hamlandi áhrifCistanche DeserticolaFenýletanóíð glýkósíð (PHG) og glabridin (GLA) við litarefni í húð, ákjósanlegasta massahlutfall PHG og GLA var skimað forkeppni í gegnumí vitroTyrosinase virknihindranir, 1, 1- dífenýl -2- picrylhydrazyl (dpph) róttæk hreinsun, og 2,2'-Azino-bis (3- etýlbenzothiazoline {8}} sulfonic acid) (absts⁺) radical scavenging impliment. Frekari mat var gerð með þremur frumulíkönum:

UVB-framkallað B16F10 melanogenesis líkan til að meta hömlun á melanínmyndun með týrósínasa virkni og melaníninnihaldi;

Lipopolysaccharide (LPS)-framkallað HACAT bólgu líkan til að meta bólgueyðandi áhrif með því að mæla interleukin -6 (IL -6) og æxlisþátt- (TNF-) kúgun;

AAPH (2,2'-azobis (2- amídínóprópan) díhýdróklóríð af völdum HACAT oxunarálagsslíkans til að ákvarða andoxunarvirkni með superoxíð dismutase (SOD) og katalasa (CAT) aukningu.

Besta PHG/GLA massahlutfallið var greint með þessum gerðum. Niðurstöður sýndu fram á að PHG/GLA lausnir (framleiddar í fosfatjafnalausu saltvatni, PBS, pH 6,8) við massahlutföll 1: 1, 5: 1 og 10: 1 sýndu marktækt týrósínasa hömlun og samverkandi andoxunaráhrif. Tyrosinase hömlun var 94,37%, 92,93%og 88,06%, í sömu röð; DPPH róttæk hreinsunarhlutfall náði 89,44%, 88,72%og 88,10%; Hreinsihlutfall ABTS⁺ var 100,13%, 100,01%og 99,87%. Við 25 ug/ml í DMEM sýndi PHG/GLA (1: 1, 5: 1, 10: 1) engin frumudrepandi áhrif á B16F10 eða HACAT frumur. PHG/GLA (1: 1) DMEM lausn sýndSuperior tyrosinase hömlun(23,80% afgangsvirkni), verulegaminnkað melaníninnihald(30,90%), og gengu betur en önnur hlutföll og einlyfjameðferð við að bæla IL -6/TNF-losun og auka virkni SOD/CAT. Samverkandi samsetning PHG og GLA léttir á áhrifumofstækkun frænda með því að hindra melanogenesis, draga úr bólgu ogefla andoxunargetu.

Lykilorð
CistancheDeserticola Fenýletanoid glýkósíð; glabridin; samverkandi áhrif; and-melanogenesis; andoxunarefni; bólgueyðandi; Lyfjafræðileg hráefni

 

 

 

CistancheDeserticola þykkni meðHátt stigfenýletanóíð glýkósíð til að hvíta húð

Whatsapp okkur fyrir frekari upplýsingar

 

Tilraunahluti

1.1 Efni, hvarfefni og hljóðfæri

Mús sortuæxlisfrumurB16F10 (Vörulisti nr: STCC20013G -1), Wuhan ServiceBio Technology Co., Ltd.

Manna ódauðlegir keratínfrumurHACAT (Vörulisti nr.: Icell-H066), Icell Bioscience Inc., Shanghai, Kína.

Cistanche fenýletanoid glýkósíð (PHG)OgGlabridin (GLA), Shaanxi Tianxingjian Líffræðileg Efnafræðileg Tækni Co., Ltd.

Týrósínasi, Hefei Basf Biotechnology Co., Ltd.

Arbutin (ARB)OgL-týrósín, Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, Kína.

1, 1- diphenyl -2- picrylhydrazyl (dpph), Tókýó Chemical Industry Co., Japan.

2,2′-Azino-Bis (3- etýlbenzóþíasólín -6- sulfonic acid) diamonium salt (ABTS), Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd.

Askorbínsýra (VC), Tianjin Damao Efnafræðilegt hvarfefni verksmiðja.

Kalíum persúlfatOgvatnsfrítt etanól, Tianjin Zhiyuan Efnafræðileg hvarfefni Co., Ltd.

Natríumhýdroxíð, Chengdu Huayi Pharmaceutical Awicipient Manufacturing Co., Ltd.

Dipotassium fosfatShanghai Sanpu Chemical Co., Ltd.

L-DOPA, Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd.

Cell Counting Kit -8 (CCK8), Peking Sinoinvitrogen Biotechnology Co., Ltd.

Triton x -100, Dimetýlsúlfoxíð (DMSO), 2,2′-azobis (2- metýlprópíónamidín) díhýdróklóríð (aaph), ogLipopolysaccharide (LPS), Peking Solarbio Science & Technology Co., Ltd.

DMEM háglúkósa miðill, Thermo Fisher Scientific (Kína).

Fóstur nautgripasermi (FBS), Sigma-Aldrich (Shanghai) Viðskipti Co., Ltd.

Penicillin-streptomycin lausn, Shanghai Dashier Bio-Technology Co., Ltd.

Human il -6 ELISA Kit, Human TNF- ELISA Kit, ogHuman Cat Elisa KitWuhan Fine Biotech Co., Ltd.

Heildar superoxide dismutase (SOD) prófunarbúnaður, Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute. Öll hvarfefni voru í greiningareinkunn.

Hljóðfæri notuð:

Multiskan FC fulla bylgjulengd örplata lesandiOgHeracell 371 CO2 útungunartæki, Thermo Fisher Scientific, Bandaríkjunum.

Kq -200 vdb ultrasonic hreinsiefni, Kunshan Ultrasonic Hljóðfæri Co., Ltd.

DVKW-D -2 Stafræn hitastilla vatnsbað, Peking Yongguangming lækningatækniverksmiðja.

DHG -9246 Rafmagns hitastillir, Shanghai Jinghong tilraunabúnaður Co., Ltd.

KN4006B UVB Ultraviolet geislunartæki(Geislunarstyrkur: 8 MW/cm²), Xuzhou Kenuo Medical Instrumple Equipment Co., Ltd.

1.2 Aðferðir

Í fyrsta lagi voru PHG og GLA leyst upp í annað hvort fosfatjafnalausu saltvatni (PBS, ph =6. 8) eða 50% etanóllausn til að útbúa lausnir með massaþéttni á{{0}}. 0 0 1, 0. {{1 0}} 05, 0,025, 0,1, 0,4, 0,8, 1,2, 1,6 og 2.0 g/l/l,. Þá var PHG og GLA blandað saman í hlutföllumm (phgs): m (gla)=40: 1, 20: 1, 10: 1, 5: 1, 1: 1, 1: 5, 1:10, 1:20 og 1:40, til að útbúa PHG/GLA lausnir með heildarmassa styrk0.4 g/L, merkt semPHG/GLA (40: 1) ~ PHG/GLA (1:40), hver um sig.

 

1.3 Lífefnafræðilegar tilraunir

1.3.1 Týrósínasa virkni Hömlunargreining

Í 96- vel plata,50 μl af prófunarsýnislausninni, 50 μl af PBS (ph =6. 8), og50 μl af L-týrósínlausn (1 g/l)var bætt við í röð. Platan var ræktað í 37 gráðu vatnsbaði í 10 mínútur. Þá,5 0 μl af týrósínasa lausn (0,4 g/l, jafngildir 200 U/ml)var bætt við og plötunni var ræktað aftur í 37 gráðu vatnsbaði í 10 mínútur í viðbót.

Arbutin (ARB)var notað sem jákvæða stjórnun ogPBS (ph =6. 8)var notað sem autt stjórn.

Frásog lausnarinnar kl490 nmvar mælt með því að nota örplötulesara og in vitro týrósínasahraði (%) var reiknaður með jöfnu (1).

 

 

Í formúlunni:

A _ viðbrögðer frásog sýnislausnarinnar sem inniheldur L-týrósínlausn, PBS og tyrosinase lausn.

A _ viðbragðsstýringer frásog sýnislausnarinnar sem inniheldur L-týrósínlausn og PBS án týrósínasa lausnar.

A _ autter frásog lausnarinnar sem inniheldur L-týrósínlausn, PBS og týrósínasa lausn án sýnisins.

A _ autt stjórner frásog lausnarinnar sem inniheldur L-týrósínlausn og PBS án sýnisins og týrósínasa lausnarinnar.

1.3.2 Ákvörðun DPPH -róttækra hreinsunarvirkni

Í fyrsta lagi, {{0}}. 0197 g (0,05 mmól) af DPPH var vegið nákvæmlega og leyst upp í 250 ml af vatnsfríu etanóli til að undirbúa DPPH vinnulausn með styrk af styrk af styrk0. 2 mmól/l.

Síðan voru PHG og GLA leyst upp í 50% etanóli til að framleiða etanóllausnir af PHG og GLA með massaþéttni af{{0}}. 0 0 1, 0. 0 1, 0,1, 0,4, 0,8, 1,2, 1,6 og 2,0 g/l. Etanóllausnir af VC voru framleiddar á sama hátt.

Í kjölfarið var etanóllausnum PHG og GLA blandað saman í hlutföllumm (phgs lausn): m (GLA lausn)=40: 1, 20: 1, 10: 1, 5: 1, 1: 1, 1: 5, 1:10, 1:20, 1:40Til að fá 9 etanóllausnir af PHG/GLA með mismunandi massahlutföllum, merktar semPHG/GLA (40: 1) ~ PHG/GLA (1:40).

Loksins,100 μl af hverri sýnislausnOg100 μl af DPPH vinnulausninnivar bætt við 96- vel plötu, blandað jafnt og ræktað við stofuhita í myrkrinu í 30 mínútur. Frásog kl517 nmvar mælt með því að nota örplötulesara. VC var notað sem jákvæða stjórnun og hver tilraun var endurtekin þrisvar.

DPPH sindurefnahraðahraði (%) var reiknaður með jöfnu (2).

 

Í formúlunni:

A1er frásog sýnislausnarinnar + DPPH vinnulausn.

A2er frásog 50% etanól + DPPH vinnulausn.

A3er frásog sýnislausnarinnar + 50% etanól.

 

1.3.3 Ákvörðun Abts ⁺ Sindurefna.

Í fyrsta lagi,1 g (1,82 mmól) af ABTvar leyst upp í afjónuðu vatni til að útbúa ABT -vinnulausn með lokastyrk7,4 mmól/l. 0. 5 g af kalíum persúlfatvar leyst upp í afjónuðu vatni til að útbúa kalíumpersúlfat vinnulausn með lokastyrk2,6 mmól/l. Jafnt rúmmál ABT -vinnulausnarinnar og kalíumpersúlfat vinnulausnar var blandað saman og leyft að bregðast við í myrkrinu í 12 klukkustundir til að undirbúa ABTS⁺ vinnulausnina.

Síðan, etanóllausnir PHG, GLA og VC, svo og PHG/GLA etanóllausnir með hlutföllum áPHG/GLA (40: 1) ~ PHG/GLA (1:40), voru framleiddar samkvæmt aðferðinni sem lýst er í kafla 1.3.2.

Loksins,40 μl af hverri sýnislausnOg160 μl af ABTS⁺ vinnandi lausninnivar bætt við 96- vel plötu, blandað jafnt og brást við í myrkrinu við stofuhita í 6 mínútur. Frásog lausnarinnar kl734 nmvar mælt með því að nota örplötulesara.

Abts⁺ sindurefnahraðahraði (%) var reiknaður með jöfnu (3).

 

 

Í formúlunni:

A1er frásog sýnislausnarinnar + ABTS⁺ vinnulausn.

A2er frásog afjónaðs vatns + Abts⁺ vinnulausnar.

A3er frásog sýnislausnarinnar + afjónað vatn.

1.4 Frumutilraunir

1.4.1 Frumurækt

Eftir að hafa endurvakið B16F10 og HACAT frumur voru þær sáð í DMEM hár-glúkósa miðli (sem innihélt 10% fóstur nautgripasermi og 1% penicillín-strangtómýcín lausn) og ræktað við37 gráðu, 5% CO2, og70% rakastigí útungunarvél í sólarhring. Frumuvöxtur sást við smásjá og miðlungs breytingar eða leið voru gerðar eftir því sem nauðsyn krefur út frá vaxtarástandi frumna.

1.4.2 Tilraunahópur

Logarithmic-fasa B16F10 og HACAT frumur voru sáð í 96- brunnplöturnar við viðeigandi frumuþéttleika og ræktaðar í 24 klukkustundir til að leyfa frumuaðhald. Sýnishitunarlausnir með mismunandi styrk voru framleiddar með DMEM miðli.

Tilraunahóparnir voru eftirfarandi:

Venjulegur hópur

Fyrirmyndarhópur

PHG lágskammtur hópur(125 ug/ml)

PHG miðlungsskammta hópur(250 ug/ml)

PHG Háskammta hópur(500 ug/ml)

GLA lágskammta hópur(6,25 ug/ml)

GLA miðlungsskammtur hópur(12,5 ug/ml)

GLA Háskammta hópur(25 ug/ml)

PHGS/GLA (1: 1) hópur(25 ug/ml)

PHGS/GLA (5: 1) hópur

PHGS/GLA (10: 1) hópur

FyrirLitunarlíkan af völdum UVB í B16F10 frumum, fyrirmyndarhópfrumurnar voru meðhöndlaðar með30 μl af PBS (ph =7. 4)og geislað undir UVB útfjólubláu geislunartæki við3 cm fyrir neðan tækiðfyrir110 sekúndur. Tilraunahóparnir voru formeðhöndlaðir með100 μl af mismunandi sýnislausnumí 1 klukkustund áður en þú bætir við30 μl af PBSog geislun undir UVB tækinu í 110 sekúndur. Venjulegur hópur var stöðugt meðhöndlaður með miklum glúkósa DMEM miðli og auðir hópurinn innihélt ekki frumur en var skipt út fyrir jafnt magn af miðli.

FyrirBólgulíkan af völdum LPS í HACAT frumum, fyrirmyndarhópurinn var meðhöndlaður með20 ug/ml LPS PBS lausní sólarhring. Tilraunahóparnir voru formeðhöndlaðir með100 μl af mismunandi sýnislausnumí sólarhring áður en þú bætir við20 ug/ml LPS lausní sólarhring í viðbót. Venjulegur hópur var stöðugt meðhöndlaður með miklum glúkósa DMEM miðli og auðir hópurinn innihélt ekki frumur en var skipt út fyrir jafnt magn af miðli.

FyrirOxunarálag af völdum AAPH í HACAT frumum, fyrirmyndarhópurinn var meðhöndlaður með25 mmól/l aaph lausní sólarhring. Tilraunahóparnir voru formeðhöndlaðir með100 μl af mismunandi sýnislausnumí sólarhring áður en þú bætir við25 mmól/l aaph lausní sólarhring í viðbót. Venjulegur hópur var stöðugt meðhöndlaður með miklum glúkósa DMEM miðli og auðir hópurinn innihélt ekki frumur en var skipt út fyrir jafnt magn af miðli.

Hver hópur var settur upp með3 endurtaka holurog ræktað kl37 gráðu, 5% CO2, og70% rakastigí útungunarvél.

1.4.3 Frumueyðandi prófun

Frumueitrunaráhrifin voru mæld með þvíCCK8 aðferð. Logaritmísk fasa B16f10 og hacat frumur voru melt með0. 25% trypsiní 3 mínútur. Eftir að meltingin var stöðvuð með miðlinum voru frumurnar ítrekað pipett til að útbúa frumusviflausn með þéttleika af1 × 10⁴ frumur/ml. Frumurnar voru jafnt sáð í 96- vel plöturnar á100 μl á brunn, og PBS var bætt við jaðarholurnar. Eftir viðloðun frumna var mismunandi styrkur sýnislausna bætt við með3 endurtaka holur í hverjum hópi, og frumurnar voru ræktaðar kl37 gráðu, 5% CO2, og70% rakastigfyrir24, 48 og 72 klukkustundiráður en þú fleygir miðlinum.

Fyrir alla hópa,100 μl af CCK8 DMEM há-glúkósa miðli (sem inniheldur 10% CCK8)var bætt við og ræktað fyrir60 mínútur. Frásog lausnarinnar kl450 nmvar mælt með því að nota örplötulesara.

Lífvænleiki frumunnar (%) var reiknaður með jöfnu (4).

 

Í formúlunni:

A _ meðhöndluðer frásog brunnsins, CCK8 lausnar og sýnislausnarinnar.

A _ autter frásog brunnsins sem inniheldur miðlungs og CCK8 en án frumna.

A0er frásog brunnsins og CCK8 lausnarinnar en án sýnislausnarinnar.

1.4.4 Týrósínasa virkni próf

L-DOPA aðferðin var notuð til að mæla virkni týrósínasa. Eftir að hafa meðhöndlað frumurnar fyrir48 klukkustundirEins og lýst er í kafla 1.4.2 var flotinu fargað og holurnar voru þvegnar tvisvar með PBS (ph =7. 4). Þá,50 μl af 1% Triton x -100 lausnvar bætt við hverja holu og strax sett í –80 gráðu frysti fyrir30 mínútur. Frumurnar voru þíddar við stofuhita til að framkalla lýsingu.

Eftir að hafa hlýtt fyrir37 gráðufyrir5 mínútur, 10 μl af 10 mmól/L L-DOPA lausnvar bætt við hverja brunn og ræktað kl37 gráðu, 5% CO2 og 70% rakastigfyrir1 klukkustund. Frásog kl475 nmvar mælt með því að nota örplötulesara. Hver tilraun var endurtekinþrisvar, og týrósínasa virkni (%) var reiknuð með jöfnu (5).

Í formúlunni:

A _ tilrauner frásog brunnsins og sýnishorns lausnar undir UVB geislun.

A _ eðlilegter frásog brunnsins frumna og sýnislausn án UVB geislunar.

A _ autter frásog brunnsins sem inniheldur miðil en án frumna.

 

1.4.5 Mæling á melanín innihaldi

NaOH lýsisaðferðin var notuð til að mæla melaníninnihald. Eftir að hafa meðhöndlað frumurnar fyrir72 klukkustundirEins og lýst er í kafla 1.4.2 var flotinu fargað og holurnar voru þvegnar tvisvar með PBS.100 μl af NaOH vatnslausn sem inniheldur 10% DMSO (1 mól/L)var bætt við hverja holu og plötunni var sett í a90 gráðu ofnfyrir1 klukkustund. Frásog kl490 nmvar mælt með því að nota örplötulesara. Hver tilraun var endurtekinþrisvar, og melaníninnihaldið (%) var reiknað með jöfnu (5).

 

1.5 Mæling á bólguþáttum og oxunarálagsvísum

Eftir að hafa meðhöndlað frumurnar fyrir48 klukkustundirEins og lýst er í kafla 1.4.2,Hacat frumurÚr hverjum hópi var safnað með frumusköfu, skilvindt, og flotinu var safnað. Styrkur IL -6 og TNF- var mældur samkvæmt leiðbeiningum ELISA pakkanna.

Eftir að hafa meðhöndlað frumurnar fyrir48 klukkustundir, Hacat frumum var safnað með frumusköfum, látinn ítrekaðar frysti-þíðingar lotur til að framkalla frumulýsingu og skilvindt á12, 000 snúninga í 10 mínútur við 4 gráðu. Flotvatninu var safnað og starfsemiGosog styrkurKötturvoru mældir með leiðbeiningum ELISA Kit.

 

1.6 Mæling á samsetningarvísitölu

TheSamsetningarvísitala (CI) aðferð[20] var notað til að meta hvort samsetning PHG og GLA við mismunandi massahlutföll sýndi samverkandi áhrif við að hindra virkni týrósínasa og andoxunar. Samsetningarvísitalan var reiknuð með jöfnu (6).

 

Í formúlunni:

D1OgD2tákna viðkomandi styrk (g/l) lyfjanna tveggja í samsetningarmeðferðinni sem þarf til að náx% virkni.

DXtáknar styrk (g/l) hvers einstaka efnis þegar það er notað eitt og sér til að náx% virkni.

TheCompuyn hugbúnaðurvar notað til útreikninga:

CI> 1gefur til kynna andstæðar áhrif.

CI =1gefur til kynna aukefni.

CI <1gefur til kynna samverkandi áhrif.

 

1.7 Gagnagreining

Öll gögn voru gefin upp sem"Meðaltal ± staðalfrávik (x̄ ± s)", og umræður voru byggðar á meðalgildum.

Tölfræðileg greining var gerð meðGraphPad Prism 9.5. 0. Ein leið ANOVA (greining á dreifni) var notuð til samanburðar meðal margra hópa. A.P-gildi <0. 05var talið tölfræðilega marktækt.