Samverkandi bólgueyðandi áhrif Laminaria Japonica Fucoidan og Cistanche Tubulosa þykkni

Sem ónæmissvörun gegn erlendum mótefnavakum, gefa átfrumur frá sér bólgueyðandi frumuvaka eins og æxlisdrep (TNF-), interleukin-1 (IL- 1), IL-6 og fleiri. Slík cýtókín valda efnafræðilegu innstreymi kyrninga, einfrumna, eitilfrumna og mastfrumna í skemmdan vef sem stuðlar að brottnámi mótefnavaka og endurheimt vefja. Hins vegar of mikil íferð og virkjun frumanna eykur vefjaskaða sem leiðir til bjúgs (æðaútflæðis) og sársauka sem eru vel þekkt bólgufyrirbæri.

TNF- er mikilvægur þáttur til að framkalla nitric oxide synthase (iNOS) genatjáningu í nokkrum frumulínum. iNOS virkjun leiðir til framleiðslu nituroxíðs (NO) sem mótar ekki aðeins nokkrar lífeðlisfræðilegar aðgerðir eins og bakteríudrepandi og æðavíkkandi heldur veldur einnig bólgu. Eftir vefjaskaða myndar niðurbrot fosfólípasa á fosfólípíðum í frumuhimnu arakidonsýru. Arachidonsýra er frekar niðurbrotin með sýklóoxýgenasa (COX) í prostaglandín (PGs). Of mikið magn af PGE2 sem myndast af COX-II framkallar nokkur frumudrep til bólgu. Þar sem bæði NO og PGE2 virka sem meginþættir fyrir bólgu og framkalla sársauka, eru TNF- –NO og COX-II–PGE2 ferlar aðalstraumar bólguferlisins, sem hindrast af barksterum og ekki sterum.bólgueyðandi lyf(NSAID lyf), í sömu röð.

Jafnvel þó að það séu nokkrir sterar og bólgueyðandi gigtarlyf fyrirmeðferð við bólgusjúkdómum, geta þessi lyf valdið skaðlegum áhrifum á ónæmiskerfið, meltingarveginn, nýru, lifur, miðtaugakerfið, blóðþrýsting og hjarta- og æðakerfi. Þess vegna er nauðsynlegt að lágmarka skaðleg áhrif efnafræðilegra lyfja með því að skipta um þau eða nota þau í samsettri meðferð með náttúrulegum vörum.

Fucoidan, súlfat fjölsykrusamstæða úr þangi eins og Laminaria japonica og Cladosiphon okamuranus sem er víða dreift í mörgum löndum, hefur verið notað sem lækningalyf í austurlenskri læknisfræði í langan tíma. Í fyrri rannsóknum hefur verið sýnt fram á að fucoidan hefur andoxunarefni, blóðstorknandi, gegn krabbameini ogbólgueyðandi virkni. Í samræmi við það eru jákvæð áhrif fucoidan á bólgusjúkdóma, blóðþurrð, ónæmisvandamál og æxli að vekja athygli rannsakenda. Á hinn bóginn,Cistanche tubulosa(CT) hefur einnig verið mikið notað sem hefðbundið lyf í Kína. Greint var frá því að CT útdrættir lækka framleiðslu á TNF-á og IL- 4 sem eru stórir þættir fyrir NO framleiðslu í bólguferlum [19].

Slíkar fyrri niðurstöður leiddu til þess að við könnuðum samsetta virkni fucoidan og CT þykkni á 2 helstu bólguleiðum. Til að skýra verkunarháttinn greindum við NO og PGE2 í útdrætti frá carrageenan völdum loftpokabólgu.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA TIL AÐ koma í veg fyrirBLÓÐASTARFPHGS75% ECH 30% ACT 12%

Efni og aðferðir

Efni

Hálfhreinsað fucoidan og vatnsþykkni úr CT voru fengin frá Misuba RTech Co., Ltd. (Asan, Kóreu). Fucoidan og CT þykkni var haldið við 4 gráður, blandað (1:3) uppleyst í hreinsuðu vatni fyrir notkun og gefið til inntöku í 5 ml/kg rúmmáli.

Frumuræktun og NO magngreining

Músaátfrumu RAW 264.7 frumulínan var keypt frá American Type Culture Collection (Manassas, Bandaríkjunum) og ræktuð í Dulbecco's modified Eagle's medium (Sigma, St. Louis, Bandaríkjunum) sem innihélt 10% nautgripasermi og sýklalyf [100 U/mL penicillín (Sigma) og 100 µg/mL streptomycin (Sigma)]. Frumurnar voru ræktaðar í rakaðri 5% CO2 andrúmslofti við 37 gráður.

Til að meta áhrif fucoidan og CT útdráttar á seytingu NO voru RAW 264.7 frumur (1×106 frumur/ml) ræktaðar með fucoidan eða CT útdrætti (1–320 µg/ml) í 5 mínútur , fylgt eftir með interferóni- (IFN-, 10 U/ml) og lípópólýsykra (LPS, 10 µg/ml) í 24 klst. Í bráðabirgðarannsóknum okkar var staðfest að meðferð með IFN- plús LPS til virkjunar á RAW 264.7 frumum hafði ekki áhrif á lífvænleika frumanna í allt að 24 klst. og að fucoidan og CT þykkni voru ekki frumudrepandi allt að 1 mg/ml. Styrkur nítríts (NO2 – ), oxaðrar afurðar NO, var mældur sem vísbending um NO. Ræktunarmiðlinum var blandað saman við jafnt rúmmál af Griess hvarfefni (1% súlfanílamíði, 0,1% naftýletýlendíamín í 2,5% fosfórsýru) [21] og ræktað við stofuhita í 10 mínútur. Nitrítstyrkur var greindur við 540 nm, þar sem NaNO2 var notað til að búa til staðlaðan feril.

Dýr og meðferð

Karlkyns ICR mýs (7 vikna gamlar) voru keyptar frá Daehan Biolink (Eumseong, Kóreu) og geymdar í herbergi með stöðugum umhverfisaðstæðum (22±2ºC; 40-70% rakastig; 12-klst. ljós -dökk hringrás; 150-300 lux birta). Kögglafóður og hreinsað vatn var fáanlegt að vild. Allar dýratilraunirnar voru samþykktar af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) í Chungbuk National University (CBNU), Kóreu, og framkvæmdar samkvæmt stöðluðum aðgerðaaðferðum (SOP) Rannsóknarstofu dýrarannsóknamiðstöðvarinnar, CBNU.

Mýsnar (n=8/hópur) voru meðhöndlaðar til inntöku með fucoidan (18 eða 54 mg/kg), CT þykkni (54 eða 162 mg/ kg) eða blöndu þeirra (18+54, {{6 }} eða 90+270 mg/kg) einu sinni á dag í 7 daga. Lágir skammtar af fucoidan (18 mg/kg) og CT þykkni (54 mg/kg) voru úr áætluðum skömmtum manna upp á 100 mg/líkama (70 kg) og 300 mg/líkam eftir yfirborðsþýðingu líkamsþyngdar (Km{{14 }} fyrir mann/Km=3 fyrir mús), í sömu röð. Stórir skammtar af fucoidan og CT þykkni voru stilltir á 3 falt, eitt sér eða í blöndu, og mesta skammta blandan var fest í 5 falt til að meta hámarks samlegðaráhrif.

Á 1. degi fucoidan og CT þykknimeðferðar var músum sprautað undir húð með 10 ml af dauðhreinsuðu lofti í bakhliðina til að mynda poka [22,23]. Eftir 2 og 5 daga var pokinn sprautaður aftur með 5 ml af lofti. Klukkutíma eftir lokameðferð var 1 ml af karragenani (1% í saltvatni; Sigma) eða burðarefni þess (saltvatn) sprautað í pokann.

Greiningar á útflæði

Loftpokinn var þveginn með 1 ml af köldu saltvatni 6 klukkustundum eftir inndælingu karragenans og nettórúmmál skolvökva var skráð. Heildarfjöldi bólgufrumna, daufkyrninga, einfrumna og eitilfrumna var ákvarðaður með því að nota coulter teljara. Styrkur NO og PGE2 var ákvarðaður með Griess hvarfefni (Sigma) og ensímónæmisgreiningu (EIA) með því að nota Crelate-EIA sett (Assay Designs, Ann Arbor, Ann ArboUSA), í sömu röð.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA TIL AÐ LOKA AÐGERÐ VIÐ bólgufrumukrabbameini PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Vefjameinafræðileg skoðun

Pokafóðrunarvefur var fjarlægður og festur í hlutlausri formalínlausn. Parafín-inngreyptar vefskífur voru litaðar með hematoxýlín-eósíni og skoðaðar í ljóssmásjá með tilliti til bólguskemmda.

tölfræðigreining

Niðurstöðurnar eru settar fram sem meðaltal±SE. Samanburður á tilraunahópum var gerður með einhliða dreifigreiningu og síðan leiðrétting á Tukey prófi. AP gildi<0.05 was considered statistically significant.

Niðurstöður

In vitro, RAW 264.7 frumuræktun, IFN- og LPS meðferð jók NO framleiðslu til muna (Mynd 1). Formeðferð með fucoidan (1–320 µg/ml) hafði ekki áhrif á losun NO frá átfrumufrumulínu (Mynd 1A). Til samanburðar, CT þykkni (32-320 µg/mL) bæla verulega NO framleiðslu, sem gefur til kynna bólgueyðandi virkni (Mynd 1B).

Inndæling karragenans í músaloftpokann jók verulega útblástursrúmmálið í pokanum (Mynd 2). Slík aukinn útblástur minnkaði með meðferð með fucoidan (18 mg/kg) og CT þykkni (54 og 162 mg/kg). Sérstaklega minnkaði samsett meðferð með fucoidan og CT útdrætti enn frekar magn útblásturs, samanborið við einstök áhrif, þó að stærri skammtasamsetningar (54+162 mg/kg og 90+270 mg/kg) sýndu ekki frekari virkni. í lægstu skammtasamsetningu (18+54 mg/kg) (Mynd 2A). N gráðu spenna í pokanum jókst einnig verulega eftir inndælingu karragenans (Mynd 2B). Í samanburði við væg áhrif fucoidan lækkaði CT þykkni verulega N gráðu styrkleika. Samsett meðferð á fucoidan og CT þykkni lækkaði NO stigið enn frekar á skammtaháðan hátt. Á sama hátt var aukið PGE2 innihald bælt niður með samverkandi meðferð með fucoidan og CT þykkni (Mynd 2C).

Samhliða bólgumiðlunum í pokanum jókst fjöldi bólgufrumna verulega með inndælingu karragenans: 37,8, 4,8 og 24,1 falt af viðmiðunargildum fyrir daufkyrninga, einfrumur og eitilfrumur, í sömu röð (tafla 1). Hins vegar, fucoidan og CT þykkni dró verulega úr bólgufrumuíferð, þar sem fucoidan var nokkuð betra en CT þykkni. Óvænt náðist engin samverkandi áhrif í íferð bólgufrumu með samhliða gjöf fucoidan og CT þykkni.

Eins og ályktað er af íferð bólgufrumna í exudates, sýndu undirhúðvefurinn umhverfis loftpokana alvarlegar bólguskemmdir (mynd 3). Gífurlega margar frumur í þykknuðum undirhúðvef sem urðu fyrir Carrageenan sáust (Mynd 3B), samanborið við næstum eðlilega eiginleika í samanburðardýrum (Mynd 3A). Slíkar bólguskemmdir voru ótrúlega veiktar með meðferð með fucoidan (myndir 3C og 3D) eða CT þykkni (myndir 3E og 3F).

Sérstaklega fengust meiri bólgueyðandi áhrif með samsettri meðferð með fucoidan og CT þykkni (myndir 3G-3I).

Umræða

Með því að nota in viv gráðu arrageenan-framkallaða loftpokabólgulíkan, veldur inndæling lofts í bak nagdýra fjölgun frumna sem lagast á yfirborði holrúmsins til að mynda byggingu svipað liðvef. Í þessu líkani jók inndæling carrageenan-framkallaðrar bólgufrumuíferðar útflæðið, sem er vísbending um æðaleka. Loftpokinn þjónar sem geymi bólgufrumna og miðlara sem auðvelt er að mæla í vökvanum sem safnast fyrir á staðnum.

Meðal fjölbreyttra bólgumiðla sem geta framkallað gegndræpi í æðum er vel þekkt að NO og PGE2 eru stórir þættir sem taka þátt í meingerð margra bólgusjúkdóma. Þeir eru einnig þekktir sem miðlarar verkjaörvunar og skynjunar. iNOS, sem er tjáð og virkjuð í fjölbreyttum frumugerðum með örvun með TNF- og/eða LPS við bólgu, framleiðir háan, viðvarandi styrk NO. NO er ​​mikilvæg stjórnsameind í fjölbreyttum lífeðlisfræðilegum aðgerðum, svo sem æðavíkkun sem leiðir til æðaleka. PGE2, sem er myndað úr arakidonsýru í gegnum COX, stuðlar að þróun margra bólgusjúkdóma og offramleiðsla PGE2 sem svar við ýmsum bólguörvunum tengist uppstjórnun á COX-II gildum og framgangi bólgu. Þess vegna hafa TNF- - NO og COX-II-PGE2 ferlar verið taldir vera tveir meginstraumar bólguferla, sem eru lokaðir af hemlum iNOS (barkstera) og COX (NSAID), í sömu röð.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA TIL AÐ BANNA BLÓÐSJÚKDÝÐA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Í þessari rannsókn minnkaði samhliða gjöf fucoidan og CT þykkni magn af vökva í pokanum, sem bendir til þess að þau hafi bælandi virkni gegn æðaleka (Mynd 2A). Í samanburði við einstök áhrif hvers fucoidan og CT útdráttar, jókst samsett meðferð enn frekar, sem gefur til kynna að tveggja gráður hafi samverkandi áhrif. Slík samlegðaráhrif milli fucoidan og CT þykkni voru studd af starfsemi þeirra á NO og PGE2 stigum í útflæði (myndir 3B og 2C).

Athyglisvert var þó að staðfest var að fucoidan hamlar ekki beint virkjun átfrumna in vitro prófun (Mynd 1A). Á sama hátt var hamlandi möguleiki fucoidan á NO og PGE2 uppsöfnun in vivo prófun tiltölulega lægri en CT þykkni (myndir 2B og 2C). Slíkur verkunarháttur fucoidan er frábrugðinn beinni óvirkjun á frumunum með CT útdrætti (Mynd 1B). Til samanburðar sýndi fucoidan mikla verkun á hömlun á íferð bólgufrumna í pokana (tafla 1). Fucoidan var betri en CT þykkni við að hindra flutning daufkyrninga, einfruma og eitilfrumna til vefjaskaðastaða af völdum karragenans. Athyglisvert var að það voru engin samverkandi andstæðingur-flæði áhrif, sem gefur til kynna mismunandi verkunaraðferðir milli fucoidan og CT þykkni: þ.e. fucoidan hindrar íferð bólgufrumna, en CT þykkni hindrar virkjun frumanna.

Polymorphonuclear frumur, sérstaklega daufkyrninga, eru helstu frumuþættirnir sem safnað er á bráða bólgustaði af völdum karragenans. Að auki gegna bólgufrumur í kjölfarið eins og átfrumur og eitilfrumur einnig miðlægu hlutverki í bólguferlinu með því að seyta cýtókínum. Þegar það var formeðhöndlað með fucoidan eða CT útdrætti var fjöldi hvítra blóðkorna sem fluttu inn í loftpokana sem sprautað var með karragenan verulega niður. Þessi niðurstaða var í samræmi við áhrif sem myndu fást með barksterum eins og dexametasóni, en ekki með bólgueyðandi gigtarlyfjum þar með talið indometasíni. Þess vegna er gert ráð fyrir að fucoidan og CT þykkni hafi að hluta eiginleika stera.

Auk þess að hindra virkni á bólgufrumukrabbameini, virtist CT þykkni bæla virkjun átfrumna. Þetta var staðfest með hamlandi verkun þess á NO in vitro og in vivo, sem er helsti bólgumiðillinn sem myndast af átfrumum. Þannig gætu áhrif CT útdráttar á átfrumur stafað af bælingu á mRNA tjáningu og/eða beinni hömlun á iNOS virkni í þessum frumum.

PGE2 er líka einn helsti bólgumiðlarinn. Það eykst samhliða vefjabjúg, sem er bælt með bólgueyðandi gigtarlyfjum, hemlum COX. Carrageenan getur aukið PGE2 framleiðslu með því að örva COX-II mRNA og COX-II prótein í pokanum. Í þessu líkani jók karragenan verulega magn PGE2 og það var verulega bælt með CT útdrætti. Það er athyglisvert að þessi niðurstaða var í samræmi við áhrif sem myndu fást af bólgueyðandi gigtarlyfjum indometacíni. Þess vegna er ályktað af niðurstöðunum að CT þykkni hafi viðbótareiginleika bólgueyðandi gigtarlyfja. Samanlagt er talið að CT þykkni hafi haft bæði barkstera og bólgueyðandi gigtarlyf í bólgulíkaninu af karragenan og að fucoidan hafi aukiðbólgueyðandi áhrif CT þykknimeð því að hindra íferð bólgufrumu.

Þó að skilgreina nákvæman verkunarmáta krefjist frekari rannsókna, dregur blanda af fucoidan og CT þykkni verulega úr bólgueinkennum með því að hindra TNF- –NO og COX-II-PGE2 ferla í loftpokabólgu af völdum carrageenan. Þessar niðurstöður gefa vísbendingar um að samsett meðferð með fucoidan og CT þykkni gæti verið efnilegur frambjóðandi til að draga úr ýmsum tegundum bólgu sem svara barksterum eða bólgueyðandi gigtarlyfjum.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA TIL AÐ BANNA BLÓÐSJÚKDÝÐA PHGS75% ECH 30% ACT 12%