Stx2 framkallar mismunandi genatjáningu og truflar dægurtaktsgen í nærpíplum Ⅱ

3. Umræður

3.1. The Proximal Tubular Pathology í STEC sjúklingum og dýralíkönum

Oliguria er merki umbráðt pípludrep(ATN). Vegna ATN hindra útþekjufrumur holrými pípla til að draga úr vökvaflæði sem virðist sem oliguria. Hjá STEC sjúklingum eru oliguria og anuria oft niðurstöður sem benda til ATN. Sýnt hefur verið fram á minnkun á starfsemi nærpípla á fyrri stigum STEC smitsjúkdóms sem aukning á 2MG og NAG í þvagi [3,33]. B2MG er 12 kDa lítið prótein sem síast frjálslega í gegnum glomeruli og frásogast að fullu af nærpíplum í heilbrigðu ástandi. Hins vegar, þegar nærliggjandi píplar eru skemmdar, eykst magn 2MG í þvagi og þjónar því sem lífmerki fyrir starfsemi nærpípla. NAG er stórt lysosomal ensím sem er 130 kDa og aðal glúkósíðasinn í nærpíplum. Vegna stórrar stærðar getur glomerulus ekki síað NAG en skemmdar nærpíplar seyta NAG í þvagi. Þannig er aukning á NAG í þvagi annað lífmerki fyrir skaða á nærpíplum. Glomerular vefjameinafræði eins og fibrín-stífluð háræðar er algengt hjá STEC sjúklingum; hins vegar benda ofangreindar þvaggögn til skaða á nærpíplum í fyrri sjúkdómnum. Einnig inniheldur þvag frá STEC-sjúklingum gifs sem samanstanda af pípulaga þekju sem er afleiðing af því að skemmdar aðlægar píplar frumur hafa losnað [1]. Í dýralíkönum kemur oft fram sloughing á nærliggjandi pípulaga frumum bæði í STEC sýkingu og Stx inndælingarlíkönum [25-27,34]. Í yfirstandandi rannsókn fundum við sloughing á nærliggjandi píplufrumum í Stx2-músnýrum sem sprautað var sem bendir til Stx2-framkallaðrar nærpíplabreytingar (Mynd 1). Einnig fundum við Stx2 viðtaka Gb3 í bæði mús ogproximal píplar í nýrum mannameð luminal hliðartjáningu sem er vísbending um bein víxlverkun Stx2 við nærpíplarnir (myndir 2 og 3). PDK4 fosfórýlerar pýrúvat dehýdrógenasa til að hamla virkni þess sem leiðir til minnkunar á nýtingu glúkósa og aukins fituefnaskipta sem svar við langvarandi föstu og hungri. Það verndar aðskildar þekjufrumur gegn frumudauða af völdum losunar (anoikis) [35]. PDK4 hafði upphaflega hámark eftir 4 klst, síðan annan topp eftir 8 klst (Mynd 5A). Það var minnkað eftir 12 klst., en þaðan hafði það hægfara aukningu þar til 72 klst. með log2-falt breytingu og endaði með 3 (12-falt breytingu) (Mynd 5A). Losun þekjufrumna átti sér stað í Stx2-nærpíplufrumum úr músum (sloughing) með tiltölulega ósnortinni formgerð (Mynd 1), þetta gæti endurspeglað PDK4 uppstjórnun.

CISTANCHE TUBULOSA ÚRDRAGSDUFT FYRIR NÝRU

Þar sem NHERF1 (SLC9A3R1) stuðlar að eðlilegri viðloðun frumna við utanfrumu fylkið [36], skipulag aktíns umfrymis og viðheldur formgerð frumna, getur minni tjáning þessa gena haft afleiðingar eins og hrun frumna (Mynd 5K).

Áhrif Stx2 á nærpíplarnir virðast svo mikilvægur þáttur fyrir STEC smitsjúkdóm; þó voru breytingar á genatjáningu með áherslu á in vivo nærliggjandi pípulaga frumur ekki tiltækar áður. Keepers o.fl. [37] sýndu mismunandi tjáð gen (DEG) í nýrum Stx2+LPS-sprautaðra músa þannig að flest fyrri og að miklu leyti breyttu gena voru frá LPS áhrifum og gen sem breyttust mjög seint eru frá Stx2 áhrifum . Gögnin þeirra sýndu dýrmæta innsýn í mismunandi genatjáningu nýrna en aðskildu ekki þær tegundir frumna sem voru ábyrgar fyrir þeirri breytingu. Í núverandi rannsókn reyndum við að leita að DEG sem tengjast nærliggjandi pípulaga frumum með því að bera saman örfylkisgögn frá músumnýru og frumpípla í mönnumfrumur sem voru meðhöndlaðar með Stx2.

3.2. Nálægir pípuþættir sem taka þátt í Stx2-framkölluðum meinafræði í tengslum við þekkta Stx2 starfsemi í Gb3 tjáningarfrumum

3.2.1. Virkni (I), Merkjaflutningur framkallaður af Stxs-bindingu við Gb3

B undireiningar Stxs örva óviðtaka src týrósín kínasa Já fosfórun [4]. Fosfórýlerað Já virkjar niðurstraumsmerkjasameindir með kínasavirkni sinni og leiðir til endurgerðar frumubeina [5]. Ja-tengd prótein (YAP) fosfórun í Y357 af Yes er þekkt fyrir að framkalla YAP kjarnaflutning þar sem það virkar sem umritunarvirkja til að örva markgen eins og CTGF [38]. Matricellular prótein CYR61 (CCN1) og CTGF (CCN2) eru seytt í utanfrumu fylkið (ECM) og stuðla að því að viðhalda frumu-ECM viðloðun með því að binda viðtaka integrín og frumu yfirborðstengd heparan súlfat próteóglýkan (HSPGs) [39,40]. Lykilsameind CCN1 og 2 umritunar er YAP og henni er haldið óvirku (fosfórýleruð við serínleifar 127) í eðlilegu ástandi undir merkjaleiðinni Hippo. Þegar lítil frumuviðloðun hefur greinst er YAP (S127) ekki lengur fosfórýlerað sem gerir það kleift að komast inn í kjarnann og umritun CCN1 og 2 eykst [41-43]. CCN1 og 2 virka sem sárgræðandi sameindir til að gera við frumu-týndan vef [38,44]. Í gagnasafninu okkar höfðu CCN1 og 2 litla toppa á fyrri tímapunkti (6 klst.). Þetta gæti verið að endurspegla Stx2 bindingu af völdum Já virkjunar. Seinna klukkustundir gæti sloughing hafa hrundið af stað frekari YAP virkjun með því að slökkva á Hippo merkjaleiðinni til að framkalla meiri tjáningu á CCN1 og 2 eftir 12 klst. eða síðar (Mynd 5C).

3.2.2. Virkni (II), Framkalla ER-streitu/UPR

Stxs ná til ER, þar sem klofnir A1 bútar og B undireiningar líkja eftir óbrotnum próteinum [9,10,45,46]. Glúkósastýrt prótein 78 kDa (Grp78, bindandi immúnóglóbúlínprótein (Bip)) festir þrjú UPR lykilprótein Inositol-þarf ensím-1 (Ire-1), próteinkínasa R-líkur endoplasmic reticulum kínasa (PERK) ) og virkja umritunarþátt 6 (ATF6) í ER himnu við eðlilegt ástand. Hins vegar, vegna meiri sækni Grp78 við óbrotin prótein, losar það þessi festu prótein. ATF6 er virkjað eftir losunina og eykur CHOP (DDIT3) og X-box bindandi prótein 1 (XBP-1) mR NAs, en Ire-1 skeytir XBP-1 mRNA til að framleiða XBP{{ 22}} prótein, sem stuðlar að CHOP (DDIT3) umritun. PERK virkjun leiðir til ATF4 virkjunar sem einnig eykur CHOP (DDIT3) mRNA. Þess vegna er aukning á CHOP (DDIT3) mRNA einkenni UPR [47,48]. Greint er frá því að Stxs framkalli UPR og CHOP (DDIT3) er uppstýrt í gagnapakkanum okkar (Mynd 5D–G).

GDF15 tilheyrir umbreytandi vaxtarþáttum beta (TGF) fjölskyldunni. Nýlega hefur verið sýnt fram á að GDF15 miðlar þyngdartapi af völdum metformíns af völdum sykursýkislyfja [49]. Hjá metformíni sem var gefið til inntöku jókst GDF15 mRNA í þörmum og nýrum sem leiddi til hækkunar á GDF15 í sermi. GDF15 í hringrás vinnur í gegnum viðtaka sem er takmarkaður í heilastofni til að bæla fæðuinntöku og draga úr líkamsþyngd [50]. Hjá músum sem fengu metformín er aukið GDF15 í nýrum að minnsta kosti að hluta undir stjórn CHOP (DDIT3). Í gagnasafni okkar með Stx2-sprautuðum músarnýrum, jókst CHOP (DDIT3) upphaflega eftir 4 klst. með mjög litlum hámarki og fór síðan að hafa vaxandi tilhneigingu í átt að 48 klst. þar sem það hélt stigi logins{{16 }}falda breytingu um 1,3 (Mynd 5E). Samkvæmt STRING klasagreiningu fær GDF15 virkt inntak frá umritunarþáttum CHOP (DDIT3) og ATF3 (Mynd 5E) [51,52]. Stx2-músþyngd sem sprautað var inn byrjaði að minnka eða víkja frá saltvatnsstjórnun eftir 24 klst (Mynd S3B). Aukning á GDF15 mRNA í nýrum eftir 12 klst. gæti hafa haft áhrif á heilastofninn til að draga úr fæðuinntöku, sem aftur virtist sem þyngdartap (myndir 5E og S3B). Þar sem tjáningarstig GDF15 hélt áfram að vera hátt eftir 24 klst, héldu mýs áfram að léttast (myndir 5E og S3B).

Við ER-streitu losnar PERK úr Grp78 (Bip) og fáliðað til að fosfórýlera og hamla eIF2 sem leiðir til alþjóðlegrar þýðingarbælingar, fyrir utan nokkur UPR-svörun prótein eins og ATF4, CHOP og Grp78. GADD34 (prótein fosfatasa 1 stjórnunarundireining 15A (PPP1R15A)) er eitt af auknu próteinum undir fosfórýleruðu eIF2 (eIF2 (P)) tengdri hömlun og uppstýrt í gagnasafni okkar (Mynd 5D,G). GADD34 er próteinfosfatasi -1 sem affosfórýlerar eIF2 (P) til að stjórna neikvætt UPR-framkallaða próteinmyndunarhömlun [53]. GADD34 (PPP1R15A) tjáning verður log2-falt breyting stærri en 1 eftir 12 klst. af Stx2 í gagnasafninu okkar og heldur áfram að aukast þar til 24 klst. þegar það er hálendi (log2-falt breyting jafngildir 2,1) og viðheldur þessu stigi til enda (Mynd 5D,G). Þetta bendir til þess að Stx2-framkallað UPR hafi haft neikvæð viðbrögð eftir 12 klst. Aukin umritun og þýðing á CHOP (DDIT3, GADD153) er aðalsmerki ER-streitu og mismunatjáningarmynstrið líkist GADD34 nema log2 stærra en 1 kemur eftir 24 klst og smám saman hálendi eftir það (log2 jafngildir 1,3) (mynd 5D,G). Einnig er CEBPB, ríkjandi dimerizing samstarfsaðili CHOP, uppstillt í gagnapakkanum okkar (Mynd 5D, G). Þessar niðurstöður benda til þess að á meðan Stx2-framkallað ER streita byrjar mjög snemma á tímaferlinu, þá eykur það áhrifin í allt að 24 klst. og viðheldur þessu stigi ER streitu til loka á meðan neikvæður endurgjöfararmur jafnar sig líka samtímis

3.2.3. Virkni (III), ríbósóm óvirkjandi prótein (RIP) Virkni

Með því að kljúfa adenín úr rRNA hamla Stxs nýmyndun próteina. Hreinsað rRNA hefur áhrif á breytingu á formgerð ríbósóma, sem virkjar merkjaflutning [11] þekktur sem ríbótoxunarálagssvörun (RSR), sem leiðir til einkennandi genavirkjunar (sjá næstu málsgrein).

3.2.4. Virkni (IV), ríbótoxandi streituviðbrögð (RSR) Virkni

ZAK (MAPKKK) er þekktur kínasi í RSR og virkjar niðurstreymis JUN N terminal kínasa (JNK) og p38 MAPK ferla [12,15]. Stx1 framkallar JUN og FOS mRNA tjáningu í þekjufrumum í þörmum manna og þessi atburður krafðist RIP virkni jákvæða Stx1 sem talið er vera undir RSR stjórn [15]. Önnur RSR niðurstreymis sameind, p38 MAPK, er þekkt fyrir að framkalla snemma viðbragðsgen eins og JUN, FOS, EGR1, MAFF, DDIT3 og ATF3 [54], sem öll voru tjáð á mismunandi hátt í gagnasafninu okkar. Einnig er vitað að JNK og p38 MAPK ferlar eru virkjaðir downstream atburðir Ire-1 samkvæmt UPR (myndir 4B,D og 5B,E,F) [47]. Vegna þessa geta Stxs virkjað þessar tvær leiðir í gegnum RSR og/eða UPR. Einnig er sýnt fram á að utanfrumumerkjastýrður kínasa (ERK) 1/2 ferillinn sé aftan við RSR [55] og vitað er að DUSP1 (MKP1) genið er framkallað af ERK1/2 ferlinu [56]. Stx1 og anisomycin (annar próteinmyndunarhemill) eru fær um að örva DUSP1 tjáningu í Caco-2 frumum [57]. Í gagnasafninu okkar var DUSP1 tjáning framkölluð og þetta gæti bent til ERK1/2 virkjunar (Mynd 4B, D).

3.2.5. Virkni (V), Sérstök genaumritun sem leiðir til cýtókíns

Secretion IL-8 secretion in Stxs-treated cells, human intestinal cells in particular, has been reported extensively as a downstream factor of RSR [12,58]. Cytokines and chemokines in animal models revealed CXCL1 and CXCL10 expression within Stx2-treated mouse kidneys [37,59]. IL-8 (CXCL8) and CXCL1 are both neutrophil chemoattractants that utilize CXCR2 as their receptor. IL-8 is expressed in humans but not in mice. In our dataset, human RPTEC showed an increase in IL-8 expression by log2 equals 4.6-fold maximum (log2 values were 4.6, 3.52 and 4.48 at 6, 13, and 19 h after Stx2, respectively). As we extracted common DEGs from mouse kidney and human proximal tubular cells IL-8 was not included in the final dataset. Instead, the molecule with similar function as IL-8, CXCL1 showed a significant increase as a common DEG (Figure 5L). A downstream pathway of UPR is the NF-κB signaling pathway. NFKBIA (IκBα) is an inhibitory factor of the classical (canonical) NF-κB pathway that binds with NF-κB subunits RelA (p65) and p50. Upon phosphorylation by an upstream kinase, NF-kappa B kinase (IKK), NFKBIA (IκBα) is degraded, thus NF-κB can translocate to the nucleus and induce transcription of inflammatory factors. RelB proto-oncogene nuclear factor-kappa B subunit (RelB) is involved in the alternative (non-canonical) NF-κB pathway and induces inflammatory factor expression. RelB-p50 or -p52 dimers act as a transcription factor (NF-κB) when phosphorylation of p100 of RelB-p50-p100 or RelB-p100 complexes is done by IKKα homodimers and this step does not involve IκBα. In our dataset, both NFKBIA and RelB were differentially expressed reaching to log2-fold change >1 eftir 24 og 48 klst., í sömu röð (Mynd 5F). Þetta bendir til þess að hattgen undir báðum NF-κB ferlum, IκB (klassískt) og RelB (val), séu framkölluð. Þar sem CHOP (DDIT3) mismunatjáning fer yfir log2 stærra en 1 eftir 24 klst., gangast nýra í músum undir UPR, þannig að virkjuð PERK fosfórýlerar heilkjörnungaþýðingar upphafsþátt 2 undireiningu alfa (eIF2) til að hindra þýðingu á NFKBIA [60]. Af þessum sökum getur aukning á NFKBIA mRNA ekki hamlað mikið af NF-KB ferlinu, þannig að umritun bólguþátta er leyfð (Mynd 5L).

Sobbe o.fl. [61] sýndi að bæði klassísk (RelA-p50) og önnur (RelB-p52) NF-KB ferlar voru virkir í Stx-sprautuðum músum sem greindu uppstjórnun á RelA-markmiða cýtókínum CCL20, CXCL1 og CXCL10 sem einnig komu fram á mismunandi hátt í okkar gagnasafn (Mynd 5L).

3.2.6. Virkni (VI), Stxs-Induced Apoptosis

Kljúfur kaspasi 3 hefur fundist í Stxs-tengdum frumudauða [13,15,62]. Sýnt hefur verið fram á að kaspasa-3 virkjun eða framkalla frumudauða af Stxs á sér stað í samhengi við RSR og UPR. Í RSR af völdum Stxs eru bæði p38 MAPK og JNK ferlar þátttakendur [15] auk ERK virkjunar er greint frá [55]. UPR er aftur á móti þekkt fyrir að framkalla NF-KB, JNK og p38 MAPK ferla. CHOP (DDIT3) undir UPR er sýnt fram á að taka þátt í apoptosis [63] og það hefur einnig verið sýnt fram á Stxs-tengda apoptosis [13]. Einnig hefur verið greint frá þátttöku JNK í UPR-framkallaðri apoptosis [64]. Í gagnasafni okkar eru nokkrar DEG eins og CHOP (DDIT3), NFKBIA, FOS, JUN og JUNB þátt í RSR og UPR (Mynd 5B, F).

3.3. Circadian Dysregulation eftir Stx2

Aukning á sermi endóþelíni-1 (ET-1, EDN1) kemur fram hjá STEC-HUS sjúklingum [65]. Einnig, með tilraunum, framkallar Stx2 EDN1 tjáningu með því að virkja merkjaflutningsfall sem felur í sér MAPKs [66], á meðan UPR er þekkt fyrir að örva EDN1 umritun [67]. Í gagnasafni okkar, Stx2 meðferð framkallað EDN1 tjáningu í bæði mús nýra og mönnum aðlæga pípulaga frumur (Mynd 5G). Þar sem EDN1 genatjáning var samnefnari músnýra og aðlæga pípulaga þekjufrumna úr mönnum, sýnir það að EDN1 tjáning á sér stað, að minnsta kosti að hluta, í nærliggjandi pípulaga þekjufrumum in vivo auk æðaþekjufrumna. Einnig, seytt ET-1 framkallar EGR1 tjáningu með MAPK virkjun [68]. Gögnin okkar staðfesta uppstjórnun EGR1 í tímasetningu þegar EDN1 er uppstýrt (Mynd 5H). EGR1 framkallar dægursveiflu lykilþátt PER1 tjáningu [69], þannig að stilla amplitude annarra circadian þátta (Mynd 5H).

Í sólarhringsreglugerð stjórnar heterodimer CLOCK-BAML1 (ARNTL) PER1 og CRY1. Í staðinn binst PER1-CRY1 heteródímer við CLOCK-BAML1 (ARNTL) til að bæla niður frekari umritun þeirra, og myndar þar af leiðandi neikvæða lykkju á sólarhringnum. Þannig gerast tjáningartoppar jákvæðra eftirlitsgena (CLOCK og BAML1 (ARNTL)) og neikvæðra regulatorgena (PER1 og CRY1) á einni klukkustund að þegar CLOCK og BAML1 (ARNTL) hafa aukna tjáningu, minnka PER1 og CRY1, og munstrið breytist á næstu klukkustundum. Þegar við bættum log2-faltbreytingargildum CLOCK og BAML1 (ARNTL) við grafið (Mynd 5J), á fyrri tímapunktum, sýndu PER1 og BAML1 (ARNTL) öfugt taktmynstur með skörpum/mjóum tindum, þó, eftir 24 klst. fóru topparnir að verða daufir og hækka stöðugt án takts. Þetta gefur til kynna að Stx2 hafi haft áhrif á nýrnasveiflur, þar með talið innan nærpíplanna. Þrátt fyrir að þörf sé á frekari staðfestingartilraun, benda gögn okkar ásamt útgefnum bókmenntum sem lýsa PER1 áhrifum á nýrnabilun við áreiti [70,71], til mögulegrar Stx2 þátttöku í dægurtruflunum og áhrifum á nærliggjandi píplastarfsemi með því að draga úr nýrnaklukkurgenum- stýrðir þættir eins og SGLT1 (SLC5A1) (Mynd 5K). Reyndar sáum við sykurþurrð í Stx2-sprautuðum músum sem fjölga sér í annarri rannsókn með Stx1-sprautuðum músum [21] sem bendir til truflunar á SGLT1 (SLC5A1) í nærliggjandi píplum (tafla 3). Eftir því sem við best vitum er þetta fyrsta skýrslan sem gefur til kynna að Stx2 hafi tekið þátt í dægurtruflunum á nýrum.

4. Niðurstöður

Við ákváðum mikilvæg gen varðandi nærliggjandi píplutengda tjáningu sem var breytt af Stx2. Gert er ráð fyrir að mismunatjáning þessara gena sé afleiðing af Stx2 virkni eins og UPR örvun, rRNA afhreinsun tengdum RSR og merkjaflutningi framkallað af Gb3 bindingu við plasmahimnuviðtaka. Genið sem er mest tjáð, GDF15, getur haft áhrif á þyngdartap af völdum Stx2 í gegnum heilastofn-takmarkaða viðtaka með því að draga úr fæðuinntöku. Utanfrumufylki og frumuviðloðun geta verið undir áhrifum af PDK4, NHERF1 (SLC9A3R1), CYR61 og CTGF sem valda Stx2-sértækri vefjameinafræði og sloughing. Ennfremur getur truflun á dægursveiflu nýrna af völdum Stx2 leitt til galla í nærliggjandi píplum eins og endurupptöku glúkósa.

5. Efni og aðferðir

5.1. Dýr Mýs

(C57BL/6, karlkyns, 19–22 g, frítt tiltekinn sjúkdómsvald) voru keyptir frá Charles River Laboratories Japan, Inc. (Yokohama, Japan). Matur og vatn var gefið að vild. Músum var haldið með hefðbundinni 12 klst.: 12 klst ljós-myrkri hringrás þar sem ljós er kveikt klukkan 7 og slökkt klukkan 19. Herbergishita dýra var haldið um 24 ◦C. Allar aðferðir voru samþykktar af dýraverndarnefnd háskólans.

5.2. Mannlegur nýrnavefur

Líkamsvefur án nokkurra persónuauðkenna var notaður í þessari rannsókn og er hann talinn undanþeginn samkvæmt leiðbeiningum háskólans um rannsóknir á mönnum.

5.3. Frumumenning

Frumræktun á nærpípulaga þekjufrumum úr mönnum úr mönnum var keypt frá Clonetics (Walkersville, MD, Bandaríkjunum) og henni haldið við 37 ◦C, 5% CO2 andrúmsloft. Frumur voru ræktaðar í nýrnaþekjufrumuvaxtarmiðli sem bætt var við húðþekjuvaxtarþætti manna, hýdrókortisóni, adrenalíni, insúlíni, tríjoðtýróníni, transferríni, GA-1000 og FBS.

5.4. Hreinsun á LPS-frjáls Stx2 LPS fjarlæging úr Stx2 var framkvæmd eins og áður hefur verið lýst [72]. Í stuttu máli var and-Stx2 11E10 mótefnatengd súlan notuð til að fá Stx2 brotið, og brotið var síðan flutt í gegnum Detoxi-gel (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA) til að fjarlægja LPS. Stx2 hluti var síaður með 0.2 µm síu og LPS magn var prófað með Limulus amebocyte lysate prófun (Pyrotell, Associates of Cape Cod Incorporated, East Falmouth, MA, Bandaríkjunum). Stx2 brotið var ákvarðað með minna en 0,03 endotoxín einingar (ESB)/mL. Stx2 afbrigðistegundin var Stx2a.

5.5. Stx2 gjöf í mús 2LD50 skammtur (5 ng Stx2/20 g líkamsþyngd), sem drepur mýs innan fjögurra daga (Mynd S3A), var sprautað í mýs í kviðarhol í rúmmáli 0,1 ml í LPS-fríu saltvatni (Otsuka pharmaceutical, Japan). Eiturefnissprautun var gerð á milli klukkan 7 og 9 á morgnana, þar sem mýs á lengri tíma fengu Stx2 klukkan 7 og fylgt eftir með 24, 48 og 72 klst. sýnatöku klukkan 7.

5.6. Þvagsöfnun og glúkósamæling í þvagi Eftir 2, 6, 8, 12, 24, 36, 48, 60 og 84 klst. af Stx2 inndælingu var þvag tekið og 10 µL var sleppt á Fuji þurrefnaglas GLU- P III (FUJIFILM, Kanagawa, Japan) og glúkósa í þvagi var mældur með Fuji Dry Chem 7000 V (FUJIFILM) á aðstöðunni sem stjórnað er af. Þvag frá for-Stx2 inndælingu var notað sem 0 klst sýni. Þvagsöfnun var framkvæmd með tveimur músum

5.7. Vefjavinnsla Eftir 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48 og 72 klst af Stx2 inndælingu voru þrjár mýs á hverjum tímapunkti aflífaðar af CO2 og nýrum safnað. Helmingur af einu nýra var festur með 4% paraformaldehýð/fosfat-bufferuðu saltvatni í 7 daga við 4 ◦C og unnið fyrir paraffínhlutann. Annar helmingur nýrna var notaður til að draga RNA út fyrir örfylkisgreiningu. Þrjár mýs án nokkurrar meðhöndlunar voru notaðar sem venjuleg (barnlaus eða 0 klst). Þrjár mýs voru sprautaðar með PBS (burðarefni) og þeim fórnað eftir 72 klst. og þjónuðu sem burðarefnisstýring til að sýna að það eru hverfandi breytingar á tjáningu gena samanborið við eðlilega stjórn.

5.8. Periodic Acid-Schiff (PAS) blettur Parafínhlutar voru vökvaðir og litaðir með 0,5% periodic acid lausn, fylgt eftir með skolun með eimuðu vatni. Hlutar voru fluttir yfir í Schiff hvarfefni. Eftir að hlutar voru þvegnir vandlega með 0,6% natríumbísúlfítlausn, voru þeir mótlitaðir með hematoxýlíni.

5.9. Stx2 meðferð í RPTEC RPTEC frumum úr mönnum var meðhöndluð með 10 ng/ml af Stx2 í 6, 13 og 19 klst við 37 ◦C, 5% CO2. RPTEC án Stx2 meðferðar var notað sem viðmið. Tvær líffræðilegar eftirmyndir voru gerðar á hverjum tímapunkti. Eftir þvott með PBS voru frumur notaðar til RNA útdráttar.

5.10. Free-Floating Immunofluorescence litun Fyrir lausa fljótandi hluta vinnslu, var venjuleg mús bleytt-fixed eins og lýst er í Obata et al. [69]. Nýru úr músum voru síðan krufin og sökkt í 4% PFA/PBS í 3 klst við 4 ◦C með vægum hristingi. Vefur var þveginn með PBS og frostverndaður með 30% súkrósa/PBS við 4 ◦C yfir nótt eða þar til þeir sökkva til botns. Þykkir frosnir hlutar (50 µm) voru skornir með rennandi míkrótómi með frosnum stillingum. Hlutar voru lokaðir með 1:50 geit-and-rottu IgM mótefni í PBS (F104UN, American Qualex International, Inc., San Clemente, CA, Bandaríkjunum) í 1 klst og ræktaðir með and-Gb3/CD77 mótefni 1:100 í blokkuninni lausn eða samsætustjórnun (rotta IgM) í samsvarandi styrk sem aðal mótefni yfir nótt við 4 ◦C. Eftir þvott voru hlutar ræktaðir með öðru mótefni (anti-rottu IgM Alexa Fluor 488, 1:2000 þynning í PBS) í 2 klst við 4 ◦C. Hlutar voru litaðir fyrir aðra rannsaka AQP1 (1:1000 þynningu, Sigma-Aldrich Japan, Tókýó, Japan) og CD31 (550274, 1:50 þynning, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, Bandaríkjunum) með efri mótefnum gegn kanínu IgG Alexa Fluor 546 (1:2000 þynning í PBS) og anti-mús IgG Alexa Fluor 647 (1:2000 þynning í PBS), í sömu röð. Eftir þvott með PBS var 40,6-Diamidino-2-fenýlindól (DAPI, D21490, Thermo Fisher) litað í 15 mínútur við 4 ◦C. Hlutum var sökkt í vökva í brunn á 96-brunnplötunni (U-laga) með örlitlum málningarroða í hvert skipti sem lausninni var skipt. Þvottaskrefið var gert í stærri brunnum eins og í 12- eða 6-brunnsplötum. Vatnskenndur festingarmiðill var notaður til að hylja. Til að undirbúa vefja úr mönnum var nýrun eftir slátrun fest í 20% formalíni í 2 vikur og unnin fyrir lausa fljótandi undirbúning eins og gert var fyrir músavef með einni undantekningu á CD31 mótefni gegn mönnum (CBL468, 1:20 þynning, Merck KGaA, Darmstadt , Þýskalandi) var notað.

5.11. Örfylkisgreining

Helmingi nýrna er sökkt í 2 ml af RNALater (Ambion, Austin, TX, Bandaríkjunum) við 4 ◦C og heildar-RNA var dregið út með Rneasy Midi settinu (Qiagen, Santa Clarita, CA, Bandaríkjunum). Mús erfðamengi 430A 2.0 fylki (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) voru notuð. CEL skrár voru fengnar og staðlaðar með öflugri fjölkubba meðaltölu (RMA), útreikningi á RNA afritatölum og fellingarbreytingum á móti 0 h voru framkvæmdar í R (v.3.6.0) með pakkanum sínum affy [73] og RankProd 2.0 [74]. Gögnin eru sýnd í 2-faldbreytingargildum. Gagnapakkinn er afhentur í Gene Expression Omnibus (GEO) (aðgangsnúmer GSE172465). Úr RPTEC frumum var heildar RNA dregið út með RNAgents Total RNA einangrunarkerfi (Promega, Tókýó, Japan). Allt erfðamengi fákirnis örfylkis (44K fákirnis DNA örfylki, Agilent Technologies, Tókýó, Japan) var notað fyrir örfylkitilraunir. Heildar RNA sýnin voru notuð til að undirbúa Cy5- og Cy3-merkta cDNA rannsaka. Flúorófór-merkt sýni voru blanduð á hverja glerskyggnu og þvegin, síðan skannuð með DNA örfylkisskanni (gerð G2505A; Agilent Technologies). Eiginleikaútdráttur og myndgreiningarhugbúnaðurinn (Agilent Technologies) var notaður til að staðsetja og afmarka hvern blett í fylkinu og til að samþætta styrkleikana, sem síðan voru síaðir og staðlaðir með því að nota staðbundið vegið dreifisléttunaraðferð. Endurtakanleiki örfylkisgreiningar var metinn með tveimur endurteknum litarefnaskiptum í hverri tilraun. Mismunur á mRNA tjáningu milli viðmiðunar og Stx2-meðhöndlaðs RPTEC sem var safnað eftir 6, 10 eða 19 klst. var borinn saman. TXT snið gögn frá GeneSpring hugbúnaði voru notuð til að ákvarða genanöfn út frá rannsakans auðkenni og umbreyta fellingarbreytingum í log2-falt breytingar. Gagnapakkinn er afhentur GEO (aðgangsnúmer GSE172466).

5.12. Lífupplýsingagreining á örfylkisgögnum og sjónrænum gögnum Í bæði músnýra og RPTEC örfylkisgögnum minnka gen sem eru sameiginleg báðum og þar sem breytingin á tjáningu var meira en 2-falt minnka eða aukast (eða log2-faldast) er annaðhvort minna en -1 eða stærra en 1) á hvaða tímapunkti sem er voru valdir af R. Þar að auki, í mús nýra microarray gögnum. Genbreytingar sem passa við rúmlínur voru valdar með því að nota R pakkann maSigPro [https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/ maSigPro.html (síðast skoðaður 4. janúar 2022)] [75]. Kúbískur ferillinn er hentugur til að mæta aukningu eða lækkun þessara gena á tímaferli. Hærri margliðagráðu eins og teningsferill gerir kleift að velja gen með mörgum breytingum á tímaferlinu betur en ferningsferill. Gen sem hegðuðu sér með svipuðum ferli voru þyrpt og minnkunar-/aukningarmynstur þeirra voru sýnd með hitakorti með því að nota R pakka gplots [https://CRAN.R-project.org/package=gplots (síðast skoðað 4. janúar 2022)] [76]. Genaverufræði (GO) var úthlutað og virkni GO meðal algengra gena var auðgað með Metascape [http://metascape.org (síðast skoðað 4. janúar 2022)] [77]. Tenging/tengsl algengra gena voru greind með því að nota STRING [https://string-db.org/ (síðast skoðað 4. janúar 2022)] [78]. Leitað var handvirkt í tengslum milli algengra gena auk þess að nota textanámaaðgerðina í STRING.

Heimildir

1. Gianantonio, C.; Vitacco, M.; Mendilaharzu, F.; Rutty, A.; Mendilaharzu, J. The Hemolytic-Uremic Syndrome.J. barnalæknir.1964, 64, 478–491. [CrossRef] 

2. Vitsky, BH; Suzuki, Y.; Strauss, L.; Churg, J. The hemolytic-uremic syndrome: Rannsókn á meinafræðilegum breytingum á nýrum.Am. J. Pathol.1969, 57, 627–647. 

3. Takeda, T.; Dohi, S.; Igarashi, T.; Yamanaka, T.; Yoshiya, K.; Kobayashi, N. Skerðing af völdum verotoxíns á pípluvirkni stuðlar að nýrnaskemmdum sem sést við hemolytic uremic syndrome.J. Infect.1993, 27, 339–341. [CrossRef] 

4. Katagiri, YU; Mori, T.; Nakajima, H.; Katagiri, C.; Taguchi, T.; Takeda, T.; Kiyokawa, N.; Fujimoto, J. Virkjun Src fjölskyldu kínasa já framkallað af Shiga eiturefni bindingu við globotriaosyl ceramide (Gb3/CD77) í lágþéttni, þvottaefni-óleysanleg örlén.J. Biol. Chem.1999, 274, 35278–35282. [CrossRef] 

5. Takenouchi, H.; Kiyokawa, N.; Taguchi, T.; Matsui, J.; Katagiri, YU; Okita, H.; Okuda, K.; Fujimoto, J. Shiga eiturefnisbinding við globotriaosyl ceramide framkallar innanfrumumerki sem miðla endurgerð umfrymisbeina í frumum úr nýrnakrabbameini úr mönnum.J. Cell Sci.2004, 117, 3911–3922. [CrossRef] [PubMed] 

6. Garred, O.; van Deurs, B.; Sandvig, K. Furin-framkölluð klofning og virkjun Shiga eiturefnis.J. Biol. Chem.1995, 270, 10817–10821. [CrossRef] 

7. Majoul, I.; Ferrari, D.; Söling, HD Minnkun prótein tvísúlfíðtengja í oxandi umhverfi. Tvísúlfíðbrú kólerutoxíns A-undireiningar minnkar í endoplasmic reticulum.FEBS Lett.1997, 401, 104–108. [CrossRef] 

8. Spooner, RA; Watson, PD; Marsden, CJ; Smith, DC; Moore, KAH; Cook, JP; Drottinn, JM; Roberts, LM Prótein tvísúlfíð ísómerasi dregur úr ricin í A og B keðjur þess í endoplasmic reticulum.Biochem. J.2004, 383, 285–293. [CrossRef] 

9. Yu, M.; Haslam, DB Shiga eiturefni er flutt frá endoplasmic reticulum eftir samskipti við Luminal Chaperone HEDJ/ERdj3.Smitast. Ónæmi.2005, 73, 2524–2532. [CrossRef] 

10. Falguieres, T.; Johannes, L. Shiga eiturefni B-undireining binst leiðsögumanninum BiP og kjarnapróteininu B23.Biol. Cell2006, 98, 125–134. [CrossRef]