Rannsókn á verndandi virkni Cistanche á nýrum: Andrógenháður munur á magni CYP MRNA í svínsnýra

Andrógenháður munur á magni CYP mRNA í svínnýrum

Tengiliður:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Við greindum áður frá andrógenháðu kyni og kynjamun á magni mRNAs af CYP ísóformum í svínalifri. Til að skýra hvort slíkur kynja- og kynjamunur sé ánýru, skoðuðum við magn nokkurra CYP mRNAs í nýrum með því að nota bæði kyn 5-mánaðargamla Landrace, Meishan og/eða blandað F1 (LM og ML) svín þeirra. Marktækur kynjamunur á magni nokkurra CYP mRNAs fannst: karl < kona="" fyrir="" cyp2a19="" og="" cyp3a29;="" og="" karl=""> kvendýr fyrir CYP4A24/25 í öllum tegundum. Kynjamunur á magni CYP2B22 mRNA (karlkyns < kvenkyns)="" og="" á="" cyp2c33="" og="" cyp2c49="" mrna="" (karlkyns=""> kvenkyns) kom einnig fram hjá öllum tegundum nema landkyns svínum. Ennfremur fannst marktækur kynjamunur (karl < kvenkyns)="" á="" cyp3a46="" mrna="" aðeins="" í="" lm="" og="" ml="" svínum.="" enginn="" marktækur="" kynjamunur="" fannst="" hjá="" landrace="" eða="" meishan="" svínum="" fyrir="" cyp1a1,="" cyp1a2="" og="" cyp4b1="" mrna.="" magn="" cyp2c33="" og="" cyp4a24/25="" mrna="" hjá="" karldýrum="" var="" meira="" í="" meishan="" svínum="" en="" í="" landrace="" svínum.="" viðbótartilraunir="" með="" því="" að="" nota="" svín="" sem="" eru="" meðhöndluð="" með="" geldingu="">testósterónprópíónat gaf til kynna að munur á kyni og kyni á magni þessara CYP mRNAs væri, að minnsta kosti að hluta, háður sermiþéttnitestósterón. Ennfremur voru áhrif andrógen á magn CYP mRNA í nýrum ekki endilega í tengslum við áhrif í lifur, sem bendir til þess að það sé vefjasértækur þáttur sem ber ábyrgð á andrógentengdri tjáningu CYP gena. Verndun áCistancheánýruer alhliða, sem er rakið til frumefna eins og echinacoside, verbascoside, flavonoids og heildarfenetýlalkóhólglýkósíða sem eru íCistanche. Cistanchegetur ekki aðeins verndaðnýrufrá meiri skemmdum en einnig gera við núverandi skemmdir ánýru. Þess vegna,Cistancheer sú jurt sem oftast er notuð í hefðbundnum kínverskum lyfseðlum.Cistanchehefur mjög mikið lækningagildi.

Leitarorð:testósterón; CYP;nýru; kynjamunur; kynmunur; svín;nýruklefi;Cistanche

Misaki Kojima og Masakuni Degawab

Animal Genome Unit, Institute of Livestock and Grassland Science, National Agriculture and Food Research Organization (NARO); 2 Ikenodai, Tsukuba, Ibaraki 305–0901, Japan: og bLaboratory of Molecular Toxicology, School of Pharmaceutical Sciences, University of Shizuoka; 52–1 Yada, Suruga-Ku, Shizuoka 422–8526, Japan. Móttekið 16. apríl 2021; samþykkt 19. maí 2021

KYNNING

Lyfjaumbrotsensími (DME), svo sem CYP, súlfótransferasar (SULT) og úridín 5'-dífosfat (UDP)-glúkúrónósýltransferasar (UGT), gegna mikilvægu hlutverki í umbrotum útlendingalyfja, þar á meðal lyfja og innræn efnasambönd eins og sterahormóna. og lípíð.1,2) Hússvín (Sus scrofa domesticus), þar á meðal smásvín, eru mikilvæg í lyfjafræðilegum og eiturefnafræðilegum rannsóknum vegna þess að DME virkni er lík mönnum og svínum, sérstaklega CYP.3–7) Við höfum áður greint frá kynlífi. og kynmunur á magni DME mRNAs í lifur, þar á meðal CYP ísóformum, milli Landrace og Meishan svína, og við sýndum enn fremur fram á að andrógenmagn í sermi er einn af mikilvægu þáttunum sem valda þessum mun.8)

Cistanchetubulosakemur í veg fyrirnýrnasjúkdómur,smelltu hér til að fá sýnishornið

Thenýruauk lifrarinnar er mikilvægur vefur sem ber ábyrgð á umbrotum og útskilnaði útlendingalyfja, þar með talið lyfja og innrænna efnasambanda og er eitt algengasta skotmarkið fyrir eiturverkanir af völdum lyfja.9,10) Greint hefur verið frá því að CYP ísóform sem tilheyra CYP1, CYP2, CYP3 og CYP4 fjölskyldur eru til í svínumnýru.11–15) Flest þessara CYP ísóforma gegna mikilvægu hlutverki í umbroti útlendingalyfja og/eða lípíða í tilraunadýrum og mönnum.9,10,16,17) Ennfremur tjáning Cyp4a og Cyp4b ísóforma í músum.nýruer stjórnað af andrógeni.18–21)

Í þessari rannsókn skoðuðum við fyrst kynja- og kynjamun á magni CYP mRNAs (CYP1A1, CYP1A2, CYP2A19, CYP2B22, CYP2E1, CYP2C33, CYP2C49, CYP3A22, CYP3A24, 2CY, 4CY, 4C, 4, 4, 3, 4, 4, 3, 4, 4, 4, 4, 4, 4nýruaf Meishan, Landrace og blönduðum F1 svínum þeirra. Ennfremur skoðuðum við hvort andrógen sé mikilvægur þáttur sem ákvarðar kynja- og kynmun á magni þessara CYP mRNA í svínumnýru, með tilraunum með geldingu og/eða gjöf átestósterónprópíónat (TP).

EFNI OG AÐFERÐIR

Dýr

Notuð voru Landrace, Meishan og blandað F1 (LM, kvenkyns Landrace × karlkyns Meishan; ML, kvenkyns Meishan × karlkyns Landrace) svín, þau sömu og notuð voru í fyrri rannsóknum okkar.22) Í stuttu máli voru svín geymd á National Institute búfjár- og graslendisfræði, Tsukuba, Japan. Öllum svínum var fóðrað með kornfóðri í atvinnuskyni og þau fengu vatn að vild. Svín voru drepin með rafdeyfingu og síðan blóðþurrð milli 10:00 og 11:00 að morgni. Sum karlkyns Landrace og Meishan svín voru gelduð á aldrinum 1 mánaðar og aflífuð við 5 mánaða aldur. Hluti af nýrum eða lifur úr hverju svíni var fljótt fjarlægður, frystur í fljótandi köfnunarefni og haldið við -80 gráður þar til síðari greiningar.

Þessi rannsókn var samþykkt af dýraverndarnefnd National Institute of Livestock and Grassland Science (nr. 1711B060, 1811B032, 1911B068, 20B005NILGS). Öll dýr voru meðhöndluð á mannúðlegan hátt samkvæmt leiðbeiningum nefndarinnar.

Andrógen meðferð

Eins og lýst er í fyrri skýrslum, 23,24)testósterónprópíónat (TP, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, Bandaríkjunum) uppleyst í maísolíu var sprautað fimm sinnum í vöðva með 48- klst. millibili í afturfót hvers svíns, í 10 mg/kg skammti líkamsþyngd; svínin voru aflífuð 24 klst. eftir síðustu inndælingu.

Magn af sermiTestósterón

Magn sermisinstestósterónhjá einstökum karlkyns svínum var mælt með því að notaTestósterónensímtengd ónæmissogandi prófun (ELISA) Kit (Enzo Life Sciences Inc., NY, USA) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda, eins og áður hefur verið lýst.24) Að auki voru gögnin sem fengust í fyrri rannsóknum okkar einnig notuð.24,25)

Magn CYP mRNA

Heildar-RNA var útbúið úr einstökum vefjum með því að nota TRIzol hvarfefni (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA), og notað til að ákvarða magn CYP1A1, CYP1A2, CYP2A19, CYP2B22, CYP2E1, CYP2C33, CYP2C49, 2CYP39, 2CYP39, 2CYP39, 2CYP39, 2CYP39, 2CYP39, 2CYP39, 2CYP39, 2CY, CYP4A24/25 og CYP4B1 mRNA. Magn þessara mRNA var metið með rauntíma RT-PCR með því að nota 7500 rauntíma PCR kerfi og SYBR græna master mix (PE Applied Systems, Tokyo, Japan), eins og áður hefur verið lýst,25) nema CYP3A mRNA. Magn CYP3A22, CYP3A29 og CYP3A46 mRNA var athugað með Eagle Taq Master Mix með ROX (Roche Molecular Systems, Inc., Branch burg, NJ, USA) eins og áður hefur verið greint frá.22) Grunnsettin og TaqMan rannsakan sem notuð eru í dag rannsóknin var sú sama og í fyrri rannsóknum okkar22,25) nema fyrir CYP1A1, CYP1A2, CYP4A24/25 og CYP4B1, þar sem grunnröðin voru sem hér segir: CYP1A1, 5'-ACT TCA TCC CTA TCC TCC GTT ACC{{53} }′ (áfram) og 5′-GCA TTC TCG TCC ATC CTC TTG TC-3′ (aftur); CYP1A2, 5'-GCT ATC GGG ACT TTG ACA AGA ACT-3′ (áfram) og 5'-CCA GGA GAT GGC TGT GGT AAT TG-3' (aftur); CYP4A24/25, 5′-CAC CGT GCC GCC AGG ATA-3′ (áfram) og 5′-CAA GGA GGA GGA TGT CCA GGA A-3' (aftur); CYP4B1; 5′-GAG CAC CAG CAT CGT TGT CG-3' (áfram) og 5'-TCC CCA GAT CCT CCC CCT G-3' (afturábak). Ríbósómal prótein L7 (RPL7) var notað sem innri staðall. Magn hvers cDNA var metið með hlutfallslegri staðlaðri ferilaðferð samkvæmt PE Applied Biosystems User Bulletin #2 (1997). Staðlaðar ferlar til að ákvarða magn CYP mRNAs voru myndaðir með því að nota RT-hvarfblöndu með heildar-RNA úr lifur 5-mánaðagamla kvenkyns Landrace svína, eða úr nýrum 5-mánaðagamla kvenkyns Landrace eða Meishan svín, í samræmi við tilganginn

Tölfræðigreiningar

Tölfræðilega marktækur munur var metinn með Tukey's post hoc prófi eftir ANOVA eða Student's t-próf. Fylgni milli tilgreindra breytu var ákvörðuð með aðhvarfsgreiningu.

NIÐURSTÖÐUR

Magn CYP mRNA í nýrum landkyns og Meishan svína

Magn CYP mRNA var fyrst mælt í nýrum beggja kynja 5-mánaðagamla Landrace og Meishan svín. Til að bera saman magn hvers CYP mRNA á milli nýra og lifrar, var magn hvers CYP mRNA í nýra gefið upp sem hlutfallslegt hlutfall við samsvarandi magn í lifur 5-mánaðagamla kvenkyns Landrace svín, og niðurstöðurnar eru sýndar í töflu 1.

Í öllum svínum sem voru skoðuð var magn CYP4A24/25 og CYP4B1 mRNA í nýrum mun hærra en í lifur, á meðan magn hinna CYPs var hið gagnstæða (tafla 1). Að auki, þrátt fyrir að CYP2E1 og CYP3A22 mRNA hafi fundist í nýrum, var þetta magn undir einum þúsundasta af því sem var í lifur í hverri tegund (gögn ekki sýnd).

Hjá báðum svínakynjum var magn CYP2A19 og CYP3A29 mRNA minna hjá körlum en kvendýrum (tafla 1, mynd 1). Aftur á móti var magn CYP4A24/25 mRNA í báðum tegundum svína marktækt hærra hjá körlum en kvendýrum. Ennfremur, hjá Meishan svínum, var magn CYP2C33 og CYP2C49 mRNA marktækt meira hjá körlum en kvendýrum. Enginn slíkur kynjamunur á magni CYP2C33 og CYP2C49 mRNA kom fram hjá Landrace svínum. Enginn marktækur kynjamunur á magni CYP1A1, CYP1A2, CYP2B22 og CYP4B1 mRNAs kom fram hjá báðum svínategundum, þó kynjamunur á magni CYP2B22 mRNA í Meishan svínum hafi verið marktækur samkvæmt t-prófi nemenda. Ennfremur greindist CYP3A46 mRNA í báðum kynjum Landrace-svína en það var undir greiningarmörkum hjá báðum kynjum Meishan-svína.

Breed  differences  in  the  amounts  of  several  CYP mRNAs were also found. The amounts of CYP2B22 and CYP4B1 mRNAs in Landrace pigs were signifificantly higher than those  in sex-matched Meishan pigs, while those of CYP2C49 and CYP3A29  mRNAs  were the  opposite.  A  significant  breed  difference (Meishan > Landrace) in the amounts of CYP2C33 and CYP4A24/25  mRNA  was  also  observed in  males,  but  no  such  difference  was  found in  females.  Furthermore, the  breed  differences  (Landrace >Meishan) í magni CYP1A1, CYP1A2 og CYP2A19 mRNAs á milli kynþátta Landrace og Meishan svína.

Áhrif andrógen á genatjáningu dæmigerðra kyntengdra CYPs Til að skýra andrógenfíkn genatjáningar CYPs (CYP2A19, CYP2B22, CYP2C33, CYP2C49 og CYP3A29) í nýrum, voru áhrif TP-meðferðar og/eða gifsmeðferðar. skoðaðar með því að nota 5-mánaðargamla Meishan- og Landrace-svín (mynd 1). Hjá geldum karldýrum af báðum kynjum var magn CYP2A19 mRNA hærra en hjá samsvarandi ósnortnum karldýrum. Ennfremur leiddi TP meðferð á geldum karldýrum og ósnortnum kvendýrum af báðum tegundum svína til lækkunar á mRNA magni. Magn CYP2B22 og CYP3A29 mRNA jókst í gelduðum Meishan svínum, en ekki í gelduðum Landrace svínum, samanborið við samsvarandi ósnortinn karldýr. TP meðferð á geldum karldýrum og ósnortnum kvendýrum af báðum tegundum svína leiddi til minnkunar á magni þessara mRNA, þó að engin marktæk áhrif TP á CYP2B22 mRNA í gelduðu Meishan og CYP3A29 mRNA í gelduðum Landrace svínum hafi komið fram vegna mikilla milli- einstaklingsmunur.

Tafla 1. Hlutfallslegt magn af mRNA af nýrna-CYP ísóformum í 5-mánaðargömlum landkyni og meishan svínum

Mynd 1. Áhrif geldunar og/eða TP gjafar á magn CYP mRNA í 5-mánaðargamalt svínnýra

TP var sprautað í vöðva í {{0}}mánaðargamalt geldað karlkyns og ósnortið kvenkyns Landrace og Meishan svín, eins og lýst er í Efni og aðferðum. Magn hvers CYP mRNA í nýrum var ákvarðað með rauntíma RT-PCR og staðlað að RPL7 sem innri staðall. Staðlaðar ferlar voru búnar til með því að nota RT-hvarfblöndu með heildar-RNA úr nýrum 5-mánaðagamla kvenkyns Landrace-svína, að undanskildum ákvörðun á magni CYP2C49 mRNA, þar sem staðlaðar ferlar voru búnar til með því að nota RT-hvarfblöndu með heildar-RNA frá nýrum 5-mánaðagamla kvenkyns Meishan-svína. Hver dálkur táknar meðaltal hvers tilraunahóps og hver súla táknar staðalfrávik (SD) meðaltalsins (n= 6 fyrir ósnortinn karlkyns og kvenkyns Landrace og Meishan svín; n= 3 fyrir önnur). a,b Marktækur munur frá samsvarandi ósnortnum karlkyns svínum var metinn með Post hoc prófi Tukey: ap < 0.{{20}}5,="" bp="">< 0,01.="" c,d="" marktækur="" munur="" frá="" samsvarandi="" tp="" ómeðhöndluðum="" svínum,="" eins="" og="" metið="" er="" með="" t-prófi="" nemenda:="" cp="">< 0,05,="" dp="">< 0,01.="" ferningar="" í="" cyp2b22="" og="" cyp3a29="" gefa="" til="" kynna="" meishan="" og="" landrace="" svín,="" í="" sömu="" röð,="" með="">

Magn CYP2C33 mRNA minnkaði í gelduðum Meishan svínum, en ekki í gelduðum Landrace svínum, samanborið við samsvarandi ósnortna karldýr, og TP meðferð á geldum karldýrum og ósnortnum kvendýrum af báðum svínakynjum leiddi til aukningar á magni mRNA. Hjá Meishan svínum minnkaði magn CYP2C49 mRNA einnig við geldingu og TP meðferð á geldum karldýrum og ósnortnum kvendýrum leiddi til aukins magns þess. Engin slík áhrif vönunar eða TP meðferð sáust hjá Landrace svínum.

Mynd 2. Áhrif geldunar og/eða TP gjafar á magn CYP4A24/25 og CYP4B1 mRNA í nýrum og lifur 5-mánaðargamla svína

TP var sprautað í vöðva í {{{{10}}}}mánaðargamalt geldað karlkyns og ósnortið kvenkyns Landrace og Meishan svín, eins og lýst er í Efni og aðferðum. Magn hvers CYP mRNA í nýrum og lifur var ákvarðað með rauntíma RT-PCR og staðlað að RPL7 sem innri staðall. Staðlaðar línur voru búnar til með því að nota RT-hvarfblöndu með heildar-RNA frá nýrum 5-mánaðagamla kvenkyns Landrace svína. Hver dálkur táknar meðaltalið í hverjum tilraunahópi og hver súla táknar SD meðaltalsins (n= 6 fyrir ósnortinn karlkyns og kvenkyns Landrace og Meishan svín; n= 3 fyrir aðra). Marktækur munur frá samsvarandi ósnortnum karlkyns svínum var metinn með Post hoc prófi Tukey: ap < 0.01.="" b,c="" marktækur="" munur="" frá="" samsvarandi="" tp="" ómeðhöndluðum="" svínum,="" eins="" og="" metið="" er="" með="" t-prófi="" nemenda:="" bp="">< 0,05,="" cp=""><>

To date, there are no reports concerning the constitutive amounts of CYP4A24/25  and  CYP4B1 mRNAs and sex differences in their amounts in the pig liver, although a clear sex  difference  (male >kvenkyns) í magni CYP4A24/25 mRNA sést hér í svínsnýra (tafla 1). Þess vegna, til að skýra áhrif andrógen á tjáningu þessara mRNA í nýrum og lifur bæði Landrace og Meishan svína, skoðuðum við ekki aðeins áhrif geldunar heldur einnig áhrif TP meðferðar á geldum karldýrum og ósnortnum kvendýrum ( mynd 2). Magn CYP4A24/25 mRNA í nýrum minnkaði hjá bæði Landrace og Meishan svínum með geldingu og TP meðferð á gelduðum karldýrum og ósnortnum kvendýrum af báðum tegundum svína leiddi til aukins magns þess. Hins vegar, í lifur beggja svínakynja, sáust engin slík áhrif geldunar, og heldur enginn kynjamunur á magni CYP4A24/25 mRNA. Sömuleiðis sáust engin marktæk áhrif TP-meðferðar á magn CYP4A24/25 mRNA í lifur í báðum svínakynjum, þó að aukning á magni þess með TP-meðferð hafi aðeins sést hjá gelduðum karldýrum af Landrace svínum. Ennfremur sýndi CYP4B1 mRNA engan kynjamun bæði í nýrum (mynd 2 og tafla 1) og lifur fyrir hverja tegund svína. Hjá báðum svínakynjum var magn CYP4B1 mRNA ekki marktækt breytt með vönun og/eða TP meðferð (mynd 2).

Við höfum áður komist að því að TP meðferð leiddi til aukningar á magni CYP3A46 mRNA í lifur Landrace svína.22) Þess vegna voru áhrif TP meðferðar og geldingar á mRNA magn í nýrum skoðuð frekar með því að nota {{3} }mánaðargamalt landkynssvín (mynd 1). Þrátt fyrir að gelding karldýra hafi engin marktæk áhrif á magn CYP3A46 mRNA í nýrum, leiddi TP meðferð á geldingum karldýra og ósnortnum konum til minnkunar á magni CYP3A46 mRNA. Ennfremur var CYP3A46 mRNA undir greiningarmörkum bæði í nýrum og lifur allra Meishan svína sem voru meðhöndlaðir með geldingu og/eða TP.22)

Erfðafræðilegir þættir sem bera ábyrgð á kyntengdri tjáningu CYP mRNA

We have previously reported that sex-related expression of CYP mRNAs in the pig liver is, at least in part, dependent on the amount of serum testosterone,8) and  that  the  amount  is  determined  by  autosomal  dominant  inheritance.25) Therefore, using F1 progeny (LM and ML) of Landrace and Meishan pigs, the amounts of sex-related CYP mRNAs in the kidney were measured (Fig. 3). Incidentally, the amounts of serum testosterone in 5-month-old male LM and ML pigs, as well as Meishan pigs, were >40 ng/ml, og þau í 5-mánaða gömlum karlkyns Landrace svínum voru<23 ng>

In both LM and ML pigs, the mRNA amounts of CYP2A19, CYP2B22, and CYP3A29 in males were much lower than those in  females,  while  the  converse  was  observed  for  CYP2C33 and CYP4A24/25.  For CYP2C49 mRNA,  a  significant  sex  difference (males >kvendýr) sást hjá ML svínum, en enginn marktækur munur sást hjá LM svínum vegna talsverðs munar á milli einstaklinga á LM svínum karlkyns. CYP3A46 mRNA greindist í LM og ML svínum, sem og Landrace svínum, og kynjamunur (karldýr< females)="" in="" the="" amount="" of="" cyp3a46 mrna was observed in lm and ml pigs ="">

Mynd 3. Kynjamunur á magni CYP mRNA í nýrum 5-mánaðargamla LM og ML svína

MRNA magn hvers CYP í nýrum var ákvarðað með rauntíma RT-PCR og staðlað að RPL7 sem innri staðall. Staðlaðar kúrfur voru búnar til með því að nota RT-hvarfblöndu með heildar-RNA úr nýrum 5-mánaðagamla kvenkyns Landrace-svína, fyrir utan ákvörðun á magni CYP2C49 mRNA, þar sem staðlaðar ferlar voru búnar til með því að nota RT-hvarf. blöndu með heildar-RNA úr nýrum 5-mánaðagamla kvenkyns Meishan-svína. Hver hringur sýnir einstakan svín (n= 6 og 9 fyrir karlkyns og kvenkyns LM svín, í sömu röð; n= 7 og 10 fyrir karlkyns og kvenkyns ML svín, í sömu röð). Súlan sýnir meðaltalið í hverjum hópi. a,b Marktækur munur á karldýrum og kvendýrum í hverri tegund var metinn með t-prófi nemenda: ap < 0.05,="" bp=""><>

Tengsl milli magns testósteróns í sermi og tjáningar kyntengdra CYP mRNA í nýrum

Styrkur andrógen í sermi er talinn vera einn af mikilvægu þáttunum sem valda mismun á kyni og kyni á magni nokkurra CYP mRNAs í nýrum svína. Þess vegna var sambandið á milli andrógenstyrks í sermi og kyntengdrar tjáningar CYP mRNA (CYP2A19, CYP2B22, CYP2C33, CYP2C49, CYP3A29, CYP3A46 og CYP4A24/25) í nýrum rannsakað frekar með því að nota, 1- {17}} og 5-mánaðagömul svín. Sum 1-mánaðargömlu svínanna (óþroskuð,< 10 ng  testosterone/ml ="" serum) ="" were ="" treated ="" with ="" tp="" and="" used="" as="" samples="" for="" the="" present="" experiments.="" the="" concentrations="" of="" serum="" testosterone="" in="" the="" tp-treated="" pigs="" were ="" 28–59 ng/ml. ="" in ="" addition, ="" serum ="" testosterone ="" amount ="" increased="" in="" an="" age-dependent="" manner="" in="" males25) ="" but ="" not ="" in ="" females="" of="" all="" the="" pigs=""><7 ng  testosterone/ml ="" serum) ="" used. ="" therefore,="" as="" representative="" samples="" of="" females,="" 1-month-old="" and ="" 5-month-old ="" pigs ="" but ="" not ="" 3-month-old ="" pigs ="" were ="" used ="" for ="" the="" present="">

The mRNA amounts of CYP2A19, CYP2B22, CYP3A29, and CYP3A46 in all the pigs with high concentrations (>ca. 30 ng/ml) af testósteróni í sermi voru lág samanborið við þau hjá öllum svínum með lága þéttni testósteróns í sermi (<30 ng l). ="" in ="" particular, ="" the ="" amount ="" of ="" cyp3a29="" mrna="" decreased="" in="" a="" serum="" testosterone="" concentration-dependent ="" manner ="" in ="" all ="" the ="" breeds ="" of ="" pig ="" examined ="" (fig. ="" 4). ="" furthermore,="" a="" serum="" testosterone="" concentration-dependent="" decrease="" in="" the="" amount="" of="" cyp3a46 mrna was also observed ="" in="" all="" the="" pigs="" except="" meishan="">

Magn CYP2C33 og CYP4A24/25 mRNAs jókst hins vegar í sermisþéttni testósteróns í öllum tegundum svína sem voru skoðaðar (mynd 5). Magn CYP2C49 mRNA jókst í sermi testósterónþéttni háð hátt í Meishan, LM og ML svínum en ekki í Landrace svínum. Að auki sást lítil aukning á magni CYP2C49 mRNA hjá 1-mánaðargömlum Landrace og Meishan svínum sem fengu TP meðferð. Þetta bendir til þess að tjáning slíkra TP-tengdra áhrifa sé háð tjáningarstigi TP-svarandi umritunarþátta fyrir CYP2C49 genatjáningu, sem tekur þátt í þroska.

UMRÆÐA

Í þessari rannsókn fundum við upphaflega kynja- og kynmun á magni nokkurra CYP mRNAs í nýrum með því að nota 5-mánaðargamla Landrace og Meishan svín og F1 (LM og ML) afkvæmi þeirra. Í kjölfarið, til að skýra áhrif andrógens á magn CYP mRNAs í nýrum, skoðuðum við áhrif geldunar og/eða TP meðferðar á þetta magn. Þessar niðurstöður eru teknar saman í töflu 2. Með því að greina slíkan kynja- og kynjamun í tengslum við styrk testósteróns í sermi sýndum við hér fram á að testósterón í sermi er að minnsta kosti einn af mikilvægu þáttunum sem valda þessum mun á magni hvers CYP mRNA í nýru.

Mynd 4. Neikvæð fylgni milli sermisþéttni testósteróns og magns CYP2A19, CYP2B22, CYP3A29 og CYP3A46 mRNA í svínsnýrum

Styrkur testósteróns í sermi og magn CYP mRNA var mældur eins og lýst er í Efni og aðferðum. Sumt af sermisþéttni testósteróns einstakra svína var tekin úr áður fengin gögn.24,25) Hvert tákn táknar hvert einstakt svín. Opnir ferninga og munnsogstöflur, 1-mánaðargamalt karlkyns og kvendýr, í sömu röð, af landkyns- og meishan-svínum (n= 3 fyrir bæði kyn landkyns og meishan-svína); gráa ferninga, 3-mánaðargamalt karlkyns Landrace og Meishan svín (n= 4 fyrir Landrace svín og n= 6 fyrir Meishan svín); lokuð ferningur og munnsogstöflur, 5-mánaðargamalt karlkyns og kvendýr, í sömu röð, af landkyns- og meishan-svínum (n= 6 fyrir bæði kyn landkyns og meishan-svína); lokaðir og opnir þríhyrningar, 5-mánaðargamalt karlkyns og kvenkyns LM svín, í sömu röð (n= 6 fyrir karldýr og n= 9 fyrir kvendýr); lokaðir og opnir öfugir þríhyrningar, 5-mánaðargamalt karlkyns og kvenkyns ML svín, í sömu röð (n= 7 fyrir karldýr og n= 10 fyrir kvendýr); lokaðir og opnir hringir, 1-mánaðargömul karlkyns og kvenkyns Landrace og Meishan svín sem meðhöndlaðir eru með TP, í sömu röð (n= 3 fyrir bæði kyn Landrace og Meishan svín). Fylgnin voru skoðuð með gögnum frá öllum dýrunum sem prófuð voru og ákvörðuð með aðhvarfsgreiningu, þar sem r er fylgnistuðullinn.

Við fundum áður kynjamun (karl< female)="" in="" the="" amounts="" of="" cyp1a1="" and="" cyp1a2="" mrnas="" in="" the="" liver="" of="" meishan, lm, and ml pigs but not in landrace pigs.23–25) however, ="" no ="" such ="" sex ="" differences were ="" observed in the ="" kidney ="" of landrace="" and="" meishan="" pigs.="" on="" the="" contrary,="" there="" was="" a="" sex="" difference="" (male="" >="" female)="" in="" the="" amount="" of="" cyp4a24/25="" mrna="" in ="" the ="" kidney ="" but ="" not ="" in ="" the ="" liver. ="" sex ="" differences ="" in ="" the ="" amounts="" of="" cyp2a19,="" cyp2c33,="" and="" cyp2c49="" mrnas="" in="" the="" pig="" kidney,="" especially="" in="" meishan,="" lm,="" and="" ml="" pigs,="" correlated="" with="" the="" previous="" results="" in="" the="">< female="" for="" cyp2a19;="" male="" >="" female="" for="" cyp2c33="" and="" cyp2c49.="" interestingly, ="" sex ="" differences ="">< female)="" in="" the="" amounts="" of="" cyp2b22,="" cyp3a29, and/or cyp3a46="" mrnas="" in="" the="" kidney="" of="" meishan,="" lm,="" and="" ml="" pigs="" were="" the="" opposite="" of="" that="" previously obtained in the liver.22) sex differences in the amount of ="" cyp2a19,="" cyp3a29,="" and="" cyp4a24/25 ="" mrnas ="" were ="" observed ="" in the kidney of all the breeds of pig examined. although ="" sex ="" differences ="" in cyp2b22,="" cyp2c33, ="" and/or cyp2c49 ="" were ="" observed in meishan, lm, ="" and ml ="" pigs, ="" no ="" such ="" sex ="" differences ="">

Tafla 2. Yfirlit yfir andrógenháð kyni og tegundamun á genatjáningu CYP ísóforma í svínsnýrum

These  sex  and  breed  differences  can  be  explained  by  the  differences  in  the  concentration  of  serum  testosterone  in  male pigs. Male 5-month-old Meishan, LM, and ML pigs had high concentrations of serum testosterone (>ca. 40 ng/ml) á meðan þau af Landrace svínum höfðu lágan styrk (<23 ng l). ="" because ="" the ="" amount ="" of ="" cyp2a19="" and="" cyp3a29 ="" mrnas ="" considerably ="" decreased ="" in ="" pigs ="" with ="">ca. 20 ng/ml af testósteróni í sermi, kynjamunur (karl< female)  in ="" their ="" amounts ="" were ="" observed ="" in ="" all ="" the ="" breeds ="" of ="" pig. ="" likewise, ="" since ="" the ="" amount ="" of ="" cyp4a24/25="" mrna="" increased="" in="" a="" serum="" testosterone="" concentration-dependent manner up to 80 ng/ml, a sex difference (male =""> female) was observed in all the breeds of pig. However, because  clear changes in the amount of CYP2B22, CYP2C33, and CYP2C49 mRNAs occurred at >30 ng/mL af sermi testósteróni, kynjamunur á magni þeirra sást hjá Meishan, LM og ML svínum en ekki hjá Landrace svínum. Samkvæmt því er talið að slíkur kynja- og kynjamunur sé háður styrk testósteróns í sermi. Þessi tilgáta er enn frekar studd af tilraununum með því að nota geldað og/eða TP-meðhöndlaða svín. Þ.e.a.s. magn þessara mRNA í geldingum karldýra (<12 ng  testosterone/ml ="" in ="" serum) ="" were ="" almost ="" the="" same="" as="" the="" corresponding="" females.="" serum="" concentrations="" of="" testosterone="" in="" 5-month-old="" castrated="" males="" and="" intact="" females="" rose="" to="">100 ng/ml á TP meðferð. Þar af leiðandi jókst magn af CYP2C33 og CYP4A24/25 mRNA, CYP2C33 og CYP4A24/25 mRNA eins mikið og eða hærra hjá TP-meðhöndluðum svínum en hjá 5-mánaðargömlum karlkyns Meishan svínum, og magn af CYP2B22, CYP3A29 og CYP3A46 mRNA minnkuðu jafn mikið og hjá samsvarandi karlkyns svínum.

Munur á seytingarsniði vaxtarhormóns (GH) milli karlkyns og kvendýra hjá mörgum dýrum, sérstaklega hjá nagdýrum, er talinn leiða til kynjamismunar á magni nokkurra lyfjaumbrotsensíma, þar á meðal CYP, í lifur.26) Til dæmis er kynjamunur á mRNA magni Ugh, Sult og Cyp4a ísóforma í músalifur undir áhrifum frá karlkyns GH seytingu og/eða andrógeni, en þeim kynjamun er fyrst og fremst stjórnað af andrógeni í nýrum.21,27 ,28) Ennfremur er lagt til að umskiptastaður, nefndur GH-háð kúgun (GDR), stýra geninu fyrir kvenkyns sértæka stera 15 -hýdroxýlasa (Cyp2a4) í músalifur,29) en greint er frá þessu geni að vera gagnkvæmt stjórnað af andrógeni í lifur og nýrum karlmúsa.30) Aftur á móti höfum við áður komist að því að hjá Landrace svínum með kynjamun á GH seytingarsniði,31) var enginn kynmunur á mRNA magni í lifur af nokkur CYP, SULT og UGT ísóform sem sýna þó kynjamun hjá Meishan svínum.22–25,32) Því er talið að slíkur kynjamunur hjá svínum sé aðallega háður mun á styrk testósteróns í sermi. Hins vegar, vegna þess að seytingarsnið GH er breytt af andrógeni, 33–35) er möguleikinn á að breytingar á mRNA magni sem sjást við geldingu og/eða TP gjöf eiga sér stað, að minnsta kosti að hluta, með andrógenmiðluðum breytingum á GH. Ekki er hægt að útiloka seytingarmynstur.

Breed  differences  in  amounts  of  the  mRNAs  of  CYP1A1, CYP1A2, CYP2A19, CYP2B22, and CYP4B1  between  sex-matched  Landrace  and  Meishan  pigs  were  also  observed  in  the  kidney  (Table  1),  while  no  such  clear  breed  differences  were  observed  in  the  liver.22,25) Additionally, as for CYP2C49 mRNA,  individual  differences  in  each  breed  of  pig  were  observed  regardless  of  serum  testosterone  concentration,  suggesting that these varieties have genetic diversity. Incidentally, pig  breeds  are  not  genetically  homogeneous.  Interestingly,  CYP3A46 mRNA was  clearly  detected in  both the  kidney  and  the liver of Landrace pigs but was below the detection limit in  both organs of Meishan pigs.22) Furthermore, CYP3A46 mRNA was  clearly  detected  in  both  the  kidney  and  the  liver  of  LM  and ML pigs, indicating that expression of CYP3A46 mRNA, as well as serum testosterone,25)  is  determined  by  autosomal  dominant inheritance. Because 5-month-old male LM and ML pigs, but not Landrace pigs, had high concentrations of serum  testosterone (>40 ng/ml), sást kynjamunur á magni CYP3A46 mRNA hjá LM og ML svínum en ekki hjá Landrace svínum. Þessar niðurstöður benda eindregið til þess að erfðafræðilegir (kyn) og vefjasértækir þættir, ásamt testósteróni í sermi, eigi þátt í kyn- og kyntengdu tjáningarstigi nokkurra CYP gena. Því miður eru þessir þættir enn óljósir.

Að lokum sýnum við hér að það er kynja- og kynmunur á mRNA magni CYP2, CYP3 og CYP4 fjölskyldu ísóforma í svínanýrum og benda eindregið til þess að sá munur sé háður erfðafræðilegum hýsilþáttum, þar á meðal styrk andrógena í sermi. . Ennfremur sýnum við vefjamun á nýrum og lifur í kyni/andrógentengdri tjáningu CYP gena og bendir eindregið til þess að það sé vefjasértækur þáttur sem ber ábyrgð á andrógentengdri tjáningu CYP gena. Rannsóknir til að bera kennsl á kyntengda erfðafræðilega hýsilþáttinn og vefjasértæka þáttinn sem ber ábyrgð á stjórnun CYP genanna er nauðsynlegur í framtíðinni. Í öllum tilvikum, þar sem andrógen er einn af hýsilþáttunum sem ákvarða tjáningarstig nokkurra CYP sem bera ábyrgð á umbrotum lyfja, er mæling á styrk testósteróns í sermi talin stuðla að þróun viðeigandi lyfjameðferðar.

Viðurkenningar

Þessi vinna var að hluta styrkt af styrkjum til vísindarannsókna frá Japan Society for the Promotion of Science (nr. 19K06463, MK). Höfundarnir þakka Tsukuba Operation Unit 7, Technical Support Center of Central Region, NARO, Tsukuba, Japan fyrir umönnun dýra og fyrir að safna vefjum.

HEIMILDIR

1) Almazroo OA, Miah MK, Venkataramanan R. Umbrot lyfja í lifur. Clin. Liver Dis., 21, 1–20 (2017).

2) Nebert DW, Wikvall K, Miller WL. Cýtókróm manna P450 í heilsu og sjúkdómum. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci., 368, 20120431 (2013).

3) Burkina V, Rasmussen MK, Pilipenko N, Zamaratskaia G. Samanburður á cýtókróm P450 sem umbrotnar útlendingalyf úr mönnum, svínum, nagdýrum og fiskum. Eiturefnafræði, 375, 10–27 (2017).

4) Nielsen SD, Bauhaus Y, Zamaratskaia G, Junqueira MA, Blaabjreg K, Petrat-Melin B, Young JF, Rasmussen MK. Stofnandi tjáning og virkni cýtókróm P450 í hefðbundnum svínum. Res. Dýralæknir. Sci., 111, 75–80 (2017).

5) Puccinelli E, Gervasi PG, Longo V. Xenobitotic umbrot cýtókróm P450 í svínum, efnilegt dýralíkan. Curr. Drug Metab., 12, 507–525 (2011).

6) Schelstraete W, Clerck LD, Govaert E, Millecam J, Devreese M, Deforce D, Bocxlaer JV, Croubels S. Lýsing á CYP450 sem umbrotnar lyf í lifur og þörmum: samanburður við rétttrúnaðarmenn úr mönnum frá magnfræðilegu, virkni og sértækni. Sci. Rep., 9, 9233 (2019).

7) Skaanild MT. Svínsýtókróm P450 og umbrot. Curr. Pharm. Des., 12, 1421–1427 (2006).

8) Kojima M. Mismunur á kyni og kyni í myndandi genatjáningu á lifrarlyfjaumbrotsenímum í Meishan og Landrace svínum: Testósterónmiðlaður munur. Jpn. Agric. Res. Q., 54, 7–12 (2020).

9) Bajaj P, Chowdhury SK, Yucha R, Kelly EJ, Xiao G. Nýrnalíkön til að rannsaka efnaskipti, flutning og eiturverkanir lyfja og útlendingalyfja. Drug Metab. Dispos., 46, 1692–1702 (2018).

10) Knights KM, Rowland A, Miners JO. Umbrot lyfja í nýrum hjá mönnum: möguleiki á milliverkunum lyfja og lífvera sem fela í sér cýtókróm P450 (CYP) og UDP-glúkúrónósýltransferasa (UGT). Br. J. Clin. Pharmacol., 76, 587–602 (2013).

11) Kojima M, Morozumi T. Klónun sex cDNA í fullri lengd sem kóða svínsýtókróm P450 ensím og genatjáning þessara ensíma í lifur og nýrum. J. Health Sci., 50, 518–529 (2004).

12) Lundell K. Klónun og tjáning tveggja nýrra svínalifrar og nýrna fitusýruhýdroxýlasa [sýtókróm P450 (CYP)4A24 og CYP4A25]. Biochem. J., 363, 297–303 (2002).

13) Nannelli A, Chirulli V, Longo V, Gervasi PG. Tjáning og örvun með rifampicíni á CAR- og PXR-stýrðum CYP2B og CYP3A í lifur, nýrum og öndunarvegi svínsins. Toxicology, 252, 105– 112 (2008).

14) Puccinelli E, Gervasi PG, La Marca M, Buffy P, Longo V. Tjáning og örvun með phenobarbital á CYP2C33, CYP2C42, CYP2C49, CYP2B22 og CYP3As í lifur, nýrum og smáþörmum í svína. Xenobiotica, 40, 525-535 (2010).

15) Shang H, Guo K, Liu Y, Yang J, Wei H. Stofnandi tjáning CYP3A mRNA í Bama smækkaðri svínvef. Gene, 524, 261–267 (2013).

16) Imaoka S, Hiroi T, Tamura Y, Yamazaki H, Shimada T, Komori M, Degawa M, Funai Y. Stökkbreytandi virkjun á 3-metoxý-4-amínóazóbensen með nýrnasýtókróm P450 í músum CYP4B1: Klónun og einkenni músa CYP4B1. Arch. Biochem. Biophys., 321, 255-262 (1995).

17) Jarrar YB, Lee SJ. Sameindavirkni cýtókróm P450 4 (CYP4) erfðafræðilegrar fjölbreytni og klínískar afleiðingar þeirra. Alþj. J. Mol. Sci., 20, 4274 (2019).

18) Hiratsuka M, Matsuura T, Watanabe E, Sato M, Suzuki Y. Kynjamunur á samsettu magni laurínsýruhýdroxýlasa í nýrum og CYP4A tengdum próteinum í músum. Biol. Pharm. Bull., 19, 512-517 (1996).

19) Degawa M, Miura S, Hashimoto Y. Andrógenháð nýrnamíkrósomal cýtókróm P-450 sem ber ábyrgð á N-hýdroxýleringu og stökkbreytandi virkjun á 3-metoxý-4-amínóazóbenseni í BALB/c mús. Cancer Res., 50, 2729–2733 (1990).

20) Isern J, Meseguer A. Hormónastjórnun og lýsing á Cyp4b1 geninu 5'-hliðarsvæði músarinnar. Biochem. Lífeðlisfræði. Res. Commun., 307, 139–147 (2003).

21) Zhang Y, Klaassen CD. Hormónastjórnun Cyp4a ísóforma í lifur og nýrum músa. Xenobiotica, 43, 1055-1063 (2013).

22) Kojima M, Degawa M. Kynjamunur á mRNA-gildum CYP2B22, CYP2C33, CYP2C49, CYP3A22, CYP3A29 og CYP3A46 í svínalifri: Samanburður á milli Meishan- og Landrace-svína. Drug Metab. Pharmacokinet., 31, 185–192 (2016).

23) Kojima M, Sekimoto M, Degawa M. Nýr kynbundinn munur á myndandi tjáningu lifrar cýtókróm P4501A undirfjölskylduensíma í Meishan svínum. Biochem. Pharmacol., 75, 1076–1082 (2008).

24) Kojima M, Sekimoto M, Degawa M. Andrógenmiðluð niðurstýring á CYP1A undirættargenum í svínalifrinni. J. Endocrinol., 207, 203–211 (2010).

25) Kojima M, Degawa M. Andrógenmagn í sermi ræðst af sjálfsfrumna ríkjandi erfðum og stjórnar kyntengdum CYP genum í svínum. Biochem. Lífeðlisfræði. Res. Commun., 430, 833–838 (2013).

26) Waxman DJ, Holloway MG. Kynjamunur á tjáningu lyfja sem umbrotnar ensím í lifur. Mol. Pharmacol., 76, 215–228 (2009).

27) Buckley DB, Klaassen CD. Vélbúnaður kynskiptrar UDP glúkúrónósýltransferasa mRNA tjáningar í lifur og nýrum músa. Drug Metab. Dispos., 37, 834–840 (2009).

28) Alnouti Y, Klaassen CD. Verkfæri kynbundinnar stjórnun á súlfótransferasa músa (Sults). Xenobiotica, 41, 187–197 (2011).

29) Aida K, Negishi M. Trans-virkandi staðsetning stjórnar umritunarbælingu kvenkyns sértæka stera 15 -hýdroxýlasa gensins í karlkyns músum. J. Mol. Endocrinol., 11, 213-222 (1993).

30) Squires EJ, Negishi M. Gagnkvæm stjórnun á kynháðri bælingu testósteróns 15 -hýdroxýlasa (P-45015) í lifur og nýrum karlkyns músa með andrógeni. Vísbendingar um eitt gen. J. Biol. Chem., 263, 4166-4171 (1988).

31) Arbona JR, Marple DN, Russell RW, Rahe CH, Mulvaney DR, Sartin JL. Seytingarmynstur og efnaskiptaúthreinsunarhraði vaxtarhormóns svína í svínum sem eru valin til vaxtar. J. Anim. Sci., 66, 3068-3072 (1988).

32) Kojima M, Degawa M. Kynmismunur á myndandi genatjáningu súlfótransferasa og UDP-glúkúrónósýltransferasa í svínalifrinni: Andrógenmiðluð stjórnun. Drug Metab. Pharmacokinet., 29, 192–197 (2014).

33) Chowen JA, Frago LM, Argente J. Stjórnun á seytingu GH með kynsterum. Eur. J. Endocrinol., 151 (fylgi 3), U95–U100 (2004).

34) Dubreuil P, Pelletier P, Couture Y, Lapierre H, Petitclerc D, Moris set J, Gaudreau P, Brazeau P. Áhrif á geldingu og testósterón á innræna og sómatókrínín-framkallaða losun vaxtarhormóns í ósnortnum og geldum karlsvínum. Innlent. Anim. Endocrinol., 6, 15-24 (1989).

35) Giustina A, Veldhuis JD. Meinalífeðlisfræði taugastjórnunar seytingar vaxtarhormóns í tilraunadýrum og mönnum. Endocr. Rev., 19, 717–797 (1998).