Wen-Lan Li, Jing-Xin Ding, Jing Bai, Yang Hu, Hui Song, Xiang-Ming Sun, Yu-Bin Ji

Fyrir frekari upplýsingar vinsamlega hafið samband við:Joanna.jia@wecistanche.com

Ágrip

LC Technology er viðurkennd aðferð sem notuð er um allan heim til að meta gæði hefðbundinna kínverskra lyfja (TCM). Gæði TCM hafa bein áhrif á virkni þess. Þess vegna, til að sýna rækilega hvernig TCM beitir virkni sinni, er fyrst og fremst nauðsynlegt að skilja efnislegan grundvöll virkni þess og síðan að stjórna gæðum virkra efnasambanda. Notkun litrófs-áhrifatengslaaðferðarinnar skiptir sköpum til að ákvarða grunn lyfjafræðilegs efnis. Markmið þessarar greinar var að kanna undirliggjandi fylgni milli efnafræðilegra sniða og estrógenvirkniCistanche, til að sýna virku efnasamböndin. Efnasniðin afCistanchevoru skráðar með HPLC/Q-TOF-MS/MS og estrógenvirkni var ákvörðuð með legvaxtarprófi og MTT prófi. Þegar niðurstöður tvíþáttagreiningar, aðalþáttagreiningar og grár fylgnigreiningaraðferð voru sameinuð, voru fimmtán virk efnasambönd auðkennd. Þau eru 8-epiloganic acid, salidroside, syringalide A 3'- -l-rhamnopyranoside, cistanoside A, echinacoside, cistanoside F, cistanoside B, cistanoside C, osmanthuside B, acteoside, isoacteoside, tubuloside B, 2 '-asetýlakteósíð, og tvö óþekkt efnasambönd. Þessi rannsókn leggur grunn að in vivo rannsóknum áCistanche, og fyrir þróun klínískrar notkunar þess.

Cistanchetubulosa

Leitarorð:Cistanchedeserticola; LC/Q-TOF-MS; estrógenvirkni; Aðalhlutagreining (PCA); Legvaxtarpróf.

Skammstafanir

TCM: Hefðbundin kínversk læknisfræði

HPLC/Q-TOF-MS: hágæða vökvaskiljun/fjórpóla flugtímamassagreiningu

BA: tvíþáttagreining

PCA: aðalþáttagreining

GCAM: grá fylgnigreiningaraðferð

MTT :Trypsín, 3-(4, 5-dímetýlþíasól-2-ýl)-2, 5-dífenýltetrasólíumbrómíð

DMSO: dímetýl súlfoxíð

RPMI1640 Roswell Park Memorial Institute 1640

1. Inngangur

Nýlega hefur TCM orðið sífellt vinsælli í Asíu og Vesturlöndum vegna stöðugra lækningaáhrifa og lítillar eiturverkana á heilsugæslustöðinni. Þar af leiðandi er nauðsynlegt að þróa nýjar tegundir TCM og skilja áhrifaríkar samsetningar sem notaðar eru við klíníska notkun þeirra [1-6].

Í fyrsta lagi er litrófs-áhrif sambandið rannsakað til að greina fylgni milli litskiljunarfingrafara og lyfjafræðilegrar virkni. Notaðu síðan sambandið til að leita að áhrifaríkum íhlutum í TCM og til að móta eftirlitsstaðla til að endurspegla innri gæði þeirra. Sambandi litrófs og áhrifa hefur verið beitt á mörgum sviðum TCM rannsókna, svo sem efnisgrunni eins og samsettrar TCM, samhæfni íhluta, vinnslukerfi, lyfjafræðileg áhrifaspá og tæknihagræðingu [7-12]. Litróf-áhrif sambandið er notað til að setja fram nýjar hugmyndir og aðferðir til að kanna virk efni, fínstilla formúlur, bæta undirbúningsferla, rekja og aðgreina markefni og til að þróa ný TCM lyf [13-17].

Cistanchehefur verið mikið notað til að meðhöndla kynlífsvandamál, hægðatregðu, blöðruhálskirtilsbólgu og nýrnaskort. Það hefur breitt svið lífvirkni, þar á meðal estrógenáhrif, öldrun gegn öldrun, andoxun og ónæmisvirkni [18-19]. Almennt var litið á fenýletanóíð glýkósíð (eins og cistanoside A, tubuloside A), lignans og iridoid glýkósíð sem lyfjafræðilega innihaldsefni og efnamerki fyrir gæðaeftirlit með Cistanche og vörum þess [20-21]. Efnafræðileg litróf Cistanche frá mismunandi svæðum voru skráð með High-performance vökvaskiljun (HPLC) [22-23]. Í þessari rannsókn veljum við legvaxtarpróf og MCF7 frumufjölgunarpróf til að meta estrógenvirkni þeirra. Aðalþáttagreining, tvíþáttagreining og gráfylgnigreiningaraðferðir voru notaðar til að tengja estrógenvirkni við einstaka þætti. Þessi rannsókn miðar að því að bera kennsl á lífvirk efnasambönd Cistanche sem bera ábyrgð á estrógenáhrifum in vivo. Rannsóknin leggur grunn að ítarlegum rannsóknum á Cistanche.

Allar tilraunaaðferðir voru skoðaðar og samþykktar af dýrasiðanefnd við Harbin háskólann.

Cistanchedeserticola (cd-20120227-005) var keypt af lyfjamarkaði og auðkennd af prófessor Zhang Delian (Harbin University of Commerce). Diethylstilbestrol var keypt frá HEFEI JIULIAN PHARMACEUTICAL CO., LTD. RPMI1640 og RPMI1640 án fenólrauðs voru keyptir frá HyClone Company (Bandaríkjunum). MTT og DMSO voru öll keypt frá Sigma-Aldrich Co. LLC (St Louis, Bandaríkjunum). MCF7 frumulínan fyrir brjóstakrabbamein í mönnum var veitt af Rannsóknamiðstöð lífvísinda og umhverfisvísinda (Harbin University of Commerce). Staðlarnir sem notaðir voru voru sem hér segir: acteoside (111530- 200505), echinacoside (111670-200503) og salidroside (110736-200628) voru fengin frá National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products (Peking). , Kína). Asetónítríl, metanól og maurasýra voru af MS-gráðu en vatn var ofurhreint. Önnur hvarfefni voru af greiningargráðu og voru fáanleg í verslun.

2 Tilraunaaðferð

2.1 Efni

Agilent 1290 HPLC kerfi, Agilent 6530 Series Quadrupole Time-of-Flight LC/MS (Q-TOF) kerfi og Chemical HPLC-3D vinnustöðvar voru notaðar fyrir greiningarefnafræðilegar tilraunir og gagnavinnslu. Milli-Q ofurhreint vatn var notað við gerð sýna og staðla. Önnur hljóðfæri voru rafrænt Analytical Balance AR1140 (Ohaus International Ltd), 680 Microplate Reader (Bio-Rad Corporation) og 64R háhraða miðflótta (Beckman Coulter Allegra).

Óþroskaðir kvenkyns Kunming mýs (um 21 d. frá fæðingu, vanin) sem vógu (12 ± 2) g, voru keyptar frá Changchun National Biological Industry Base Laboratory Animal Center (Changchun, Kína). Mýsnar voru geymdar í hitastýrðu herbergi (22 ± 2 gráður) með óheftan aðgang að mat og vatni. Dýratilraunir voru hafnar eftir fimm daga aðlögun. Mýsnar voru fastar yfir nótt með frjálsan aðgang að vatni áður en próflausnirnar voru gefnar. Þessi rannsókn var framkvæmd í ströngu samræmi við ráðleggingar í leiðbeiningum um umönnun og notkun tilraunadýra frá Heilbrigðisstofnuninni.

2.2 Undirbúningur sýnislausnarinnar

Cistanchesýnum var safnað úr tíu fjölbreyttum búsvæðum, þ.e. Neimeng, Xinjiang, Ningxia, Guizhou, Chaidamu, Xizang, Alashan, Qinghai, Sichuan og Hubei héraði.

Lausnin (1.0 g/ml) afCistanchesýni var útbúið í eimuðu vatni til inntöku. Styrkur diethylstilboestrols var 20ug/ml og var notaður sem jákvæða samanburðarlausn. Lausnin (1,0 g/mL) af Cistanche sýninu var útbúin í 50 prósent asetónítríl. Acteosíð, echinacoside og salidroside (2,0 mg hvor) voru leyst upp í 10 ml af 50 prósenta asetónítríllausn. Bæði sýni og staðallausnir voru síaðar með 0.45-μm síu fyrir greiningu.

2.3 LC-MS aðstæður

Waters Symmetry Shield RP18 (3,9 mm×150 mm, 5μm; Waters Corporation, Milford, MA, USA) var notað til að greina sýnin. Hreyfanlegur fasi samanstóð af asetónítríl (A) og 0,2 prósent (v/v) maurasýru vatnslausn (B) og var dælt með flæðihraða 0,5 ml/mín. Inndælingarrúmmál hvers sýnis var 10 μL. Gradient eluation program var sem hér segir: Farsímastig A var hafið við 5 prósent og jókst línulega í 23 prósent eftir 35 mín. Lausn A var síðan aukin í 25 prósent (35 til 65 mín). Hreyfanlegur fasi A var síðan lækkaður í 5 prósent síðustu 5 mínútur hlaupsins (65 til 70 mínútur). Súluhitanum var haldið við 30 gráður. Fylgst var með litskiljunum við 254 nm. Atómgasþrýstingurinn var 30 psi og háræðaspennan var 3,5 kV. Rennsli þurrgassins var stillt á 8 l/mín með 30 gráðu hita. Massarófin voru skráð innan skannasviðsins 100- 3,000 Da og voru í neikvæðu jónaskönnunarham.

2.4 Fingrafaramat

LC fingraför af sýnunum sem safnað var úr 10 mismunandi lotum voru stofnuð og pöruð sjálfkrafa með því að nota Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingrafar of TCM (útgáfa 2012; China Pharmacopoeia Committee, Peking, Kína). Ennfremur var viðmiðunarskiljukortið búið til með miðgildisaðferðinni. Að auki var klasagreiningu beitt til að meta gæði sýna úr tíu fjölbreyttum búsvæðum.

2.5 Aðalhlutagreining (PCA)

PCA er fjölþátta tölfræðileg aðferð. Það getur haldið nægilegum upplýsingum frá gagnaöfluninni. Í þessari rannsókn voru einkennandi toppar úr LC litskiljum skimaðir frekar með PCA og miðuðu að því að bera kennsl á virk efnasambönd byggð á litrófs-áhrifasambandinu.

2.6 Legvaxtarpróf

Músunum var skipt í 12 hópa (10 í hverjum hóp). Sýnalausnunum sem voru útbúnar úr Cistanche var safnað frá tíu fjölbreyttum búsvæðum og voru gefnar tvisvar á dag (morgun og kvöld) með magaslöngu í 30 g/kg líkamsþyngdarskammti í fjóra daga. Eyðu- og jákvæðu samanburðarhóparnir samanstanda af jöfnu magni af eimuðu vatni og díetýlstilbóestróllausn og voru gefnir tvisvar á dag í fjóra daga. Á fimmta degi voru blóðsýnin sem innihéldu lyf tekin úr svæfðu músunum. Sýnin voru skilin í skilvindu (5, 000 snúninga á mínútu, 10 mín) og flotið (sermissýni sem innihalda lyf) voru aðskilin. Sermissýnin sem innihéldu lyf voru óvirkjuð með því að hita við 56 gráður í vatnsbaði í 30 mínútur og voru síuð í gegnum 0.22-μm síu fyrir MTT prófunina. Samhliða var legi músanna strax skorið út og vigtað til að reikna út legþyngdarvísitölur. Dýratilraunin var hafin eftir fimm daga aðlögun. Mýsnar hafa fastað yfir nótt með frjálsan aðgang að vatni áður en próflausnirnar eru gefnar. Þessi rannsókn var framkvæmd í ströngu samræmi við ráðleggingar í Leiðbeiningar um umönnun og notkun tilraunadýra frá Heilbrigðisstofnuninni. Allar tilraunaaðferðir voru skoðaðar og samþykktar af dýrasiðanefnd við Harbin háskólann. Allar hugsanlegar streituvaldandi aðgerðir voru gerðar undir natríumpentóbarbital svæfingu.

2.7 MTT próf

MCF7 frumur voru samræktaðar með RPMI 1640 án fenólrauðs (inniheldur 5 prósent CDT-FBS) í fjóra daga. Frumunum var sáð í 96-brunnsplötur með þéttleikanum 2,000 frumur/holu. Viðloðandi ræktun náðist og eftir 72 klst. ræktun voru frumurnar samræktaðar í RPMI 1640 miðli sem innihélt sermisýni úr Cistanche-meðhöndluðum músum. Tilraunirnar voru gerðar í sex eintökum. Í kjölfarið var 20 μL af MTT lausn (5 mg/ml í PBS) bætt í hvern brunn og frumurnar ræktaðar í 4 klst. Eftir að miðillinn var fjarlægður var 150 µL af DMSO bætt við til að framleiða formazan afurðina og plöturnar voru hristar í myrkri til að leysast alveg upp. Gleypið var mælt við 570 nm með því að nota Microplate Reader. Útbreiðsluhraði var reiknaður út sem meðalgleypnigildi sermishópsins sem inniheldur lyf deilt með meðalgleypnigildi óútsýnda samanburðarhópsins (frumur samræktaðar í RPMI 1640 án sermi).

2.8 Tölfræðigreining

T-prófið með pöruðu sýni (tvíhliða) var notað til að bera kennsl á tölfræðilega marktækan mun á gildum í núllviðmiðunarhópnum og tilraunahópnum. Munurinn var talinn marktækur við 95 prósenta öryggi (p <>

PCA var notað til að meta einkennandi toppsvæði í litskiljum sýnanna frá tíu fjölbreyttum búsvæðum. Tvíþáttagreining og Grey fylgnigreining voru notuð til að meta fylgni toppsvæða og estrógenvirkni þeirra. Fylgnin var reiknuð út með SPSS tölfræði hugbúnaðartölfræði (SPSS fyrir Windows 21.0, SPSS Inc., Bandaríkjunum). Munurinn var talinn marktækur við 95 prósenta öryggi (tvíhliða).

Siðferðilegt samþykki: Rannsóknirnar sem gerðar eru tengjast hvorki notkun manna né dýra.

3 Niðurstöður og umræður

3.1 Klasagreining og líkindismat

Hlutfallslegt staðalfrávik varðveislutíma og toppflatar einkennandi toppa var {{0}}.58 og 0.34 prósent fyrir nákvæmni, 0.52 og {{8} },31 prósent fyrir endurgerðanleika og {{10}}.19 og 0,13 prósent fyrir stöðugleika, í sömu röð. Þessar niðurstöður gáfu til kynna að LC-aðferðin okkar við fingrafarasetningu væri sanngjörn og áreiðanleg. Líkindin með litskiljum tíu sýna voru meiri en 0,9. Sameiginlegir toppar fyrir öll sýni gætu ekki að fullu táknað einkennandi efnisþætti Cistanche, þar sem toppurinn gæti hafa tapast. Þess vegna var samsvörunarnúmer sýna stillt úr 26 í 20 til að fá nákvæmara litskiljunarkort. Alls fengust 26 toppar og var summa flatarmáls þeirra meiri en 0,8 miðað við heildar toppflatarmál úrtaksins. Þess vegna komumst við að þeirri niðurstöðu að þessir litskiljunartoppar gætu í raun endurspeglað helstu efnafræðilegu innihaldsefni Cistanche. Niðurstöður klasagreiningar eru sýndar á mynd 1. Alls var tíu fjölbreyttum búsvæðum skipt í þrjá flokka sem hér segir: (A) 2, Guizhou; 3, Qinghai; 4, Chaidamu; 10, Neimeng; 7, Xinjiang og 6, Sichuan. (B) 1, Xizang; 8, Ningxia og 5, Alashan. (C) 9, Hubei. Þróun klasagreiningar sýndi að búsvæði lækningajurtanna eru svipuð þegar þau eru neðst á þröskuldinum. En með hækkandi þröskuldi eru loftslag og vaxtarskilyrði búsvæða nálægt. Hún sýnir að klasagreiningin getur ekki aðeins greint fjölbreytt búsvæði vel heldur einnig endurspeglað skyldleika þeirra á milli.

3.2 Auðkenning efnafræðilegra innihaldsefna

Based on the synergy between components, TCM exerted pharmacological effects. Certain studies have been conducted to identify the chemical compositions of C. deserticola [24-26]. The correlation of inherent constituents with their activities indicated that they could be identified based on the combination of LC with the corresponding indices of pharmacological activity. Q-TOF-MS is suitable for multi-constituent identification of TCM since it can provide the exact molecular mass because of its high resolution. A total of 26 compounds were identified by analyzing the primary and secondary MS data. PCA was used to assess whether these compounds concerning their oestrogenic activity. A contribution of the activity is indicated by an eigenvalue higher than 1 (> 1) and a cumulative contribution rate of variables higher than 0.8 (>0.8). Því hærra, sem er algildi Eigen álagsins, því meiri áhrif hafa efnasamböndin á estrógenvísitölur.

Litskiljun Cistanche og stöðluðu sýnin voru borin saman til að bera kennsl á einstaka þætti við sömu LC-MS aðstæður. Eins og sést í töflu 1 voru alls 26 efnisþættir auðkenndir út frá varðveislutíma og MS gögnum [24-26]. Virk innihaldsefni eru gefin til inntöku í formi blöndu frekar en einliða þar sem hefðbundin kínversk læknisfræði er í formi blöndu til að gegna lækningahlutverki. Eitt efnasamband eftir að hafa verið aðskilið hvert fyrir sig reyndist ekki gegna hlutverki. Markmið okkar er að sýna efnasambönd sem hafa estrógenvirkni í þekktum íhlutum Cistanche [23-30], og völdum því ekki NMR og aðrar tæknilegar leiðir til að sannreyna auðkenni þeirra. Toppur 1 gaf til kynna ríkjandi afprótóna jón með m/z hlutfallið 373 (C16H22O10), sem var eins og frumefnasamsetning genipósínsýru. Þetta var stutt af tapi á glúkósahluta sem gaf af sér brotajón með m/z hlutfallinu 211. Toppur 2 gaf til kynna ríkjandi afprótóna jón með m/z hlutfallinu 461 (C20H30O12), sem var eins og frumefnasamsetningin af decaffeoylacteoside, og var studd af tapi á rhamnosyl hluta, sem myndaði sundrun með m/z hlutfallinu 315. Toppur 4 gaf til kynna ríkjandi afprótóna jón með m/z hlutfallinu 375 (C16H24O10), sem var eins og frumefnasamsetning 8-epiloganic sýru. Tap á glúkósahluta, myndaði sundrungu með m/z hlutfallinu 213, studdi enn frekar ályktunina. Toppur 6 gaf til kynna ríkjandi afprótóna jón með m/z hlutfallið 607 (C29H36O14), sem var eins og frumefnasamsetning syringalíðs A3'- - l-rhamnopyranosides.

Tap á caff-hluta, myndaði brotajón með m/z hlutfallinu 445, studdi enn frekar ályktunina. Toppur 8 gaf til kynna ríkjandi deprotonated jón með m/z hlutfallið 799 (C36H48O20), sem var eins og frumefnasamsetning cistanoside A. Tap á caff hluta, myndaði brotajón með m/z hlutfallinu 637, studdi enn frekar ályktunina. Toppur 11 gaf til kynna ríkjandi afprótónaðri jón með m/z hlutfallinu 487 (C21H28O13 ), sem var eins og frumefnasamsetning cistanoside F. Þetta var stutt af tapi á rhamnosyl hluta sem gaf brotajón með m/z hlutfallið 341, og tap á öðrum kaffihluta myndaði brotajón með m/z hlutfallinu 179, studdi enn frekar ályktunina. Toppur 12 gaf til kynna ríkjandi afprótóna jón með m/z hlutfallinu 813 (C37H50O20), sem var eins og frumefnasamsetning cistanoside B. Tap á glúkósahluta myndaði brotajón með m/z hlutfallinu 651, studdi enn frekar ályktunina. Toppur 13 gaf til kynna ríkjandi afprótóna jón með m/z hlutfallinu 827 (C37H48O21), sem var eins og frumefnasamsetning túbúlósíðs A. Tap á rhamnosyl hluta myndaði sundrun með m/z hlutfallinu 681, ennfremur studdi ályktunina. Toppur 14 gaf til kynna ríkjandi afprótóna jón með m/z hlutfallið 637 (C30H38O15), sem var eins og frumefnasamsetning cistanoside C. Tap á rhamnosyl hluta myndaði brotajón með m/z hlutfallinu 491, studdi enn frekar ályktunina.

Toppur 15 gaf til kynna ríkjandi afprótóna jón með m/z hlutfallinu 591 (C29H36O13), sem var eins og frumefnasamsetning osmantúsíðs B. Tap á rhamnosyl hluta myndaði brotajón með m/z hlutfallinu 445, studdi enn frekar ályktunina. Toppur 16 gaf til kynna ríkjandi afrótónuð jón með m/z hlutfallið 623 (C29H36O15), sem var eins og frumefnasamsetning akteósíðs. Tap á caff-hluta, myndaði brotajón með m/z hlutfallinu 461, studdi enn frekar ályktunina. Toppur 18 gaf til kynna ríkjandi afprótóna jón með m/z hlutfallið 623 (C29H36O15), sem var eins og frumefnasamsetning ísóakteósíðs. Tap á caff hluta, fortopp 15 gaf til kynna ríkjandi afprótóna jón með m/z hlutfallinu 591 (C29H36O13), sem var eins og frumefnasamsetning osmanthusíðs B. Tap á rhamnosyl hluta myndaði brotajón með m/z hlutfallið 445, studdi enn frekar ályktunina. Toppur 16 gaf til kynna ríkjandi afrótónuð jón með m/z hlutfallið 623 (C29H36O15), sem var eins og frumefnasamsetning akteósíðs. Tap á caff-hluta, myndaði brotajón með m/z hlutfallinu 461, studdi enn frekar ályktunina. Toppur 17 gaf til kynna ríkjandi afprótóna jón með m/z hlutfallið 623 (C29H36O15), sem var eins og frumefnasamsetning cis-akteósíðs. Tap á caff hluta, myndaði brot joð brot jón með m/z hlutfallinu 461, studdi enn frekar ályktunina. Toppur 21 gaf til kynna ríkjandi afprótóna jón með m/z hlutfallinu 653 (C30H38O16), sem var eins og frumefnasamsetning campneoside Ⅰ.

Tap á caff hluta myndaði brotajón með m/z hlutfallinu 491 og tap á öðrum ramnosyl hluta myndaði brotajón með m/z hlutfallinu 345, sem styður enn frekar ályktunina. Toppur 22 gaf til kynna ríkjandi afprótóna jón með m/z hlutfallið 665 (C31H38O16), sem var eins og frumefnasamsetning túbúlósíðs B. Tap á CH3 CO hluta myndaði brotajón með m/z hlutfallinu 623, og tap á öðrum kaffihluta myndaði brotajón með m/z hlutfallinu 461, sem styður enn frekar ályktunina. Toppur 23 gaf til kynna ríkjandi afrótónuð jón með m/z hlutfallið 639 (C29H36O16), sem var eins og frumefnasamsetning campneosides. Tap á rhamnosyl hluta, myndaði brotajón með m/z hlutfallinu 493, studdi enn frekar ályktunina. Toppur 24 gaf til kynna ríkjandi afprótóna jón með m/z hlutfallið 665 (C31H38O16), sem var eins og frumefnasamsetning 2'-asetýlakteósíðs. Tap á Ac hluta myndaði brotajón með m/z hlutfallinu 623 og tap á öðrum caff hluta myndaði brotajón með m/z hlutfallinu 461, sem styður enn frekar ályktunina. Toppur 25 gaf til kynna ríkjandi deprotonated jón með m/z hlutfallinu 445 (C20H30O11), sem var eins og frumefnasamsetning cistanoside G. Tap á rhamnosyl hluta myndaði brotajón með m/z hlutfallinu 299, studdi enn frekar ályktunina. Uppbygging efnasambanda er skráð á mynd 2.

3.3 PCA

As shown in Table 2, the eigenvalues of the first eight principal components were higher than 1(> 1), and the cumulative contribution rate of the first six principal components was 93.417%. Therefore, the first six principal components were evaluated further. Table 2 indicates their eigenvalues and factor loadings. The first principal component exhibited a higher load based on the eigenvalues of the eight peaks (>0.9). Þessir toppar voru eftirfarandi: 9, 12, 14 og 15. Þar af leiðandi voru echinacoside, cistanoside B, osmanthuside B og acteoside, sem samsvara samtals 4 toppum, valdir sem dæmigerðar breytur fyrir estrógenvirkni (Mynd 3).

.

3.4 Ákvörðun á estrógenvirkni

Hlutfall blautþyngdar í legi og líkamsþyngdar hverrar músar var reiknað út (Mynd 4). Dýrin sem voru útsett fyrir Cistanche frá níu búsvæðum sýndu marktæka estrógenvirkni með því að auka legþyngd sína samanborið við mýs í auða samanburðarhópnum. Mynd 4 sýnir ennfremur útbreiðsluhraða MCF7 frumna sem voru meðhöndlaðar með sermi úr Cistanche-meðhöndluðum músum. Frumurnar sem voru meðhöndlaðar með sermi músa sem fengu Cistanche frá tíu búsvæðum sýndu marktækt meiri vöxt samanborið við frumur án meðferðar.

3.5 Tvíþáttagreining

Í þessari rannsókn sáum við að legþyngd óþroskaðra kvenkyns Kunming músa jókst og fjölgun MCF7 manna brjóstakrabbameinsfrumna var ýtt undir. Þessar niðurstöður staðfestu estrógenvirkni Cistanche. Mynd 5 sýndi legvísitölu og MCF7 frumufjölgunarhraða þessara innihaldsefna. Fylgnistuðull Pearsons var notaður til að reikna út hlutfallsleg toppsvæði sem samsvaraði estrógenvirkni sýnanna. Fylgnistuðlar hærri en 0.3 voru taldir marktækir (p < 0.05),="" en="" hærri="" fylgnistuðlar="" en="" 0.5="" voru="" taldir="" mjög="" marktækir="" (p="">< 0,01).="" byggt="" á="" niðurstöðunum="" var="" sýnt="" fram="" á="" að="" cistanche="" hefði="">

Alls höfðu níu efnasambönd marktæk fylgni við aukningu á legþyngd (p < {0}}.05),="" en="" tíu="" efnasambönd="" höfðu="" marktæka="" fylgni="" við="" mcf7="" frumufjölgun="" (p="">< 0,05).="" efnasambönd="" sem="" höfðu="" marktæka="" fylgni="" við="" legþyngd="" og="" frumufjölgun="" voru="" 8-epiloganic="" acid,="" salidroside,="" syringalide="" a3'-="" -="" l-rhamnopyranoside,="" cistanoside="" a,="" cistanoside="" b,="" cistanoside="" c,="" osmanthuside="" b,="" acteoside,="" isoacteoside,="" tubuloside,="" tubuloside.="" b,="" 2'-asetýlakteósíð="" og="" tvö="" óþekkt="" efnasambönd="" (mynd="" 5).="" þessi="" þrettán="" efnasambönd="" höfðu="">

3.6 Grá fylgnigreiningaraðferð

Mynd 6 sýnir hlutfallslega fylgni einkennandi toppa 26 efnasambanda við legvísitölur, og mynd 7 sýnir hlutfallslega fylgni einkennandi toppa 26 efnasambanda við frumufjölgunarhraða þeirra. Alls sýndu þrjú efnasambönd hæstu fylgnina við legvísitölur, nefnilega 8-flogaveikisýra, cistanosíð F og akteósíð (mynd 6, í lækkandi röð); en sex efnasamböndin sem sýndu hæstu fylgni við MCF7 frumufjölgunina voru echinacoside, cistanoside F, cistanoside B, osmanthuside B, isoacteoside og tubuloside B (Mynd 7, í lækkandi röð). Hlutfallsleg fylgni echinacoside, osmanthuside B, acteoside og isoacteoside var hærri en 0.5.

3.7 Hagræðing LC-MS aðstæður

Til að fá betra skiljunarkort var borið saman metanól og asetónítríl. Að lokum var blandan af vatnskenndri maurasýru (0.2 prósent , v/v) - asetónítríl besti hreyfanlegur fasinn til aðskilnaðar. Á bilinu 200-400nm fullbylgjulengdarskönnun var 254nm valið sem ákjósanlegasta. Að auki voru MS breytur einnig bættar. Neikvæð jónaskönnunarstillingin var valin vegna þess að hann bætti svörunargildi flestra innihaldsefna í Cistanche.

4 Niðurstaða

LC-Q-TOF-MS tækni var notuð til að bera kennsl á estrógenvirk efni í Cistanche. Þessi rannsókn sýndi að 8-epiloganic acid, salidroside, syringalideA3'- -l-rhamnopyranoside, cistanoside A, echinacoside, cistanoside F, cistanoside B, cistanoside C, osmanthuside B, acteoside, isoacteoside, tubuloside 2'-asetýlakteósíð og tvö óþekkt efnasambönd voru helstu virku innihaldsefnin í Cistanche. Þessar niðurstöður krefjast hins vegar frekari rannsókna til að kanna in vivo áhrif og verkunarmáta innihaldsefnanna.

Viðurkenningar:

Þetta verkefni var stutt af National Natural Science Foundation of China (nr. 81073015), Nature Scientific Foundation Heilongjiang Province (ZD2017014) og þjálfunaráætlun um unga nýsköpunarhæfileika háskólans í Heilongjiang héraði (UNPYSCT-2017209) . Höfundar lýsa því yfir að ekki sé um hagsmunaárekstra að ræða varðandi útgáfu þessa blaðs.

Heimildir

[1] Wang Z., Xia Q., Liu X., Liu W., Huang W., Mei X., Luo J., Shan M., Lin R., Zou D., Ma Z., Fytoefnafræði, lyfjafræði , gæðaeftirlit og framtíðarrannsóknir á Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl: A review, J. Ethnopharmacol., 2018, 210, 318- 339.

[2] Shu Y., Liu Z., Zhao S., Song Z., He D., Wang M., Zeng H., Lu C., Lu A., Liu Y., Samþætt og alþjóðleg gervimiðuð efnaskiptastefna beitt til skimunar fyrir gæðaeftirlitsmerkjum Citrus TCMs, Anal. Lífanal. Chem., 2017, 409(20), 4849-4865.

[3] Yang B., Wang Y., Shan L., Zou J., Wu Y., Yang F., Zhang Y., Li Y., Zhang Y., A Novel and Practical Chromatographic "Fingerprint-ROC-SVM " Stefna beitt við gæðagreiningu á sprautum í hefðbundnum kínverskum læknisfræði: Notkun KuDieZi innspýtingar sem dæmisögu, sameindir., 2017, 22

(7). PII: E1237.[4] Zhuo L., Peng J., Zhao Y., Li D., Xie X., Tong L., Yu Z., Skimun lífvirkra gæðaeftirlitsmerkja QiShenYiQi dreypipilla byggt á tengslum milli ofurafkastamikilla vökvaskiljunar fingrafars og æðaverndarvirkni, J. Sep. Sci., 2017, 40(20), 4076-4084.

[5] Liu N., Li J., Li BG, Notkun fjölþátta tölfræðilegrar greiningar og hugsunar í gæðaeftirliti kínverskra lækna, Zhongguo. Zhong. Yao. Za. Zhi., 2014, 39

(21), 4268-4271.

[6] Wang DD, Liang J., Yang WZ, Hou JJ, Yang M., Da J., Wang Y., Jiang BH, Liu X., Wu WY, Guo DA, HPLC/qTOF-MS stilla einkennandi íhlutagögn sett og efnafræðileg greining fyrir heildrænt gæðaeftirlit með flóknum TCM efnablöndur: Niuhuang Shangqing pilla sem dæmi, J. Pharm. Biomed. Anal., 2014, 89, 130-141. [7] Hernaez R., Thrift AP, High Negative Predictive Value, Low Prevalence, and Spectrum Effect: Caution in the Interpretation, Clin. Gastroenterol. Hepatol., 2017, 15(9), 1355-1358.

[8] Liang J., Chen Y., Ren G., Dong W., Shi M., Xiong L., Li J., Dong J., Li F., Yuan J., Screening Hepatotoxic Components in Euodia rutaecarpa eftir UHPLC-QTOF/MS Byggt á litrófs-eiturhrifasambandinu, Molecules., 2017, 22(8). PII: E1264.

[9] Li W., Sun X., Liu B., Zhang L., Fan Z., Ji Y., Skimun og auðkenning á eituráhrifum á lifur í Evodia rutaecarpa byggt á litrófs-áhrifasambandi og UPLC-Q-TOFMS, Biomed. . Chromatogr., 2016, 30(12), 1975-1983.

[10] Chopard G., Puyraveau M., Binetruy M., Meyer A., ​​Vandel P., Magnin E., Berger E., Galmiche J., Mauny F., Spectrum Effect and Spectrum Bias in the Skim Test Performance for Minnisleysi væg vitsmunaleg skerðing: Hverjar eru klínískar afleiðingar?, J. Alzheimers. Dis., 2015, 48(2), 385-393.

[11] Xu GL, Xie M., Yang XY, Song Y., Yan C., Yang Y., Zhang X., Liu ZZ, Tian YX, Wang Y., Jiang R., Liu WR, Wang XH, She GM, Litróf-áhrif sambönd sem kerfisbundin nálgun við rannsóknir á hefðbundnum kínverskum læknisfræði: núverandi staða og framtíðarsjónarmið, Molecules., 2014, 19(11), 17897-17925.

[12] Zheng Q., Zhao Y., Wang J., Liu T., Zhang B., Gong M., Li J., Liu H., Han B., Zhang Y., Song X., Li Y. , Xiao X., Litrófsáhrif tengsl milli UPLC fingraföra og lífvirkni óhreinsaðra aukaróta Aconitum carmichaelii Debeaux (Fuzi) og þriggja unnar afurða þess á hvatberavexti ásamt kanónískri fylgnigreiningu, J. Ethnopharmacol., 2014,153(3) , 615-623.

[13] Shi Z., Liu Z., Liu C., Wu M., Su H., Ma X., Zang Y., Wang J., Zhao Y., Xiao X., Litrófsáhrifatengsl milli efnafingraföra og bakteríudrepandi áhrif Lonicerae Japonicae Flos og Lonicerae Flos Base á UPLC og Microcalorimetry, Front. Pharmacol., 2016, 7, 12.

[14] Usher-Smith JA, Sharp SJ, Griffin SJ, Litrófsáhrifin í prófunum fyrir spá um áhættu, skimun og greiningu, BMJ, 2016, 353, i3139.

[15] Chen Y., Yu H., Wu H., Pan Y., Wang K., Liu L., Jin Y., Zhang C., Rekja nýjar blæðandi efnasambönd frá upphitunarafurðum heildarflavonoids í Flos Sophorae eftir litrófi -áhrifatengsl og súluskiljun, J. Sep. Sci., 2015, 38(10), 1691-1699.

[16] Liu X., Wang XL, Wu L., Li H., Qin KM, Cai H., Pei K., Liu T., Cai BC, Rannsókn á litrófs-áhrifatengslum Da-Huang-Fu- Zi-Tang í rottum með UHPLC-ESI-Q-TOF-MS aðferð, J. Ethnopharmacol., 2014, 154(3), 606-612.

[17] Xie RF, Zhou X., Shi ZN, Li YM, Li ZC, Rannsókn á litrófsáhrifasambandi rhizoma Rhei, heilaberki Magnoliae Officinalis, Fructus Aurantii Immaturus og formúla þeirra, J. Chromatogr. Sci., 2013, 51(6), 524-532. [18] Li F., Yang X., Yang Y., Guo C., Zhang C., Yang Z., Li P., Þynningareyðandi virkni echinacosides í rottum með eggjastokkum, Phytomedicine., 2013, 20(6), { {9}}.

[19] Xiong WT, Gu L., Wang C., Sun HX, Liu X., Blóðsykurslækkandi og blóðfitulækkandi áhrif Cistanche tubulosa í DB/DB músum með sykursýki af tegund 2, J. Ethnopharmacol., 2013, 150(3) , 935- 945.

[20] Morikawa T., Ninomiya K., Imamura M., Akaki J., Fujikura S., Pan Y., Yuan D., Yoshikawa M., Jia X., Li Z., Muraoka O., Acylated phenylethanoid glycosides , echinacoside og acteoside frá Cistanche tubulosa, bæta glúkósaþol í músum, J. Nat. Med., 2014, 68(3), 561-566.

[21] Nan ZD, Zeng KW, Shi SP, Zhao MB, Jiang Y., Tu PF, Phenylethanoid glýkósíð með bólgueyðandi virkni frá stönglum Cistanche deserticola ræktuð í Tarim eyðimörkinni, Fitoterapia., 2013, 89, {{4 }}.

[22] Lu D., Zhang J., Yang Z., Liu H., Li S., Wu B., Ma Z., Magngreining á Cistanches Herba með því að nota hágæða vökvaskiljun ásamt díóða fylkisgreiningu og há- upplausnarmassagreiningu ásamt efnafræðilegum aðferðum, J. Sep. Sci., 2013, 36(12), 1945-1952.

[23] Han L., Boakye-Yiadom M., Liu E., Zhang Y., Li W., Song X., Fu F., Gao X., Byggingareinkenni og auðkenning á fenýletanóíð glýkósíðum frá Cistanches deserticola YC Ma eftir UHPLC/ESI-QTOF-MS/MS, Phytochem. Anal., 2012, 23(6), 668-676.

[24] Xiang Y., Jing Z., Haixia W., Ruitao Y., Huaixiu W., Zenggen L., Lijuan M., Yiping W., Yanduo T., Antiproliferative Activity of Phenylpropanoids Einangrað frá Lagotis brevituba Maxim, Phytother . Res., 2017, 31(10), 1509-1520.

[25] Yan Y., Song Q., Chen X., Li J., Li P., Wang Y., Liu T., Song Y., Tu P., Samtímis ákvörðun á íhlutum með breitt pólun og innihaldssvið í Cistanche tubulosa með raðtengdri öfugfasa-vatnssækinni víxlverkunarskiljun-tandem massagreiningu, J. Chromatogr. A., 2017, 1501, 39-50.

[26] Zou P., Song Y., Lei W., Li J., Tu P., Jiang Y., Notkun 1H NMR-undirstaða efnaskiptafræði til að mismuna mismunandi hlutum og þróun á nýju vinnsluferli fyrir Cistanche deserticola, Acta. Pharm. Synd. B., 2017, 7(6), 647-656.

[27] Pan YN, Rannsóknir á innihaldsefnum og lífvirkni ferskra Cistanche tubulosa, Ph.D. ritgerð, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang, Kína, 2011.

[28] Cui Q., ​​Pan Y., Xu X., Zhang W., Wu X., Qu S., Liu X., Efnaskiptasnið akteósíðs framleitt af þarmabakteríum úr mönnum eða rottum eða þarmansími in vitro notaði UPLC Q-TOF–MS, Fitoterapia., 2016, 109, 67-74.

[29] Cui Q., ​​Pan Y., Bai X., Zhang W., Chen L., Liu X., Kerfisbundin lýsing á umbrotsefnum echinacosides og acteosides frá Cistanche tubulosa í rottuplasma, galli, þvagi og saur byggt á UPLC-ESI-Q-TOF-MS, Biomed. Chromatogr., 2016(9), 1406-1415.

[30] Cui Q., ​​Pan Y., Yan X., Qu B., Liu X., Xiao W., Efnaskiptaleið til að rannsaka tengdar hindranir sem valda lélegu aðgengi við inntöku ísóakteósíðs í rottum sem notast við ofurafkastamikil vökvaskiljun/ fjögurra póla tímaflugs samþjöppunarmassagreiningu, hröð. Commun. Mass. Spectrom., 2017(4), 371-380.