Lítil en kröftug — Exosomes, nýir millifrumuboðberar í taugahrörnun 1. hluti

Einföld samantekt:

Exosomes eru líffræðilegar nanóagnir sem nýlega hafa verið viðurkenndar sem millifrumuboðefni. Þau innihalda farm af lípíðum, próteinum og RNA. Þeir geta flutt innihald sitt ekki aðeins í frumur í nágrenninu heldur einnig til fruma í fjarlægð.

Exosomes eru nýuppgötvað millifrumusamskiptatæki sem getur losað litlar og viðkvæmar blöðrur til nærliggjandi frumna, skilað sumum próteinum, merkjaefnum og öðrum efnum til nærliggjandi frumna. Þessi efni geta hjálpað frumum að breyta ástandi sínu og jafnvel haft áhrif á vöxt, þroska, efnaskipti og aðra þætti annarra frumna. Undanfarin ár hafa rannsóknir sýnt að exósóm gegna mikilvægu hlutverki í heilastarfsemi mannsins, sérstaklega við viðhald og endurbætur á minni.

Í fyrsta lagi geta exósóm stuðlað að boðflutningi milli taugafrumna. Upplýsingaflutningur milli taugafrumna er eitt af nauðsynlegum skilyrðum fyrir eðlilegri starfsemi taugakerfisins og útafbrigði gegna hlutverki boðefna sem geta gert upplýsingaflutning milli taugafrumna sléttari og þar með bætt heilavitund og minni.

Í öðru lagi geta exósóm einnig stjórnað efnaskiptum taugafrumna. Í ferli taugafrumna sem framleiða og gefa út exósóm tekur þátt í fjölda efnaskiptaferla sem stuðlar að jafnvægi og stjórnun á efnaskiptum frumna. Þessir ferlar geta ekki aðeins aukið getu taugafrumna heldur einnig hjálpað til við að fjarlægja efnaskiptaúrgang og skaðlegar sameindir og halda heilafrumum heilbrigðum.

Að lokum geta exósóm einnig hjálpað taugafrumum að gera við skemmdir. Mörg prótein og kjarnsýrur, sem bera með exósóm, eru gagnleg fyrir frumuvöxt, viðgerð og endurnýjun og geta stuðlað að viðgerð og endurnýjun taugafrumna og þar með bætt lifunargetu heilafrumna og styrkt minnisstöðvar og vitræna hæfileika.

Í stuttu máli er náið samband á milli exosomes og minnis. Við getum breytt minni barna með því að byrja á mataræði. Að leiðbeina mataræði barna á virkan hátt og borða meira af matvælum sem eru rík af gagnlegum innihaldsefnum eins og fitusýrum, próteinum og vítamínum getur stuðlað að framleiðslu og losun exósóma og þar með hjálpað börnum að bæta náms- og minnishæfileika sína. Einnig er hægt að útvega börnum nokkra heilaþjálfunarleiki og æfingar til að ögra og æfa hugsun sína, örva möguleika exósóma og gegna betra hlutverki. Það má sjá að við þurfum að bæta minnið og Cistanche getur bætt minnið verulega því Cistanche er hefðbundið kínverskt lækningaefni með mörg einstök áhrif, ein þeirra er að bæta minni. Virkni Cistanche kemur frá hinum ýmsu virku innihaldsefnum sem það inniheldur, þar á meðal tannínsýru, fjölsykrur, flavonoid glýkósíð o.fl. Þessi innihaldsefni geta stuðlað að heilsu heilans á margan hátt.

Smelltu á Vita til að bæta skammtímaminni

Þessi einstaka hæfileiki gerir þeim kleift að móta lífeðlisfræði viðtökufrumna. Í heilanum gegna exósóm hlutverki í taugahrörnunarsjúkdómum eins og Alzheimerssjúkdómi Parkinsonsveiki og amyotrophic lateral sclerosis.

Ágrip:

Exosomes af endosomal uppruna eru einn flokkur utanfrumublaðra sem eru mikilvægar í millifrumusamskiptum. Exosomes losna af öllum frumum í líkama okkar og farmur þeirra sem samanstendur af lípíðum, próteinum og kjarnsýrum hefur fótspor sem endurspeglar uppruna þeirra.

Hinn utanaðkomandi farmur hefur vald til að móta lífeðlisfræði viðtökufrumna í nágrenni við losunarfrumurnar eða frumur í fjarlægð. Að nýta möguleika exósóma byggir á hreinleika exosome undirbúnings.

Þess vegna hafa margar aðferðir til einangrunar verið þróaðar og við bjóðum upp á stutta samantekt á nokkrum aðferðum. Þrátt fyrir einangrunina sem blóð-heilaþröskuldurinn setur, eru frumur í miðtaugakerfi ekki ónæmar fyrir utanaðkomandi uppáþrengjandi áhrifum. Bæði taugafrumur og gliarelease exosomes, oft á virkniháðan hátt.

Stutt lýsing á úthverfum sem losuð eru af mismunandi frumum í heila og hlutverki þeirra við að viðhalda jafnvægi miðtaugakerfis er veitt. Aðalsmerki nokkurra taugahrörnunarsjúkdóma er uppsöfnun próteinasafna. Nýlegar rannsóknir benda til samskiptahlutverks milli frumna í útbreiðslu misbrotna próteina og segja útbreiðslu meinafræðinnar.

Í þessari endurskoðun ræðum við hugsanlegt framlag frá exosomes í framvindu Alzheimerssjúkdóms, Parkinsonsveiki og amyotrophic lateralsclerosis.

Skilningur á framlagi frá exósómum í meingerð taugahrörnunar opnar sviðið fyrir notkun exósóma sem lækningamiðla til lyfjagjafar til heilans þar sem exósóm fara yfir blóð-heila þröskuldinn.

Lykilorð: exosomes; taugafrumur; glial frumur; miðtaugakerfi (CNS); taugahrörnunarsjúkdómar;Alzheimer-sjúkdómur; Parkinsonsveiki; amyotrophic lateral sclerosis.

1. Inngangur og sögulegt sjónarhorn

Millifrumusamskipti eru afar áhugaverð fyrir fósturþroska, endurnýjun/skipti þekjuvefs, kynfrumnamyndun og viðhaldi á samvægi.

Nokkrir kerfi frumu-frumusamskipta eins og innfrumumyndun/frumnafrumnafæð og upptekin útstæð umfrymisblöðrur voru auðkenndar með því að nota útbyggingar- og lífefnafræðilegar rannsóknir [1-3]. Annar leikmaður, utanfrumublöðrur, var auðkenndur en hlutverk þeirra í millifrumusamskiptum var ekki metið strax [4].

Utanfrumublöðrur fundust á sléttum tíma við rannsókn á losun plasmahimnutengdra ensíma, ecto-ATPasa og ecto-50-núkleótidasa í frumuræktunarmiðil. Árið 1981 ræktuðu samstarfsmenn Tramsand eðlilegar og æxlisfrumulínur af músum og mönnum í sermifríum miðli vegna þess að vitað var að sermi hafði hvatavirkni ATPasa og 50-núkleótidasa.

Eftir að fljótandi frumur og rusl hafa verið fjarlægðar var skilyrt miðillinn skilinn í skilvindu á hraðanum 310,000× g í 90 mínútur í Spinco Ti-70 snúningi og kögglurnar voru skoðaðar undir rafeindasmásjá. Tveir stofnar af utanfrumuhimnuhjúpuðum blöðrum fundust, einn með meðalþvermál á milli 500 og 1000 nm og annar, minni þýði með þvermál ~40 nm.

Þessar blöðrur, sem upphaflega var lýst sem „afhúðaðar blöðrur“ af höfundum, innihéldu bæði 50-50-núkleótidasa og ATPase ensímvirkni. Að auki innihéldu afhúðaðar blöðrurnar RNA og fosfólípíð sem voru frábrugðin móðurfrumum og móðurplasmahimnu, í sömu röð.

Ræktun á skrúfuðum blöðrum úr C6 glioma frumum með 32P formerktum taugafrumukrabbameinsfrumum örvaði affosfórun taugafrumukrabbameinspróteina með samhliða losun óbundins geislamerkts fosfórs (32P).

Þessi gögn staðfestu að afhúðaðar blöðrur voru ekki aðeins burðarefni frumuúrgangs (ensím) heldur höfðu lífeðlisfræðilega virkni. Tram og félagar settu fram hugtakið exosomes til að lýsa "exfoliated vesicles" [5] (sjá grein eftir [6] fyrir utanfrumublöðrusögu fyrir 1981). Nokkrum árum síðar rannsökuðu tveir rannsóknarhópar sjálfstætt afdrif transferrínviðtakans í netfrumum með rafeindasmásjá [7-9].

Þroskandi netfrumur þurfa ekki transferrín svo þeir missa transferrín viðtaka. Báðir hóparnir sáu að ræktaðar netfrumur slepptu litlum blöðrum sem voru ~50 nm í þvermál inn í utanfrumurýmið.

Þessar litlu blöðrur innihéldu ekki niðurbrotna transferrínviðtaka. Árið 1987 notuðu Johnston og félagar hugtakið exosomes til að lýsa litlum blöðrum sem innihalda transferrínviðtaka [10]. Eftir þessi fyrstu ár var möguleiki utanfrumna að veruleika sem nýir millifrumuboðefni sem geta stýrt lífeðlisfræði markfrumna.

Athyglisvert er að tilurð frumufruma er hafin með innfrumumyndun (ferli sem var auðkennt árið 1883; skoðað af [3]) í frumum og losun utanfrumuefna í innanfrumurými notar ferlið við frumufrumu. Síðan þeir fundust í fyrstu vitum við nú að frumufrumur eru undirtegund utanfrumublaðra af innfrumuuppruna með stærðarbili 40–160 nm í þvermál [11].

Sporefnarannsóknir sýndu fram á að stórsameindir eru frumugreindar í burstahúðuðum (þ.e. clathrinhúðuðum) inngöngum eða holum á frumuyfirborði. Þessar inndælingar skiljast að lokum frá plasmahimnunni og greinast í umfryminu.

Eftir að burstarnir hafa tapast (þ.e. clathrin) verða innfrumuhúðaðar blöðrur sléttar og renna saman við snemma innkirtla til að annað hvort endurvinna hratt aftur á frumuyfirborðið (endurvinnsla endósóma á mynd 1) [12] eða þroskast til að mynda seint endósóm.

Snemma og seint innkirtla virka sem "flokkunarmiðstöðvar" til að beina innihaldi þeirra á viðeigandi hátt: (i) fyrir afturábak flutning til trans-Golgi netsins (þ.e. endurheimt innkirtla til TGN) [13,14]; (ii) til leysisóma fyrir niðurbrot stórsameinda í einfaldar afurðir til endurnotkunar innan frumunnar [15,16]; og/eða (iii) til endurvinnslu á frumuyfirborðið í gegnum fjölblöðrulaga líkama [17].

Meðan á þroskun snemmbúna endósóma innsnúin innkirtla stendur, gengst innri innkirtlahimnan í gegnum inndælingu, sem leiðir til myndunar blöðrur innan líma (nú nefnt sem exosomes). Sérstakar stórsameindir eins og frumufrumur prótein, kjarnsýrur og lípíð eru flokkuð í að þróa exósóm.

Seint endósóm pakkað með exósómum eru auðkennd sem fjölblöðrulaga líkamar sem flytja í átt að plasmahimnunni. Við samruna við plasmahimnuna losa fjölblöðrufrumur útfrumna út í utanfrumurýmið í gegnum frumufrumuferli (Mynd 1) [18,19]. Stór undirhópur próteina sem eru teknir í röð skipta sköpum í ferli innfrumumyndunar í frumufrumur, þroska innkirtla í síðfrumu og síðari örlaga innanfrumu þeirra (skoðað af [17,18,20]).

Mikilvægi þessara próteina er undirstrikað með tapi þeirra og/eða stökkbreytingum sem valda ýmsum sjúkdómum. Til dæmis eru Strumpellin og SWIP prótein hluti af WASH flókinu sem tekur þátt í aktínfjölliðun, svo og klofnun og flokkun innkirtla. Stökkbreytingar í Strumpellin geninu valda arfgengri spastískri paraplegia, sem einkennist af hrörnun hreyfitaugafruma [21].

Stökkbreyting á einum punkti (Pro1019Arg) í SWIP próteininu gerir WASH flókið óstöðugleika. Óstöðugleiki WASH flókinn hindrar verslun með endolysosomal, sem veldur því að endosomes kekkjast. Gölluð innkirtlaumferð hefur áhrif á vitsmuni og hreyfitaugavirkni, með einkennum sem lýst er sem óheilkennisþroska [22,23].

Í umfrymi eru frumufrumur upprunnar frá innkirtlum með því að nota innkirtlaflokkunarsamstæður sem nauðsynlegar eru til flutnings (ESCRT), einnig þekktur sem ESCRT-háður gangverkur líffræðilegrar frummyndunar (endurskoðaður af [18,20]).

Tveir hópar greindu sjálfstætt frá lípíðmiðluðum lífmyndun exósóma, ESCRT-óháð kerfi. Tvö lípíð sem auðkennd voru í þessum rannsóknum voru bis(mónóasýlglýseró)fosfat/lýsóbisfosfatidínsýra (BMP/LBPA) og keramíð [29,30].

Rab31 er annar ESCRT-óháður búnaður fyrir frumumyndun í umfrymi. Virkjun á Rab31 örvar myndun blöðrubólna [31]. Það er annað kerfi sem er lítið rædd og vankannað.

Þetta fyrirkomulag er byggt á öfgafræðilegum athugunum sem gerðar voru seint á fimmta áratugnum til sjöunda áratugarins sem sýndu að frumukjarnar geta verið staður fyrir uppruna fjölblöðrulaga sem eru pakkaðir litlum blöðrum. Litlar blöðrur sem lýst er í þessum rannsóknum voru ef til vill exósóm en hugtakið exosome var ekki búið til á þeim tíma. Kilarski og Jasinski skoðuðu ferli sem kallast kjarnablæðing eða kjarnaútdráttur í frumum í sundblöðru karfafisksins, Perca fluviatilis L. (Mynd 2a) [24] með innihaldi svipað og kjarnafrumum [32].

Þessir höfundar bentu á að hægt væri að örva kjarnablæðingu með því að fjarlægja gas úr sundblöðru karfafisksins [24]. Ferlið við kjarnablæðingu virðist hafa verðleika sem upprunastaður exósóma auðgað með kjarnsýrum og/orribonucleoprotein.

Kjarnablöðrur voru fylltar með litlum blöðrum sem komu upp úr einfellingum á innri himnu kjarnablöðranna (Mynd 2b), ferli sem er í ætt við myndun blaðla í leghimnu. Kjarnablöðrur fylltar með „litlum blöðrum“ skildu að lokum frá kjarna til að verða hluti af umfrymi (Mynd 2c).

Kilarski og Jasinski vísuðu til kjarnablóma sem fjölblöðrulaga í handriti sínu vegna skorts á betri hugtökum. Óviljandi gætu þessir höfundar hafa haft rétt fyrir sér þar sem síðari rannsóknir greindu frá tilvist fjölblöðrulaga í frumukjarnum [33]. Kjarnablöðrurnar sem eru fylltar með litlum blöðrum hafa svipaða formgerð og fjölblöðrulíki sem koma frá innkirtlum í umfrymi (Mynd 1 og 2).

Vegna líkt kjarna fjölblöðrulíkama og veirukjarnakapsíðs, beindi vísindamenn athygli sinni að veirufræði og fyrirbæri kjarnabólga og frumuvirkni þess var enn vankönnuð [34].

Burtséð frá aðferð lífverunnar eru exósóm samsett úr alipíð tvílagi og innihalda stórsameindainnihald sem samanstendur af lípíðum, próteinum og kjarnsýrum.

Sumar stórsameindanna eru sameiginlegar fyrir exósóm sem eru upprunnar úr öllum frumum og eru þess vegna flokkaðar sem exósómamerki og eru notaðar sem staðfestingartæki til að greina exósóm frá öðrum utanfrumublöðrum. Einstakar stórsameindir sem eru til staðar í exosomesoften endurspegla uppruna þeirra og eru því líklega tilgreindar sem lífmerki(r).

Allar frumur gefa út exosomes út í utanfrumurýmið. Frá utanfrumurými rata exósóm inn í ýmsa líffræðilega vökva og ná til frumna staðbundið og í fjarlægð. Frumur sem eru ræktaðar in vitro gefa út exósóm sín í ræktunarmiðla. Stöðug losun exósóma inn í utanfrumurýmið gerir ræktunarmiðil og líffræðilegan vökva að ríkum uppsprettu fyrir einangrun exósóma.

Exosomes innihalda umtalsvert magn af kóða og ekki-kóða RNA, tvíþátta erfðaefnis DNA brot og hvatbera DNA. Sporvagnar og samstarfsmenn voru fyrstir til að lýsa nærveru RNA í „flögguðum blöðrum“, blöndu af exosomes og örblöðrum.

Þeir ákváðu að "afhúðaðar blöðrur eða exosomes" innihalda 5% RNA [5]. Valadi og félagar voru fyrstir til að greina RNA pakkaðar inexosomes kerfisbundið. Exosomal RNAs innihalda þýðanleg mRNA og microRNA (miRs) [35].

MicroRNA eru flokkur RNA sem ekki er kóðað (ncRNA). Þau eru ~22 núkleótíð að lengd og stjórna tjáningu gena á stigi eftir umritun með því að bindast 30-óþýddum svæðum markboða-RNA þeirra [36]. Athyglisvert er að sum miRNA sem auðgað er í exósómum finnast ekki í móðurfrumunum sem bendir til sértæks RNA flokkunar/pökkunarkerfis meðan á lífmyndun exosomes stendur [35,37].

Ólíkt frumum innihalda exósóm lítið sem ekkert ríbósómal RNA en innihalda þó tRNA brot [38]. Flokkun RNA í exósóm fer eftir (1) RNA-völdum þagnarkomplex (RISC)-tengd prótein, (2) RNA raðmyndum og leiðarpróteinum, (3) núkleótíðaviðbótum í 30. enda miRNA, (4) frumuaðgengi miRNA, og (5) keramíð [39,40].

Við trúum því að kjarnablæðing sé annað frumuferli sem gerir kleift að flokka RNA, RNA-próteinfléttur og erfðafræðilegt DNA í frumuflokka. Það eru nokkrar ástæður fyrir þessu sjónarmiði: (1) innihald „intraluminal vesicles“ var svipað og nucleolar karyoplasm [32]. „vesicles“ í nuclearmultivesicular bodies (MVB II) voru auðguð með RNA, súrum og grunnpróteinum, og þess vegna töldu höfundar ' intraluminal vesicles' sem staður fyrir RNA nýmyndun auk tonucleolus [41].

Proteins present in the vesicles may have been RNA-binding proteins and Dicer1 that were detected in exosomes [42] (unpublished data, Kumari Lab, Kansas State University, Manhattan, KS, USA). (2) Considering the nucleus as a site of exosome biogenesis can explain the presence of RNAs including precursor miRNAs (unpublished data, Kumari Lab) and double-stranded genomic DNA fragments ranging from 100 bp to >10 kbin exosomes [43–47].

Tilviljun, erfðafræðilegt DNA greindist aðeins í exósómum úr krabbameinsfrumulínum en ekki venjulegum frumum [47]. Krabbameinsfrumur hafa óeðlilegt litning vegna endurröðunar/flutnings á litningi og ef til vill ploidy [48] sem getur valdið erfðafræðilegu DNA sundrun í krabbameinsfrumukjarna. Þessi DNA brot geta auðveldlega verið felld inn í MVB tegund II (og exosomes) sem þróast í kjarnanum. (3) Lítil blöðrumyndun í kjarnablöðrum sem Kilarski og Jasinski [24] lýstu er svipaður og myndun blaðra í ljósum í síðum innkirtla í umfrymi.

Við trúum því eindregið að tilvist erfðafræðilegs DNA í exosomes sé sjúkleg og þess vegna sé nærvera þess í exosomes hægt að nota sem greiningartæki til að þróa óeðlilegar (eða krabbameins) frumur í líkamanum. (4) Virkniháð aukning á fjölda exósóma sem frumur gefa út [49] er sambærileg við gasfrumur sem sýndu aukna kjarnabólga við að fjarlægja gas úr sundblöðru karfafiska [24].

Nýlega greindust hvatberaprótein og DNA í blóðvökvafrumum sumra krabbameinssjúklinga og tilvist þeirra tengist árásargirni krabbameins [50,51].

Niðurbrot hvatbera sést oft í hrörnunarfrumum [52,53]. Hvatberakristar sem losna úr hrörnunarhvatberum geta verið innbyggðir af fjölblöðrulíkamum og eru að lokum pakkaðir inexosomes.

Þessi hugmynd er studd af öfgamyndum af eitilfrumur úr mönnum og holrými acini í blöðruhálskirtli bavína sem voru með „smáblöðrur“ (eða exosomes) sem komu frá niðurbroti á kristum hvatbera [54].

Byggt á ofangreindum umræðum og stuðningi við tilraunagögn, leggjum við til að ólíkur eðli útrænna stofna sé upprunnin frá lífmyndun fjölblöðrulíkamna og tengdra úthverfa á mismunandi undirfrumustöðum og ekki að öllu leyti í umfrymi eins og við teljum nú. auk misræmis á milli fræðilegra útreikninga og tilraunagagna um fjölda lítilla RNA eða próteinsameinda sem eru í einu exósómi hreinsað úr sermi [55].

Byggt á fræðilegum útreikningum með meðalstærð exósóma, spáðu Li og félagar að hvert exósóm myndi rúma um það bil 70–25,000 litlar RNA- eða próteinsameindir.

Hins vegar sýndu tilraunagögn þeirra tilvist einnar RNA sameindar í hverri exósóm hreinsaðs úr sermi [55]. Tilgáta okkar krefst frekari könnunar á kjarnablæðingum, kjarnaflóttahlutum og lífmyndun exósóma sem innihalda RNA/ríbonucleoprotein kjarna fjölblöðrulíkama.Lipíð eru mikilvægur hluti af frumuhimnum og dreifast ósamhverft á milli frumublaðahimnanna tveggja. Lípíðsamsetning er mismunandi á milli móðurfrumuhimnunnar og exosome himnunnar.

Almennt séð eru lípíð auðguð í frumuhimnum sfingómýlín, keramíð, kólesteról og kólesterólrík lípíðaft örlén, ganglíósíð GM3, mettuð lípíð og fosfatidýlserín [56–58]. Exosomal prótein eru samsett af þeim sem eru sameiginleg fyrir flest einstök og einstök prótein sem og einstök prótein. til ákveðinnar foreldrafrumu.

Próteininnihald allra exósóma er almennt auðgað fyrir miðunar- og samrunaprótein eins og tetraspanín, integrín, chaperoneprótein, td hitasjokkprótein (Hsp60, Hsp70 og Hsp90), litlu HSP himnusmyglpróteinin, Rab prótein, ARF GTPasa, annexín og prótein sem taka þátt í myndun fjölblöðrulaga eins og ALIX og TSG101 [59].

Nýlegri rannsóknir benda til tilvistar RNA-bindandi próteina sem mynda RNA-próteinfléttur í exósómum [38]. Nokkrir frumuferli sem tryggja upphleðslu próteina í exosomesare (1) ESCRT kerfi fyrir prótein með ákveðnum breytingum eftir þýðingu eins og ubiquitination, Wnt-örvaða arginín metýleringu, oxun, fosfórýleringu, glýkósýleringu og sítrúllínering; (2) Chaperone-mediated autophagy (CMA) sem byggir á víxlverkun milli hitalosts samsetts 71 kDa próteins (HSC70) og próteina með KFERQ mótíf.

Eftir að HSC70 hefur verið bundið við prótein með KFERQ mótíf, eru prótein miðuð á fjölblöðrulíkama. Chaperone-miðluð sjálfsát virkar venjulega fyrir niðurbrot próteina í lýsósum. Nýlegri gögn benda til þess að CMA gegni hlutverki í losun exósóma og exósómmiðlaðri dreifingu próteinasaminga í sumum taugahrörnunarsjúkdómum [60-63].

Það hefur verið veldisaukning í rannsóknum á úthverfum frá því á tíunda áratugnum og mikið af gögnum um utanaðkomandi farm hefur verið búið til. Gagnagrunnar hafa verið búnir til til að útvega utanaðkomandi farm áður en það verður of erfitt að stjórna stórum gagnasöfnum.

Endurtekningarnákvæmni birtra gagna um exósóm er önnur ástæða þar sem flestar rannsóknarstofur nota afbrigði af mismunandi aðferðum sem þróaðar hafa verið til að einangra exósóm. Til dæmis er Vesiclepedia handvirkt safn af sameindafarmi (lípíð, RNA og prótein) sem er auðkennt í mismunandi flokkum utanfrumublaðra [64]. Vesiclepedia veitir dýrmætt úrræði fyrir vísindamenn.

Gagnagrunnurinn Vesiclepedia er aðgengilegur almenningi og gerir notendum kleift að spyrjast fyrir um og hlaða niður gögnum frá útlægum farmi á grundvelli leitarskilyrða sem notendur hafa slegið inn. EV pedia, Exocarta, ExoRbase og EV miRNA eru viðbótargagnagrunnar sem skrá exosomalproteins og RNA [64].

Gagnagrunnarnir eru knúnir áfram af samfélagsskýringum. Gögnin sem eru safnað í þessum gagnagrunnum eru fengin með því að einangra exósóm með ýmsum mismunandi aðskilnaðaraðferðum sem eru ekki innifalin í gagnagrunninum.

Innihald utanaðkomandi farms getur því verið mismunandi eftir einangrunaraðferðinni sem notuð er, sem veldur því að niðurstaðan sem tilkynnt er um er tvíræðni. Til að bæta endurgerð tilrauna og gagnsæi var þróað þekkingargrunn EV-TRACK verkfærasett með opnum uppspretta. EV-TRACK nær yfir gögn um undirbúning exósóma og einkenni exósóma [65].

Lykilatriði í EV-TRACK er EV-METRIC sem sýnir skýrslu um tilraunabreytur sem hlutfall af uppfylltum hlutum af lista með níu [66]. Þessir þættir voru ákveðnir af EVTRACK hópnum og voru taldir nauðsynlegir fyrir ótvíræða túlkun gagna og framleiðslu á tilraunagögnum. Þannig var EV-METRIC hannað til að aðstoða vísindamenn og áhorfendur við að veita alhliða yfirsýn yfir gögnin.

2. Núverandi aðferðir við einangrun exósóma

Exosomes eru rík auðlind fyrir uppgötvun lífmerkja og fyrir nýjar meðferðaraðferðir, þar á meðal endurnýjandi lyf. Aðalatriðið fyrir velgengni þessara markmiða er einangrun hreinna exósóma með endurgerðanlegri aðferð.

Einangrun hagnýtra hæfra exósóma er sérstaklega mikilvæg fyrir hugsanlega lækningalega notkun. Exosomes hafa verið hreinsuð úr ýmsum líffræðilegum vökva eins og blóði, plasma, heila- og mænuvökva, munnvatni, þvagi og mjólk. Hver líffræðilegur vökvi hefur mismunandi eðlisfræðilega og efnafræðilega eiginleika sem þarf að hafa í huga áður en exósóm einangrun.

Í sumum tilfellum geta sérstakar varúðarráðstafanir verið nauðsynlegar fyrir einangrun utanfrumna. Lokanotkun hreinsaðra exósóma er annar ákvörðunarþáttur sem hefur áhrif á aðferð við einangrun exósóma.

Hingað til hafa verið þróaðar nokkrar aðferðir til einangrunar á exósómum og sumar þeirra byggjast á eiginleikum utanaðkomandi eins og stærð þeirra, þéttleika, yfirborðshleðslu og prótein sem tengjast yfirborði exósómsins (Mynd 3) [67].

Sumar af þeim exósóma einangrunaraðferðum sem nú eru notaðar eru taldar upp í töflu 1. Flestar þeirra eru ekki sjálfstæðar aðferðir og krefjast fyrri vinnsluþrepa eftir sýni. Áberandi aðferðir eru ræddar í stuttu máli hér að neðan.

Mynd 3. Algengar aðferðir til einangrunar utanfrumna og notkunar þeirra síðar. Nokkrar aðferðir sem þróaðar hafa verið til þessa fyrir einangrun utanfrumna eru byggðar á flotþéttleika þeirra, skema 1, 13 og 1,19 g/ml, útskilvinduaðferðin (UC) var endurbætt til að einangra hreinar efnablöndur af exósómum byggðar á flotþéttleika þeirra með ísópískri útskiljun yfir súkrósa eða jodixanól þéttleikastigli (DG).

Til að fjarlægja hátt próteininnihald í próteinþvagi var útskilvinduaðferðin sameinuð með stærðarútilokunarskiljun (SEC). Tímatakmarkanir tengdar útskilvinduaðferðinni leiddu til þróunar síunaraðferðarinnar (UF).

Með því að koma þynntum sýnum eins og ræktunarmiðli og þvagi í gegnum nanó- eða örhimnuþykkni leyfðist hreinsun exósóma. Himnustífla og léleg endurheimt utanaðkomandi próteina gerði þessa aðferð óvinsæla fyrir notkun á eftirleiðis eins og RNA einangrun og notkun með miklum afköstum.

Önnur aðferð þróuð til að einangra exósóm úr mjög þynntri líffræðilegri vökvaskilun með vökvaskilun (HFD *) ásamt skiljun. Í HFD aðferðinni er sýnið skilað í gegnum skilunarhimnu með 1000 kDa mólþunga undir vatnsstöðuþrýstingi, sem gerir kleift að fjarlægja óæskilegar stórsameindir úr sýninu og exósóm eru endurheimt með skilvindu.

Útfellingaraðferðin sem byggir á leysni eða dreifileika og samloðun var þróuð til að vinna úr nokkrum sýnum samtímis. Auglýsingasett fyrir hreinsun utansóma eru byggð á þessari stefnu.

Í þessari aðferð er þvag-orascites blandað saman við pólýetýlen glýkól (PEG) 6000 eða ásamt prótamíni (auk PEG35.000) og ræktað annað hvort yfir nótt eða 1 klst. á ís.

Grugg blandan sem myndast er skilvinduð til að endurheimta exósóm sem eru notuð til RNA- og próteinagreininga. Önnur hvarfefni sem notuð eru við útfellingu exósóma eru (1) 0,1M natríumasetat pH 4,75 (söltunaraðferð) (NaAc), (2) 4-falt rúmmál af köldu asetoni (−20 ◦C) ( PRotein Organic Solvent Precipitation og skammstafað sem PROSPR), (3) og blöndu af PEG og dextranlausn (allt að 1,5%) (tvífasa aðferð sem gerir kleift að aðskilja prótein frá exósómum).

Að bera kennsl á utanaðkomandi yfirborðsprótein leiddi til þróunar aðferða sem byggjast á ónæmissækni með því að nota mótefni gegn ytri yfirborðspróteinum eins og Tim4, annexíni, EpCAM, algengu ytri yfirborðspróteini, CD63 og hitasjokkpróteinum (sæknisvíxlverkun). Sækni í lektín (sem binst glýkópróteinum á yfirborði exósóma) og heparíni (sem binst heparan súlfat próteóglýkönum á yfirborði exósóma) var nýtt til að þróa einangrunaraðferðir exósóma.

Nokkrir vettvangar eins og segulperlur, mjög gljúpar einlitar kísil öroddar, yfirborð plastplötur, sellulósasíur, himnusækni síur, agarosesorbent og örvökvatæki voru notaðir fyrir sæknitengdar exósómhreinsunaraðferðir og hafa mismunandi kosti fyrir notkun þeirra í greiningarkerfi, forspár, sem lyfjaafhendingarkerfi og greiningu og greiningar á farmi í fæðubótarefnum.

Lagað með leyfi frá Konoshenko MY, Lekchnov EA, Vlassov AV, Laktionov PP. Einangrun utanfrumublaðra: Almenn aðferðafræði og nýjustu straumar.Biomed Res Int. 2018 30. janúar; 2018:8545347. doi:10.1155/2018/8545347. PMID: 29662902; PMCID:PMC5831698; Höfundarréttur © 2022 Maria Yu. Konoshenko o.fl.

Þetta er grein með opnum aðgangi sem dreift er samkvæmt Creative Commons Attribution License, sem leyfir ótakmarkaða notkun, dreifingu og framleiðslu á hvaða miðli sem er, að því gefnu að rétt sé vitnað í upprunalega verkið [67].

For more information:1950477648nn@gmail.com