Sidt2 er lykilprótein í sjálfsát-lýsosomal niðurbrotsferli og er nauðsynlegt fyrir viðhald nýrnabyggingar og síunarvirkni Ⅱ
Nov 07, 2023
UMRÆÐA
Mikill fjöldi rannsókna hefur sýnt að LMPs taka þátt í nýrnastarfsemi eða uppbyggingarjafnvægi [21-25]. Fyrri rannsókn okkar leiddi í ljós að LMP Sidt2 hefur áhrif á bólguboðaleiðina og veldur skemmdum á glomerular mesangial frumum músa [28]. Í þessari rannsókn, í fyrsta skipti, könnuðum við áhrif á uppbyggingu og virkni nýrna músa af völdum LMP Sidt2. Í ljós kom að brottfelling Sidt2 leiddi til samruna nýrnafótarferla músa, þykknunar á grunnhimnu, bjúgs í nýrnapíplum þekjufrumum, skemmda á örvillum og aukinnar próteinmigu eftir 24 klst., sem gefur til kynna að tap á Sidt2 leiði til skertrar síunarvirkni. og uppbyggingu músarnýra, en nákvæmur gangur þess er ekki skýr.
Vegna þess að LMP eru mikilvægar starfrænar einingar lýsósómsins [17] ogleysisvandamáler einn af algengum sjúkdómsvaldandi þáttum margra langvinnra nýrnasjúkdóma (CDK) (tilvísanir [4, 29]), höfum við framkvæmt tengdar rannsóknir á lýsósum eftir brottfellingu Sidt2 og komist að því að súr lýsósóm minnkaði og sýrustig lýsósóm jukust in vitro. Hins vegar voru engar augljósar breytingar á fjölda aðal lýsósóma sem bundin voru sjálfsátfrumum og heildar leysisóma með rafeindasmásjárgreiningu. Cathepsin tákna stærsta hóp próteinlýsandi ensíma í leysisómum [30], þar á meðal er CTSB einn af algengustu lýsósóma próteasunum [31].
Þar sem cathepsin þarf að sýra fyrir þroska (virkjun), mun breyting á pH að lokum leiða til verulegrar lækkunar á niðurbroti próteina [32]. Styrkur in vivo og in vitro sýndi minnkaða virkni og innihald lýsósómalsýruhýdrólasa, sem staðfestir enn frekar að Sidt2 hamlar virkni lýsósóma með því að hafa áhrif á þroska próteasa í leysisómunum.
SMELLTU HÉR TIL AÐ FÁ JURTABÚNAÐUR AF CISTANCHE FYRIR NÝRU
Á sama tíma virkar lýsósómið sem endurvinnslustöð fyrir niðurbrot frumuumbrotsefna og úrgangsefna í lok sjálfsáts [1]. Eðlileg niðurbrotsvirkni er nauðsynleg fyrir sjálfsát, viðhalda frumujafnvægi og gera frumum kleift að lifa af í lífeðlisfræðilegu ástandi [33-36]. Sýnt hefur verið fram á að tilkoma og þróun margra nýrnasjúkdóma tengist óeðlilegri sjálfsát [37-39]. Nýlegar rannsóknir hafa leitt í ljós að Sidt2 er DNA/RNA flutningsefni. Óhefðbundnar tegundir sjálfsáfalls í gegnum RNautophagy og DNautophagy (RDA) eru mikilvægar fyrir sértækt RNA/DNA niðurbrot [40]. Við höfum áður komist að því að brottfelling Sidt2 skaðar samruna sjálfsátfrumna og lýsósóma, sem veldur því að skemmdir hvatberar geta ekki brotnað niður, sem leiðir til skemmda á uppbyggingu og starfsemi beinagrindarvöðva [41]. Þess vegna, í þessari rannsókn, könnuðum við sjálfsát þegar nýrnaskemmdir voru af völdum Sidt2 eyðingar. Við sáum að autophagolysosomes söfnuðust upp í nýrum Sidt2−/− músa með rafeindasmásjá. Sjálfsát er kraftmikið ferli, þar með talið myndun sjálfsátsfrumna og myndun og niðurbrot á sjálfsátfrumum. Myndun snemma autophagosomes er stjórnað af Atg geninu og myndun LC3-II er merki um autophagosome myndun [42]. Við komumst að því að tjáning sjálfsátatengdra próteina Atg og LC3-II jókst bæði eftir Sidt2 eyðingu, sem gefur til kynna að sjálfsátsvirknin gæti aukist. Hins vegar getur uppsöfnun LC3-II einnig stafað af stíflu á autophagolysosomes ferli í lok sjálfsáts
Til að kanna frekar áhrif Sidt2 á sjálfsátsástand nýrna var tjáning og myndun P62 farmpróteins mæld og einnig voru áhrif lyfja sem beinast að sjálfsát (CQ og RAPA) rannsökuð. P62 þarf að sameina við LC3B og brjóta síðan niður í leysisóminu. Aukning á magni P62 próteins táknar oft stíflu á sjálfsátflæði [43]. Til að útrýma orsök aukningar á P62 framleiðslu, mældum við mRNA magn P62 og komumst að því að framleiðsla á P62 minnkaði, þannig að uppsöfnun LC3-II var líklega vegna hindraðs niðurbrots. Til að kanna frekar ferlið sjálfsáfalls gerðum við klórókínfliptilraun. Klórókín getur hlutleyst súrt umhverfi lýsósómsins og í kjölfarið eyðilagt virkni lýsósómsins og hindrað sjálfsát [44]. Aukningin á LC3-II próteini fyrir og eftir CQ meðferð endurspeglar fjölda autophagosomes sem brotna niður af lysosomes, sem geta endurspeglað virkni autophago. Sama CQ flip prófið er einnig hægt að nota til að ákvarða magn P62 niðurbrots í gegnum autophagolysosome ferlið. Í samræmi við niðurstöður okkar leiddi brottfelling Sidt2 til minnkunar á sjálfsátflæði vegna stíflaðs enda sjálfsáts. Á sama tíma, í RAPA tilrauninni, jókst LC3-II og P62 próteinmagn verulega í Sidt2−/− hópnum, sem getur enn frekar stutt að skortur á Sidt2 skerði lokafasa sjálfsáts.
Lokaáfangi sjálfsáfalls felur í sér myndun og niðurbrot sjálfsáfalla. Við notuðum LAMP1 og LC3B ónæmisflúrljómun samstaðsetningartilraunir til að greina samruna autophagosomes og lysosomes [45, 46], og niðurstöðurnar sýndu að samruni autophagosomes og lysosomes var læst eftir Sidt2 eyðingu. Ad-mCherry-GFP-LC3B tvöfalda merkingartilraunin greinir myndun og niðurbrot á sjálfsátfrumum [27]. Það staðfesti ennfremur að stífla á myndun og niðurbroti sjálfsáfalla er aðalástæðan fyrir skemmdum á uppbyggingu og starfsemi nýrna eftir brottfellingu Sidt2.
Af ofangreindum niðurstöðum getum við dregið þá ályktun að skortur á Sidt2 valdi fækkun á súr lýsósómum og að súrnunarvandamál leysisómanna hafi áhrif á þroska vatnsrofna ensíma. Þetta kann að vera mikilvægasta orsök skemmda á sjálfsát-lýsósóm niðurbrotsferlinu auk sjálfsátafósóma og lýsósómsamrunasjúkdóma. Á sama tíma getur skert sjálfsátferlið verið nátengt skemmdri nýrnabyggingu og síuvirkni eftir brottfellingu Sidt2 (mynd 8). Rannsókn okkar fjallar aðeins um hluta af áhrifum Sidt2 á nýrnabyggingu og nýrnastarfsemi, en það sem er áhugavert er að uppsöfnun lykilpróteina í sjálfsát og skerðing á uppbyggingu og starfsemi nýrna af völdum brottfalls Sidt2 eru svipuð breytingum á helstu sjálfsátapróteinum og marktækt aukin próteinmigu sem sést við nýrnakvilla af völdum sykursýki [37, 47]. Viðgerð á lýsósómavirkni gæti verið möguleg ný aðferð til að meðhöndla nýrnakvilla af völdum sykursýki [37]. Við gerum ráð fyrir að Sidt2 muni veita leið til að kanna meingerð og meðferð nýrnasjúkdóma í framtíðinni.
Próteinpróf í þvagi í músum. Tilviljunarkennt 12-vikugamlar WT mýs og Sidt2−/− karlkyns mýs voru settar í efnaskiptabúr og fastuðu en fengu vatn. 24 klst. þvagsýnum var safnað og síðan prófað með tilliti til próteins í þvagi (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, CHN, C035-2-1) (vinsamlegast skoðaðu viðbótarefni fyrir nákvæmar aðferðir). Frumur MPC5 gaukulfrumur úr músum voru keyptar frá BeNa Culture Collection og ræktaðar með 10% FBS (Excell Bio, Suður-Ameríku, FSP500) og lág-glúkósa DMEM (Sigma-Aldrich, 6046). SV40 MES 13 músa glomerular mesangial frumur voru keyptar frá dæmigerðum ræktunarverndarnefnd frumubanka kínversku vísindaakademíunnar og ræktaðar með 10% FBS (Excell Bio, Suður Ameríku, FSP500) og háglúkósa DMEM (Sigma-Aldrich, 6429) . Styrkur CO2 í frumuræktunarboxinu var haldið í 5% og hitastiginu haldið við 37 gráður. Klórókín (CQ) og rapamýsín (RAPA) voru keypt frá Sigma-Aldrich (C6628, V900930). 10 mM CQ og 25 mg/ml rapamýsín voru bæði leyst upp í ofurhreinu vatni. CQ var bætt við petrískálina þannig að endanlegur styrkur var 50 μM og ræktað í 16 klst sem sjálfsátshemill. Rapamýsíni var bætt við petrískálina í lokastyrknum 15 μM og ræktað í 2 klst sem sjálfvirka virkja. CRISPR/Cas9 genabreytandi lentivirus vektorkerfi var notað til að fjarlægja Sidt2 gen Lenticrispr-v2 (AddgenePlasmid49535, Feng Zhang) plasmíð voru keypt og sgRNA nethönnunarverkfærið (http://crispr.mit.edu/) var notað til að hanna sgRNA sem miðar á Sidt2.
Grunnraðirnar voru sem hér segir: F: 5'-ACCACACCGTGACCC CAC-3', R: 5'-GTTGCGGGTCACTGGTGT-3′, framleidd af líftæknifyrirtæki (Sangon Biotech, Shanghai, CHN). Með því að nota CRISPR/Cas9 lentivirus kerfið var Lenticrispr-v2 plasmíðið línuskipt og tengt við annealed sgRNA duplexið til að smíða Lenticrispr-v{{1{{180}}}} Sidt2 raðbrigða plasmíðið. Vigofect (Vigorous Biotechnology, Beijing, CHN) transfection hvarfefni var notað til að transfræða Lenticrispr-v2 plasmíðið og Lenticrispr-v2-Sidt2 raðbrigða plasmíðið til að smíða lentiveiru. Lentiveiran sem fékkst var sýkt inn í MPC5 frumurnar og SV40 MES 13 frumurnar. Eftir 48 klst voru frumurnar ræktaðar með púrínómýsíni í 72 klst til að velja. Frumurnar sem lifðu af voru Sidt2+/+ hópurinn og Sidt2−/− hópurinn sem hafði verið fluttur með góðum árangri. RNA einangrun og rauntíma PCR próf Trizol (Invitrogen) var notað til að draga RNA úr nýrnafrumum músa og sértæka RT-PCR aðferðin var eins og áður hefur verið lýst [21]. Grunnraðir RT-PCR voru sem hér segir: Aktín (skilningur: F: 5′- GGACTCC TATGTGGGTGACG-3′, R:5′-CTTCTCCATGTCGTCCCAGT-3′), P62(skilning: F:5 '- GGACCCATCTACAGAGGCT G-3', R: 5'-ATCACAATGGTGGAGGGTGC-3'), Sidt2(skilning: F:5'-TAGTGCCTGTTACCACGTCTTGC-3', R:5'CAGTCAGTCAGT{GG {48}}′). Western blotting Sértæka aðferðin er eins og áður sagði [28]. Í þessari rannsókn innihéldu aðal mótefni kanínu and-LC3B (1:1000; Sigma-Aldrich L7543), kanínu-anti-P62 (1:1000; Abcam ab205719), músa and- -Actin (1:1000; Sigma Aldrich) A5316), kanínu-anti-Sidt2 (1:1000; Invitrogen PA5-69064), kanína-anti-Atg5 (1:1000; Cell Signaling Technology 9980S), kanína and-Atg7 (1:1000; Cell Signaling Technology 8558S) , kanína andstæðingur-Atg12 (1:1000; Cell Signaling Technology 2011S), mús andstæðingur-LAMP1 (1:1000; Santa Cruz Biotechnology H4A3), kanína and-kathepsín B (1:1000; Cell Signaling Technology 31718S). Ad-mCherry-GFP-LC3B Frumurnar voru sáðar á Nunc glerbotna Petri diska. Eftir að hafa vaxið í hæfilegan þéttleika var Ad-mCherry-GFP-LC3B bætt við (Beyo time, Shanghai, CHN, C3011-10 mL), sem leiddi til lokastyrks upp á 10 -11 vp/ml. Eftir örvun í 48 klst. sást fjöldi mCherry og GFP flúrljómunarpunkta beint undir leysissmásjánni (Leica SP8, Þýskalandi). Ónæmisflúrljómun Frumurnar voru sáðar á Petri diska með glerbotni og festar með paraformaldehýði. Eftir lokun voru frumurnar ræktaðar yfir nótt með aðalmótefni og síðan ræktaðar með aukamótefni í 90 mínútur í myrkri. Frumurnar voru ljósmyndaðar með leysiskönnun confocal smásjá (Leica SP8, Þýskalandi) eftir að hafa litað kjarnana með DAPI (1 ug/mL). Aðalmótefni voru P62 (1:200; Abcam ab205719), LAMP1 (1:200; Santa Cruz líftækni H4A3), LC3B (1:200; Sigma-Aldrich L7543); efri mótefni innihéldu and-mús secondary and Cy3-conjugated Affinipure geit and-mús IgG (H + L) (1:200; Proteintech SA00009-1), CoraLite488-conjugated Affinipure geit anti-mús IgG (H + L) (1:200; Proteintech SA00013-1), CoraLite594- samtengd Affinipure geit gegn kanínu IgG (H + L) (1:200; Proteintech SA{{144 }}). Fyrir LysoTracker (Beyotime, Shanghai, CHN, C1046) sátum við líka frumurnar á glerbotna Petri diska. Eftir að hafa vaxið í hæfilegan þéttleika var frumuræktunarvökvi sem innihélt LysoTracker lokastyrk upp á 75 nM bætt við frumurnar sem voru myndaðar eftir 45 m örvun. Notaðu ImageJ til að telja fjölda flúrljómandi punkta og Pearson fylgnistuðulinn. Sendingarrafeindasmásjár Athuganir Úr hverjum hópi voru 3-5 12-vikna gamlar Sidt2-/- og WT karlkyns mýs valdar af handahófi til að undirbúa rafeindasmásjársýni af nýrnavef, og sértæka aðferðin er eins og lýst er fyrr [48] , taktu myndir af hlutunum af handahófi með rafeindasmásjá, það eru fleiri en 10 myndir teknar úr nýrnasköflum fyrir hverja mús, veldu af handahófi 3–5 myndir með 8000× stækkun úr rafeindasmásjá myndum af hverri mús, reiknaðu fjölda sjálfsátsfrumna á myndinni og berðu saman Sidt2−/− hópinn við WT hópinn. Varðandi undirbúning frumu rafeindasmásjársýna, skafa ekki færri en 105 frumur með frumusköfu og safna þeim í EP túpu, síðan skilvinda við 800 rpm/mín í 5 m, fleygja flotinu og fylla það með rafeindasmásjá festaefni. Eftir að hafa verið geymd í 4 gráðu kæli í meira en 1 klst. er hægt að senda það til skoðunar. Rafeindasmásjáin var tekin af KingMed Diagnostics (Guangzhou, Kína). LysoSensor Frumurnar voru sáðar á 96-brunnsplötu. Eftir að hafa vaxið í viðeigandi þéttleika var forhituðum (37 gráður) miðli sem innihélt 1 µM LysoSensorDND-160® (Thermo Fisher L7545) bætt við. Frumurnar voru ræktaðar í 5 mínútur við 37 gráður og síðan var miðillinn fjarlægður og skipt út eftir að hafa þvegið frumurnar þrisvar sinnum með PBS. WellScan háttur var notaður til að lesa plötuna í BioTek Citation 5 (BioTek, Winooski, VT, Bandaríkjunum). Flúrljómun var mæld með Ex360nm/Em450nm og Ex380nm/Em540nm örvun/losunarbylgjulengdum, og sýrustig leysisómsins var ákvarðað út frá hlutfallinu Em540 og Em450. Tölfræðileg greining Niðurstöðurnar voru gefnar upp sem meðaltal ± SEM. Tölfræðilegur samanburður á milli tveggja hópa var gerður með því að nota ópöruð t-próf. Þegar Graphics 8.0 hugbúnaður var notaður við tölfræðilega greiningu var P < 0,05 talið tölfræðilega marktækt. Hver hópur tilrauna í þessari rannsókn var endurtekinn að minnsta kosti þrisvar sinnum sjálfstætt. FÁLÆGT gagna Gagnasöfnin sem eru mynduð og/eða greind í yfirstandandi rannsókn eru fáanleg hjá samsvarandi höfundi ef sanngjarnt er óskað eftir því.
HEIMILDIR
1. Settembre C, Fraldi A, Medina DL, Ballabio A. Merki frá lýsósóminu: stjórnstöð fyrir frumuúthreinsun og orkuefnaskipti. Nat Rev Mol Cell Biol. 2013;14:283–96.
2. Lamming DW, Bar-Peled L. Lysosome: Efnaskiptamerkjamiðstöðin. Umferð. 2019;20:27–38.
3. Ballabio A. Hinn æðislegi leysisóm. EMBO Mol Med. 2016;8:73–76.
4. Yamamoto T, Takabatake Y, Takahashi A, Kimura T, Namba T, Matsuda J, o.fl. Fituríkt mataræði af völdum leysisvandamála og skert sjálfsáfallsflæði stuðla að eiturverkunum á fitu í nýrum. J Am Soc Nephrol. 2017;28:1534–51.
5. Nonclercq D, Wrona S, Toubeau G, Zanen J, Heuson-Stiennon JA, Schaudies RP, et al. Pípulaga meiðsli og endurnýjun í rottum nýra eftir bráða útsetningu fyrir gentamísíni: tímarannsókn. Ren Fail. 1992;14:507–21.
Stuðningsþjónusta Wecistanche - Stærsti útflytjandi cistanche í Kína:
Netfang:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Sími:+86 15292862950
Verslaðu fyrir frekari upplýsingar:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
