Salmonella Enterica Serovars í fjarveru TtrA og PduA gena auka ónæmissvörun frumna við sýkingar kjúklinga

Salmonella spp. er einn helsti matarsýkillinn sem ber ábyrgð á að valda alifuglaiðnaðinum efnahagslegu tjóni og hafa einnig afleiðingar fyrir lýðheilsu. Bæði lifunargeta sýkla í þarmaumhverfi við bólgu sem og tengsl þeirra við ónæmiskerfið hýsilsins gegna lykilhlutverki við sýkingar í alifuglum. Markmið þessarar rannsóknar var að mæla nærveru átfrumna og CD4+ /CD8+ frumustofna með því að nota ónæmisvefjaefnafræði tækni, í viðskiptalegum ættum kjúklinga sem sýkt voru með tilraunastarfsemi af villigerð og stökkbreyttum stofnum af Salmonellu Enteritidis og Salmonella Typhimurium skortir ttrA og pduA gen. Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA olli hærra hlutfalli af lituðu svæði en villigerðin, að undanskildum ljóshænum. Salmonella Typhimurium villitegundastofn og Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA sýkingar leiða til svipaðs mynsturs þar sem, við 1 og 14 dpi, sýndu hálskirtlar og þvaglegg fugla meira svipmikið litað svæði samanborið við 3 og 7 dpi. Í öllum ættkvíslum sem rannsakaðar voru sást áberandi íferð átfrumna í samanburði við CD4+ og CD8+ frumur. Á heildina litið sýndu dýr sem voru sýkt af stökkbreytta stofninum jákvætt litað svæði hærra en villigerðin. Úrfellingar í bæði ttrA og pduA genum leiddu til kröftugri íferðar átfrumna og CD4+ og CD8+ fruma í hýsilfuglunum, sem bendir til þess að sjúkdómsvaldið hafi ekki veikst, jafnvel í mismunandi stofnum af Salmonellu.

cistanche ávinningur fyrir karla styrkir ónæmiskerfið

Salmonella enterica er matarborinn sýkill sem veldur tjóni á búfé og hefur bein áhrif á lýðheilsu. Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis (Salmonella Enteritidis) og Typhimurium (Salmonella Typhimurium) hafa aðallega verið tengd matarsýkingum í áratugi. Á árunum 1995 til 2010 greindist Salmonella Enteritidis í 34,2% allra sýna sem voru jákvæð fyrir Salmonella spp1. Fyrir utan það birtu Winter et al.2 umfangsmikla rannsókn þar sem tetraþíónat-kóða genahlutverkið var valið, þar sem sermisgerðin Salmonella Typhimurium var valin en mýs notaðar sem tilraunalíkan. Að teknu tilliti til þessa gæti dýpkun þekkingar okkar á samskiptum hýsils og sýkla hjálpað til við að bæta eftirlit og útrýmingarmælingar. Nokkrir þættir taka þátt í sjúkdómsmyndun salmonellu, svo sem hæfni sýkilsins til að fjölga sér í bólgu í slímhúð, allt eftir næringarsöfnun og loftfirrtri öndun2. Hins vegar tryggir framboð næringarefna ekki lifun baktería í samkeppnisumhverfi sem er þéttbýlt af öðrum örverum. Þannig veitir hæfni Salmonella enterica til að umbrotna tetraþíónat með því að nota tetraþíónatredúktasa til að framleiða 1,2-própandíól sem orkugjafa, líkamsræktarkosti. Þetta ensím er myndað af TtrA, TtrB og TtrC. Fyrsta undireiningin sem vitnað er í tilheyrir mólýbdópteríni (MPT) yfirfjölskyldunni og hefur FeS afmarkandi lén sem tekur þátt í minnkun tetraþíónats í þíósúlfat (S2O3 2-)2–4. Te 1,2-própandíól er notað af bakteríuörum (MCP). Þessi uppbygging samanstendur af sjö mismunandi próteinum, þar á meðal er PduA aðalþátturinn í MCP uppbyggingu5. Í fyrsta lagi er 1,2-própandíól breytt í própíónaldehýð, sem aftur er minnkað í própanól og própíónat með própandíóldehýdrasavirkni. Þetta ferli myndar ATP með fosfórun, rafeinda (1-própanól) halla til NAD endurnýjunar, og milliliður (própíónýl-CoA) sem hægt er að nota sem kolefni og orkugjafa í gegnum metýlsítrat í gegnum, sem er háð B12 vítamíni sem er tilbúið á innrænan hátt6. Meðan á kjúklingasýkingum stendur er getu Salmonella enterica serovar til að ráðast inn og lifa af innan þekjufrumna og átfrumna í þörmum fylgt eftir með því að forðast ónæmissvörun7. Í því samhengi er sýkingin mikilvægur áfangi sem veltur á samspili bakteríu- og hýsilfrumna og getu baktería til að sigrast á þekjuþekjuhindrunum í þörmum til að tryggja landnám hennar og eftirmyndun. Engu að síður virkjar það bólgusvörun og ónæmissvörun8 sem leiða til innfrumumyndunar og átfrumna af þekjufrumum og mótefnavaka-kynja frumum (APC), í sömu röð. Örverueyðandi virkni þessara frumna kallar fram meðfædda svörun í gegnum átfrumur og aðlagandi ónæmissvörunarsamsetningin byggir á CD4+ og CD8+ virkjun9. Til að varpa ljósi á víxlverkanir hýsils og sýkla á bak við þarmasýkingu af völdum Salmonellu í kjúklingum, metum við stofn ónæmiskerfisfrumna við landnám í þörmum og kerfisbundna sýkingu í fuglum af viðskiptalegum ættum sem þjást af villigerð stökkbreyttum stofnum af Salmonella Enteritidis og Salmonella Typhimurium , sem bera úrfellingar í genum sem tengjast umbroti tetraþíónats (ttrA) og 1,2-própandíóls (PDU).

cistanche tubulosa-bæta ónæmiskerfið

Niðurstöður

Tilraun 1—Salmonella Enteritidis áskorun.

Niðurstöður magngreiningar á nærveru ónæmissvörunarfrumna í hálshálskirtlum, hálskirtli, ristli og lifur úr kálhænum, léttum varphænum og hálfþungum varphænum eru sýndar í töflum 1, 2 og 3. Við fundum fleiri CD 4+ og átfrumnaíferð frá ungkjúklingum sem hafa fengið Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA (SEΔttrAΔpduA) en frá ungkjúklingum sem hafa fengið Salmonella Enteritidis villigerða stofn (wt-SE) eða ósýktum fuglum, í öllum metnum vefjum. Undantekning fannst fyrir CD4+ frumuíferð við 3 dpi í hálshálskirtlum, ristli og lifur, og fyrir átfrumnaíferð við 3 og 14 dpi í lifur frá SEΔttrAΔpduA smituðum ungkjúklingum. Þar að auki sást fjöldi CD8+ frumna sem síast inn í meira magni frá fuglum sem fengu SEΔttrAΔpduA við 1 og 7 dpi í hálsi og lifur, við 3 dpi í hálshálskirtlum og 14 dpi í hálskirtli. Aftur á móti höfðu Wt-SE-áskoranir fuglar mikla íferð CD8+ frumna í ristli og hálskirtlum við 1 og 7 dpi, í sömu röð (flipi 1; viðbótarmynd S1). Tafla 2 og aukamynd S2 sýna CD4+ og CD8+ og átfrumnaíferð sem finnast í vefjum hálfþungra varphænna. Almennt séð var mikill munur á milli svæða frumuíferðar bæði varðandi áskorunarstofninn og vefina sem rannsakaðir voru. Fuglar sem fengu SEΔttrAΔpduA sýndu hærri svæði sem eru þakin CD4+ frumum (í ileum við 1 og 14 dpi og lifur við 7 dpi), og átfrumur (í ileum við 7 dpi, og lifur við 3, 7 og 14 dpi), en í sama vefi fugla sem þjást af WT-SE. Á hinn bóginn fundust CD8+ frumur í meira magni í hálshálskirtlum (við 1 og 7 dpi) og caecum (við 3 dpi) fugla sem voru smitaðir af wt-SE stofni. Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA, sem sást með öðrum hætti hjá kálfuglum og hálfþungum varpungum, olli minna ákafa ónæmissvörunarfrumum en villigerðin, í áskorun frá léttum varphænum. Fuglar með Wt-SE-áskorun sýndu stærri CD4+ íferðarsvæði í hálskirtlum (við 1 og 3 dpi), caecum (við 3, 7 og 14 dpi), ileum (við 1 og 7 dpi) og lifur (við 3, 7 og 14 dpi). 14 dpi). Á sama hátt hafa áskoranir með SEΔttrAΔpduA leitt til minni íferðarsvæða bæði CD8+ í hálshálskirtlum (við 1 dpi) og ileum (við 7 og 14 dpi), og átfrumum í hálshálskirtlum og hálskirtlum (við 3 dpi), í samanburði við Wt-SE-áskorunarfugla. Engar marktækar breytingar á svæði ónæmiskerfisfrumna CD8+ og átfrumna sáust í lifur frá bæði SEΔttrAΔpduA og wt-SE-þróuðum fuglum. Nákvæmar niðurstöður áskorunarinnar með ljóshænum eru sýndar í töflu 3 (sjá viðbótarmynd S3).

Tafla 1. Framsetning umtalsverðs munar sem tengist magndreifingu mismunandi ónæmissvörunarfrumna í líffærum kjúklinga sem eru sýktir af Salmonella Enteritidis villtum og stökkbreyttum stofnum á mismunandi dögum eftir sýkingu. DPI, dagar eftir sýkingu; ∆-SE, Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA; wt-SE, Salmonella Enteritidis villigerð; ns, enginn verulegur munur. Innan hvers líffæris og DPI þýðir * mismun með tvíhliða ANOVA fylgt eftir með samanburðarprófi Bonferroni á gildi villtra og stökkbreyttra stofna (*P Minna en eða jafnt og 0.05; **P Minna en eða jafnt og 0.01; ***P Minna en eða jafnt og 0,001; ****P Minna en eða jafnt og 0,0001). Stofninn sem sýndur er í töflunni (∆-SE eða wt-SE) sem marktækur innan líffæris og DPI er sá sem sýndur er meginþenslusvæði hverrar frumu.

Tafla 2. Framsetning á umtalsverðum mun sem tengist magndreifingu mismunandi ónæmissvörunarfrumna í líffærum hálfþungra varphænna sem smitast af Salmonella Enteritidis villtum og stökkbreyttum stofnum á mismunandi dögum eftir sýkingu. DPI, dagar eftir sýkingu; ∆-SE, Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA; wt-SE, Salmonella Enteritidis villigerð; ns, enginn verulegur munur. Innan hvers líffæris og DPI þýðir * mismun með tvíhliða ANOVA fylgt eftir með samanburðarprófi Bonferroni á gildi villtra og stökkbreyttra stofna (*P Minna en eða jafnt og 0.{{10}}5 ; **P Minna en eða jafnt og 0,01; ***P Minna en eða jafnt og 0,001; ****P Minna en eða jafnt og 0,0001). Stofninn sem sýndur er í töflunni (∆-SE eða wt-SE) sem marktækur innan líffæris og DPI er sá sem sýndur er meginþenslusvæði hverrar frumu.

Tafla 3. Framsetning á marktækum mun sem tengist magndreifingu mismunandi ónæmissvörunarfrumna í líffærum ljóshænsna sem smitast af Salmonella Enteritidis villtum og stökkbreyttum stofnum á mismunandi dögum eftir sýkingu. DPI, dagar eftir sýkingu; ∆-SE, Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA; wt-SE, Salmonella Enteritidis villigerð; ns, enginn marktækur munur. Innan hvers líffæris og DPI þýðir * mismunur með tvíhliða ANOVA fylgt eftir með samanburðarprófi Bonferroni á gildi villtra og stökkbreyttra stofna (*P Minna en eða jafnt og 0.{{10}}5 ; **P Minna en eða jafnt og 0,01; ***P Minna en eða jafnt og 0,001; ****P Minna en eða jafnt og 0,0001). Stofninn sem sýndur er í töflunni (∆-SE eða wt-SE) sem marktækur innan líffæris og DPI er sem sýnir helstu íferðarsvæði hverrar frumu.

cistanche plöntuaukning ónæmiskerfi

Smelltu hér til að skoða Cistanche Enhance Immunity vörur

【Biðja um meira】 Netfang:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Tilraun 2—Salmonella Typhimurium áskorun.

Niðurstöður magngreiningar á nærveru ónæmissvörunarfrumna í hálshálshálskirtlum, hálskirtli, hálskirtli og lifur frá kálfiskum, hálfþungum varphænum og léttum varphænum eru sýndar í töflum 4, 5 og 6, í sömu röð. Á heildina litið sýndu holdakjúklingar, sem sýktir voru af stökkbreytta stofninum, jákvætt merkt svæði hærra en þeir sem fengu Salmonella Typhimurium villigerða stofninn (wt-STM) alla fjóra sýnatökudagana. Þar að auki sáust engar breytingar á ónæmissvörunarfrumum í ósýktum samanburðarhópum. CD4+ frumusvæðin í öllum vefjum kjúklinga náðu tölfræðilegum mun við 1 dpi, með stærri íferðum fyrir áskorunina með Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA (STM∆ttrA∆pduA). Marktækur munur á flatarmáli magngreindra ónæmissvörunar frá STM∆ttrA∆pduA- og wt-STM ögruðum fuglum hafði verið, með stærri íferðum þegar áskorunin var með stökkbreytta stofninum í blindandi og þörmum við 1 dpi og lifur. við 14 dpi (CD8+ frumur); í caecum, ileum og lifur við 1 og 14 dpi (átfrumur) (tafla 4; aukamynd S4). Niðurstöður frá hálfþungum varpfuglum sýndu engan tölfræðilegan mun á stökkbreyttum og villigerða stofna áskorunum fyrir CD4+ frumur í blindhimnu og CD8+ frumum í hálshálskirtlum og þörmum alla 4 dagana eftir sýkingar metnar (tafla 5; viðbótarmynd S5). Hins vegar, þegar marktækt styrktarsvæði ónæmiskerfisfrumna sást, voru hálfþungu varphænurnar ögraðar af STM∆ttrA∆pduA: helstu átfrumum íferðarsvæði í öllum vefjum sem rannsakaðir voru (við 1 og 14 dpi); stórt íferðarsvæði CD4+ frumna í hálskirtlum og lifur (við 1, 7 og 14 dpi) (tafla 5; aukamynd S5). Tafla 6 og aukamynd S6 sýna CD4+, CD8+ og átfrumuíferð sem finnast í vefjum léttra varphæna. Fuglar með STM∆ttrA∆pduA sýndu aðal ónæmiskerfisfrumnasvæði CD4+ og átfrumna í hálskirtlum og hálskirtli (við 14 dpi) og ileum (við 1 og 14 dpi) í samanburði við ónæmissvörunarfrumur svæði sömu vefja frá Wt-STM ögruðum fuglum. Enginn tölfræðilegur munur fyrir CD8+ íferðarsvæðið hafði fundist í hálskirtlum, hálskirtli og þörmum frá veikum fuglum. Öfugt við niðurstöður sem fengust í öðrum vefjum, hafði lifrin frá STM∆ttrA∆pduA-áskorun fuglum meira tjáningarlitað svæði ónæmissvörunarfrumna fyrir CD4+ og CD8+ frumur á öllum fjórum dpi, og átfrumur við 1 og 14 dpi.

Tafla 4. Sýning á umtalsverðum mismun sem tengist magndreifingu mismunandi ónæmissvörunarfrumna í líffærum kálfa sem sýktar eru af Salmonella Typhimurium villtum og stökkbreyttum stofnum á mismunandi dögum eftir sýkingu. DPI, dagar eftir sýkingu; ∆-STM, Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA; wt-STM, Salmonella Typhimurium villigerð; ns, enginn verulegur munur. Innan hvers líffæris og DPI þýðir * mismun með tvíhliða ANOVA fylgt eftir með samanburðarprófi Bonferroni á gildi villtra og stökkbreyttra stofna (*P Minna en eða jafnt og 0.05; **P Minna en eða jafnt og 0.01; ***P Minna en eða jafnt og 0,001; ****P Minna en eða jafnt og 0,0001). Stofninn sem sýndur er í töflunni (∆-STM eða wt-STM) sem marktækur innan líffæris og DPI er sá sem sýndur er meginþenslusvæði hverrar frumu.

Tafla 5. Sýning á umtalsverðum mun sem tengist magndreifingu mismunandi ónæmissvörunarfrumna í líffærum hálfþungra varphænna sem smitaðar eru af Salmonella Typhimurium villtum og stökkbreyttum stofnum á mismunandi dögum eftir sýkingu. DPI, dagar eftir sýkingu; ∆-STM, Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA; wt-STM, Salmonella Typhimurium villigerð; ns, enginn verulegur munur. Innan hvers líffæris og DPI þýðir * mismun með tvíhliða ANOVA fylgt eftir með samanburðarprófi Bonferroni á gildi villtra og stökkbreyttra stofna (*P Minna en eða jafnt og 0.{{10}}5 ; **P Minna en eða jafnt og 0,01; ***P Minna en eða jafnt og 0,001; ****P Minna en eða jafnt og 0,0001). Stofninn sem sýndur er í töflunni (∆-STM eða wt-STM) sem marktækur innan líffæris og DPI er sá sem sýndur er meginþenslusvæði hverrar frumu.

Tafla 6. Framsetning á marktækum mun sem tengist magndreifingu mismunandi ónæmissvörunarfrumna í líffærum ljóshænsna sem smitast af Salmonella Typhimurium villtum og stökkbreyttum stofnum á mismunandi dögum eftir sýkingu. DPI, dagar eftir sýkingu; ∆-STM, Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA; wt-STM, Salmonella Typhimurium villigerð; ns, enginn marktækur munur. Innan hvers líffæris og DPI þýðir * mismunur með tvíhliða ANOVA fylgt eftir með samanburðarprófi Bonferroni á gildi villtra og stökkbreyttra stofna (*P Minna en eða jafnt og 0.{{10}}5 ; **P Minna en eða jafnt og 0,01; ***P Minna en eða jafnt og 0,001; ****P Minna en eða jafnt og 0,0001). Stofninn sem sýndur er í töflunni (∆-STM eða wt-STM) sem marktækur innan líffærisins og DPI sem sýnir helstu íferðarsvæði hverrar frumu.

Umræða

Þegar bakteríur verða fyrir loftfirrtum aðstæðum geta þær notað tetraþíónat og 1,2-própandíól efnaskiptahvarfefni sem orku- og öndunargjafa10. Þannig hafa Salmonella spp. hefur lengi verið rannsakað hvernig eyðing gena sem vitað er að bera ábyrgð á þessum ferlum hefði áhrif á lifun þeirra í hýsilnum. Eftir því sem við best vitum var aðeins ein rannsókn sem rannsakaði hlutverk tetraþíónat- og própandíólkóðar gena samtímis birt. Rannsóknarhópurinn okkar greindi frá áhrifum þessara úrfellinga með því að meta almenna sýkingu og saurútskilnað Salmonella Enteritidis og Salmonella Typhimurium í ættkvíslum kjúklinga í atvinnuskyni11. Til að auka umræðuna um þetta efni, lögðu núverandi niðurstöður áherslu á ónæmisfrumuna sem síast inn í mismunandi vefi kjúklingaætta sem þjást af bæði villigerð og stökkbreyttum stofnum sem bera úrfellingar í ttrA og pduA genum. Í 2-viku tilrauninni fylgja jákvætt lituðu svæði CD4+ og CD8+ frumna og átfrumna að mestu svipuðu mynstri, þar sem við 1 og 14 dpi sýna hærri fjölda ónæmissvörunar frumur. Þetta má útskýra með aðalsnertingu varnarkerfis hýsilsins þegar sýkillinn ræðst inn. Fyrri skýrslan hefur sýnt að hjá kjúklingum sem eru sýktir, jafnvel þegar Salmonella skilst ekki út við 12 dpi, getur sýkingin orðið jákvæð með húðþurrku frá 13 dpi12, sem útskýrir hvers vegna ónæmiskerfisfrumusvæði við 3 og 7 dpi voru lægri en aftur til aukningar . Við fyrstu sýn má búast við að framkölluð svörun hýsilsins myndi minnka þegar bæði pduA og ttrA var eytt þar sem þessi gen gegna mikilvægu hlutverki í lifun við sýkingu af völdum Salmonella2,4,13–15. Hins vegar sýndu niðurstöður okkar, þar sem tvöfalt stökkbrigði sem skorti bæði genin, hið gagnstæða, stökkbreyttir stofnar Salmonella Enteritidis og Salmonella Typhimurium kölluðu fram hærri ónæmissvörunarfrumur en villtar tegundir stofna.

Kostir cistanche tubulosa-styrkja ónæmiskerfið

Stysta litaða svæðið gæti leitt til mikils fjölda nýlendna í meltingarveginum, sem staðfestir fyrri rannsókn, þar sem Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA og Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA stofnar fundust í meiri fjölda úr villitegundaþurrku þeirra en 11 . Salmonella getur hegðað sér sem utanfrumu- eða innanfrumubaktería, eftir því hvaða næringarefnaskrá er tiltæk, og á sér stað sem skipti á milli landnáms í þörmum og innleiðingar í hýsilfrumur16. Þegar bakteríurnar eru teknar inn og drepnar af átfrumum, eru sum peptíðbrot flutt yfir á yfirborð frumunnar sem sýnir mótefnavaka, sem er kóðað af Major histocompatibility complex (MHC), flokki II. Þessi peptíð-MHC II binding örvar T CD4+ eitilfrumur. Hins vegar, ef bakteríurnar ákveða að ráðast inn í hýsilfrumuna, fara inn í umfrymi átfrumunnar, örvar peptíðtengingin við aðra tegund af MHC, flokki I, T CD8+ eitilfrumuframleiðslu17. Athyglisvert er að CD4+ og CD8+ frumur sýna sama mynstur átfrumna í gegnum tilraunina, jafnvel tákna mismunandi ónæmissvörun. Þar sem CD4+ og CD8+ frumur tákna aðallega T eitilfrumur sem eru hluti af aðlagandi ónæmissvörun, eru átfrumur hluti af meðfæddu ónæmissvörun9. Til viðbótar við þetta sáum við að holdakjúklingar sýna meira tjáningarmerki, jákvæð merkt svæði en varphænur, staðfest af fyrri rannsókn þar sem broilers með stökkbreytta stofna sýndu, til dæmis, ífarandi landnám í þörmum og almenna sýkingu11. Niðurstöður okkar benda til þess að ónæmisvefjafræðiaðferðin veiti áhugaverðar upplýsingar um hegðun ónæmissvörunarfrumna á mörgum líffærum af mismunandi viðskiptalegum ættum meðan á sýkingu af völdum Salmonella enterica serovars stendur yfir. Ennfremur bendir núverandi rannsókn á því að eyðing báðum genum, jafnvel í mismunandi stofnum af Salmonellu, leiddi til baktería sem framkallaði hærri ónæmissvörunarfrumu í hýsilnum, sem sýnir að sýkillinn hefur ekki verið veiklað. Við getum íhugað að Salmonella hafi ef til vill fundið annan lifunaraðferð sem varð enn sjúkdómsvaldandi. Í fyrri rannsókninni hefur verið sýnt fram á notkun ttr og pdu óperóna í samhljóða samhljóða cob og PRP operónum sem nauðsynleg fyrir loftfirrta öndun16, sem leiðir okkur til að trúa því að það sé ekki aðeins nauðsynlegt til að eyða fleiri genum úr hverri operón18, heldur höfum við einnig að íhuga að eyða öllu þessu setti, til að ná til minna sjúkdómsvaldandi stofna af Salmonella enterica.

efni og aðferðir

Tilraunirnar, framkvæmdar í samræmi við viðeigandi leiðbeiningar og reglugerðir, voru samþykktar af siðanefnd um notkun dýra við Sao Paulo State University (CEUA/Unesp Process—006621/18; 10. maí 2018), voru framkvæmdar í fuglasjúkdómafræðinni. Rannsóknarstofa deildar meinafræði, landslagsfræði og einnar heilsu frá Landbúnaðar- og dýravísindasviði Sao Paulo State University (FCAV/ Unesp), Jaboticabal, Brasilíu.

Bakteríustofnar og stökkbreytt bygging.

Bakteríustofnarnir sem notaðir eru hér voru geymdir í frostverndarmiðli sem var blandaður með Lysogeny seyði (LB; BD DifcoTM, USA) sem bætt var við 30% af glýseróli (Merck, BR—H30402394 228) og geymt í ofurfrysti (- 80 gráðu ) á rannsóknarstofu fuglasjúkdómafræði frá FCAV/UNESP. Salmonella Enteritidis P125109 (aðgangsnúmer: AM933172) og Salmonella Typhimurium str. 9819 voru framkallaðir fyrir nalidixic sýru- og spectinomycin-ónæmi (Nalr Spcr ) og þeir veittu erfðafræðilegan bakgrunn til að smíða stökkbreytta stofna með Lambda-rauðu tækni20 með smávægilegum breytingum, sem lýst er í Saraiva et al.11. Stökkbreyttar bakteríur sem smíðaðar eru hér eru auðkenndar á textanum sem SEΔttrAΔpduA (Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA) og STMΔttrAΔpduA (Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆due).

In vivo tilraun.

Tilraun 1—Salmonella Enteritidis. Þrjátíu og sex 1-daggamlir ungar af hverri af þremur mismunandi ættum (broiler, hálfþungar varphænur og léttar varphænur), samtals eitt hundrað og átta dýr, fengust frá útungunarstöðvum í atvinnuskyni. Við komuna var botn flutningakortakassa skoðaðir til að staðfesta Salmonellulausa stöðu fuglanna21 og dýrin voru hýst í málmbúrum inni í aðlögunarherberginu og fengu sýklalyfjalaust fóður og vatn að vild. 24-klst ljós prógramm var valið fyrsta daginn til að tryggja bestu vatns- og fæðuinntöku, síðan var 12-klst ljós prógramm tekið upp fyrstu vikuna og minnkaði niður í 8 klst á þeim dögum sem eftir voru. Sáðefnið var útbúið samkvæmt Berchieri Junior et al.22. Fyrir þetta voru frosnu ræktirnar sáðar í LB og ræktaðar yfir nótt við 37 gráður undir 150 snúningum á mínútu. Daginn eftir voru bakteríuræktirnar fluttar í ferskt miðil og ræktað í 18 klst við sömu aðstæður og áður. Síðan voru 0,2 mL úr ræktunum sem innihéldu 108 nýlendumyndandi einingar á mL (CFU/mL) sáð um munn með málmslöngu beint í uppskeru fuglanna. Níu hópar voru myndaðir (A til I) og þeim var skipt af handahófi í samræmi við mismunandi ættir og stofna (tafla 7). Einum, þremur, sjö og 14-dögum eftir sýkingu (dpi) voru þrír fuglar í hverjum hópi á hverjum degi, að morgni, aflífaðir með leghálsi til að uppskera miðlæga hluta hálshálshálskirtla, caecum, og ileum, og fjarlæga hluta lifrar vinstri lappar fyrir frekari ónæmisvefjaefnafræði (IHC) greiningu. Fyrir þetta voru sýni sökkt í n-Hexane pa (n-Hexano pa, Synth, Brasilíu) áður í kæli í fljótandi köfnunarefni. Strax eftir frystingu vefja var það flutt yfir í 2 ml kryótúpu (Corning, USA) og skilyrt í fljótandi köfnunarefni. Eftir sýnatöku voru vefirnir geymdir við -80 gráður þar til IHC fer fram.

Tilraun 2—Salmonella Typhimurium. Þessi tilraun var framkvæmd í samræmi við sömu eiginleika sem nefnd eru hér að ofan í tilraun 1. Þrjátíu og sex kjúklingum (1 dags gömlum) var skipt af handahófi í níu hópa (A til I) miðað við ætterni þeirra og stofna (tafla 7).

Tafla 7. Stofnaðir hópar eftir mismunandi ættum og stofnum. SE∆ttrA∆pduA, Salmonella Enteritidis ∆ttrA∆pduA; STM∆ttrA∆pduA, Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA; wt-SE, Salmonella Enteritidis villigerð; wt-STM, Salmonella Typhimurium villigerð; NC, neikvæð stjórn.

Ónæmisvefjafræði.

Vefjahluti. Söfnuðu sýnin voru flutt frá -80 gráðu yfir í frystistill (Leica CM1860, Leica Biosystems Nussloch GmbH, Þýskalandi) við -22 gráður þar sem þau voru stífluð hvert fyrir sig í OCT efnasambandi (Tissue-Tek®, Sakura Finetek Europe BV, Hollandi) á 30 mín. til 6 µm hluta með lágsniðnum einnota hnífum (Leica 819, Leica Biosystems Nussloch GmbH, Þýskalandi). Það er athyglisvert að skurðir voru gerðir við -22 gráður, nema lifrarskurðir, sem voru gerðir við -15 gráður. Glærur sem innihéldu þrjár endurtekningar af skiptingu hvers líffæris fyrir hverja ónæmisfrumusvörun merkt voru útbúin, með þynningu á milli hverrar endurtekningar. Með því að nota málningarpensil voru vefjaskurðirnir settir á vefjafræðilega glærur sem voru formeðhöndlaðar með pólý-l-lýsíni (Sigma-Aldrich, Bretlandi, vörunúmer P4832) og silani (Sigma-Aldrich, Bandaríkjunum. Vörunúmer 440574). Glerurnar voru geymdar við -20 gráður eftir það þar til IHC litun. Ónæmisfrumulitun. Í fyrsta lagi voru skyggnurnar sökktar í 200 ml af kældu asetoni (Acetone PA—ACS, Synth, Brazil) og ræktaðar við -20 gráður í 10 mínútur. Eftir það voru skyggnurnar fluttar í rakahólf (EasyPath®, Brasilíu) við stofuhita í 5 mínútur til að þurrka sýnin. Glærurnar voru þvegnar eftir það með PBS og pollur var látinn standa í 5 mínútur til að forðast ofþornun vefja. Tíu, vefjum var sökkt í 200 ml af 4% H2O2 á 10 mín á dimmum stað og skolað aftur með PBS. Svæðið í kringum vefjahlutana var þurrkað með ísogandi pappír og sýnið var farið framhjá með vatnsfælnum penna (Dako Pen, Dako Denmark A/S, Danmörku). Þvottaskrefið sem skilur eftir poll var endurtekið eins og áður. Bíótínlausa settið Mouse and Rabbit Specific HRP/DAB IHC Detection—Micropolymer (Abcam©, USA) var notað til að lita ónæmisfrumurnar með því að velja Avidin–Biotin Streptavidin Peroxidase Complex (ABC) aðferðina. Til þess var pollurinn fjarlægður og ósértækum bakgrunnslitaloka hvarfefnisdropum bætt við vefina. Glerunum var haldið inni í rakaklefanum á dimmum stað í 30 mínútur, þvottaskrefið var endurtekið og 200 µL af aðal mótefni (Mouse Anti-Chicken CD4-UNLB; Mouse Anti-Chicken CD{{34} } UNLB; Mouse Anti-Chicken Monocyte/Macrophage-UNLB, Southern Biotech, USA) þynnt í hlutfallinu 1:200 (v/v) í mótefnaþynningarefninu (Antibody diluent, Abcam©, USA) var bætt við eftir það. Glærurnar voru ræktaðar við 4 gráður í 18 klst. Daginn eftir voru rennibrautirnar þvegnar eins og áður. Tíu dropum af efri mótefninu (Reveal Complement, Abcam©, USA) var bætt við eftir að umfram PBS var fjarlægt og rakahólfið var sett í dimmt umhverfi í 30 mín. Í kjölfarið var dropi af 3,3′-díamínóbensidíni (DAB Chromogen 50×, Abcam©, USA) þynntur í 1 ml af hvarfefni (DAB Substrate, Abcam©, Bandaríkjunum), sem dugar fyrir þrjár glærur, og bætt við vefjasneiðarnar. Einni mínútu síðar voru skyggnurnar sökktar í 200 ml dH2O í 5 mín. Eftir það voru þau færð yfir í plastkubba sem innihélt Harris hematoxylin (Êxodo Científca, Brasilíu) og látin standa í 1 mín. Að aftan voru rennibrautirnar þvegnar í 10 mínútur undir rennandi vatni við lágan þrýsting. Glerurnar voru settar í alkóhól-xýlen röðina (70% áfengi, 90% áfengi, 100% áfengi, Xýlen I og Xýlen II). Að lokum voru hyljarnar settar á glærurnar eftir að dropi af vatnslausu festiefni var bætt við (Entellan®, Merck, Brasilía). Myndir úr vefjahlutunum voru teknar af handahófi, þar sem fimm tilviljunarkennd svið voru valin, með ljóssmásjá (linsu 400×) (Coleman®, gerð N-120) með millistykki fyrir stafræna myndavél, til frekari tölfræðilegrar greiningar (Mynd 1) ).

Gagnagreining.

cistanche tubulosa-bæta ónæmiskerfið

Hlutfall CD{0}} og CD8+ frumna og átfrumna var reiknað út með Image-Pro Plus v.4.5.0.29 (MediaCybernetics, USA). Þau voru magngreind sem prósentugildi með ónæmisfrumumerkinu jákvætt svæði/heildarsvæði. Tölfræðileg greining og grafík voru gerðar með því að nota hugbúnaðinn GraphPad Prism v.8.0.1 fyrir macOS (GraphPad Software, La Jolla California, USA) og gögn voru send til afbrigðisgreiningar (ANOVA) og síðan Bonferroni margfaldur samanburður, miðað við marktektarstig sem er lægra en 5% (P Minna en eða jafnt og 0,05).

Mynd 1. Sneiðmynd af hálsi á ungfiski sem sýkt er af Salmonella Typhimurium ∆ttrA∆pduA sem sýnir ónæmisverkanir í átfrumum, 7 dögum eftir sýkingu (×400; Avidin–Biotin Streptavidin Peroxidase, mótlitað með Hematoxylin).

Heimildir

1. Freitas Neto, OC, Penha Filho, RC & Barrow, PA Heimildir um salmonellosis í mönnum sem ekki eru taugaveiki: endurskoðun. Braz. J. Poult. Sci. 12(1), 1–11. https://doi.org/10.1590/S1516-635X2010000100001 (2010).

2. Winter, SE o.fl. Þarmabólga veitir rafeindaviðtaka í öndunarfærum fyrir Salmonellu. Náttúra 467, 426–429. https://doi.org/ 10.1038/nature09415 (2010).

3. Hinsley, AP & Berks, BC Sérhæfni öndunarferla sem taka þátt í minnkun brennisteinssambanda af völdum Salmonella enterica. Örverufræði (lesning) 148, 3631–3638. https://doi.org/10.1099/00221287-148-11-3631 (2002).

4. Tiennimitr, P. o.fl. Þarmabólga gerir Salmonella kleift að nota etanólamín til að keppa við örveruna. Frv. Natl. Acad. Sci. Bandaríkin 108, 17480–17485. https://doi.org/10.1073/pnas.1107857108 (2011).

5. Staib, L. & Fuchs, TM Reglugerð um nýtingu fúkósa og 1,2-própandíóls af Salmonella enterica serovar Typhimurium. Framan. Örverur. 6, 1116. https://doi.org/10.3389/fmicb.2015.01116 (2015). 6. Horswill, AR & Escalante-Semerena, JC Própíónat niðurbrot í Salmonella Typhimurium LT2: Tvær mismunandi umritaðar einingar samanstanda af prp staðinum við 8,5 sentisóm, prpR kóðar meðlim af sigma-54 fjölskyldu virkjana, og prpBCDE genin mynda óperón. J. Bakteríól. 179, 928–940. https://doi.org/10.1128/jb.179.3.928-940.1997 (1997).

7. Soria, MC, Soria, MA, Bueno, DJ & Terzolo, HR Samanburður á 3 ræktunaraðferðum og PCR prófum fyrir uppgötvun Salmonella Gallinarum og Salmonella Pullorum í alifuglafóðri. Poult. Sci. 92, 1505–1515. https://doi.org/10.3382/ps.2012-02926 (2013).

8. Van Immerseel, F. o.fl. Virkni ónæmisfrumuíferðar í caecal lamina propria kjúklinga eftir nýburasýkingu með Salmonella Enteritidis stofni. Dev. Samgr. Immunol. 26, 355–364. https://doi.org/10.1016/s0145-305x(01)00084-2 (2002).

9. Montassier, HJ Fisiopatologia do systema immune. Í Doenças das Aves (ritstj. AndreattiFilho, RL o.fl.) 467–489 (FACTA, 2020).

10. Price-Carter, M., Tingey, J., Bobik, TA & Roth, JR Annað rafeindaviðtaka tetraþíónatið styður B12-háðan loftfirrtan vöxt Salmonella enterica serovar Typhimurium á etanólamíni eða 1,{{4} }própandíól. J. Bakteríól. 183, 2463–2475. https://doi.org/10.1128/JB.183.8.2463-2475.2001 (2001).

11. Saraiva, M. o.fl. Að ráða hlutverk ttrA og pduA gena fyrir Salmonella enterica serovars í kjúklingasýkingarlíkani. Avian Pathol. https://doi.org/10.1080/03079457.2021.1909703 (2021).

12. Beal, RK, Wigley, P., Powers, C., Barrow, PA & Smith, AL Krossviðbrögð frumu- og húmors ónæmissvörunar við Salmonella enterica serovars Typhimurium og Enteritidis tengjast vernd gegn ólíkum enduráskorun. Dýralæknir. Immunol. Ónæmispatól. 114, 84–93. https://doi.org/10.1016/j.vetimm.2006.07.011 (2006).

13. Winter, SE & Bäumler, AJ Stórkostlegt afrek: Til að keppa við örveru í þörmum knýr Salmonella hýsil sinn til að útvega rafeindaviðtaka í öndunarfærum. Þarmaörverur 2, 58–60. https://doi.org/10.4161/gmic.2.1.14911 (2011).

14. Rivera-Chávez, FI o.fl. Salmonella notar orkuleigubíla til að njóta góðs af þarmabólgu. PLoS Pathog. 9, e1003267. https:// doi.org/10.1371/journal.ppat.1003267 (2013).

15. Khan, CM Te Dynamic milliverkanir milli Salmonellu og örveru, innan krefjandi sess í meltingarvegi. Alþj. Sch. Res. Ekki. 2014, 1–23. https://doi.org/10.1155/2014/846049 (2014).

16. Yoo, W., Kim, D., Yoon, H. & Ryu, S. Ensím IIANtr stjórnar innrás Salmonellu með 1,2-própandíól og própíónat niðurbroti. Sci. Rep. 7, 44827. https://doi.org/10.1038/srep44827 (2017).

17. Salyers, AA & Whitt, DD Hýsilvarnir gegn bakteríusýkingum: Varnir vefja og blóðs. Í Bacterial Pathogenesis: A Molecular Approach (ritstj. Salyers, AA & Whitt, DD) 16–29 (ASM Press, 1994).

18. Góes, V. o.fl. Salmonella Heidelberg hliðarstigsgen tap á öndunarþörfum í kjúklingasýkingarlíkani. Örverusjúkdómur. 171, 105725. https://doi.org/10.1016/j.micpath.2022.105725 (2022).

19. Barrow, PA, Hassan, JO & Berchieri, A. Jr. Minnkun á saurútskilnaði Salmonella Typhimurium stofns F98 hjá kjúklingum sem voru bólusettir með lífi og drepnir S. Typhimurium lífverur. Faraldur. Smitast. 104, 413–426. https://doi.org/10.1017/s095026880 0047439 (1990).

20. Datsenko, KA & Wanner, BL Einþrepa óvirkjun á litninga genum í Escherichia coli K-12 með því að nota PCR vörur. Frv. Natl. Acad. Sci. Bandaríkin 97, 6640–6645. https://doi.org/10.1073/pnas.1201632977 (2000).

21. Zancan, FB, Berchieri Junior, A., Fernandes, SA & Gama, NMSQ Salmonella spp. rannsókn í flutningskassa dagsgömlu fugla. Braz. J. Microbiol. 31, 230–232. https://doi.org/10.1590/S1517-83822000000300016 (2000).

22. Berchieri, A. Jr., Murphy, CK, Marston, K. & Barrow, PA Athuganir á þrálátri og lóðréttri sendingu Salmonella enterica serovars Pullorum og Gallinarum í kjúklingum: Áhrif erfðafræðilegs bakgrunns baktería og hýsils. Avian Pathol. 30, 221–231. https://doi.org/10.1080/03079450120054631 (2001).