fyrir frekari upplýsingar:ali.ma@wecistanche.com

Hluti: II Nýrna- og aukanýrnatilbrigði í fullorðnum sebrafiskum Líkan af blöðrubólgu

2.3.5. Ctns−/− Zebrafish Núverandi aukin þykkt hornhimnu

Blöðrubólgahefur áhrif á augun sem leiðir til blöðrusöfnunar í nokkrum vefjum, svo sem lithimnu, táru og þekju í sjónhimnu, hins vegar er hornhimnan sá hluti sem hefur mest áhrif vegna blöðrusöfnunar [19] og sýnir aukna þykkt [20]. Með því að nota H&E litun tókum við eftir því að ctns-/-zebrafish sýndi aukna þykkt stromal lags hornhimnunnar samanborið við villigerð (Mynd 10A, B, E) sebrafish. Hins vegar leiddum við ekki í ljós augljós frávik í þekjuvef í sjónhimnu ctns-/-zebrafiska (Mynd 10C, D).

Mynd 9. Meðalsundhraði í villigerð og ctns-/-sebrafi. Meðalhraði er minnkaður í ctns-/-zebrafiskum samanborið við villigerð hjá báðum kynjum. Meðalsundhraði er mældur í pixlum/sekúndu. Hver punktur táknar einn sebrafisk, samtals n=6 villigerð og n=6 ctns−/−18-mánaðargamla sebrafiska. Tvíhliða ANOVA með Fishers minnsta marktæka mun (PLSD) prófi: ** p <>

Mynd 10. Augnvefjafræði í villigerð og ctns-/- sebrafiskum. (A, B) Fulltrúarmyndir af hornhimnu villigerðar (A) og ctns−/− (B) 18-mánaðargamlans sebrafiska. Stromalag hornhimnunnar (svartir örvaoddar og svartar línur). H&E litun. Kvarðastikurnar tákna 50 µm. (C, D) Fulltrúar myndir af sjónhimnu villigerðar (A) og ctns-/- (B) sebrafiska. H&E litun. Kvarðastikurnar tákna 50 µm. (E) Hlutfallsleg magngreining á þykkt stromallags hornhimnunnar. Hver punktur táknar eina mynd af þykkt stromallags hornhimnunnar. Óparað t-próf ​​með leiðréttingu Welch, tvíhliða: * p <>

2.3.6. Viðbótar Ctns-/− Sebrafish svipgerðir

Til viðbótar við svipgerðirnar sem nefndar eru hér að ofan, gerðum við vefjafræðilega greiningu á heila og eggjastokkum án þess að finna mun á milli -/- og villitegunda sebrafiska. Ennfremur metum við líkamslengd og þyngd ctns-/- og villigerðar sebrafiska 18 mánaða seldir og fundum aukna líkamsþyngd-/-sebrafiska á meðan við fundum aukna líkamslengd í ctns-/-sebrafiskum af báðum kynjum samanborið við villigerð (viðbót).

3. Umræður

Á síðustu áratugum,blöðrubólguhefur breyst úr banvænum sjúkdómi í æsku í efnaskiptasjúkdóm sem hægt er að meðhöndla þar sem sjúklingar geta lifað af til fullorðinsára og náð háum aldri [21,22]. Lengri lifun sjúklinganna leiddi í ljós nýjar svipgerðir sjúkdóma og vakti nýjar spurningar varðandi meingerð og langtímaáhrif meðferða. Í þessu sambandi verður rannsókn á fullorðnum dýralíkönum af blöðrubólgu meira og meira viðeigandi.

Í núverandi rannsókn könnuðum við nýru og utan nýru birtingarmyndir cystínósu í fullorðnum sebrafiskalíkani sem er 18 mánaða selt, sem samsvarar 40-50 ára aldurs manna [23,24]. Í fyrsta lagi staðfestum við að fullorðna ctns−/− sebrafiskalíkanið sýnir cystínsöfnun í öllum líkamanum og ýmsum líffærum. ÍnýruÁ vefjafræðilegu stigi sáum við merki um PTEC-skemmdir sem endurspeglast af nærveru fjölmargra hýalín-líkra eósínfíkla dropa, umfrymistæma og að hluta til tapi á burstamörkum. Ennfremur þróuðu ctns-/- karlkyns sebrafiskar gauklastækkun. Að lokum sýndum við fram á að tjáning klofnaðs kaspasa 3 var aukin í nýrna-PTEC ctns-/-zebrafiska, sem gefur til kynna að frumudauði sé þátttakandi í meingerð nýrnasjúkdóms cystinosis í sebrafiskum. Síðanblöðrubólgusjúklingar eru einnig utan nýrna birtingarmyndir, könnuðum við áhrif ctns-/- stökkbreytinga í öðrum líffærum í sebrafiskalíkani okkar. Athyglisvert kom í ljós að ctns−/− stökkbreyting olli skerðingu á líffærafræði húðarinnar og hefur áhrif á frjósemi, hreyfivirkni og augu.

Lýsósóm eru staðir fyrir meltingu innan frumu og eru taldir vera mikilvægir samræmingaraðilar frumuefnaskipta [25]. Að vera ljósósómal geymslusjúkdómur, lykilatriðið íblöðrubólguer lysosomal cystín uppsöfnun [26,27]. Athyglisvert er að við fundum 54-falda aukningu á cystíni í öllum líkamanum18-mánaða cystinosis zebrafis samanborið við villigerð, en í fyrri rannsókn okkar [10] sýndu cystinosis zebrafilirfur 6 dögum eftir frjóvgun 13-föld aukning. Á heildina litið benda þessar upplýsingar til þess að cystín safnist fyrir á ævinni í cystinosis zebrafiskum. Vökvaskiljun og massagreiningargreiningar hafa staðfest að meðal allra líffæra,nýrusare ákjósanlegur staður fyrir cystínsöfnun. Tilkynnt hefur verið um bólgu í ljósósóma og hýalínlíkum eósínófílum dropum inni í ljósósómunum í cystínhlaðnum PTEC [28,29] og í vefjasýni úr mönnum birtast cystínkristallar sem fjölbreytileg lögun rými innan millivefsátfrumna og PTEC umfrymis [27]. Í vefjum manna er uppsöfnun og kristöllun cystíns uppsafnað ferli sem á sér stað á ævinni. Inline fundust cystínkristallar ekki í ctns−/−zebrafiskunum á lirfustigi [10] en í tilraunum okkar fundum við að fjölbreytileg lögun cystínkristalla birtist á aldrinum 3 og 6 mánaða og sést vel. við 18-mánaða aldur, sem bendir til versnandi áhrifa blöðrubólgu ínýru.

Smelltu til aðCistanche áhrif fyrir nýrnasjúkdóm

Til að meta vefjafræðilegar breytingar á gaukla mældum við yfirborðsflatarmál Bowmans hylkis, gauklaþófa og Bowmans rýmis ctns-/-zebrafish á PAS-lituðum hluta. Við komumst að því að ctns-/-zebrafish þróuðu gauklastækkun, sem bendir til ofsíunar. Mögulega má rekja væga hnakkaskemmd sem sést á snertingum-/-sebrafiskum til endurnýjunarhæfni sebrafiskanýru, að geta bætt við nýjum nýrnahettum, auk þess að gera við núverandi nýrana [30].

Til viðbótar við vefjaskemmdirnar hefur verið sýnt fram á að cystínsöfnun virkjar próteinkínasa sem kveikir apoptosisin PTEC [12]. Þannig metum við klofna caspasa-3 tjáningu í PTEC og við komumst að því að ctns−/−zebrafisharnir sýndu aukinn kaspasa-3 og kjarna sundrungu. Tilvist klofins kaspasa-3 fannst aðallega í frumum sem söfnuðu upp umfrymislofttæmunum, sem bendir til þess að frumuddrun eigi sér stað í hinu slasaða PTEC. Einn viðbótarbúnaður sem getur útskýrt aukna apoptosis gæti verið nærvera hvarfgjarnra súrefnistegunda vegna minnkaðs glútaþíons í tengslum við cystínsöfnun [31]. Hins vegar eru frekari rannsóknir nauðsynlegar til að meta hvort þessi aðferð á sér stað einnig í ctns-/-zebrafish.

Samtnýrueru fyrstu og alvarlegustu líffærin,blöðrubólguer fjölkerfissjúkdómur þar sem ýmis líffæri, svo sem húð, kynkirtlar, augu og vöðvar taka þátt í. Frá bókmenntum er vitað að sjúklingar með blöðrubólgu sýna oft ótímabæra húðöldrun, ljóst hár og ljósan húðlit [13]. Síðarnefnda svipgerðin er tilkomin vegna þátttöku cystínósínflutninga í stjórnun melanínmyndunar [32] og viðhalda dekkri litarefni í gegnum nýfundna cystein flutningsefnið MFSD12 [33]. Spennandi, fullorðna ctns-/-zebrafiskalíkanið okkar sýndi vanlitað og blettótt húðmynstur og sýndi skerta melaníndreifingu sem ekki sást á lirfustigi [10].

Auk þess,blöðrubólguveldur ófrjósemi hjá körlum, en konur eru þekktar fyrir að vera frjóar [14]. Nýlegar upplýsingar benda til þess að ófrjósemi gæti stafað af versnandi hrörnun eistna, sem leiðir til breyttra sæðisgæða, eða vegna hindrunar í óskilgreindum hluta útskilnaðarkerfis karla. Hindruðu uppbyggingin gæti haft áhrif á gæði sæðisins, sérstaklega á þeim svæðum þar sem rásir hafa mjög lítið þvermál, td retetestis[16]. Inzebrafis, sæðisfrumurnar fyrir genic processis eru mjög svipaðar spendýrum; þó er einn helsti munurinn sá að sáðfrumumyndun á sér stað í blöðrunum [34]. Í rannsókn okkar fundum við auknar sæðisfrumur í sæðismyndandi blöðru ctns-/-zebrafiska, hins vegar fundum við ekki merki um hrörnun eistna. Þess vegna gæti svipgerðin sem lýst er bent til hindrunar á eistum sem leiðir til minni losunar sæðisfruma í umhverfinu, en frekari rannsóknir eru nauðsynlegar til að staðfesta þessa tilgátu. Á virknistigi virðist minnkuð eggjafjöldi og fækkun frjóvguð egg endurspegla skerðingu á frjósemi ctns-/-sebrafiska.

Önnur klínísk birtingarmyndblöðrubólgu, sem almennt hefur áhrif á sjúklinga frá og með öðrum áratug ævinnar, er vöðvakvilli, sem einkennist af vöðvarýrnun og máttleysi [1]. Athyglisvert komumst að því að ctns-/- fullorðnir sebrafiskar sýndu minni hreyfivirkni samanborið við stjórn, sem bendir til skertrar vöðvastarfsemi. Athyglisvert er að þessi svipgerð var ekki til staðar í lirfum [10], sem bendir til þess að hún hafi áhrif á ctns-/-zebrafish á seinna stigi sjúkdómsins. Þrátt fyrir þetta greindist enginn sjáanlegur vefjafræðilegur munur á vöðvum. Minnkuð hreyfivirkni gæti stafað af truflun á starfsemi hvatbera sem ekki var hægt að greina með venjubundnum vefjafræðirannsóknum [35-37]. Þess vegna þarf frekara mat á yfirgripsmikilli lýsingu á hvatberum í cystinosis zebrafiskum.

Til viðbótar við ofangreindar svipgerðir hafa nokkrar rannsóknir sýnt að sjúklingar með blöðrubólgu sýna einnig augneinkenni eins og ljósfælni og blæðingakrampa [1], þar sem hornhimnan er einn af þeim hlutum augans sem hefur mest áhrif sem leiðir til uppsöfnunar cystínkristalla og aukinnar þykktar [20]. Hins vegar er lítið vitað um orsakir aukinnar þykkt hornhimnu. Til dæmis var lagt til að svipgerðin sem lýst er sé vegna undirklínískrar truflunar á þekju- og/eða æðaþelsfrumum sem leiða til stromalbjúgs [20]. Í rannsókn okkar komumst við að því að ctns-/- fullorðinn zebrafiskur jókst er þykkt stromal lags hornhimnunnar, sem gefur til kynna að líkan okkar sýnir merki um truflun á hornhimnu íblöðrubólgu.

Cistanche fyrirnýruvirka

Ein helsta eyðin sem þarf að fylla til að fá yfirgripsmikinn skilning áblöðrubólguer skortur á dýralíkani sem endurspeglar mannsjúkdóminn að fullu. Nokkur músalíkön hafa verið þróuð sem sýna cystínsöfnun en ná ekki að endurskapa heildarnýrusvipgerð [8,26]. Nánar tiltekið sýndi C57BL/6 músin cystínsöfnun í nokkrum líffærum, sem eykst með aldrinum [8]. Að auki sýnir C57BL/6 músarlíkanið nærliggjandi pípulaga skemmdir frá 6 mánaða aldri. Á sama hátt, í líkaninu okkar, versna nærliggjandi pípulaga sár með tímanum. Hins vegar, á gauklastigi, sýndi C57BL/6 músarlíkanið eðlilega svipgerð, en fullorðins sebrafiskalíkan okkar sýnir gauklastækkun. Að auki nær C57BL/6 músarlíkanið ekki að líkja eftir skertri frjósemi sem sést í mönnum, en ctns-/-zebrafiskalíkanið sýnir sæðisvaldandi blöðrur auðgað í sæðisfrumum og minnkaða eggframleiðslu. Á augnstigi sýna bæði mús[38] og sebrafiskalíkan frávik í augum. Þvert á móti, á húðstigi, sýnir þetta músarlíkan ekki skerta melatónínframleiðslu [8], sem birtist í fullorðnum sebrafiskalíkani sem vanlitað húðmynstur. Að lokum, á hegðunarstigi, sýnir ctns−/− sebrafislíkanið okkar minnkaða hreyfivirkni, sem getur stafað af skertri starfsemi hvatbera eða það gæti stafað af aukaáhrifum aukinnar þyngdar íblöðrubólgusebrafiskur. Á heildina litið virðist sem ctns−/− sebrafislíkanið okkar endurspeki betur sjúkdóm mannsins. Nýlega, Shimizu o.fl. stofnað nýja meðfædda Ctnsugl stökkbreytingu í rottustofni sem kom framnýruskemmdir og cystínkristallar í leysisómumnýruheilaberki [7]. Hins vegar vantar enn ítarlegri lýsingu á líkaninu. Þess vegna er brýn þörf á að þróa og einkenna ný hagnýt líkön sem rifja upp sjúkdóma í mönnum.

Að lokum sýndum við fram á að fullorðna ctns-/- sebrafiskalíkanið okkar endurskapar nokkrar mannlegar svipgerðir af cystínsandgryfju getur verið gagnlegt til að rannsaka meingerð sjúkdómsins hjá fullorðnum og til að prófa langtímaáhrif nýrra lyfja til að leiðrétta nýru og auka-nýrubirtingarmyndir.

4. Efni og aðferðir

4.1. Viðhald og ræktun sebrafiska

Sebrafiskur var meðhöndlaður og viðhaldið í samræmi við reglur KU Leuven um dýravelferð (siðferðilegt samþykki nr.142/2019). Fyrir þessa rannsókn tókum við ctns-/-zebrafiska 18 mánaða og villigerðarviðmiðunarsebrafis í bæði kynin. Upplýsingar um að búa til ctns-/-sebrafiska var lýst í fyrri rannsókn okkar [10].

4.2. Cystine Mæling

Blöðrustig voru mæld í sebrafiskum (villitegundarkarlfiski,n=3ogctns−/−karlfiskum, n=3) og magnið gefið upp sem nmól/mg prótein. Fyrst var sebrafiskum fórnað með dýfingu í tricaine metansúlfónat MS-222 (300 mg/L), síðan voru vefjasýni hljóðbeitt í nærveru 200 µL af 5 mM N-etýlmaleimíði (NEM, St. Louis, MO, Bandaríkjunum, Sigma-Aldrich E3876) í Dulbecco's fosfat-bufferuðu saltvatni (PBS), fyrir að hámarki 200 mg af vefjum fyrir hvert ljósat. Í kjölfarið var 100 µL af 12 prósent súlfósalicýlsýru (SSA) bætt við hvert einsleitt efni og sýni voru skilin í skilvindu við 12,000 g í 10 mínútur, 4◦C. Fljótandi vökvar sem innihéldu cystín voru geymdar við -80◦C þar til greiningar voru gerðar, en kögglar voru leystir upp yfir nótt við 4◦C í 300 µL af 0,1 M NaOH og haldið við -80◦C þar til prótein er mælt með því að nota Pierce BCA Protein Assay Reagent Kit. Í kjölfarið var magn (nmól) af cystíni staðlað að magni (mg) próteins úr hverju sýni. Því næst var 50 µLaf ofanleysingunni sem innihélt blöðru blandað með 50 µL af innri staðallausninni (Cystine d6) og hringt í 5 sekúndur; síðan var blandan dregin út með 200 µL af asetónítríl, hvirflað í 30 s og síðan skilið í skilvindu við 16,000 g í 9 mín. Vökvaskiljun og massagreiningargreining voru framkvæmd með UHPLCAgilent1290InfinityII6470(Agilent tækni, Santa Clara, CA, Bandaríkjunum) búin ESI-JET-STREAM uppsprettu sem starfar í jákvæðri jóna (ESI plús) ham. Hugbúnaðurinn sem notaður var til að stjórna þessum búnaði og greina gögn var MassHunter (vinnustöðin Agilent Technologies, Barcelona, ​​Spáni). Aðskilnaðarsúlan sem notuð var var InfinityLab Poroshell 120 HILIC 1,9 µm 100×2,1 mm (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, Bandaríkjunum).

4.3. Hematoxylin og Eosin og Periodic Acid-Shiff litun

Zebrafiskur (villtur kvenfiskur, n=3; villtur karlfiskur, n=3; ctns−/−kvenkyns fiskur, n=3; ctns−/−karlfiskur, n=3) var fórnað með niðurdýfingu í tricaine metansúlfónat MS-222 (300 mg/L), síðan var allur sebrafiskurinn festur í 4 prósent jafnaðri paraformaldehýð (4 prósent PFA) við 4 ◦C í 1 viku . Eftir að hafa verið þveginn með PBS tvisvar var sebrafiskurinn fluttur yfir í EDTA lausn (100 mM, pH=8) til að afkalka í aðra 1 viku, fylgt eftir með því að fella inn í parafín. Paraffin-innfelldur sebrafiskvefur var skorinn (4-µmþykkt) á Leicamicrotome (LeicaBiosystems, Wetzlar, Þýskalandi). Hlutar voru litaðir með H&E og PAS í samræmi við staðlaðar samskiptareglur.

Vísindafræðilegar rannsóknir á sebrafiskaeygum (villigerð kvenfiska,n=3ogctns-/-kvenfiska, n=3), augu voru kjarnaskorin og fest í 4 prósent PFA við stofuhita í 4 klst. Eftirfarandi innfelling í ákjósanlegur skurðarhitamiðill (Tissue-Tek® VIP®; Sakura Finetek, Japan), 10-µm frostskurðir voru gerðir (Cryostar NX70, Thermofisher Scientific, Tókýó, Japan). Hlutar voru litaðir með H&E í samræmi við staðlaðar samskiptareglur. Myndir voru gerðar með Leica björtu sviði smásjá (Leica DM6, Wetzlar, Þýskalandi).

4.4. Ónæmisvefjaefnafræði (kljúfur kaspasa-3 litun)

Hlutar með nýskornum sebrafiskvef voru afparaffínaðir og endurvökvaðir. Hlutar voru látnir endurheimta mótefnavaka af völdum hita með því að nota 10 mM sítratbuffi (pH=6). Eftir blokkun með 5 prósent venjulegu geitasermi (NGS) í dPBS, voru hlutar ræktaðir með kanínum gegn klofnum kaspasa-3 (Cell Signaling, Danvers, MA, USA, 1:200 þynning) fylgt eftir með and-kanínu -Envision, HRP-merkt aukamótefni (Dako Products, Agilent, Santa Clara, CA, Bandaríkjunum). Sem neikvæð viðmiðun var venjulegt kanínusermi notað. Díamínóbensidín (DAB, DAKO, Glostrup, Danmörk) var notað sem litningur. Í kjölfarið voru hlutar mótlitaðir með H&E, þurrkaðir og settir upp.

Meðferð við nýrnasjúkdómum: Cistanche

4.5. Toluidin Blue litun og TEM

Zebrafiskurnýruvefir (villigerð karlkyns sebrafiskar, n=3 og ctns-/− karlkyns sebrafiskar, n=3) voru tíndir og festir í EM festingarbuffi (1,5 prósent glútaraldehýð/1 prósent paraformaldehýð) í 24 klst. . Í kjölfarið var nýrnavefurinn festur eftir á með 2,5 prósent glútaraldehýðs/1,2 prósenta akróleini í festingarbuffi (0.1 mól/L kakódýlöt, 0,1 mól/L súkrósa, pH 7,4) og 1 prósent osmíumtetroxíð, og fellt inn í plastefni. Hálfþunnir hlutar (0.5-µm þykkt) voru litaðir með tólúidínbláu. Ofurþunnu sneiðarnar voru litaðar með úranýl asetati. Myndunum var safnað með JEM-1200 EX rafeindasmásjá (JEOL Ltd, Tókýó, Japan) með mismunandi stækkunum.

4.6. Stafræn myndgreining

Litaðar skyggnur voru stafrænar með Philips Ultra-Fast Scanner 1.6 RA (Philips, Eindhoven, Hollandi)

4.6.1. Glomerular Hypertrophy Analysis

Til að greina gauklastækkun í sebrafiskum voru yfirborðsflatarmál (µm2) Bowmans hylkis, Bowmans rúms og gauklaþófa mæld á PAS-lituðum glærum. Allar tiltækar glomeruli á hluta voru innifaldar og mældar með ImageJ hugbúnaði. Meðaltal mælinga frá hverjum sebrafiski var notað við tölfræðilega greiningu.

4.6.2. Klofnað kaspasa-3 tjáningargreining

Twoobserversscoredthecleavedcaspase-3expressioninthetubulesofeachzebrafish. The semiquantitative score was conducted on the three randomized tubular fields in each zebrafish(20×magnification). Thepercentageofcaspase-3positivearearelativetothetotal area of tubules was scored as 1 (negative staining), 2 (1–10% positive staining), 3 (10%–25% positive staining), 4 (>25 prósent jákvæð litun). Meðaltal stiga úr hverjum sebrafiski var notað við tölfræðilega greiningu.

4.6.3. Þykkt hornhimnustrómagreiningar

Þykkt hornhimnu sebrafiska (10× stækkun) var mæld í sömu fjarlægð frá miðju augans með því að nota ImageJ hugbúnað á sebrafiska. Fyrir hverja mynd voru teknar n=7 mælingar á mismunandi stöðum í augnhlutanum (miðja, miðju, jaðar) meðfram hornhimnunni með 100 µM millibili. Meðaltal mælinga var notað við tölfræðilega greiningu.

4.7. Frjósemisrannsókn

Frjósemi var metin með því að para kvenkyns og karlkyns sebrafiska (villigerð karlfiska, n=4 og villigerð kvenfiska, n=6 og ctns−/− karlfiskar, n=4 og ctns−/−kvenkyns fiskur, n=6) í hrygningarbakka. Morguninn eftir, einni klukkustund eftir birtu, var fósturvísum safnað saman og heildarfjöldi eggja sem framleiddur var skráður. Frjóvguð egg voru skimuð og talin frá þeim ófrjósömu með ljóssmásjá. Ræktunin var framkvæmd n=7 sinnum einu sinni í viku í röð. Tvær tilraunir sem leiddu til engrar eggjaframleiðslu samtímis í bæði villigerð og ctns-/-zebrafis voru útilokaðar.

4.8. Hreyfivirkni

Zebrafiskur (villtur kvenfiskur, n=6; villtur karlfiskur, n=6; ctns−/−kvenkyns fiskur, n=6; ctns−/−karlfiskur, n=6) voru settar í venjulegar húsnæðiseiningar og eftir 5 mín aðlögunartíma voru þær filmaðar í 5 mín. Myndbandsupptaka var gerð með því að nota GoPro® HERO 7 sem var settur ofan á tankinn og þannig var hægt að sjá ofan á fiskinum sem synti. Upplausn og rammahraði voru stillt á 1080 p (1920×1080) og 30 fps. Myndbönd voru greind með Tracker. a fylgjast með brautum einstakra sebrafiska í gegnum tilraunina. Ferilarnir voru í kjölfarið greindir með sérsniðnum python kóða til að leiða út meðal hreyfihraða (pixla / sek) í hverjum hópi [39].

Cistanche-nýru

4.9. Líkamsþyngd og lengdarmælingar

Sebrafiskar voru aflífaðir með niðurdýfingu í 300 mg/Loftricaine-metansúlfónati MS-222. Eftir að sannreynt var að ekki var svarað við ytri áreiti var aflífuðu sebrafiskurinn settur á pappírsvef og þurrkaður. Lengd aflífaðs sebrafiska var metin með því að nota vog, mæld frá munnoddinum að stöngulstönginni. Þyngd sebrafiska sem aflífuðust var metin með greiningarkvarða.

4.10. Tölfræðigreining

Tölfræðileg greining var gerð með SPSS (IBM, New York, NY, Bandaríkjunum) og GraphpadPrism (GraphPadSoftware, LaJolla). Gögn úr tveimur hópum voru greind með óparuðu t-prófi með Welch's leiðréttingu, tvíhliða. Gögn um tvær óháðar breytur voru greind með tvíhliða ANOVA með Fishers minnsta marktæka mun (PLSD) prófi. Mismunur með p < 0.05="" var="" talinn="" tölfræðilega="">

4.11. Frjósemisrannsókn

Til að bera saman hraða hrognaframleiðslu á milli villtgerðar og ctns-/-sebrafiska, var gerð Poisson aðhvarfsgreining með því að nota almennar matsjöfnur með öflugum staðalskekkjum til að taka tillit til fylgni tíðni við tilraunir. Til að bera saman líkurnar bjóða nýtt egg á milli villtgerða og ctns-/-zebrafiska Gerðar voru gerðar aðhvarfsgreiningar með almennum matsjöfnum með sterkum staðalskekkjum til að gera grein fyrir fylgni líkurnar innan tilrauna.

Viðbótarefni: Eftirfarandi er fáanlegt á netinu á https://www.mdpi.com/article/ 10.3390/ijms22179398/s1.

Framlög höfundar: Hugmyndafræði, SPB, JH, LvdH, HJB, EL; aðferðafræði, SPB, JH, LDG, HT, TN, PB, SC, BG; hugbúnaður SPB, JH, LDG, HT, TN; löggilding, SPB, JH, LDG, PB, LvdH, HJB og EL; formleg greining, SPB, JH, LDG, HT, TN; rannsókn, LvdH, HJB, EL; auðlindir, HJB og EL; gagnaöflun, SPB, JH, LDG, LvdH, HJB, EL; skrif — frumdrög að undirbúningi SPB, JH; skrif – yfirferð og ritstjórn, LvdH, HJB, EL; sjón, LvdH, HJB, EL; eftirlit, PdW, LvdH, HJB, EL; verkefnastjórn, LvdH, HJB, EL; fjármögnunaröflun, HJB, EL Allir höfundar hafa lesið og samþykkt útgáfu handritsins.

Fjármögnun: Höfundar vilja viðurkenna innri sjóðinn frá KULeuvenC1 GranttoE.L. (C14/17/113), styrki Kína námsstyrksráðs til JH (CSC n◦ 201508500109), og FWO postdoctoral styrk til LDG (12I3820N).

Yfirlýsing endurskoðunarnefndar stofnana: Rannsóknin var gerð í samræmi við leiðbeiningar Helsinki-yfirlýsingarinnar og samþykkt af siðanefnd KU Leuven n.142/2019. Þakkir: Okkur langar að þakka: Didier Cagnini fyrir að meta vefjafræði heilans í bæði ctns-/- og villitegundazebrafish, Kathleeen Lambaerts, FrédéricHendrickx og KimvanKelst fyrir stöðugan stuðning og aðstoð í vatnastöð KU Leuven fyrir tæknilega aðstoðina, Peter Neesken. TEM, og Ron Wolterbeek fyrir tölfræðilega greiningu.

Hagsmunaárekstrar: Höfundar lýsa því yfir að þeir hafi ekki hagsmunaárekstra. Fjármögnunaraðilar höfðu ekki einvörðungu hönnun rannsóknarinnar; við söfnun, greiningu eða túlkun gagna; við ritun handritsins, eða við ákvörðun um að birta niðurstöðurnar.

Heimildir

1. Elmonem, MA; Veys, KR; Soliman, NA; van Dyck, M.; van den Heuvel, LP; Levtchenko, E. Cystinosis: endurskoðun. Orphanet J. Rare Dis. 2016, 11, 47. [Krossvísun]

2. Jesegú, A.; Llinares, E.; Anne, C.; Kieffer-Jaquinod, S.; O'Regan, S.; Aupetit, J.; Chablis, A.; Sagne, C.; Debacker, C.; ChadefauxVekemans, B.; o.fl. Heptahelical prótein PQLC2 er lysosomal katjónísk amínósýruútflytjandi sem liggur að baki verkun cysteamíns íblöðrubólgumeðferð. Frv. Natl. Acad. Sci. Bandaríkin 2012, 109, E3434–E3443. [CrossRef] [PubMed]

3. Besouw, MT; Levtchenko, EN Að bæta horfur nýrnasjúkdóms blöðrubólgu. Alþj. J. Nephrol. Renova. Dis. 2014, 7, 297–302. [Krossvísun]

4. Brodin-Sartorius, A.; Tete, MJ; Niaudet, P.; Antignac, C.; Gestur, G.; Ottolenghi, C.; Charbit, M.; Moyse, D.; Legendre, C.; Lesavre, P.; o.fl. Cysteamínmeðferð seinkar framgangi nýrnasjúkdóms cystinosis hjá seint unglingum og fullorðnum. NýraInt. 2012, 81, 179–189. [Krossvísun]

5. Cherqui, S. Cysteamín meðferð: Meðferð við blöðrubólgu, ekki lækning. Nýra Int. 2012, 81, 127–129. [Krossvísun]

6. Davíð, D.; Princiero Berlingerio, S.; Elmonem, MA; Oliveira Arcolino, F.; Soliman, N.; van den Heuvel, B.; Gijsbers, R.; Levtchenko, E. MolecularBasis of Cystinosis: Landfræðileg dreifing, hagnýtar afleiðingar stökkbreytinga í CTNS-geninu og möguleiki á viðgerð. Nephron 2019, 141, 133–146. [CrossRef] [PubMed]

7. Shimizu, Y.; Yanobu-Takanashi, R.; Nakano, K.; Hamase, K.; Shimizu, T.; Okamura, T. Eyðing í Ctns geninu veldur skerðingu á nýrnapíplum og cystínsöfnun í LEA/Tohm rottum. Mamma. Erfðamengi 2019, 30, 23–33. [Krossvísun]

8. Nevo, N.; Chol, M.; Bailleux, A.; Kalatzis, V.; Morisset, L.; Devuyst, O.; Gubler, MC; Antignac, C. Nýrna svipgerð afblöðrubólgumúsarlíkan er háð erfðafræðilegum bakgrunni. Nephrol. Hringdu. Ígræðsla 2010, 25, 1059–1066. [CrossRef] [PubMed]

9. Elmonem, MA; Berlingerio, SP; van den Heuvel, LP; de Witte, PA; Lowe, M.; Levtchenko, EN GeneticNýruSjúkdómar: Nýtt hlutverk sebrafiskalíkana. Cells 2018, 7, 130. [CrossRef] [PubMed]

10. Elmonem, MA; Khalil, R.; Khodaparast, L.; Khodaparast, L.; Arcolino, FO; Morgan, J.; Pastore, A.; Tylzanowski, P.; Ny, A.; Lowe, M.; etal. Blöðrubólga (ctns) sebrafiskstökkbreytt sýnir prónephric glomerular og tubular truflun. Sci. Rep. 2017,7, 42583. [CrossRef]

11. Lusco, MA; Najafian, B.; Alpers, CE; Fogo, ABAJKDAtlas of RenalPathology:Blöðrubólga. Am. J.KidneyDis. 2017,70,e23–e24. [Krossvísun]

12. Park, MA; Pejovic, V.; Kerisit, KG; Junius, S.; Thoene, JG Aukin frumudauði í blöðruvefjafrumum ognýruproximal tubule þekjufrumum stafar af cysteinylering á prótein kínasa C delta. Sulta. Soc. Nephrol. 2006, 17, 3167–3175. [Krossvísun]

13. Veys, KRP; Elmonem, MA; Dhaenens, F.; Van Dyck, M.; Janssen, M.; Cornelissen, EAM; Hohenfellner, K.; Reda, A.; Quatresooz, P.; van den Heuvel, B.; o.fl. Aukin innri öldrun húðar í nýrnasjúkdómum blöðrubólgu metin með háskerpu sjónrænni samhengissneiðmynd. J. Fjárfest. Dermatol. 2019, 139, 2242–2245. [Krossvísun]

14. Besouw, MT; Kremer, JA; Janssen, MC; Levtchenko, EN Frjósemisstaða hjá karlkyns cystinosis sjúklingum sem fengu meðferð með cysteamíni. Frjósemi. Steril. 2010, 93, 1880–1883. [Krossvísun]

15. Veys, KR; D'Hauwers, KW; van Dongen, A.; Janssen, MC; Besouw, MTP; Goossens, E.; van den Heuvel, LP; Wetzels, A.; Levtchenko, EN Fyrsta árangursríka getnaðurinn af karlkyns blöðrubólgusjúklingi. JIMD Rep. 2018, 38, 1–6. [CrossRef] [PubMed]

16. Rohayem, J.; Haffner, D.; Cremers, JF; Huss, S.; Wistuba, J.; Weitzel, D.; Kliesch, S.; Hohenfellner, K. Eistastarfsemi hjá körlum með ungbarnabólgu í nýrnasjúkdómum. Humm. Reprod. 2021, 36, 1191–1204. [CrossRef] [PubMed]

17. Blakey, H.; Proudfoot-Jones, J.; Knox, E.; Lipkin, G. Meðganga hjá konum með blöðrubólgu. Clin. Nýra J. 2019, 12, 855-858. [Krossvísun]

18. Dogulu, CF; Tsilou, E.; Rubin, B.; Fitzgibbon, EJ; Kaiser-Kupper, MI; Rennert, OM; Gahl, WA Sjálfvakinn innankúpuháþrýstingur í blöðrubólgu. J. barnalæknir. 2004, 145, 673–678. [CrossRef] [PubMed]

19. Dixon, P.; Kristófer, K.; Chauhan, A. Hugsanlegt hlutverk stromal kollagens í cystínkristöllun hjá cystinosis sjúklingum. Alþj. J. Pharm. 2018, 551, 232–240. [Krossvísun]

20. Katz, B.; Melles, RB; Schneider, JA; Rao, NA Hornhimnuþykkt í nýrnasjúkdómum. Br. J. Oftalmól. 1989, 73, 665–668. [CrossRef] [PubMed]

21. Nesterova, G.; Gahl, WA Cystinosis: Þróun sjúkdóms sem hægt er að meðhöndla. Barnalæknir. Nephrol. 2013, 28, 51–59. [CrossRef] [PubMed]

22. Ariceta, G.; Giordano, V.; Santos, F. Áhrif langtíma cysteamínmeðferðar hjá sjúklingum meðblöðrubólgu. Barnalæknir. Nephrol. 2019, 34, 571–578. [CrossRef] [PubMed]

23. Gilbert, MJ; Zerulla, TC; Tierney, KB Zebrafish (Danio rerio) sem fyrirmynd fyrir rannsókn á öldrun og hreyfingu: Líkamleg hæfni og þjálfunarhæfni minnkar með aldri. Exp. Gerontol. 2014, 50, 106–113. [CrossRef] [PubMed]

24. Gerhard, GS; Kauffman, EJ; Wang, X.; Stewart, R.; Moore, JL; Kasales, CJ; Demidenko, E.; Cheng, KC Líftími og öldrunarsvipgerðir í tveimur stofnum sebrafiska (Danio rerio). Exp. Gerontol. 2002, 37, 1055–1068. [Krossvísun]

25. Saftig, P.; Klumperman, J. Lysosome biogenesis og lysosomal himnaprótein: Mansal mætir virkni. Nat. Séra Mol. Cell Biol. 2009, 10, 623–635. [Krossvísun]

26. Cherqui, S.; Sevin, C.; Hamard, G.; Kalatzis, V.; Sich, M.; Pequignot, MO; Gogat, K.; Abitbol, ​​M.; Broyer, M.; Gubler, MC; o.fl. Uppsöfnun cystíns í meltingarvegi í músum sem skortir cystinosis, próteinið sem er gallað í cystinosis. Mol. Cell. Biol. 2002, 22, 7622–7632. [Krossvísun]

27. Raggi, C.; Luciani, A.; Nevo, N.; Antignac, C.; Terryn, S.; Devuyst, O. Aðgreining og frávik í endolysosomal hólfinu einkenna snemma stig nýrnasjúkdóms blöðrubólgu. Humm. Mol. Genet. 2014, 23, 2266–2278. [Krossvísun]

28. Hard, GC Nokkur hjálpartæki við vefjafræðilega greiningu á nýrnakvilla hýalíndropa í níutíu daga rannsóknum á eiturhrifum. Toxicol. Pathol. 2008, 36, 1014–1017. [Krossvísun]

29. Sakarcan, A.; Timmons, C.; Baum, M. Innanfrumudreifing cystíns í cystínhlaðnum nærpíplum. Barnalæknir. Res. 1994, 35, 447–450. [Krossvísun]

30. Kroeger, PT, Jr.; Wingert, RA Notkun sebrafiska til að rannsaka tilurð fræfrumna meðan á nýrnaþroska og endurnýjun stendur. Mósebók. 2014, 52, 771–792. [Krossvísun]

31. Sumayao, R.; McEvoy, B.; Newsholme, P.; McMorrow, T. Lysosomal cystínsöfnun stuðlar að afskautun hvatbera og framkalla redox-næma gena í nærliggjandi pípulaga frumum nýrna manna. J. Physiol. 2016, 594, 3353–3370. [Krossvísun]

32. Chiaverini, C.; Sillard, L.; Flori, E.; Ito, S.; Briganti, S.; Wakamatsu, K.; Fontas, E.; Berard, E.; Cailliez, M.; Spjall, P.; o.fl. Cystínósín er sortukornaprótein sem stjórnar myndun melaníns. FASEB J. 2012, 26, 3779–3789. [Krossvísun]

33. Adelmann,CH;Traunbauer,AK;Chen,B.;Condon,KJ;Chan,SH;Kunchok,T.;Lewis,CA;Sabatini,DMMFSD12miðlar innflutningi cysteins í sortukorn og lýsósóm. Náttúra 2020, 588, 699–704. [Krossvísun]

34. Leal, MC; Cardoso, ER; Nobrega, RH; Batlouni, SR; Bogerd, J.; Franca, LR; Schulz, RW Vefjafræðilegt og sterafræðilegt mat á sæðisfrumum sebrafiska (Danio rerio) með áherslu á sæðiskynslóðir. Biol. Reprod. 2009, 81, 177–187. [CrossRef] [PubMed]

35. Sansanwal, P.; Sarwal, MM Óeðlileg sjálfsáhrif hvatbera í nýrnasjúkdómumblöðrubólgu. Autophagy 2010, 6, 971–973. [CrossRef] [PubMed]

36. Bellomo, F.; Signorile, A.; Tamma, G.; Ranieri, M.; Emma, ​​F.; De Rasmo, D. Áhrif óhefðbundins hvatbera hringlaga-AMP stigs í nýrnasjúkdómum cystinosis. Cell. Mol. Lífvísindi. 2018, 75, 3411–3422. [CrossRef] [PubMed]

37. De Rasmo, D.; Signorile, A.; De Leo, E.; Polishchuk, EV; Ferretti, A.; Raso, R.; Russo, S.; Polishchuk, R.; Emma, ​​F.; Bellomo, F. HvatberaDynamics of Proximal Tubulular Epithelial Cellsin Nephropathic Cystinosis. Alþj. J.Mol. Sci. 2019,21,192. [Krossvísun]

38. Kalatzis, V.; Serratrice, N.; Hippert, C.; Payet, O.; Arndt, C.; Cazevieille, C.; Maurice, T.; Hamel, C.; Malecaze, F.; Antignac, C.; o.fl. Augnafbrigðin í cystinosis dýralíkani líkja eftir meingerð sjúkdóma. Barnalæknir. Res. 2007, 62, 156–162. [Krossvísun]

39. Romero-Ferrero, F.; Bergomi, MG; Hinz, RC; Heras, FJH; de Polavieja, GG idtracker.ai: Að fylgjast með öllum einstaklingum í litlum eða stórum hópum ómerktra dýra. Nat. Aðferðir 2019, 16, 179–182. [Krossvísun]