Hratt samtímis ákvörðun á sex áhrifaríkum íhlutum í Cistanche Tubulosa með nærri innrauðri litrófsgreiningu

Tengiliður: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Netfang:audrey.hu@wecistanche.com

Xinhong Wang, Xiaoguang Wang og Yuhai Guo

Ágrip:

Magnbundin ákvörðun margra virkra þátta í tiltekinni plöntu krefst venjulega mjög mikið magn af ekta náttúruafurðum. Í þessari rannsókn lögðum við til hraðvirka og ekki eyðileggjandi aðferð til að ákvarða samtímis echinacoside, verbascoside, mannitol, súkrósa, glúkósa og frúktósa íCistanche tubulosameð nær-innrauðri litrófsgreiningu (NIRS). Nær-innrauð dreifð endurspeglun litrófsgreining (DRS) og hágæða vökvaskiljun (HPLC) voru framkvæmd á 116 lotum af Cistanche tubulosa sýnum. DRS gögnin voru unnin með því að nota staðlaða eðlilega fjölbreytni (SNV) og multiplicative scatter correction (MSC) aðferðir. Aðhvarf að hluta minnstu ferninga (PLSR) var notað til að búa til kvörðunarlíkön fyrir áhugaverða þætti í Cistanche tubulosa. Öll líkön voru síðan metin með því að reikna út rótmeðalkvaðratskekkju kvörðunar (RMSEC), fylgnistuðull kvörðunar (r). r gildi allra sex kvörðunarlíkana voru ákvörðuð hærri en 0.94, sem bendir til þess að hvert líkan sé áreiðanlegt. Þess vegna geta megindlegu NIR líkönin sem greint er frá í þessari rannsókn verið hæf til að mæla nákvæmlega innihald sex lyfjaþátta íCistanche tubulosa.

Lykilorð: Cistanche tubulosa; hágæða vökvaskiljun; nær-innrauð litrófsgreining; minnstu ferninga að hluta

Kynning

Cistanche(Hoffmg. Et Link) er ævarandi phenerogamic ættkvísl af Orobanchaceae fjölskyldu plantna. Flestar tegundir sem tilheyra Cistanche ættkvíslinni hafa verið notaðar sem lækningajurt í árþúsundir í Kína; hafa orðspor sem yfirburða tonic; og eru þekkt sem "Ginseng of the Deserts" [1,2].Cistanche tubulosaer skylt sníkjudýr í rótum fjölæru plöntunnar Tamarix Chinensis. Það hefur verið skráð í kínversku lyfjaskránni sem ósvikin uppspretta Cistanches Herba (kínverska nafnið: Roucongrong) frá 2005 útgáfunni [3]. Nútíma lyfjafræðilegar rannsóknir á Cistanche tegundum voru hafnar á níunda áratugnum [4]. Lyfjafræðilegar rannsóknir sýndu að útdrættir Cistanche plantna búa yfir breitt svið af starfsemi, svo sem að lækna nýrnaskort og hægðatregðu í elli, auka hæfni til að læra og leggja á minnið, gegn Alzheimerssjúkdómi, auka friðhelgi, gegn öldrun, gegn þreytu o.s.frv. [1,5–7]. Á síðustu þremur áratugum hefur yfirgripsmiklum og kerfisbundnum lyfjafræðilegum rannsóknum verið blandað saman við plöntuefnafræðilegar rannsóknir til að varpa ljósi á efnislegan grundvöll jákvæðra áhrifa róta Cistanche plantna. Þessar kannanir benda til þess að fenýletanóíð glýkósíð (PhGs) hafi verið helstu áhrifaríku þættirnir í Cistanche plöntum sem gegna lykilhlutverki við meðhöndlun á nýrnaskorti, getuleysi [8], gegn öldrun [9] og gegn Alzheimerssjúkdómi [10]. Innihald tveggja doktorsprófa (echinacoside og verbascoside) var krafist í kínverskri lyfjaskrá. Á sama tíma eiga kolvetni eins og mannitól, súkrósa, glúkósa og frúktósi í Cistanche plöntum hægðalosandi virkni og kolvetnaklasar Cistanche plöntur hafa verið notaðir til að meðhöndla hægðatregðu [11].

Villtar auðlindir afCistanche tubulosaeru aðallega dreift á svæðinu umhverfis Taklamakan eyðimörkina í suðurhluta Xinjiang sjálfstjórnarsvæðisins í Kína. Líkt og margar aðrar tegundir sem notaðar eru sem hefðbundin kínversk lyf (TCM), hefur C. tubulosa mikið efnahagslegt gildi og næstum útdauð í villtum búsvæðum sínum vegna ofsöfnunar. Ræktun C. tubulosa hófst á tíunda áratugnum í Kína til að tryggja hráefnisbirgðir fyrir Cistanches Herba auk þess að vernda villta plöntuauðlindir. Frá og með 2017 eru næstum 13 þúsund ha af ræktuðum C. tubulosa til í Hotan héraðinu í Xinjiang [12,13]. Framfarir í gróðursetningu tækni eru krafist auka ræktun auk þess að bæta gæðiCistanche tubulosa.

Aðaltilgangur ræktunarCistanche tubulosaer að framleiða Cistanches Herba, sem er ríkur í þessum áhrifaríku íhlutum. Hins vegar getur innihald áhrifaríku innihaldsefnanna í Cistanches Herba, eins og PhGs og fásykrur, haft veruleg áhrif á marga þætti meðan á framleiðslu stendur [12,13]. Kanna ætti rauntímagreiningarkerfi á gæðum C. tubulosa. Þess vegna er nauðsynlegt að þróa aðferð með miklum afköstum til að fullnægja kröfunni um að greina mikinn fjölda sýna á stuttum tíma. Hefð er fyrir því að ákvörðun þessara helstu virku þátta, svo sem PhGs og kolvetna, í C. tubulosa var venjulega náð með hágæða vökvaskiljun (HPLC) [14,15]. Þó að það sé nákvæmt og áreiðanlegt er það tímafrekt og flókið fyrir gagnasöfnun og úrvinnslu. Að auki þarf mikinn tíma og fyrirhöfn til að undirbúa sýni sem venjulega felur í sér duftun, útdrátt og síun á HPLC prófum. Þess vegna þarf skýra meginreglu og tól sem er auðvelt í notkun til að fá tiltölulega mikið magn af gögnum. Sem betur fer hefur nær-innrauð litrófsgreining (NIRS) verið mikið notuð til að meta landbúnaðarafurðir [16], matvæli [17], læknissýni [18] og lyfjavörur [19] vegna þess að hún er hröð og ekki eyðileggjandi. Þess vegna gæti NIRS passað nákvæmlega við kröfurnar um skilvirkar mælingar á TCM og það kemur ekki á óvart að NIRS hafi verið beitt fyrir eigindlega auðkenningu [20,21] og magngreiningu efnasambanda [22] í TCM.

Í þessari rannsókn var innihald sex áhrifaríkra innihaldsefna, þar á meðal echinacoside, verbascoside, mannitol, súkrósa, glúkósa og frúktósa í 116 lotum af C. tubulosa sýnum sem safnað var frá Hotan héraðinu í Xinjiang á árunum 2013–2015, fyrst ákvarðað með HPLC. Eftir það voru kvörðunarlíkön þessara sex íhluta komið á með PLSR-aðferðinni (partial least squares regression). Þessi líkön voru síðan staðfest með fylgnistuðlinum og spáskekkjum í kvörðunarsettunum. Niðurstöðurnar sýndu fram á að hægt væri að nota þróaða aðferðina sem áreiðanlega aðferð til megindlegrar greiningar á C. tubulosa.

Niðurstaða

HPLC greining

Innihald echinacoside og verbascoside var ákvarðað með vel skilgreindri HPLC-UV aðferð í bókmenntum [3,23] og fjögur kolvetni (mannitól, súkrósa, glúkósa og frúktósa) voru ákvörðuð með vel skilgreindri HPLC-ELSD aðferð í bókmenntir [24] fyrir öll 116 sýnin. Sýnagerð og ákvörðunaraðferðum var lýst í köflum 3.1 og 3.3. Mynd 1 sýnir einkennandi litskiljun blönduðu staðlanna. Það má sjá að allir sex virku þættirnir voru aðskildir í grunnlínu og því var hægt að mæla þær. HPLC aðferðin var fullgilt fyrir sýnisprófun. Helstu niðurstöður HPLC aðferðarinnar eru taldar upp í töflu 1. Hagstæð línuleg tengsl (r=0.9998) og endurheimt (98,5 prósent) af echinacoside ákvörðunaraðferðinni eru sýnd í niðurstöðunum, sama niðurstaða og öll fimm þættir. Þess vegna er hægt að ákvarða innihald sex áhrifaríku íhlutanna nákvæmlega. Öll ákvörðuð efnissvið eru tekin saman í töflu 1.

NIRS greining

Mynd 2 sýnir NIR litróf (4000–10,000 cm−1) af C. tubulosa sýnunum. Verulegir frásogstoppar komu fram frá 4000 cm−1 til 7500 cm−1 í öllum sýnum, en mildar sveiflur komu fram frá 7500 cm−1 til 10.000 cm−1. Grunnlínuhlaup NIR litrófsins átti sér stað vegna þess að þættir eins og kornastærð og litur höfðu auðveldlega áhrif á sýnið (Mynd 2A). Stærðfræðileg formeðferð litrófsins var notuð til að draga að einhverju leyti úr áhrifum óþarfa upplýsinga. Stærðfræðilegu formeðferðirnar innihéldu fyrstu afleiðslu (1. afleiðslu), önnur afleiðslu (2. afleiðslu), staðlaða eðlilega afbrigði (SNV) og margföldunarleiðréttingu (MSC). Mynd 2B sýnir 2. afleiðslu NIR litrófs C. tubulosa, og augljós breyting sem varð frá þremur svæðum, 4000–4500 cm−1, 5000–5500 cm−1 og 7000–7500 cm−1, sést augljóslega .

Stofnun megindlegra kvörðunarlíkana

Partial least squares regression (PLSR) er klassísk líkanaaðferð og henni hefur verið beitt víða í megindlegum líkönum vegna mikils gæða niðurstaðna. Kostir PLSR eru meðal annars góð spágeta og tiltölulega einfaldleiki. PLSR hefur einnig verið mikið notað við stofnun megindlegra kvörðunarlíkana af TCM [25]. Byggt á formeðhöndluðu NIR litrófinu og NIR megindlegu greiningarlíkani fyrir sex virku efnisþættina í C. tubulosa var komið á fót með því að nota PLSR aðferðina með HPLC greiningargögnum sem sönn gildi. Sýnunum 116 var skipt af handahófi í kvörðunar- og löggildingarsett með 3:1 hlutfalli. Hentugustu skilyrðin fyrir kvörðunina voru valin með lágum RMSEC og háum fylgnistuðli.

Val á öldusviði fyrir kvörðunarlíkönin

Val á heppilegu öldubandi var mikilvægt skref fyrir byggingu kvörðunarlíkana. Í þessari rannsókn voru NIR bilsróf 4000–7500 cm-1 (mælt með TQ sérfræðingshugbúnaði) og 4000–10.000 cm-1 borin saman. Í ljós kom að þetta bil var óhentugt fyrir kvörðunina á bilinu á milli 4000 cm-1 og 7500 cm-1 frá töflu 2. Þess vegna voru litrófsbilin fyrir sex efnasamböndin í þessari rannsókn. allt valið á bilinu frá 4000 til 10.000 cm-1 með því að bera saman árangur RMSEC og fylgnistuðul.

Val á besta fjölda þátta fyrir kvörðunarlíkönin

PLSR útskýrir hámarks breytileika í gögnunum með því að draga úr stærð litrófsgagna með útreikningi þátta. Vandamálið með „vanhæfni“ birtist vegna ófullnægjandi upplýsinga sem stafaði af takmörkuðum fjölda þátta; Hins vegar, að velja þá þætti sem eru stærri en kjörgildin sem kynnt eru í líkaninu mun leiða til „offitness“ vandamálsins. Annaðhvort „vanhæfni“ eða „ofþroska“ mun draga úr forspárkrafti hinna þekktu líkana [22]. Mynd 3 sýnir tengsl RMSECV og þátta fyrir öll sex efnasamböndin. Þess vegna völdum við þá þætti sem samsvara lægstu gildum RMSECV. Besta val á þáttum fyrir kvörðunarlíkönin er skráð í töflu 3.

Val á litrófsformeðferð fyrir kvörðunarlíkönin

Annar mikilvægasti áhrifaþáttur fyrir kvörðunarlíkön er litrófs-formeðferð sem miðar að því að draga úr áhrifum dreifingar og grunnlínureks, auka merkja- og hávaðahlutföll og fjarlægja óreglulegar breytingar. Margföldunarleiðrétting (MSC) og staðlaðar breytilegar aðferðir (SNV) voru notaðar til að útrýma áhrifum geisladreifingar sem tíðkast hefur. Til að leysa áhrif grunnlínureks voru 1. og 2. afleiðuróf borin saman og 2. afleiða valin [26]. Fyrir æskileg áhrif jöfnuðum við litrófið með Savitzky–Golay (SG) síualgríminu fyrir afleiðslu til að koma í veg fyrir stækkun hávaða. Tafla 3 sýnir upplýsingar um litrófsformeðferð og niðurstöður hennar fyrir kvörðunarlíkönin.

Mat á staðfestum líkönum

Gott NIRS kvörðunarlíkan ætti að hafa lágt RMSEC og RMSEP gildi, sem og háan fylgnistuðul (r) og lítinn mun á RMSEC og RMSEP [27–29]. Kvörðunarlíkön af völdum efnasamböndunum sex voru sett upp samkvæmt aðferðunum sem nefnd eru hér að ofan (tafla 3). RMSEC og r gildin fyrir kvörðunarsettið fyrir echinacoside voru 27,6 og 0.9808, í sömu röð. Frammistöðubreytur annarra efnasambandalíkana eru taldar upp í töflu 3, þar sem við getum ályktað að viðurkenndar líkön komi fram viðunandi spániðurstöður og er hægt að nota til hraðrar megindlegrar greiningar á C. tubulosa. Dreifingarmyndir af efnasamböndunum sex eru sýndar á mynd 4 til að gera kvörðunarlíkönin meira lýsandi og sjást sjónrænt. Eins og sést á mynd 4 kom fram minniháttar munur á spágildum og mældum gildum, vegna þess að flestir punktar dreifðust um afturhvarfsferilinn með jöfnunni sem y=x. Þess vegna sást framúrskarandi spáframmistaða á mynd 4.

Efni og aðferðir

Undirbúningur sýnis

Hundrað og sextán C. tubulosa sýnum var safnað frá Hotan héraðinu í Xinjiang sjálfstjórnarsvæðinu frá 2013 til 2015. Öll sýnin voru ræktuð, en þeim var safnað á mismunandi vaxtarstigum. Nýþyngd sýnanna var á bilinu 20 g til 1000 g. Eftir sólþurrkun voru þurrkuðu sýnin mulin og sigtuð í gegnum 60-möskvað sigti [3,23].

NIR Litrófsgagnasöfnun

NIR litróf sýnanna var safnað með 8 cm-1 millibili yfir litrófssvæðinu 4000–10.000 cm-1 með Antaris MXFT-NIR kerfi (Thermo Scientific, Madison, WI, USA) búin með handheldu ljósleiðara endurskinsmillistykki. Hvert litróf var fengið með því að taka að meðaltali 64 skannanir. Öll sýni voru látin ná jafnvægi við stofuhita (25. C) fyrir NIR litrófsskönnun til að tryggja að sýnin væru greind við sama hitastig. Rakastigi á rannsóknarstofunni var haldið í umhverfinu.

HPLC gagnasöfnun

Undirbúningur útdráttar

Eitt gramm af C. tubulosa dufti var dregið út með 50 ml af 50% metanóli í keilulaga flösku með ultra-sonication (500 W, 40 kHz) í 30 mínútur. Útdrátturinn var geymdur við 4 ◦C. Yfirvatnið af útdrættinum var síað til að fá sýni fyrir HPLC greiningu [3,23].

Samtímis ákvörðun Echinacoside og Verbascoside með HPLC-UV

Vökvaskiljunargreining var gerð á Shimadzu UHPLC kerfi (Shimadzu, Kyoto, Japan) sem samanstendur af tveimur LC-20ADXR leysieiningum, LC-20AD dælu, SIL-20ACXRauto sýnatökutæki , CTO-20AC súluofn, SPD-M20A DAD skynjari, DGU-20A3R afgasvél og ICBM-20stýring.

Grace Prevail Carbohydrate ES dálki (150 × 2,1 mm, 2,7 mm) sem notaður var fyrir litskiljunarskilin var haldið við 35 ◦C. Hreyfanlegur fasi samanstóð af asetónítríl (A) og 0,1 prósent vatnskenndri maurasýru (B) og var afhent eftir hallaáætluninni sem hér segir: 0–7 mín., línulegur halli 10–20 prósent A; 7–15 mín., 20 prósent A; og 15–20 mín, línulegur halli 20–10 prósent A. Samhliða hraði farsímafasans var 0,4 ml/mín. UV vöktun var framkvæmd við 330 nm.

Samtímis ákvörðun mannitóls, súkrósa, glúkósa og frúktósa með HPLC-ELSD

HPLC var framkvæmt á Agilent 1100 röð LC kerfi (Palo Alto, CA, USA) sem samanstóð af aG1322A afgasvél, G1311A fjórðungsdælu, G1311A sjálfssýnistæki, G1316A súluhitastýringu og G1315B DAD skynjara.

Sigma Prevail Carbohydrate ES súla (4,6 × 250 mm, 5 µm) var notuð fyrir litskiljunarskil og haldið við súluhitastigið 25 ◦C. Hreyfanlegur fasi var samsettur úr asetónítríli og vatni (77:23, rúmmálshlutfall) og ísókratískum bandamanni með 0,7 ml/mín. Fylgst var með frárennsli með því að nota uppgufunarljósdreifingarskynjara (ELSD) með sjálfgefnum breytum [23,24].

Gagnavinnsla

TQ Analyst (útgáfa 8.0, Thermo Scientific, Madison, WI, USA) var notað til að framkvæma skiptingu á kvörðunar- og staðfestingarsettum, stærðfræðilega formeðferð litrófsins, koma á kvörðunarlíkönum og öðrum útreikningum. Uppruni (útgáfa 9.1) var notuð til að búa til myndirnar.

Ályktanir

Þakkir: Þessi vinna var studd af National Science and Technology Planning Project of China (2015BAD29B00-04).

Framlag höfundar: Xinhong Wang hugsaði og hannaði tilraunirnar. Xinhong Wang og Xiaoguang Wang framkvæmdu tilraunirnar. Xinhong Wang og Yuhai Guo skrifuðu blaðið.

Hagsmunaárekstrar: Höfundar lýsa því yfir að engir hagsmunaárekstrar séu til staðar.

Heimildir

1. Jiang, Y.; Tu, PF Greining á efnafræðilegum innihaldsefnum í cistanche tegundum. J. Chromatogr. 2009, 1216, 1970–1979. [CrossRef] [PubMed]

2. Xu, R.; Chen, J.; Chen, S.-L.; Liu, T.-N.; Zhu, W.-C.; Xu, J. Cistanche deserticola Ma ræktað sem ný ræktun í Kína. Genet. Úrræði. Uppskera Evol. 2008, 56, 137–142. [Krossvísun]

3. Ritstjórn kínverskra lyfjaskráanefndar. Chinese Pharmacopoeia, 2005. útgáfa; Chemical Industrial Press: Peking, Kína, 2005; 1. bindi, bls. 90.

4. Kobayashi, H.; Komatsu, J. Innihald cistanchE herba (1). Yakugaku Zasshi 1983, 103, 508–511. [CrossRef] [PubMed]

5. Söngur, ZH; Lei, L.; Tu, PF Framfarir í rannsóknum á lyfjafræðilegri virkni í plöntum með cistanche huffing. Et hlekkur. Haka. Hefð. Herb. Fíkniefni 2003, 34, 473–476.

6. Xiong, Q.; Kadota, S.; Tani, T.; Namba, T. Andoxunaráhrif fenýletanóíða frá Cistanche deserticola. Biol. Pharm. Naut. 1996, 19, 1580–1585. [CrossRef] [PubMed]

7. Xuan, GD; Liu, CQ Rannsóknir á áhrifum fenýletanóíð glýkósíða (PEG) af Cistanche deserticola á öldrun í öldruðum músum af völdum D-galaktósa. J. Chin. Med. Mater. 2008, 31, 1385–1388.

8. Sato, T.; Kozima, S.; Kobayashi, K.; Kobayashi, H. Lyfjafræðilegar rannsóknir á Cistanchis Herba. I. Áhrif innihaldsefna Cistanchis Herba á kynlíf og námshegðun hjá langvarandi streitu músum. Yakugaku Zasshi 1986, 105, 1131–1144. [Krossvísun]

9. Shen, CY; Jiang, JG; Yang, L.; Wang, DW; Zhu, W. Virk efni gegn öldrun úr jurtum og næringarefnum sem notuð eru í hefðbundinni kínverskri læknisfræði: lyfjafræðilegir aðferðir og afleiðingar fyrir uppgötvun lyfja. Br. J. Pharmacol. 2016, 11, 1395–1425. [CrossRef] [PubMed]

10. Li, N.; Wang, J.; Ma, J.; Gu, Z.; Jiang, C.; Yu, L.; Fu, X. Taugaverndandi áhrif Cistanches Herba Therapy á sjúklinga með miðlungsmikinn Alzheimerssjúkdóm. Sönn. Byggt viðbót. Varamaður. Med. 2015, 2015. [CrossRef] [PubMed]

11. Gao, JY; Jiang, Y.; Dai, F.; Han, ZL; Liu, HY; Bao, Z.; Zhang, TM; Tu, PF Rannsókn á hægðalosandi innihaldsefnum í Cistanche deserticola YC Ma. Mod. Haka. Med. 2015, 17, 307–310.

12. Tu, PF; Chen, QL; Jiang, Y.; Guo, YH; Yang, TX; Wang, XY; Aierkan, M.; Li, XB; Du, Y.; Nan, ZD; o.fl. Ræktunartækni Cistanche tubulosa og hýsils Tamarix spp. Mod. Haka. Med. 2015, 17, 349–358.

13. Tu, PF; Jiang, Y.; Guo, YH; Tian, ​​YZ; Li, XB; Wang, XY; Wei, J.; Chen, QL; Aierkan, M. Þróun vistfræðilegrar iðnaður af cistanches herba til að efla vistfræðilega siðmenningu á vestureyðimerkursvæðinu. Mod. Haka. Med. 2015, 17, 297–301.

14. Lu, DY; Zhang, JY; Yang, ZY; Liu, HM; Li, S.; Wu, BJ; Ma, ZG Magngreining á cistanches herba með hágæða vökvaskiljun ásamt díóða fylkisgreiningu og háupplausnarmassagreiningu ásamt efnafræðilegum aðferðum. J. Sep. Sci. 2013, 36, 1945–1952. [CrossRef] [PubMed]Molecules 2017, 22, 843 9 af 9

15. Jiang, Y.; Li, SP; Wang, YT; Chen, XJ; Tu, PF Aðgreining herba cistanches með fingrafara með afkastamikilli vökvaskiljun-díóða fylki uppgötvun-massa litrófsgreiningu. J. Chromatogr. 2009, 1216, 2156–2162. [CrossRef] [PubMed]

    ---