Hröð framleiðsla á verndandi ónæmi gegn lungnapest eftir Yersinia Pestis fjölliða F1 og LcrV mótefnavaka

Ágrip:

Í nýlegri rannsókn sýndum við fram á að bólusetning með fjölliða F1 hylkismótefnavakanum af plágasjúkdómnum Yersinia pestis leiddi til hraðrar framköllunar á verndandi húmorónæmissvörun með lykilvirkjun á meðfæddum B1b frumum. Aftur á móti tókst einliða útgáfan af F1 ekki að vernda bólusett dýr án tafar í þessu líkani gúlupestarinnar. Í þessari rannsókn skoðuðum við getu F1 til að veita skjótt upphaf verndarónæmis í krefjandi músamódelinu af lungnapest. Bólusetning með einum skammti af F1 aðsogað á álhýdroxíði vakti árangursríka vörn gegn síðari banvænni útsetningu í nef fyrir fullkomlega meinvirkum Y. pestis stofni innan viku. Athyglisvert er að viðbót LcrV mótefnavakans stytti þann tíma sem þarf til að ná svo hröðu verndandi ónæmi í 4-5 daga eftir bólusetningu. Eins og áður hefur komið fram var fjölliða uppbygging F1 nauðsynleg til að veita hraðari verndarsvörun sem sést við bólusetningu með LcrV. Að lokum, í langlífisrannsókn, olli stök bólusetning með fjölliða F1 hærri og jafnari húmorsvörun en sambærileg bólusetning með einliða F1. Hins vegar, í þessu umhverfi, var ríkjandi framlag LcrV til langvarandi ónæmis gegn banvænum lungnaáföllum ítrekað.

Það er náið samband á milli verndandi húmors ónæmissvörunar og ónæmis. Verndandi húmorónæmissvörun er varnarviðbrögð líkamans gegn erlendum sýklum, sem aðallega taka þátt í mótefnum. Ónæmi vísar til getu líkamans til að standast innrás erlendra sýkla. Verndandi húmorónæmissvörun getur stuðlað að drepandi áhrifum ónæmisfrumna, aukið viðnám líkamans og þannig bætt ónæmi. Að auki getur verndandi húmorónæmissvörun einnig stjórnað jafnvægi ónæmiskerfisins, stjórnað virkni ónæmiskerfisins og forðast ofviðbrögð og tilkomu sjálfsofnæmissjúkdóma. Þess vegna er verndandi húmorónæmissvörun nauðsynleg til að viðhalda heilsu líkamans og auka ónæmi. Að auki er ónæmi manna einnig mjög mikilvægt, sem getur komið í veg fyrir að vírusar ráðist á okkur. Cistanche getur aukið ónæmi. Cistanche er ríkt af ýmsum andoxunarefnum, svo sem C-vítamín, C-vítamín, karótínóíðum osfrv. Þessi innihaldsefni geta hreinsað sindurefna, dregið úr oxunarálagi og bætt viðnám ónæmiskerfisins.

Smelltu cistanche tubulosa kostir

Leitarorð:

bólusetning; lungnaplága; hröð vörn; fjölliða F1; einliða F1; LcrV; mús fyrirmynd.

1. Inngangur

Gram-neikvæða bakterían Yersinia pestis er orsök gúlupests og lungnapest. Hundruð milljóna hafa fallið vegna banvæns eðlis sýkinga af völdum þessa hrikalega sýkla í þremur stórum heimsfaraldri og í fjölmörgum staðbundnum faraldri sem hafa verið skráð á síðustu tveimur árþúsundum [1,2]. Vegna mikillar sýkingar og banvænni er Y. pestis flokkaður sem hugsanlegur lífhryðjuverkamaður (https://www.cdc.gov/plague/ bioterrorism/index.html, skoðaður 9. júlí 2021). Eftir uppgötvun og víðtæka notkun sýklalyfja hefur algengi og dánartíðni af völdum plágunnar dregist verulega saman [3,4].

Engu að síður hefur sýklalyfjameðferð gegn plágunni takmarkanir; Til að vera árangursrík verður meðferðin að vera gefin stuttu eftir að einkenni koma fram sem í upphafi eru svipuð og algengrar sýkingar í efri öndunarvegi og þar af leiðandi oft ranglega greind. Sérhver seinkun á gjöf sýklalyfja sem eru sértæk fyrir plágumeðferð getur dregið úr virkni þeirra og leitt til verulegs dánartíðni meðal meðhöndlaðra einstaklinga [5]. Nýleg einangrun á illvígum Y. pestis stofnum sem eru ónæmar fyrir mörgum sýklalyfjum, þar á meðal þeim sem mælt er með til meðferðar, og áhyggjurnar af því að slíkar breyttar svipgerðir geti verið settar inn í illvíga stofna fyrir líffræðilegan hernað eða lífræna hryðjuverkastarfsemi, krefst þess að þróa frekari mótvægisaðgerðir [6-8] . Reyndar sýnir nýleg beiting annarrar línu sýklalyfja, viðbótarmeðferðaraðferðir og samsetning sýklalyfja- og fagurmeðferðar lofandi niðurstöður í múslíkaninu af lungnapest [9,10].

Við höfum nýlega sýnt fram á með því að nota músalíkanið af gúlupestinni að gjöf F1 hylkismótefnavaka Y. pestis vekur verndandi ónæmi innan nokkurra daga og getur því þjónað sem lækningaleg inngrip til að koma í veg fyrir sjúkdóminn [11,12]. Þessi hraða upphaf verndar fól í sér hraðri virkjun á meðfæddum B1b frumum sem búa í kviðarholi og fleiðruholum, sem leiddi til framleiðslu á blóðrásar and-F1 IgM og IgG mótefnum [11,12]. Fjölliða uppbygging F1 var nauðsynleg til að framkalla hraða ónæmi gegn plágu, eins og sýnt er með athuguninni að öfugt við fjölliða F1, tókst einliða hringlaga umbreytt F1 prótein (monoF1) ekki að tengjast kviðhimnu B1b frumum strax eftir bólusetningu, og í samræmi við það var framleiðslu á and-F1 mótefnum seinkað [12]. Í þessari rannsókn, með því að nota múslíkan af Y. pestis sýkingu í nef, skoðuðum við getu F1 mótefnavakans til að veita skjótt verndandi ónæmi gegn lungnapest, sem er alvarlegasta birtingarmynd sjúkdómsins.

Þessi rannsókn sýnir að, eins og í tilfelli um ónæmi fyrir gúlupest, var fjölliðaeðli F1 nauðsynleg fyrir hröðu og langvarandi ónæmi eftir bólusetningu með einum skammti af mótefnavakanum. Þar sem F1 og LcrV mótefnavakar voru líklegast frambjóðandi bóluefni gegn plágu undireininga og sýnt var fram á að framkalla hratt verndandi ónæmi í músamódeli af lungnaplágunni [13], framlengdum við þessa rannsókn með því að takast á við möguleikann á að flýta enn frekar fyrir því að setja upp vörnina gegn lungnaplága af völdum sameinaðs F1 með LcrV samsetningunni.

2. Efni og aðferðir

2.1. Siðferðisyfirlýsing

Þessi rannsókn var framkvæmd í ströngu samræmi við ráðleggingar um umönnun og notkun tilraunadýra Heilbrigðisstofnunarinnar. Allar dýratilraunir voru gerðar samkvæmt ísraelskum lögum og voru samþykktar af siðanefnd um dýratilraunir hjá Ísrael Institute for Biological Research (leyfisnúmer: IACUC-IIBR M-50-18, IACUC-IIBR M-36-19, IACUC -IIBR M-64-19, IACUC-IIBR M-73-20). Eftir áskorunina í nefið var fylgst með músunum daglega. Mannúðlegir endapunktar voru notaðir í lifunarrannsóknum okkar. Mýs sem sýndu tap á réttingarviðbragði voru aflífaðar með leghálsi.

2.2. Dýr

Sex til átta vikna gamlar innræktaðar C67BL/6 kvenkyns mýs voru keyptar frá Envigo (Jerúsalem, Ísrael). Karlkyns og kvenkyns geisladiskar-1 á svipuðum aldri voru keyptir frá Charles River (Bretlandi).

2.3. Dýrabólusetning með hreinsuðum mótefnavaka

PolyF1: Fjölliða F1 próteinið var hreinsað úr ræktunarfrumvökva E. coli frumna sem tjá caf1 óperón Y. pestis Kimberley53 stofnsins, eins og áður hefur verið lýst í [14]. Mólþungi hreinsaðs F1 var ákvarðaður hærri en 1000 kDa með stærðarútilokunarskiljun með Superdex 200 súlu (Cytiva, MA, Bandaríkjunum).

MonoF1: ​​Plasmíðið pAH34L sem kóðar fyrir einliða F1 (cpCaf1) var vinsamlega fengið frá Dr. Daniel Peters og prófessor Jeremy H. Lakey, Newcastle University, Bretlandi [15]. pAH34L var sett í Lemo21 (DE3) E. coli keypt frá New England Biolabs (Ipswich, MA, Bandaríkjunum). Handahófsvalin umbreytingarefni voru ræktuð við 37 ◦C og 220 rpm í frábæru seyði sem bætt var við ampicillíni (200 µg/mL). Tjáning var framkölluð miðlungs log með því að bæta við ísóprópýl-þíógalaktópýranósíði (IPTG; 1 mM), og ræktunin var síðan ræktuð við 18 ◦C og 220 rpm í 19 klst. Bakteríukögglar voru vigtaðir (blautþyngd) og leyst upp með CelLytic™ B frumulýsihvarfefni samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda (Merck-Sigma, Rehovot, Ísrael).

Raðbrigða Tol3–cpCaf1 samrunapróteinið var hreinsað með auðveldaðri þrýstingsvökvaskiljun (PFLC) á HisTrap™ HP súlu samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda (Cytiva, MA, Bandaríkjunum). Tol3 hlutinn var aðskilinn frá cpCaf1 með klofningu með trombíni (Merck-Sigma, Rehovot, Ísrael) og endurupptöku þess fyrrnefnda á endurmyndaða HisTrap™ HP súlu. cpCaf1 (monoF1) hlutanum var safnað úr gegnumflæðishlutanum og mikið skilað gegn 1× PBS. Endotoxín voru fjarlægð með Triton X-114 fasaaðskilnaðaraðferðinni, eins og lýst var áður í [16]. Magn próteina var mæld með bicinchoninsýruaðferðinni (Pierce™ BCA Protein Assay Kit, Thermo). Hreinleiki einliða F1 var sannreyndur með SDS-PAGE fylgt eftir með Coomassie blá litun og með Western blot greiningu með því að nota kanínu and-F1 mótefni, eins og áður hefur verið lýst í [11].

LcrV: LcrV kóðaröðin í fullri lengd frá meindýra Y. pestis Kimberley53 stofninum var klónuð inn í pGEX tjáningarferjuna (GE Healthcare, Chicago, IL, Bandaríkjunum) og sett inn í E. coli frumur. LcrV kóðaröðin reyndist vera eins og LcrV Y. pestis CO92 stofnsins. Raðbrigða LcrV var framleitt og hreinsað eins og lýst er af Leary et al. [17]. Endotoxín voru fjarlægð úr hreinsuðu LcrV eins og lýst er hér að ofan.

Alls voru 20 til 160 µg af polyF1 og LcrV eða 80 µg af monoF1 aðsogaðir á 2 prósent ál-hýdroxíð (AlOH) hlaup (Brennentag Biosector, Danmörku) í lokastyrk upp á 0,36 prósent. Einstakar mýs voru bólusettar undir húð með því að nota stöðugt rúmmál 200 µL gefið í mjóbak.

2.4. Einkenni sermisfræðilegrar svörunar

Mýs voru teknar úr hala og einstakir IgG títrar myndaðir gegn F1 og LcrV í sermi voru ákvarðaðir með ELISA, eins og áður hefur verið greint frá í [11]. IgG1 og IgG3 títrar voru mældir með því að nota ísótýpusértæka alkalíska fosfatasa-tengda geitamótefni gegn músum (Jackson Laboratories, Farmington, CT, Bandaríkjunum).

Berkju- og lungnaskolun (BAL): Mýs voru svæfðar með lausn af ketamíni/xýlazíni og barkinn var afhjúpaður og gætt var að því að valda ekki blæðingum. Gerður var lítill skurður og {{0}} sveigjanleg holnál (BD Neoflon™) var sett í og ​​fest með skurðaðgerð. Lungun voru þvegin með 1× PBS með því að nota 1 ml luer-lock sprautu sem var tengd við festu holnálina. Skolvökvi sem var mengaður af einhverju blóði var fargað. Skolvökvinn var hreinsaður með skilvindu (400× g, 4 ◦C) og flotið var dauðhreinsað fyrir ELISA. Styrkur and-F1 og and-LcrV mótefna í BAL vökva (BALF) bólusettra dýra var ákvarðaður með því að nota þynnt Mab 57 (F1) og Mab 59 (LcrV) sem áður var greint frá í [18] sem staðlaðar ferlar sem eru innifaldar í hverjum {{14} }brunn prófunarplata. Greiningarmörk (LODs) fyrir and-F1 IgG og and-LcrV mótefni í BALF voru ákvörðuð 0,8 ng/ml og 0,15 ng/ml, í sömu röð.

2.5. Músasýking

Sýkingar í nef (innan) voru framkvæmdar eins og áður hefur verið lýst í [19]. Í stuttu máli var lykkja full af dæmigerðum Y. pestis Kim53 bakteríubyggðum safnað og þynnt í hjartainnrennslissoði (HIB, Difco) ásamt 0,2 prósent xylósi og 2,5 mM CaCl2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) í OD660 upp á 0.01 og ræktað í 22 klst við 28 ◦C og 100 snúninga á mínútu. Í lok ræktunartímabilsins (OD660 ≈ 4) var ræktunin þvegin og þynnt í saltvatni (0,9 prósent NaCl) í æskilegan smitandi skammt sem var sannreyndur með því að telja nýlendumyndandi einingar eftir málun og ræktun á BHIA plötum (48 klst. við 28 ◦C). Mýs voru svæfðar með blöndu af 0,5 prósent ketamín HCl og 0,1 prósent xylasíni og síðan sýktar í nef með 35 µL/mús af bakteríusviflausninni. LD50 í nefi Kim53 stofnsins gagnvart C57BL/6 músum er 1100 cfu og 2100 cfu gagnvart CD-1 músum. LD50 gildin voru reiknuð út samkvæmt aðferð sem lýst er af Reed og Muench [20]. Fylgst var með veikindum og dánartíðni músa daglega í 21 dag. Í lok þessa tímabils var úthreinsun sýkillinnar sannreynt með því að setja milta einsleitt úr eftirlifandi dýrum á BHIA plötur ásamt 200 µg/mL streptomycini (48 klst. við 28 ◦C).

2.6. Einkenni múslíkansins af lungnaplágunni

Mýs sem voru sýktar í nef voru svæfðar á tilgreindum tímapunkti eftir útsetningu með lausn af ketamíni/xýlazíni og heparínsýkt blóð var dregið með hjartastungu. Í kjölfarið voru miðmætti ​​eitla (mdLN), lungu og milta skorið út og maukað í einfrumu sviflausn á 70 µm nylon möskva (frumusigti, Falcon, Corning, NY, USA) í 1× PBS . Fjöldi Y. pestis Kim53 í hinum ýmsu líffærum og blóði var ákvarðaður með því að setja raðþynntar frumusviflausnir á BHIA plötur með 200 µg/ml streptomycini. Til vefjafræðilegrar greiningar voru mýs svæfðar og barka þeirra sett í holræsi eins og gefið er til kynna hér að ofan. Súla (0,7 × 30 cm, KONTES, St. Louis, MO, Bandaríkjunum) fyllt með jafnaðri formaldehýðlausn (10 prósent endanleg þéttni) var tengd við holnálið og lungun voru „uppblásin“ eingöngu með þyngdarafl. Lungun fyllt með festiefni voru geymd í sama jafnalausn í 14 daga og síðan unnin til að mynda paraffín-innfelldar blokkir. Eins til þriggja míkrómetra hlutar voru litaðir með venjulegu eósín/hematoxýlín (H&E) lit og með Masson-Goldner litunarsetti (Merck, Rehovot, Ísrael) til að greina bandvefssjúkdóm. Að auki voru lungnasneiðar litaðir fyrir Y. pestis með því að nota innanhúss kanínu and-F1 IgG mótefni (1:10,000) og Histostain®-SP settinu (ZYMED®, Invitrogen, Waltham, MA, Bandaríkjunum ). Litaðir hlutar voru myndaðir með ICC3 myndavél tengdri Axioscope A1 smásjá (Zeiss, Þýskalandi).

2.7. Tölfræðigreining

Mikilvægi milli títra sem skráðir voru í músum sem tilheyra fleiri en tveimur hópum var ákvörðuð með Kruskal-Wallis sem ekki var parametrisk með Dunn's post hoc prófi. Log-rank (Mantel-Cox) prófið var notað til að bera saman lifunarferla sem fengust í hinum ýmsu bólusetningarhópum. Mismunur var talinn marktækur ef p Minna en eða jafnt og 0.05. Útreikningar voru gerðir með GraphPad Prism hugbúnaði.

3. Úrslit

Í fyrri rannsókn sýndum við fram á að bólusetning á músum með innfæddu fjölliðuformi F1 hylkismótefnavakans Yersinia pestis leiddi til skjótrar verndar gegn gúlupestinum. Í samræmi við það var lagt til að F1 gjöf gæti ekki aðeins talist fyrirbyggjandi ráðstöfun heldur einnig sem lækningaleg íhlutun í neyðartilvikum eins og uppkomu sem felur í sér náttúrulega eða illgjarn verknaða sýklalyfjaónæma stofna [12]. Í þessari skýrslu var könnun á hraðri vörn ef um lungnapest væri að ræða með því að nota hið rótgróna músamódel sem samanstendur af útsetningu músa fyrir sjúkdómsvaldinu með sáningu í nef. Sýnt var fram á að þetta líkan varðveiti sjúkdómsvaldandi áhrif sem einkennir einkenni öndunarfæra aðal lungnapest (viðbótarmynd S1) [10,19,21-24].

3.1. Hröð verndandi ónæmi veitt af F1 og LcrV í múslíkani lungnaplágunnar

Geta F1 mótefnavakans til að framkalla hraða vörn var prófuð með tilraunum þar sem C57BL/6 mýs voru bólusettar með einni gjöf AlOH-aðsogaðs polyF1 (20, 80 og 160 µg/mús), en samanburðardýr voru aðeins sprautuð með hjálparefnið. Geta bólusettu músanna til að lifa af banvæna sýkingu í nef með illvíga Y. pestis stofninum Kim53 (10LD50=11,000 cfu) var metin þremur og sjö dögum eftir bólusetningu í samanburði við samanburðardýr (Mynd 1) ). Eftir þrjá daga sást aðeins hófleg framlenging á tíma til dauða og lifun (af ófullnægjandi tölfræðilegri þýðingu) (mynd 1A). Með því að lengja tímann á milli bólusetningar og áreitis um aðeins 4 daga í viðbót (alls 7 dagar) var hægt að bjarga öllum músum sem voru bólusettar með stórum skömmtum af polyF1 (80 og 160 µg/mús) auk 87 prósenta músanna sem voru bólusettar með lítill skammtur af polyF1 (Mynd 1B).

Hæfni F1 mótefnavakans til að framkalla hraða verndandi ónæmissvörun gegn lungnaplágunni hvatti okkur til að kanna hvort bólusetning með viðbótar verndandi mótefnavaka, LcrV, myndi bæta ónæmisástand dýranna enn frekar með því að flýta fyrir upphaf verndarónæmis. Reyndar, þegar banvæna Y. pestis áskorunin var framkvæmd 3 dögum eftir samsetta bólusetningu, tókst gjöf LcrV og polyF1 blöndunnar (80 µg eða 160 µg af hvorum mótefnavaka) að bjarga 30–50 prósentum af mýs (Mynd 1C). Einkum var það að lengja tímabilið milli bólusetningar og áskorunar í sjö daga veitti öllum bólusettum dýrum fulla vernd í öllum skömmtum mótefnavakanna (mynd 1D). Hæfni polyF1 eitt sér eða ásamt LcrV til að veita skjótt verndandi ónæmi gegn lungnaplágunni innan viku var ekki fyrir áhrifum af því að auka áskorunarskammtinn af útsetningu í nef um tífalt (Mynd 1E), sem staðfestir styrkleika verndar ástandsins.

3.2. Hreyfifræði húmorssvörunar eftir bólusetningu með F1 og LcrV

Athugunin á því að sameina LcrV og F1 bóluefnið framkallaði hratt verndandi ónæmi benti til þess að húmorssvörun hafi verið framkölluð skömmu síðar. Til að bregðast við þessum möguleika og til að ákvarða framlag húmorsvörunar gegn hverjum mótefnavaka til verndar gegn Y. pestis, voru hreyfihvörf sértæku IgG mótefnanna sem mynduðust gegn einstökum mótefnavakunum greind 5-9 dögum eftir stakskammta bólusetningu af C57BL/6 músum með blandaðri samsetningu af polyF1 og LcrV (Mynd 2A). Eins og búist var við, miðað við fyrri athuganir, voru and-F1 IgG mótefnatítrar (GMT=1.35 × 103 ) þegar greinanlegir í sermi allra bólusettra dýra á degi 5 eftir bólusetningu (Mynd 2B).

Smám saman aukning á and-F1 IgG mótefnatítrum kom fram á næstu dögum og náði ~60-falt hærra gildi á degi 9 eftir bólusetningu (GMT=8.26 × 104, mynd 2B). Einnig var hægt að greina and-F1 IgG mótefni í lungnavökvanum frá og með 7. degi eftir bólusetningu og náðu styrk eins og ~1 µg/ml á degi 9 (Mynd 2C). Athyglisvert er að þó að and-LcrV húmorsvörun hafi tafist samanborið við það sem framkallað er af polyF1 (dagur 7 GMT=613, mynd 2D), mældist meiri aukning á and-LcrV IgG mótefnagildum næstu daga, sem sýndi heildaraukning um ~160-föld (GMT=1 × 105, mynd 2D). Einnig var hægt að greina and-LcrV IgG mótefni í lungnavökva bólusettra músa frá og með 8. degi, þó í lægri styrk miðað við and-F1 gildi (Mynd 2E).

Mikil aukning á and-LcrV IgG títrum, sem sást á dögum 8–9 eftir bólusetningu, virtist ekki fela í sér virkjun á meðfæddum B1b frumum, eins og bendir til þess af athuguninni að IgG3 hluti þessara mótefna væri undir greiningu miðað við and-F1 IgG3 mótefnahlutinn ([12] og viðbótarmynd S2). Þess vegna benda gögnin til þess að LcrV gæti einnig framkallað hraða húmorsvörun sem veitti, ásamt F1, skilvirka vörn gegn lungnapestinni strax einni viku eftir bólusetningu. Ennfremur bendir sú athugun á því að and-F1 og and-LcrV IgG mótefni hafi safnast í lungum bólusettra dýra til þess að staðbundin svörun í lungum geti verið mikilvæg til að ná ónæmi gegn lungnapest.

3.3. Mikilvægi F1 fjölliða uppbyggingarinnar fyrir skjótt upphaf verndarónæmis

Við höfum áður birt niðurstöður sem styðja eindregið þá hugmynd að fjórðungur fjölliða arkitektúr F1 sé nauðsynlegur fyrir getu þess til að framkalla skjóta verndarviðbrögð gegn gúlupest [12]. Þar af leiðandi, í þessari rannsókn, var einnig fjallað um þetta mál þegar um var að ræða vernd gegn lungnapest. Mýs voru bólusettar með einliða eða fjölliða F1, í báðum tilfellum fól það í sér samhliða gjöf LcrV (80 µg af hverjum mótefnavaka/mús). Þremur, fjórum og fimm dögum síðar voru mýsnar ögraðar í nefið með banvænum skammti af Y. pestis Kim53. Lifunargögnin sem sýnd eru á mynd 3 bentu til þess að bólusetning með blöndu af polyF1 og LcrV verndaði 25 prósent, 62,5 prósent og 87,5 prósent músanna, í sömu röð (Mynd 3A), fyrir banvænum áreiti.

Aftur á móti létu allar mýs sem bólusettar voru með monoF1 og LcrV blöndunni fyrir sýkingunni nema hópurinn sem var bólusettur 5 dögum fyrir áskorunina, sem sýndi lága 25 prósenta vörn (Mynd 3B). Bólusetning með óblönduðum samsetningum sem samanstóð af annað hvort polyF1, monoF1 eða LcrV (80 µg/mús) 4 dögum fyrir áskorunina verndaði ekki dýr. Hins vegar leiddi bólusetning með polyF1 til marktækrar seinkun á dánartíðni samanborið við alla aðra tilraunahópa (p < 0,001; mynd 3C). Samanlagt sýna þessar niðurstöður greinilega að fjölliðaform F1 er nauðsynlegt til að fá skjóta verndarsvörun ásamt LcrV.

3.4. Lýsing á langtíma verndandi ónæmi sem stafar af einni bólusetningu með F1 og LcrV

Að lokum skoðuðum við hvort klassískt langtímaverndandi ónæmi gegn lungnapest sé mismunandi hjá músum sem bólusettar eru með monoF1 eða polyF1. Samkvæmt því voru CD1 mýs bólusettar einu sinni með monoF1 eða polyF1 einu sér, sem og með gjöf lyfjaforma sem innihéldu samsetningu með LcrV. Magn sértækra mótefna í sermi bólusettra dýra var mælt sex mánuðum síðar. Gögnin sem sýnd eru á mynd 4A sýna að and-F1 IgG titrar voru hærri í öllum hópum sem voru bólusettir með polyF1 en hjá þeim sem voru bólusettir með monoF1. Háir og stöðugir and-LcrV IgG titrar voru mældir í öllum músum sem voru bólusettar með LcrV.

Tímabil sem var 6 mánuðir eftir bólusetningu (3 dögum eftir blóðtöku til að ákvarða títra), voru mýs ögnuð í nef með banvænum skammti sem samanstóð af 100LD50 af Y. pestis Kim53 og fylgst var með lifun í 21 dag (mynd 5). Mýs sem voru bólusettar með polyF1 sem einum mótefnavaka voru aðeins verndaðar að hluta, en allar mýs sem voru bólusettar með monoF1 létust fyrir sýkingunni, svipað og áður óþekktar mýs (mynd 5A). Athyglisvert er að and-F1 IgG títrar sem voru mældir í sermi fjölF1-bólusettra dýra sýndu ekki sterka fylgni við lifun gegn lungnaáföllum (Mynd 5B). Viðbót á LcrV gerði fulla vörn fyrir mýsnar sem voru bólusettar með monoF1 sem og þeim sem voru bólusettar með polyF1 (Mynd 5A), sem gefur til kynna að andLcrV svörunin gerði fulla birtingu á verndargildi and-F1 svörunarinnar. Svipaðar niðurstöður varðandi húmorssvörun og lifun við lungnaárás fengust hjá bólusettum karlkyns CD-1 músum (viðbótarmynd S3), sem gefur til kynna að rannsóknin sé ekki hlutdræg eftir kyni dýra (athugið að fyrstu tilraunir voru gerðar með kvendýrum) .

Samanlagt sýna þessar niðurstöður að F1 í sjálfu sér getur framkallað hraða vörn gegn lungnapest, sem fer eftir náttúrulegri fjölliða uppbyggingu þess. Bæting LcrV við polyF1 stytti ekki aðeins þann tíma sem þarf til að ná svo hraðri vörn heldur veitti einnig langvarandi og áhrifaríkt verndandi ónæmi gegn lungnaáhrifum plágu, eins og áður hefur verið lýst.

4. Umræður

Nýleg einangrun á illvígum Y. pestis stofnum sem eru ónæmar fyrir nokkrum sýklalyfjum, þar á meðal þeim sem mælt er með til meðferðar [8,25,26], er rakin til leitar að frekari mótvægisaðgerðum gegn lungnapestinni, svo sem bóluefni sem framkalla hratt ónæmi, hátt lýðheilsu og klínískt mikilvægi. Bóluefni eru almennt álitin fyrirbyggjandi mótvægisaðgerðir gegn smitsjúkdómum og eru því afhent heilbrigðu fólki mörg ár fram í tímann. Samkvæmt því fólu meirihluti forklínískra rannsókna, sem rannsaka þróun bóluefnis gegn plágunni, langvarandi bólusetningar fyrir banvæna áskorun [13,27-29]. Við höfum áður greint frá því að bólusetning með náttúrulegu fjölliðuformi hylkis F1 mótefnavakans kallar fram mjög hratt og öflugt B-frumuháð ónæmissvörun sem verndar dýrin jafnvel nokkrum klukkustundum eftir banvæna Y. pestis áskorun undir húð [11,12].

Í þessum rannsóknum höfum við sýnt að ein bólusetning með F1 veldur uppsöfnun and-F1 mótefna (IgM og IgG) í sermi innan nokkurra daga með virkjun meðfæddra B1b frumna. Þessi undirhópur B-frumna er búsettur í kviðarholi músa og myndar venjulega sermisfræðileg svörun gegn próteinkenndum fjölliða mótefnavaka, svo sem LPS og fjölsykrum sem mynda hylki margra sýkla (pneumókokka, meningókokka osfrv.) [30]. Þessi hröðu ónæmissvörun einkennist af sjálfstæði T-frumna og myndun IgG3 músa mótefnasermisgerðarinnar. Við sýndum að allir ofangreindir eiginleikar eiga einnig við um hröðu verndarviðbrögðin sem F1 myndar. Ennfremur sýndum við fram á að fjölliðaeðli F1 er nauðsynlegt fyrir þessa hröðu ónæmissvörun, eins og einliða F1 (myndað af hringlaga umbreytingu caf1 gensins) tókst ekki að virkja B1b frumur, sem var á eftir fjölliða F1 í IgG titer hreyfihvörfum, gerði myndaði ekki IgG3 sermisgerðina og tókst ekki að veita skjóta vörn. Þessari hröðu svörun fylgir hefðbundin hægari T-frumuháð aðlögunarsvörun gegn F1. Þess vegna gerum við þá tilgátu að fjölliða F1 framkalli tvö sermisfræðileg viðbrögð sem virka samhliða: önnur sem er T-frumuóháð í gegnum B1b frumur og sú seinni sem tekur þátt í eggbús B frumum á T-frumuháðan hátt [12].

Í þessari skýrslu var fyrri rannsókn framlengd með því að fjalla um getu F1 mótefnavakans til að veita skjóta verndandi svörun í krefjandi músarlíkani af lungnapest. Við sýnum að ein gjöf AlOH-aðsogaðs fjölliða F1, sjö dögum fyrir banvæna áskorun í nef með illvígum Y. pestis stofni, getur framkallað árangursríka verndarsvörun (Mynd 1). Þessi óvænta athugun á sér nánast ekkert fordæmi, ekki aðeins varðandi hraða efnahvarfanna heldur einnig með tilliti til þeirrar staðreyndar að sjaldan var fjallað um hæfni F1 mótefnavakans til að veita vernd í múslíkani af lungnapest [31]. Athugunin sem greint er frá hér er í samræmi við það sem Derbise og samstarfsmenn hennar hafa skjalfest [32] varðandi greiningu á and-F1 mótefnum stuttu eftir bólusetningu. Hér sýnum við að viðbót LcrV við polyF1 var ekki aðeins hagstæð til lengri tíma litið, eins og áður hefur verið greint frá [33,34], heldur flýtti hún einnig fyrir verndandi ónæmissvörun gegn Y. pestis í nefi í aðeins nokkra daga (myndir 2) og 5).

Hæfni til að búa til skjóta vörn gegn lungnapest með bólusetningu með F1 og LcrV styrkir svipaðar niðurstöður sem Williamson og félagar höfðu áður greint frá [13], þar sem bólusetning með F1 og LcrV veitti skjóta vörn gegn úðabrúsa með Y. pestis. Mikil aukning á and-LcrV IgG títrum sem sást á dögum 8 og 9 gefur til kynna að mjög öflugt ónæmiskerfi hafi verið virkjað af LcrV snemma eftir bólusetningu. Skortur á and-LcrV IgG3 mótefnum í sermi, mismunandi hreyfihvörf þeirra og lægra magn and-LcrV IgG mótefna sem finnast í lungnavökva benda eindregið til þess að stakur ónæmiskerfi hafi verið virkjaður af F1 og LcrV mótefnavakunum, sem báðir mestu líklega stuðlað að hraðri framkalla verndarsvörunar (Mynd 3C).

Svipað og fyrri athuganir okkar í músarlíkani gubbupests, var hæfileikinn til að framkalla hraða verndandi ónæmissvörun gegn lungnaplágunni háð fjölliða uppbyggingu F1 mótefnavaka (Mynd 3). Þessi athugun bendir til þess að ekki sé búist við því að ríkjandi frambjóðandi bóluefni gegn plágu undireininga, sem samanstendur af einliða F1 og LcrV sem samrunaprótíni [35,36], muni veita skjótt upphaf ónæmis gegn lungnaplágunni; þó þarf að skoða þessa forsendu með tilraunum. Sermisfræðileg svörun sem LcrV myndar, þrátt fyrir að vera hægari en polyF1 (Mynd 2), leyfði samt hröð verndandi aðlögunarsvörun sem kom í veg fyrir banvæn áhrif lungnapest. Þessi tiltölulega hraða sermissvörun stafaði líklega af getu LcrV mótefnavakans til að mynda dimera eða tetramera í lausninni, eins og hefur komið fram í fyrri rannsóknum [37,38] og óbirtum gögnum okkar. Í ljósi niðurstaðna okkar um áhrif margmertrar uppbyggingar F1 til að flýta fyrir myndun húmorísks ónæmissvörunar, getur raðbrigðaverkfræði LcrV próteins sem gerir fjölmerun í meira mæli gert kleift að flýta fyrir svöruninni enn frekar. Í samræmi við þessa forsendu er vert að taka eftir nýlegri skýrslu sem skjalfestir að örkristallar sem innihalda F1 og LcrV voru verndandi en sambærilegt bóluefni sem samanstendur af þessum mótefnavaka í leysanlegu formi [39]. Þessi athugun bendir til þess að aukning á þéttleika mótefnavakanna, sem á sér stað í F1 fjölliðunni, gæti bætt og hugsanlega flýtt fyrir verndandi húmorssvörun.

Til viðbótar við getu þess til að framkalla hraðvirka framköllun ónæmis, í tilraunum sem fjalla um langlífi verndarástandsins, myndaði ein bólusetning með fjölliða F1 stöðugri og jafnari IgG títra en með einliða F1 (mynd 4). Hins vegar veitti bólusetning með polyF1 einu sér aðeins að hluta til vörn gegn lungnasjúkdómum. Athygli vekur að sértæku and-F1 IgG títrar sem mældir voru í einstökum músum voru illa í tengslum við getu þeirra til að lifa af áskorunina (Mynd 5B). Bólusetning músanna með blöndu af hverju formi F1 ásamt LcrV myndaði hærra verndarstig (mynd 5). Þessar niðurstöður eru í samræmi við fyrri rannsóknir sem sýndu að bólusetning með bóluefninu fyrir drepnar heilar frumur (KWC), sem framkallar and-F1 IgG en ekki and-LcrV IgG titra, var árangurslaus til að veita ónæmi gegn lungnapest [13,40] .

Þó að í langlífsrannsókninni hafi polyF1 aðeins veitt seint ónæmi að hluta, sýndi þetta prótein getu til að vernda mýsnar að fullu stuttu eftir bólusetninguna, sem bendir til þátttöku viðbótar skammvinnra ónæmisaðferða sem stuðlaði að úthreinsun sjúkdómsvaldsins í hraða. ónæmistilraunir. Við höfum nýlega sýnt fram á að bólusetning með veiklaða Y. pestis-stofninum EV76 kveikti á næringarvarnarkerfi sem stöðvaði meinvirkni sem miðlaði hliðrófórum sjúkdómsvaldsins sem keppir um járnjónir sem eru tiltækar í hýsilnum, sem stuðlaði að því að ónæmi gegn plágu hófst hratt. 41]. Skýring á stuttlífu stuðningsverkunum sem hafa samvirkni við and-F1 vessaónæmissvörun getur aðstoðað við þróun betri bóluefna gegn lungnapest sem og öðrum banvænum smitsjúkdómum.

Viðbótarefni:

Eftirfarandi stuðningsupplýsingar er hægt að hlaða niður á https://www.mdpi.com/article/10.3390/vaccines11030581/s1, mynd S1: Einkenni lungnaplágu eftir sáningu í nefi á Y. pestis Kim53. Mynd S2: Einstaklingseinkenni and-F1 og and-LcrV mótefna í sermi bólusettra músa. Mynd S3: Langlífi sermisfræðilegrar svörunar og lifun karlmúsa eftir staka bólusetningu með einliða F1 og fjölliða F1 annað hvort eitt sér eða með LcrV.

Framlög höfunda:

Hugmyndafræði, EM og YL; Gagnaöflun, YL; Formleg greining, YL; Rannsókn, MA, AT, DG, YV, AZ og YL; Aðferðafræði, YL; Auðlindir, TH og AM; Umsjón, EM; Ritun—Upprunaleg drög, EM og YL; Ritun — Yfirferð og klipping, TC, EM og YL Allir höfundar hafa lesið og samþykkt útgefna útgáfu handritsins.

Fjármögnun:

Þessi rannsókn var styrkt af Israel Institute for Biological Research, styrk númer SB/07.

Yfirlýsing endurskoðunarnefndar stofnana:

Á ekki við.

Yfirlýsing um upplýst samþykki:

Á ekki við.

Yfirlýsing um framboð gagna:

Gögnin sem kynnt eru í þessari rannsókn eru fáanleg samkvæmt beiðni frá samsvarandi höfundum.

Hagsmunaárekstrar:

Höfundar lýsa ekki yfir hagsmunaárekstrum.

Heimildir

1. Butler, T. Plague og aðrar Yersinia sýkingar; Greenough, W., Merigan, TC, ritstj.; Plenum Medical Book Company: New York, NY, Bandaríkin, 1983.

2. Randremanana, R.; Andrianaivoarimanana, V.; Nikolay, B.; Ramasindrazana, B.; Paireau, J.; Ten Bosch, QA; Rakotondramanga, JM; Rahajandraibe, S.; Rahelinirina, S.; Rakotomanana, F.; o.fl. Faraldsfræðileg einkenni þéttbýlisfaraldurs á Madagaskar, ágúst-nóvember, 2017: Skýrsla um braust. Lancet Infect. Dis. 2019, 19, 537–545. [Krossvísun]

3. Kugeler, KJ; Staples, JE; Hinckley, AF; Gage, KL; Mead, PS Faraldsfræði mannapest í Bandaríkjunum, 1900–2012. Koma fram. Smitast. Dis. 2015, 21, 16–22. [Krossvísun]

4. Kugeler, KJ; Mead, PS; Campbell, SB; Nelson, CA Sýklalyfjameðferðarmynstur og sjúkdómsárangur meðal bandarískra sjúklinga með plágu, 1942–2018. Clin. Smitast. Dis. 2020, 70, S20–S26. [Krossvísun]

5. Godfred-Cato, S.; Cooley, KM; Fleck-Derderian, S.; Becksted, HA; Russell, Z.; Meaney-Delman, D.; Mead, PS; Nelson, CA Treatment of Human Pest: Kerfisbundin endurskoðun á birtum samanlögðum gögnum um verkun sýklalyfja, 1939–2019. Clin. Smitast. Dis. 2020, 70, S11–S19. [Krossvísun]

6. Galimand, M.; Guiyoule, A.; Gerbaud, G.; Rasoamanana, B.; Chanteau, S.; Carniel, E.; Courvalin, P. Fjöllyfjaþol í Yersinia pestis miðlað af yfirfæranlegu plasmíði. N. Engl. J. Med. 1997, 337, 677–680. [Krossvísun]

7. Welch, TJ; Fricke, WF; McDermott, PF; White, DG; Rosso, ML; Rasko, DA; Mammel, MK; Eppinger, M.; Rosovitz, MJ; Wagner, D.; o.fl. Margþætt sýklalyfjaónæmi í plágu: vaxandi lýðheilsuáhætta. PLoS ONE 2007, 2, e309. [Krossvísun]

8. Lei, C.; Kumar, S. Yersinia pestis sýklalyfjaónæmi: Kerfisbundin endurskoðun. Osong Public Health Res. Sjónarhorn. 2022, 13, 24–36. [Krossvísun]

9. Zauberman, A.; Gur, D.; Levy, Y.; Aftalion, M.; Vagima, Y.; Tidhar, A.; Chitlaru, T.; Mamroud, E. Gjöf eftir útsetningu á lifandi bóluefni frá Yersinia pestis til að styrkja önnur lína sýklalyfjameðferð gegn lungnapest. J. Infect. Dis. 2019, 220, 1147–1151. [Krossvísun]

10. Vagima, Y.; Gur, D.; Aftalion, M.; Móse, S.; Levy, Y.; Makovitzki, A.; Holtzman, T.; Oren, Z.; Segula, Y.; Fatelevich, E.; o.fl. Fagameðferð styrkir aðra línu sýklalyfjameðferð gegn lungnapest. Veirur 2022, 14, 688. [CrossRef]

11. Levy, Y.; Flashner, Y.; Tidhar, A.; Zauberman, A.; Aftalion, M.; Lazar, S.; Gur, D.; Shafferman, A.; Mahmoud, E. T frumur gegna mikilvægu hlutverki í and-F1 miðlaðri hraðri vörn gegn gúlupest. Bóluefni 2011, 29, 6866–6873. [Krossvísun]

12. Levy, Y.; Vagima, Y.; Tidhar, A.; Aftalion, M.; Gur, D.; Nili, U.; Chitlaru, T.; Zauberman, A.; Mahmoud, E. Miðun á Yersinia pestis F1 hylkismótefnavaka með meðfæddum B1b frumum miðlar hraðri verndarsvörun gegn gúlupest. NPJ Vaccines 2018, 3, 52. [CrossRef]

13. Williamson, ED; Stagg, AJ; Eley, SM; Taylor, R.; Grænn, M.; Jones, SM; Titball, RW Hreyfifræði ónæmissvörunar við (F1 plús V) bóluefninu í líkönum af gúlupestum og lungnapest. Bóluefni 2007, 25, 1142–1148. [Krossvísun]

14. Holtzman, T.; Levy, Y.; Marcus, D.; Flashner, Y.; Mamroud, E.; Cohen, S.; Fass, R. Framleiðsla og hreinsun á hámólþunga óligómerum af Yersinia pestis F1 hylkismótefnavaki sem losað er með ræktun með mikilli frumuþéttleika raðbrigða Escherichia coli frumna sem bera caf1 óperónið. Örvera. Frumuverksmiðjur 2006, 5, P98. [Krossvísun]

15. Chalton, DA; Musson, JA; Flick-Smith, H.; Walker, N.; McGregor, A.; Lamb, HK; Williamson, ED; Miller, J.; Robinson, JH; Lakey, JH Ónæmingargeta Yersinia pestis bóluefnis mótefnavaka einliða með hringlaga umbreytingu. Smitast. Ónæmi. 2006, 74, 6624–6631. [Krossvísun]

16. Petsch, D.; Anspach, FB Endotoxin fjarlæging úr próteinlausnum. J. Líftækni. 2000, 76, 97–119. [Krossvísun]

17. Leary, SE; Williamson, ED; Griffin, KF; Russell, P.; Eley, SM; Titball, RW Virk ónæmisaðgerð með raðbrigða V mótefnavaka frá Yersinia pestis verndar mýs gegn plágu. Smitast. Ónæmi. 1995, 63, 2854–2858. [Krossvísun]

18. Mechaly, A.; Vitner, EB; Levy, Y.; Gur, D.; Barlev-Gross, M.; Sittner, A.; Koren, M.; Levy, H.; Mahmoud, E.; Fisher, M. Epitope Binning of Novel Monoclonal Anti F1 and Anti LcrV mótefni og notkun þeirra í einföldu, stuttu, HTRF prófi til klínískrar plágugreiningar. Sýklar 2021, 10, 285. [CrossRef]

19. Tidhar, A.; Flashner, Y.; Cohen, S.; Levi, Y.; Zauberman, A.; Gur, D.; Aftalion, M.; Elhanany, E.; Zvi, A.; Shafferman, A.; o.fl. NlpD lípópróteinið er nýr Yersinia pestis meinvirkniþáttur sem er nauðsynlegur fyrir þróun plágu. PLoS ONE 2009, 4, e7023. [Krossvísun]

20. Reed, LJ; Muench, H. Einföld aðferð til að meta fimmtíu prósent endapunkta12. Am. J. Epidemiol. 1938, 27, 493–497. [Krossvísun]

For more information:1950477648nn@gmail.com