Hluti 1: Cistanoside Of Cistanche Herba dregur úr súrefnisskorti af völdum æxlunarskemmda karla með bælingu á oxunarálagi

Nánari upplýsingar hafið samband við: Tinatina.xiang@wecistanche.com

Fengqi Yan1*, Xiaoliang Dou1*, Guangfeng Zhu1*, Mingyuan Xia1, Yahui Liu3, Xiaozi Liu3, Guojun Wu2, He Wang1, Bo Zhang1, Qiuju Shao4, Yong Wang1

1Department of Urology, Tang Du Hospital, The Fourth Military Medical University, Xi'an 710038, Shaanxi, Kína;

2Urology and Nephrology Hospital, Xi'an People's Hospital, Xian 710100, Shaanxi, Kína;

3Institute of Basic Medical Science, The Fourth Military Medical University, Xi'an 710032, Shaanxi, Kína;

4Geislameðferðardeild, Tang Du sjúkrahúsið, Fjórða herlæknisháskólinn, Xi'an 710038, Shaanxi, Kína. *Jöfn framlag. Móttekið 1. september 2020;

Samþykkt 18. janúar 2021; Epub 15. maí 2021; Birt 30. maí 2021

Ágrip: Vaxandi vísbendingar sýna að súrefnisskortur er orsökófrjósemi karla, og súrefnisskortur gæti tengstoxunarálag(OS). Cistanoside (Cis) er fenýletanóíð glýkósíð efnasamband sem hægt er að vinna úrCistanches Herbaog hefur ýmsa líffræðilega virkni. Þessi rannsókn miðar að því að kanna verndandi áhrif Cis á æxlunarskemmdir af völdum með súrefnisskorti og kanna tiltekna undirliggjandi kerfi. Tilraunalíkön fyrir súrefnisskorti í frumum og dýrum voru smíðuð og verndandi áhrif mismunandi undirtegunda Cis á æxlunarfæri karla voru metin bæði in vitro og in vivo. Niðurstöðurnar bentu til þess að súrefnisskortur minnkaði marktækt lífvænleika GC-1 frumna með stöðvun frumuhrings og virkjun frumudauða., sem tengdust aukinni stýrikerfi. Þar að auki sýndi Cis sterk andoxunaráhrif bæði in vitro og in vivo, sem endurheimti marktækt andoxunarensímvirkni og lækkaði gildi hvarfefna súrefnistegunda (ROS) á sama tíma og jók lífvænleika frumna og minnkaði frumudauða. Mikilvægt er að Cis undirgerðirnar (Cis-A. Cis-B, Cis-C og Cis-H) sem rannsakaðar voru hér sýndu allar ákveðin andoxunaráhrif, þar á meðal voru áhrif Cis-B mikilvægust. Þessi rannsókn sýnir að Cis dregur verulega úr skaðlegum áhrifum súrefnisskorts af völdum OS með því að hafa áhrif á andoxunarensímvirkni í eistum og GC-1 frumum.

Leitarorð: Cistanoside, súrefnisskortur, ófrjósemi karla, oxunarálag, æxlunarvörn

Kynning

Sem stendur eru um það bil 48,5 milljónir (15 prósent) para á æxlunaraldri um allan heim fyrir áhrifum af ófrjósemi [1], þar á meðal eru 40-50 prósent tilfella rakin tilófrjósemi karla[2], ástand sem er sterkt tengt umhverfis- og lífsstílsþáttum. Vísbendingar benda til þess að næmni spendýra eistans fyrir lágum súrefnisþrýstingi sé orsakavaldur sumra formaófrjósemi karla[3]. Eins og sýnt hefur verið fram á í fyrri rannsóknum er sæðismyndun skert og minnkað við útsetningu fyrirsúrefnisskortur [4-7].

Til að kanna undirliggjandi kerfi, hafa rannsóknir sýnt að útsetning fyrirsúrefnisskortureykur viðbrögð súrefnistegunda (ROS) pro-

duction [8, 9].ROS gegnir mikilvægu hlutverki í æxlunarfærum karla. Í litlu magni eru þær nauðsynlegar fyrir sæðisgetu, acro-sume viðbrögð og sæðisfrumur-0frumusamruna [10]. Hins vegar getur of mikið ROS valdið skaða á sæðisfrumu kjarna/hvatbera DNA og plasmahimnuperoxunarskemmdir, sem aftur eru helstu orsakir fyrir aukinni hættu á ófrjósemi karla [11,12]. Þannig gæti uppsöfnun á súrefnisskorti af völdum ROS verið ein orsök ófrjósemi karla.

Cistanches Herba, ævarandi sníkjudýralyfjaplanta, er víða dreifð á þurrum svæðum [13]og notuð víða vegna lyfjafræðilegrar virkni [14-17]. Meðal alls árangursríks innihaldsCistanches Herba, PhGs hafa verið talin helsta virki þátturinn. Hingað til hafa 34 PhGs verið einangruð úr Cistanches plöntum [13]. Cistanoside (Cis), virkt PhG einangrað úr Cistanches Herba, hefur fengið athygli fyrir andoxunaráhrif sín.

Miðað við andoxunaráhrif Cis og hlutverk ROS í súrefnisskortiófrjósemi karla, Cis er talinn hugsanlegur lyfjaframbjóðandi til meðferðar á súrefnisskortiófrjósemi karla. Hins vegar hafa fáar skýrslur fjallað um andoxunaráhrif Cis sem unnið er úr Cistanches Herba við meðferð á súrefnisskorti.ófrjósemi karlaeða þær merkjaleiðir sem um ræðir. Í þessari rannsókn voru in vitro og in vivo súrefnisskortur tilraunalíkön smíðuð og áhrifaþættir mismunandi Cis metnir.

efni og aðferðir

Frumuræktun og hvarfefni

Mús spermatogonia frumulínan GC-1spg (GC-1) var keypt frá American Type Culture Collection (ATCC) og ræktuð í DMEM (Invitrogen, Bandaríkjunum) ásamt 10 prósenta sermi frá nautgripum, 1 prósent. L-glútamín (100 mM), penicillín (100 einingar/ml) og streptómýsín (100 ug/mL) við 37 gráður í rakaðri hitakassa með 5 prósent CO, Cis (Cis-A, B, C, H) var keypt frá Chengdu Gelipu Biotechnology Co., Ltd. (Kína).

Frumulífvænleikapróf

Frumulífvænleiki var prófaður með frumutalningarsetti{{0}} prófun (CCK-8). Í stuttu máli, GC-1 frumum var sáð í 96-brunnsplötur við 1,5×103 í hverri brunn og ræktaðar við 37 gráður í 24 klst. Síðan voru frumurnar meðhöndlaðar með mismunandi styrk (20 prósent, 15 prósent, 10 prósent ,5 prósent) af súrefni eða mismunandi styrk (2 μM, 0,2 μM, 0,02 μM) af Cis (Cis-A, Cis-B, Cis- C, Cis-H) í tilskilinn tíma. Síðan var flotinu hent og frumulífvera greind með CCK-8 setti (Dojindo Japan). Frásog hvers brunns var mæld við 450 nm með því að nota örplötulesara (BioRad USA). Að lokum var lífvænleiki frumna reiknaður út samkvæmt eftirfarandi formúlu: Frumulífvænleiki=(ODtilraunahópur - ODblank hópur)/ (ODviðmiðunarhópur - ODblank hópur) × 100 prósent. Western blot greining Uppskornar frumur eða vefir voru einsleitar í RIPA biðminni til að draga út prótein (RIPA Beyotime China; Cocktail Roche Switzerland). Fljótandi vökva var safnað og styrkur próteina var prófaður með BCA aðferð (Beyotime). Um það bil 40 ug af útdregnu próteinum úr hverju sýni voru aðskilin með SDS-PAGE og rafflutt á nítrósellulósa (NC) síuhimnu (Beyotime China). NC síuhimnur voru lokaðar með 5 prósent fitulausri mjólk í 1,5 klst og ræktaðar með sérstökum mótefnum (and-PARP 1:1000, and-Caspase-3 1:1000, and-Bcl-2 1:1000, and- Bax 1:1000, and-GAPDH 1:1000; öll mótefni voru keypt frá Cell Signaling Technology, Bandaríkjunum) yfir nótt við 4 gráður. Síðan voru allar NC himnur ræktaðar með samsvarandi piparrótarperoxidasa-tengdu aukamótefni í 1,5 klst við stofuhita og myndað með myndgreiningarkerfi (Tannon, Kína).

Greining frumuhrings

Framkvæmt var flæðifrumumæling (FCM) til að greina frumuhringinn. Frumur voru meðhöndlaðar við mismunandi aðstæður í 72 klst og safnað. Frumurnar voru síðan þvegnar með PBS, festar í 75 prósent etanóli og litaðar með própidíumjoðíði (PI). Fyrir hvert sýni var 1×104 frumum safnað og greindar með frumuflæðismælingu (FACS Calibur, BD Biosciences). Síðan var hlutfall G1/S/G2 fasafrumna og útbreiðslustuðull [Fasi(S plús G2)/Fasi(G1 plús S plús G2) × 100 prósent] reiknað út.

Ki-67 litun

Frumur voru ræktaðar í þéttum diski og meðhöndlaðar með súrefnisskorti eða mismunandi undirtegundum af Cis í 72 klst. Eftir að allar frumur hafa verið festar með 4 prósent paraformaldehýði voru þær ræktaðar með and-Ki-67 mótefninu (1:200, Cell Signaling Technology). Síðan voru allar frumurnar ræktaðar með samsvarandi CY-3-sambundnu IgG mótefni gegn kanínu (1:200, Boster, Kína) og DAPI lausn (1,0 ug/mL, Beyotime). Flúrljómun sást með Fluoview FV1000 confocal smásjá (Olympus, Japan).

Greining á ROS

FCM var kynnt til að mæla innanfrumu ROS gildi með DCFH-DA. Sviffrumur voru sáð í 6-brunnsplötur og gerðar mismunandi meðferðir. Eftir 72 klst. meðferð voru frumur stöðvaðar í sermifríu DMEM með 10 μM DCFH-DA (Beyotime). ROS innihald var síðan ákvarðað með flúrljómunarvirkjaðri frumuflokkun á Beckman Coulter Flow Cytometry System með örvunarbylgjulengd 488 nm og losunarbylgjulengd 525 nm [18].

Ákvörðun lípíðperoxunar (LPO)

Þíóbarbítúrsýru hvarfefni (TBARS) prófið var gert til að greina LPO. Öll aðgerðaskref voru framkvæmd í samræmi við leiðbeiningarnar (Sigma USA). Styrkurinn var reiknaður út með mólútrýmingarstuðlinum 1,56×105/(M-cm), sem fékkst með því að nota malondialdehýð sem staðal. Niðurstöðurnar eru gefnar upp sem nmól af MDA jafngildum/mg af próteini.

Ákvörðun ensímvirkni

Ensímvirknin var prófuð með því að nota prófunarsett þar á meðal glútaþíon redúktasa (GR), glútaþíon peroxidasa (GPx) og súperoxíð dismútasa (SOD). Öll aðgerðaskref voru framkvæmd í samræmi við leiðbeiningarnar sem fylgja (Nan Jing Jian Cheng Bioengineering Institute Kína).

Dýr og tilraunaaðferð

Þroskaðar Wistar karlkyns rottur (180-220 g, 8 w gamlar) voru fengnar frá dýramiðstöð fjórða herlæknisháskólans, Xi'an, Kína. Leyfi fyrir notkun dýranna var fengið hjá siðanefnd háskólans (tilvísunarnúmer: 20190506). Dýratilraunin var framkvæmd samkvæmt leiðbeiningum háskóla um umönnun og notkun tilraunadýra.

Öllum rottum var leyft að aðlagast í um það bil 1 viku áður en tilraunin hófst. Eftir aðlögun var rottunum dreift af handahófi í 6 hópa með 5 dýrum í hverjum hópi. Rotturnar í samanburðarhópnum voru aldar upp við eðlilegan þrýsting (PO.:20 prósent; loftþrýstingur:101,3 kPa), en rotturnar í líkaninu og Cis-meðhöndluðu hópunum voru aldar upp í lágþrýstisúrefnishólfinu (innri þrýstingur 61,6 kPa , sem jafngildir 4000 metra hæð yfir sjávarmáli; PO:14,55 prósent ) til að líkja eftir súrefnisskorti í mikilli hæð. Allar rottur höfðu frjálsan aðgang að mat og vatni í plastbúrum við 22 ±2 gráður og rakaskilyrði með sjálfvirkri 12-klst ljós/myrkri hringrás. Rotturnar í líkaninu og hópum sem fengu Cis voru áfram undir óstöðugum aðstæðum en voru fluttar yfir í eðlilegar aðstæður á 96 klst. fresti, en þá var þeim útvegað matur og vatn og búrin þrifin. Tímalengd breytinga frá lágþroska yfir í lægri skort var um það bil 2 klst. Allir meðferðarhópar voru meðhöndlaðir með samsvarandi Cis (8 mg/kg/d) með munngjöf í 8 vikur, en viðmiðunar- og módelrotturnar voru meðhöndlaðar með jöfnu rúmmáli af vatni.

Eftir 8 vikur var rottum fórnað í svæfingu. Eistu, epididymis og sáðblöðrur voru aðskildar og vigtaðar og líffæravísitalan var reiknaður út samkvæmt eftirfarandi formúlu:(þyngd líffæra/dýraþyngdar)

t) ×100 prósent. Í kjölfarið var sæði í epididymis safnað og hreyfanleiki þeirra og akrosómensímvirkni prófuð. Á sama hátt var vefjum í eistum safnað fyrir vefjameinafræðilegar rannsóknir og greiningu á ROS, LPO og andoxunarensímvirkni.

Mat á hlutfalli lifandi sæðisfrumna

Skurður var í epididymis með skurðskærum og sæðisviflausnin var útbúin í venjulegu saltvatni. Til að meta hraða lifandi sæðisfrumna var 5 uL af sæðisviflausninni blandað varlega saman við jafnt rúmmál af eósín-Y lit. Sæðisfrumurnar voru síðan taldar í ljóssmásjá. Hlutfall lifandi sæðisfrumna var metið með því að reikna út bæði lituð (dauð sæði) og ólituð sæði (lifandi sæði).

Ákvörðun á virkni sæðisakrósómensíma

Sæðisakrósómensímvirkniprófið var notað til að meta sæðisakrósómensím [19]. Niðurstöður í hverjum hópi voru reiknaðar út með eftirfarandi formúlu: Akrósómensímvirkni (μIU)=(ODEtilraunahópur - ODBblank hópur)/(247,5×10) × 106.

tölfræðigreining

Öll megindleg gögn eru gefin upp sem meðaltal ± SD og voru greind með SPSS 22.0 hugbúnaði. T-próf ​​Independent Student var notað til að bera saman gögnin milli tveggja hópa. „P<0.05>< 0.01="" were="" considered="" statistically="" significant="">

Niðurstöður

Áhrif súrefnisskorts á GC-1 frumur

Til að ákvarða áhrif súrefnisskorts á kímfrumur skoðuðum við fyrst breytingar á getu frumna eftir súrefnismeðferð með mismunandi súrefnisstyrk (20 prósent, 15 prósent, 10 prósent, 5 prósent) í 1, 3,5 og 7 daga , í sömu röð. Niðurstöður CCK-8 prófunar sýndu að samanborið við samanburðarhópinn (20 prósent súrefnisstyrkur), sýndu frumur sem voru útsettar fyrir súrefnisskorti verulega minnkun á lífvænleika (P<0.01; figure="" 1a).="" moreover,="" their="" survival="" rate="" was="" inversely="" proportional="" to="" the="" oxygen="" concentration="" and="" further="" decreased="" with="" induction="" time.="" to="" avoid="" an="" excessive="" cytotoxic="" effect,="" a="" 10%="" oxygen="" concentration="" and="" 3-day="" induction="" time="" were="" selected="" as="" the="" hypoxic="" model="" criteria="" for="" subsequent="" in="" vitro="">

Í kjölfarið var FCM og ónæmisflúrljómunarlitun gerð til að meta frekar útbreiðslubreytingu GC-1 frumna undir súrefnisskortsmeðferð. Niðurstöðurnar sýndu að súrefnisskortur gæti framkallað GC-1 frumustopp í G1 fasanum og þar með dregið úr inngöngu frumna í S fasa og hindrað DNA eftirmyndun. Þannig minnkaði súrefnisskortur verulega útbreiðslustuðul GC-1 frumna (P<0.01; figure="" 1b).="" positive="" ki-67="" staining="" is="" another="" specific="" biomarker="" of="" proliferating="" cells.="" therefore,="" we="" also="" examined="" the="" ratio="" of="" ki-67-positive="" cells="" with="" or="" without="" hypoxia="" treatment.="" compared="" with="" the="" control="" group,="" hypoxia="" treatment="" remarkably="" reduced="" ki-67-positive="" cells,="" as="" shown="" in="" figure="">

Næst var stefnt að því að kanna hvernig hömlun á lífvænleika GC-1 frumna er af völdum súrefnisskorts. Eins og greint hefur verið frá í bókmenntum jókst magn ROS þegar rottur voru útsettar fyrir lágt súrefnisskorts umhverfi [8,20]. Þess vegna voru innræn ROS-stig í GC-1 frumum mæld með því að nota FCM prófið. Niðurstöðurnar sýndu hærra ROS gildi undir súrefnisskorti í samanburði við venjulega súrefnishópinn (P< 0.01;="" figure="" 1d).="" accumulated="" ros="" cause="" marked="" dna="" impairment,="" which="" in="" turn="" causes="" cell="" apoptosis="" pathway="" activation="" and="" might="" be="" the="" major="" etiological="" factor="" for="" the="" increased="" risk="" of="" male="" infertility="" [21,22].="" next,="" we="" detected="" the="" apoptotic="" activation="" effect="" of="" hypoxia="" on="" gc-1="" cells="" by="" tunelstaining.="" as="" shown="" in="" figure="" 1e,="" treatment="" with="" hypoxia="" resulted="" in="" an="" increase="" in="" tunel="" fluorescence="" compared="" with="" the="" control="" group,="" indicating="" an="" increase="" in="" apoptosis="" in="" the="" model="">

Þar sem frumuskemmdir af völdum ROS eru venjulega af völdum stýrikerfis, prófuðum við stýrikerfi GC-1 frumna frekar. Eins og sýnt er á mynd 1F voru LPO gildi GC-1 frumna í líkanahópnum áberandi

hækkað samanborið við LPO gildi GC-1 frumna í samanburðarhópnum. Þessar niðurstöður eru bent á að súrefnisskortur af völdum GC-1 frumuskaða gæti tengst OS, sem er framkallað af ROS uppsöfnun.

Áhrif Cis á lífvænleika GC-1 frumna af völdum súrefnisskorts in vitro.

Til að kanna hvort Cis geti komið í veg fyrir hamlandi áhrif súrefnisskorts á lífvænleika GC{{0}} frumna, var gerð CCK-8 próf. GC-1 frumur voru meðhöndlaðar með mismunandi undirtegundum (Cis-A, B, C, H) og styrkleikasvið （0.02 μM, 0.2 μM, 2 μM） af Cis í 72 klst. Samanburður á líkanhópurinn með DMSO hópnum sýndi að DMSO stuðlaði ekki beint að lífvænleika GC-1 frumna (Mynd 2A). Hins vegar var lífvænleiki frumna verulega endurheimtur (P< 0.05)="" with="" cis="" treatments.="" compared="" with="" the="" model="" group,="" cis-a,="" cis-b,="" cis-c,="" and="" cis-h="" all="" showed="" certain="" protective="" effects="" on="" hypoxia-induced="" damage="" to="" gc-1="" cell="" viability,="" and="" cis-b="" showed="" the="" most="" significant="" effect(figure="" 2a).="" the="" protective="" effects="" of="" cis="" at="" 0.2="" μm="" were="" significantly="" higher="" than="" the="" protective="" effects="" of="" cis="" at="" 0.02="" μm,="" while="" the="" difference="" between="" 2="" μm="" and="" 0.2="" um="" was="" not="" obvious,="" indicating="" that="" the="" restored="" gc-1="" cell="" viability="" induced="" by="" cis="" demonstrated="" a="" dose-dependent="" increase="" in="" the="" concentration="" range="" from="" 0.02-0.2="" μm="" （figure="" 2a）.="" therefore,="" according="" to="" the="" experimental="" needs,="" 0.2="" m="" cis="" was="" selected="" as="" the="" optimal="" concentration="" in="" the="" following="" in="" vitro="" experiments.="" to="" further="" confirm="" whether="" germ="" cells="" were="" indeed="" protected="" by="" cis,="" fcm,="" and="" ki-67="" staining="" were="" performed="" to="" assess="" the="" alteration="" of="" the="" proliferation="" of="" gc-1="" cells="" after="" treatment="" with="" cis.="" upon="" cis="" treatment,="" the="" proportion="" of="" gc-1="" cells="" in="" the="" g1="" phase="" was="" reduced.="" in="" contrast,="" more="" cells="" entered="" s-phase,="" suggesting="" that="" cis-treatment="" could="" increase="" the="" germ="" cell="" proliferation=""><0.01; figure="" 2b).="" the="" statistics="" for="" the="" gc-1="" cell="" cycle="" are="" shown="" in="" figure="" 2bb.="" the="" ki-67="" staining="" results="" also="" showed="" that="" cis-a,="" cis-b,="" cis-cand="" cis-h="" treatment="" significantly="" improved="" the="" ki-67-positive="" cell="" ratio="" of="" hypoxia-induced="" gc-1="" cells="" in="" vitro(figure="">

Virkni Cis verndar kímfrumur gegn súrefnisskorti in vitro.

Til að kanna hvort verndandi áhrif Cis á GC-1 frumur tengdust því að fjarlægja of mikið ROS, var flúrljómandi litarefnið DCFH-DA notað til að greina ROS gildi í hverjum hópi. Eins og sýnt er á myndum 3A, 3B breytti meðferð með DMSO ekki innanfrumu ROS innihaldi eða LPO stigi samanborið við líkanahópinn. Hins vegar var ROS-magn í GC-1 frumum verulega lækkað í hópunum sem fengu Cis (mynd 3A). Ennfremur sást lækkun á LPO einnig í GC-1 frumum sem urðu fyrir Cis (mynd 3B).

Til að kanna frekar hvernig Cis verndar kímfrumur gegn súrefnisskaða, voru TUNEL litun og Western blot greiningar gerðar til að meta frumudauða. TUNEL litun (Mynd 3C) sýndi marktæka frumufrumu í líkaninu og DMSO hópunum. Hins vegar sáust færri apoptotic frumur við Cis meðferð, sem benti til þess að Cis meðferð minnkaði GC -1 frumu apoptosis. Að auki var tjáning PARP, Caspase-3, Bax og Bcl-2 mæld til að staðfesta sameindakerfið. Eins og sýnt er á mynd 3D voru Caspase-3 og PARP virkjuð í GC-1 frumum undir súrefnisskorti og þessi virkjun var hindruð með Cis meðferð. Að auki var hlutfall Bax/Bcl-2 hærra í líkanahópnum en í samanburðarhópnum og Cis meðferð minnkaði hlutfall Bax/Bcl-2(Mynd 3D). Þessar upplýsingar bentu til þess að Cis hefði mögulega getu til að draga úr oxunarskemmdum af völdum súrefnisskorts, og þessi verndaráhrif gætu náðst með því að draga úr ROS uppsöfnun og hamla virkjun á frumudauðaferli Caspase.

Ensímkerfið sem hamlar OS felur í sér hreinsiefni fyrir sindurefna eins og glútaþíon redúktasa (GR), glútaþíon peroxidasa (GPx) og súperoxíð dismútasa (SOD) [23]. Ensímkerfi sem hindrar OS gegnir mikilvægu hlutverki við að koma í veg fyriroxunarskemmdirí frumum og vefjum [23]. Til að sannreyna frekar mögulegan fyrirkomulag Cis-hömlunar á súrefnisskorti af völdum OS í GC-1 frumum, var virkni GR, GPx og SOD mæld. Niðurstöðurnar leiddu í ljós að GR, GPx og SOD virkni öll marktækt (P < {3}}.01,="" mynd="" 3e)="" minnkaði="" við="" súrefnisskort="" í="" samanburði="" við="" samanburðarhópana,="" og="" cis="" meðferð="" endurheimti="" verulega="" virkni="" þeirra="" í="" gc{{6}="" }="" frumur="" sem="" verða="" fyrir="" súrefnisskorti="">< 0.05,="" figure="" 3e),="" suggesting="" that="" these="" compounds="" could="" activate="" the="" powerful="" endogenous="" antioxidant="">

Smelltu á hlekkinn hér að neðan til að fá upplýsingar um hluta 2
https://www.xjcistanche.com/news/part2-cistanoside-of-cistanche-herba-ameliorat-54370494.html