Part1: Acteoside bælar RANKL-miðlaða beinþynningarmyndun með því að hindra C-Fos örvun og NF- KB leið og draga úr ROS framleiðslu
Mar 05, 2022
Tengiliður: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Netfang:audrey.hu@wecistanche.com
Seung-Youp Lee1,2., Keun-Soo Lee3.¤, Sea Hyun Yi2., Sung-Ho Kook, Jeong-Chae Lee22,3*
Ágrip
Fjölmargar rannsóknir hafa greint frá því að bólgueyðandi cýtókín séu mikilvægir miðlarar fyrir beinþynningarmyndun og valda þar með of mikilli beinupptöku og beinþynningu.Akteósíð úr cistanche jurtum, aðal virka efnasambandið í Rehmannia glutinosa, sem er mikið notað í hefðbundinni austurlenskri læknisfræði, hefur bólgueyðandi og andoxunarefni. Í þessari rannsókn komumst við að þvíakteósíðhamlaði verulega aðgreiningu og myndun beinmergs úr beinmergsátfrumum (BMM) og RAW264.7 átfrumum sem örvaðir voru af viðtakavirkjun kjarnaþáttar-kappaB (NF-kB) bindilsins (RANKL).Akteósíðformeðferð kom einnig í veg fyrir beinuppsog þroskaðra beinþynningar á skammtaháðan hátt. Akteósíð (10 mM) dró úr RANKL-örvaðri virkjun p38 kínasa, utanfrumumerkjastýrðum kínasa og c-Jun N-enda kínasa, og bældi einnig NF-kB virkjun með því að hindra fosfórun á p65 undireiningunni og hemlinum kBa. Að auki, RANKL-miðluð aukning á tjáningu c-Fos og kjarnaþáttar virkjaðra T-frumna, umfrymis 1 (NFATc1), og í framleiðslu æxlisdrepsþáttar-a, interleukin (IL)-1b , og IL-6 voru greinilega hindraðir með akteósíðformeðferð. Ennfremur munnlegaakteósíðminnkað beinatap af völdum eggjastokkanáms og bólgueyðandi cýtókínframleiðslu til að stjórna magni. Gögn okkar benda til þess að akteósíð hamli aðgreiningu og þroska beinþynna frá forverum beinþynningar með því að bæla RANKL-framkallaða virkjun á mítógenvirkjuðum próteinkínasa og umritunarþáttum eins og NF-kB, c-Fos og NFATc1. Samanlagt benda þessar niðurstöður til þess að akteósíð geti virkað sem uppsogsefni til að draga úr beinatapi með því að hindra beinþynningarvirkjun.
Kynning
Bein eru stöðugt endurgerð með jafnvægi á beinþynninga- og beinhimnuvirkni [1]. Osteoclastar myndast úr blóðmyndandi forverafrumum af einfrumu/átfrumuætt, en beinfrumur eru af mesenchymal ætterni [2]. Óeðlileg virkjun beinþynningar eða minnkuð beinmyndun getur truflað jafnvægi í beinum, sem að lokum valdið sjúkdómum eins og beinþynningu, liðagigt og beinakrabbameini [3,4]. Beinþynning er algengur beinsjúkdómur sem leiðir til aukinnar hættu á beinbrotum. Algengasta form beinþynningar er af völdum estrógenskorts hjá konum á tíðahvörf. Lyf eins og barksterar og flogaveikilyf geta einnig valdið ójafnvægi milli beinaupptöku og myndunar, sem getur leitt til beinþynningar [5].
Margir and-uppsogshemlar, þar á meðal bisfosfónöt, kalsítónín, estrógen og sértækir estrógenviðtakastýringar, hafa verið notaðir til að meðhöndla beinþynningu. Þessir hemlar viðhalda beinmassa með því að hindra beinþynningarstarfsemi [6]. Uppbótarmeðferð með estrógeni er vinsælasta meðferðin til að koma í veg fyrir og meðhöndla beinþynningu eftir tíðahvörf. Hins vegar getur langtíma estrógenuppbótarmeðferð aukið hættuna á legslímu- og brjóstakrabbameini. Þess vegna hafa margir rannsakendur einbeitt kröftum sínum að því að þróa nýtt uppsogslyf sem hefur ekki aukaverkanir [7-10]. Vegna þess að beinþynningar virka við beinupptöku, hefur sérstaklega hamlandi beinþynningar verið talið aðalmarkmiðið í fjölmörgum rannsóknum.
Beinfrumur eru fjölkjarna risafrumur sem myndaðar eru af einkjarna forverum einkjarna/átfrumnafjölskyldunnar með raðfjölgun, aðgreiningu og samruna blóðmyndandi forverafrumna [11]. Macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) og receptor activator of nuclear factor (NF)-kB (RANK) bindill (RANKL) eru nauðsynlegir þættir fyrir beinþynningaraðgreiningu [12]. Að auki stuðla nokkur bólgueyðandi cýtókín, eins og æxlisdrep (TNF) og interleukin (IL)-1b, að beinþynningarmyndun með því að stilla framköllun RANKL, osteoprotegerins og M-CSF [7,13]. RANKL binding við frumuyfirborðs RANK viðtaka veldur RANKL/RANK/TNFR tengdum þáttum (TRAF) fléttum sem virkja í röð NF-kB og mítógenvirkjaða próteinkínasa (MAPK), þar á meðal c- Jun N-terminal kínasa (JNK), p38 kínasa og utanfrumumerkjatengdur kínasa (ERK) [14]. Þessi virkjun gegnir lykilhlutverki við að miðla aðgreiningu beinþynninga, virkjun og lifun. RANKL virkjar einnig tjáningu umritunarþátta eins og kjarnaþáttar virkjaðra T-frumna, umfrymis 1 (NFATc1) og c-Fos, sem eru nauðsynlegir fyrir þróun beinþynningar [7,9]. Þess vegna er RANKL merking talin aðalmarkmið uppsogslyfja sem bæla beinþynningarvirkjun og beinatapi.
Akteósíðer aðal virka efnasambandið í Rehmannia glutinosa, sem er mikið notað í hefðbundnum austurlenskum lækningum [15,16]. Acteoside er sterkt andoxunarefni og hefur eiturverkanir á lifur, bólgueyðandi og sýklalyfjavirkni [17-20]. Við komumst áður að því að akteósíð dregur úr týrósínasavirkni og melanín-lífmyndun með því að stjórna ERK-boðum [21], verndar gegn hvarfgjörnum súrefnistegundum (ROS)-miðluðum tannholdsskemmdum [22] og bælir sveppaeitur-miðluðum frumuskemmdum [23]. Þessi áhrif eru nátengd getu núkleósíða til að fjarlægja ROS og stjórna MAPK-miðluðum merkjum. Sérstaklega er lagt til að ROS miðli RANKL-framkallaða merkjaleiðir og frumuviðburði í beinþynningum. Formeðferð með andoxunarefnum hindraði RANKL-framkallaða virkjun NF-kB, ERK og IkBa og bæla þannig beinþekjumyndun [24]. Þessar niðurstöður bentu eindregið til þess að auk bólgueyðandi virkni sé andoxunarvirkni mikilvæg fyrir uppsogsefni, þannig að akteósíð getur bælt beinþynningu af völdum RANKL.
Í þessari rannsókn könnuðum við hvort akteósíð hafi lækningaleg áhrif á beinmissi. Við skoðuðum áhrif akteósíðs á beinþynningaraðgreiningu og beinupptöku og tengda frumuferli með því að nota in vitro og in vivo tilraunakerfi.
Cistanche acteoside bælir beinþynningu af völdum RANKL
Efni og aðferðir
Siðferðisyfirlýsing
Dýraumönnun og notkunarvenjur voru samþykktar af Chonbuk-landsháskólanefndinni um siðfræði í umönnun og notkun tilraunadýra (leyfisnr. CBU 2010-0007). Allar tilraunir í þessari rannsókn voru gerðar samkvæmt leiðbeiningum dýraverndar- og notkunarnefndar Háskólans.
Mýs, efni og varningur til rannsóknarstofu
Fjögurra vikna gamlar kvenkyns ICR mýs voru keyptar frá Orient Bio Inc. (Seoul, Kóreu) og geymdar við 2261uC og 5565 prósent raka á 12 klst ljós/myrkri hringrás með ókeypis aðgangi að mat og vatni. Akteósíð (3,4-díhýdroxý-bfenetýl-Oa-ramnópýranósýl-(1R3)-4-O-kaffóýl-bD-glúkópýranósíð; C29H36O15) (mynd S1) var einangrað úr laufum Rehmannia glutinosa. Acteoside var leyst upp í fosfat-bufferðri saltvatni (PBS) fyrir notkun. RANKL, TNF-a, IL-1b, IL-6 og M-CSF voru keypt frá R & D Systems (Minneapolis, MN, Bandaríkjunum). Mótefni sem eru sértæk fyrir c-Fos, p65, p-p65, p-ERK, ERK, JNK, p-JNK, NFATc1, IkBa, p-IkBa og b-actin voru fengin frá Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, Bandaríkjunum ). Mótefni fyrir p-p38 og p38 voru keypt frá Cell Signaling Technology (Danvers, MA, Bandaríkjunum). Calcium Assay og Osteocalcin (OC) EIA Kits voru keyptir frá BioAssay Systems (Hayward, CA, Bandaríkjunum) og Biomedical Technologies (Stoughton, MA, Bandaríkjunum), í sömu röð, til að ákvarða lífefnafræðilegar breytur í sermi. Músartrat-ónæmur sýrufosfatasa (TRAP) prófunarbúnaður (Immunodiagnostic Systems, Scottsdale, AZ, USA) var einnig notað til að mæla TRAP5b þéttni í sermi. Nema annað sé tekið fram, voru viðbótarefni fengin frá Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, Bandaríkjunum), og varningur á rannsóknarstofu var frá SPL Life Sciences (Pochun, Suður-Kóreu).
Frumumenning
Beinmergsfrumur voru fengnar úr sköflungi og lærlegg 6 vikna gamalla kvenkyns ICR músa samkvæmt aðferðum sem lýst var áður [25]. Beinmergssviflausnin var ræktuð í 100-mm ræktunarskál í viðurvist 50 ng/ml M-CSF. Eftir 3 daga voru viðloðandi frumur notaðar sem beinmergsátfrumur (BMM) til að framkalla beinþynningaraðgreiningu. Sumar beinmergsfrumur voru einnig ræktaðar í 48 klst án M-CSF og viðloðandi frumur voru ræktaðar í beinmergsaðgreiningarmiðli, eins og lýst er annars staðar [25]. RAW264.7 átfrumnafrumur voru ræktaðar í Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) ásamt 10 prósenta nautgripafóstursermi (FBS), 2 mM L-glútamíni og sýklalyfjum. Þessar frumur voru notaðar sem hliðstæða frumulínu fyrir BMM til að kanna áhrif akteósíðs á beinþynningarmyndun.
Osteoclastic aðgreining og TRAP litun
BMM voru formeðhöndluð með ýmsum styrkjum (0–50 mM) afakteósíðí 2 klst áður en örvun er með 100 ng/ml RANKL. Ræktunarmiðlum var skipt út fyrir ferskt miðil á dögum 2 og 5. Eftir 7 daga ræktun voru ræktunin fest í 4 prósent PBS-búðuð paraformaldehýð og lituð með TRAP með Sigma Aldrich setti samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. TRAP-jákvæðar frumur voru taldar með ljóssmásjá og frumur sem innihéldu 3 eða fleiri kjarna voru taldar vera beinþynningar. RAW 264.7 frumur voru einnig útsettar fyrir 100 ng/ml RANKL eftir formeðferð með acteoside í 2 klst, og eftir 7 daga ræktun voru frumurnar unnar fyrir TRAP litun.
Mæling á lífvænleika frumna
Lífvænleiki frumna var ákvarðaður með því að nota vatnsleysanlegt tetrasólíumsalt (WST)-8 hvarfefni. Í stuttu máli voru BMM eða RAW264.7 frumur ræktaðar í vaxtaræti sem innihélt 10 prósent FBS og sýklalyf meðhöndlaðir með 10 mM akteósíði eða fenólsambandi eins og quercetin, lúteólín, apigenin eða epigallocatechin-3-gallate (EGCG). WST-8 hvarfefni var bætt við ræktunina eftir 48 klst. Eftir ræktun í 4 klst til viðbótar var WST-8- sértæk gleypni mæld við 450 nm með því að nota örplötulesara (Packard Instrument Co., Downers Grove, IL, Bandaríkjunum).
Beinupptökupróf
BMM (16105 frumur/ml) voru stöðvaðar í a-MEM sem innihélt 50 ng/ml M-CSF og 100 ng/ml RANKL, síðan skipt yfir 24-brunn plötu sem var húðuð með kalsíumfosfat nanókristöllum (OAAS{{6} }; Osteoclast Activity Assay Substrate, Oscotec Inc., Choongnam, Suður-Kóreu) með þéttleika 26104 frumur/cm2 með og án akteósíðs. Eftir ræktun í 7 daga voru frumurnar fjarlægðar af plötunum með 5% natríumhýpóklóríti og gryfjumyndun sást undir sjónsmásjá. Uppsogað svæði var einnig mælt með myndgreiningartæki og gefið upp sem hundraðshluti af viðmiðunargildi.
Western Blot greining
Heil próteinlýsöt voru útbúin í lýsisbuffi eins og lýst er annars staðar [26]. Cytosolic og kjarnaprótein voru útbúin eins og áður hefur verið lýst [25]. Jafnt magn af próteinþykkni var aðskilið með 12-15 prósent SDS-PAGE og þeytt á pólývínýldíflúoríð himnur. Blettirnir voru rannsakaðir með frummótefnum yfir nótt við 4uC fyrir ræktun með öðru mótefni í blokkunarbuffi í 1 klst. Blettirnir voru
þróað með aukinni efnaljómun (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Buckinghamshire, Bretlandi) og útsett fyrir röntgenmyndum (Eastman-Kodak Co., Rochester, NY, Bandaríkjunum).
MAPK virknigreining
Frumur voru formeðhöndlaðar meðakteósíðí 2 klst. og síðan örvað með RANKL í -30 mín. MAPK virkni var ákvörðuð með því að nota ónæmismælingarsett, eins og p-p38 kínasa greiningarsettið (Assay Designs, Inc., MI, USA), p-ERK ensímprófunarsettið (Assay Designs) og p-SAPK/JNK samloku ELISA settinu (Cell Signaling Technology, MA, Bandaríkjunum). Allar aðferðir fóru eftir leiðbeiningum framleiðanda og gleypni var mæld með örplötulesara.
Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)
DNA-próteinbindingahvörf voru framkvæmd í 30 mínútur við stofuhita, með 10–15 mg próteini í 20 ml jafnalausn sem innihélt 1 mg/ml BSA, 0,5 mg/ml pólý (dI-dC), 5 prósent glýseróls , 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 10 mM Tris-Cl (pH 7,5), 50 mM NaCl, 30, 000 cpm af [a-32P] dCTP-merktum fákjörnum og Klenow brotið af DNA pólýmerasa. Sýnin voru aðskilin á 6 prósenta pólýakrýlamíð hlaupum, sem voru þurrkuð og útsett fyrir röntgenfilmu (Eastman Kodak Co.) í 12–24 klst við 270uC. Fákjarna frumur raðir sértækar fyrir NF-kB voru 59-AAG GCC TGT GCT CCG GGA CTT TCC CTG GCC TGG A-39 og 39-GGA CAC GAG GCC CTG AAA GGG ACC GGA CCT GGA A -59.
NF-kB Luciferasa próf
RAW264.7 átfrumur í 24-brunnsplötum voru umbreyttir með 0,8 mg kB-luciferasa reporter vektor með því að nota 2 ml af Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. 24 klst. eftir transfæðingu voru frumurnar örvaðar með RANKL í nærveru og fjarveru akteósíðs í 24 klst. Frumur voru endursviflausnar í 100 ml reporter lysis buffer
(Promega, Madison, WI, Bandaríkin). Jafnt magn af próteinsýnum var sett í 96-brunn örplötur og blandað við lúsiferasa hvarfefni. Lýsun var mæld með því að nota örplötuljósamæli (MicroLumat Plus LB 964, Berthold Technologies, Bad Wildbad, Þýskalandi). Í þessari tilraun var gegndræpi NF-kB hemla peptíð (BIOMOL, Butler Pike, PA, USA) notað sem jákvæður kB hemill.
Mæling á cýtókínum
BMM eða RAW264.7 frumur voru örvaðar með RANKL í nærveru akteósíðs í 24-brunn ræktunarplötum. Eftir 48 klst. ræktun var ræktunarfrumvökva safnað og metið með ELISA með TNF-a-, IL-1b- og IL-6-sértækum OptEIATM settum samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda.
Rauntíma öfug umritun-pólýmerasa keðjuverkun (RT-PCR)
MRNA tjáning beinþynningarmerkja, eins og c-Fos, NFATc1 og TNF-a, var ákvörðuð með rauntíma RT-PCR. Í stuttu máli var heildar-RNA dregið úr átfrumum með Trizol hvarfefni samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda (Invitrogen). cDNA var búið til með 1 mg af heildar-RNA með því að nota SuperScript Reverse Transcriptase II og primers (Invitrogen). Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) var notað til að greina uppsöfnun PCR vöru í hjólreiðum með ABI 7500 raðgreiningarkerfinu (Applied Biosystems). Eftir eðlisbreytingu við 95uC í 10 mínútur var PCR
framkvæmt með því að nota fjörutíu 3-skref lotur af eðlisbreytingu við 95uC í 15 sekúndur, glæðingu við 60uC í 1 sekúndu og framlengingu við 72uC í 30 sek. Öll PCR viðbrögð voru framkvæmd að minnsta kosti í þríriti og tjáningarstigið var staðlað fyrir heimilisgenið HPRT í sömu viðbrögðum. Þessi rannsókn notaði sömu grunnröð og lýst er annars staðar [7].
Mæling á innanfrumu ROS
Stofnlausn af 29,79-díklórdíhýdróflúoresceíndíasetati (DCFH-DA) (50 mM; Calbiochem, Darmstadt, Þýskalandi) var útbúin í DMSO og geymd við 220uC í myrkri. Í stuttu máli voru BMM (106 frumur/ml í 6-brunnsplötum) ræktaðar með 50 ng/ml M-CSF í 24 klst.akteósíð2 klst. fyrir örvun með 100 ng/ml RANKL. Eftir 1 klst af samræktun voru þessar frumur síðan ræktaðar með 25 mM DCFH-DA í 30 mín. Græna flúrljómun 29,79-díklórflúrljómunar (DCF) var skráð við 515 nm (FL 1) með því að nota FACS VantageH kerfi (Becton-Dickinson, San Jose, CA, Bandaríkin), og 10,000 atburðir voru taldir fyrir hvert sýni.
Örvun beinþynningar af völdum eggjastokkanáms
Kvenkyns ICR mýs (6 vikna gamlar) voru notaðar í þessa rannsókn. Mýs fengu sýndaraðgerð (Sham, n =10) eða skurðaðgerð á eggjastokkum (OVX, n=20) í svæfingu. Viku eftir aðgerð var OVX músunum skipt af handahófi í 2 hópa með 10 músum hver: tvíhliða OVX og tvíhliða OVX bætt við 200 ml
PBS sem inniheldur 1 mM akteósíð til inntöku (AC hópur). Acteoside til inntöku var gefið einu sinni á 3 daga fresti í 8 vikur eftir aðgerð og
sama magn af PBS var gefið Sham og OVX hópunum. Eftir 1 dag frá síðustu gjöf var músum fórnað og síðan voru lífefnafræðilegar breytur í sermi og 3-víddarbeinbygging greind.
Ákvörðun á lífefnafræðilegum breytum í sermi
Blóðsýnum var safnað með hjartastungu og sermi var safnað með skilvindu. Sermissýni voru geymd við 280uC til greiningar á lífefnafræðilegum breytum. Sermisþéttni IL-1b og IL-6 var metið með því að nota ELISA settið eins og lýst er hér að ofan, en virkni alkalísks fosfatasa (ALP) var ákvörðuð með lífefnafræðilegri litamælingu sem mælir magn p -nítrófenól framleitt úr p-nítrófenólfosfat hvarfefni, eins og lýst er annars staðar [27]. Til að áætla lífmerki beinmyndunar og uppsogs voru OC, kalsíum og TRAP5b gildi í sermi einnig ákvarðað samkvæmt leiðbeiningum framleiðenda.
Greining á beinbyggingu og formfræðilegum breytum
Lærlegg músa (Sham, OVX og AC hópar) voru krufin og fyllt með lífeðlisfræðilegu saltvatni fyrir vélrænni prófun. Vélrænni styrkur lærleggsins var mældur eins og lýst er annars staðar [28]. Brotálagið var skráð sem hámarkskraftur í njútonum á þeim stað sem miðskaft hægra lærleggsins brotnaði. Að auki var ljós lærlegg hvers dýrs greind með vefjagerð með því að nota örtölvusneiðmynda (micro-CT) kerfi (SkyScan 1076 microfocus röntgenkerfi, Kontich, Belgíu). Í stuttu máli voru beinin í 4% formaldehýðgeymslu þurrkuð yfirborðslega á pappírsvef áður en þeim var pakkað inn í plastfilmu eða parafilmu, til að koma í veg fyrir þurrkun við skönnun. Hvert plastvafið bein var sett í plast/pólýstýren froðu rör sem voru fest lóðrétt lárétt í 1076 sýnishólfinu skanna fyrir
ör-CT myndgreiningu. Skönnun var framkvæmd með 100 kV spennu og 140 mA straumi með 35 mm upplausn.
Þrívíddarlíkön af beinabeinum lærleggsins voru endurgerð með SkyScan CT Analyzer útgáfu 1.11. Byggingarfæribreytur eins og beinþéttni í æðabein (BMD, g/cm3), prósent beinrúmmál (beinrúmmál (BV)/vefjarrúmmál (TV), prósent ), þykkt (Tb.Th, mm), aðskilnaður (Tb.Sp) , mm), og fjöldi (Tb.N, 1/mm) var síðan mældur.
Beinfræðileg aðgreining og steinefnagreining Beinmergsfrumur ræktaðar í {{{{10}}}}brunn ræktunarplötum voru meðhöndlaðir með DAG (10 nM dexametasóni, 50 mM askorbínsýru og 20 mM b-glýserófosfati) í tilvist 10 mM akteósíðs. Eftir 2 vikna aðgreiningu voru frumurnar festar með ísköldu 70 prósent (rúmmál/rúmmál) etanóli í 1 klst og litaðar með 0,2 prósent alizarín rauðu S í eimuðu vatni í 30 mínútur við stofuhita. Eftir að frumurnar voru aflitaðar og loftþurrkaðar voru frumuræktarplöturnar metnar með ljóssmásjá með því að nota öfuga smásjá (Nikon TS100, Japan). Til að mæla magn rauðs litarefnis var liturinn skolaður út með 10 prósent asetýlpýridíníum klóríði með því að hrista í 20 mínútur og gleypni var mæld við 560 nm. Magn kalsíums sem sett var í frumulögin var einnig mælt með því að nota Calcium C kit (Wako Chemical Inc. Osaka, Japan) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Að auki var tjáning beinsértækra mRNA-merkja, eins og run-tengdra umritunarþáttar-2 (Runx2), osterix, beinsíalóprótein (BSP) og OC, ákvörðuð með rauntíma RT-PCR. Oligonucleotide primers þessara merkja voru hannaðir með vörustærðum minni en 200 bp með því að nota Primer Express Software 3.0 (Applied Biosystems) eins og lýst er annars staðar [27].
cistanche acteoside eykur beinmyndun
Niðurstöður
Acteoside hindrar myndun beinþynningar af völdum átfrumna á skammtaháðan hátt
Til að sannreyna áhrif akteósíðs á aðgreining BMM í beinfrumur voru frumurnar ræktaðar með ýmsum styrkjum (0– 20 mM) af akteósíði í 7 daga í viðurvist 50 ng/ml M-CSF og 100 ng/ml RANKL. Acteósíð minnkaði fjölda beinþynningar á skammtaháðan hátt. Þegar frumurnar voru formeðhöndlaðar með 10 mM akteósíði í 2 klst, minnkaði beinfrumufjöldi um 43 prósent samanborið við frumur sem bættar voru við M-CSF og RANKL (mynd 1A). Mynd 1B sýnir RANKL-miðlaða beinþynningaraðgreiningu og hömlun hennar með samsettri meðferð með akteósíði. Í samræmi við þessa niðurstöðu dró akteósíð formeðferð úr RANKL-örvuðum aðgreiningu RAW264.7 frumna og beinþynningarmyndun (Mynd 1C og D). Þegar and-beinþynningarmöguleiki akteósíðs á BMMs var borinn saman við andósteoclast möguleika nokkurra fenólefnasambanda við sama styrk (10 mM), sýndi lúteólín hæsta virkni (mynd 2A). Hins vegar minnkaði lúteólín, quercetin eða apigenin sjálft lífvænleika frumanna (mynd 2B). Öll efnasamböndin hindruðu beinþynningaraðgreiningu með RAW264.7 átfrumum með eftirfarandi hlutfallslega virkni: lúteólín. quercetin=apigenin .
Cistanche acteoside hamlar osteoclast