PartⅠ: Tubular Mitochondrial AKT1 er virkjað við blóðþurrðarendurflæðisskaða og gegnir mikilvægu hlutverki í tilhneigingu til langvinns nýrnasjúkdóms.
Apr 03, 2023
Ágrip
Vanstarfsemi nýrnapípla getur leitt til bráðs nýrnaskaða og umbreytingar í langvinnan nýrnasjúkdóm. Þrátt fyrir að pípulaga hvatberar séu tengdir meinalífeðlisfræði nýrnabilunar, þá er fyrirkomulagið óljóst. Hér sýnum við fram á að blóðþurrðar-endurflæðisskaðar valda bráðri umfærslu og virkjun hvatberapróteinkínasa B (einnig þekktur sem AKT1) í nýrnapíplum. Við gerðum þá tilgátu að hvatbera AKT1 merkjasending gæti komið í veg fyrir þróun bráðs nýrnaskaða og síðari langvinns nýrnasjúkdóms. Til að prófa þessa spá notuðum við Cre-Lox stefnuna til að búa til tvo nýja nýrnapíplusértæka erfðabreytta músastofna sem framkalluðu tjáningu á annað hvort hvatbera-miðaða ríkjandi-neikvæðu AKT1 eða stofnvirka AKT1. í hvatbera-miðuðum ríkjandi AKT1-neikvæðum músum, hömlun á hvatbera AKT1 versnaði azotemia, pípluskaða, nýrnatrefjun, glomerulosclerosis og lifun eftir blóðþurrðar-endurflæðisskaða neikvæða. Aftur á móti, hjá hvatbera-miðuðum, virkum AKT1 músum, veiktu aukin pípulaga hvatbera AKT1 merki nýrnaskaða, verndaði nýrnastarfsemi og verulega bætt lifun eftir blóðþurrðar-endurflæðisskaða (76,9 prósent á móti 20,8 prósent, í sömu röð). Þegar hvatbera AKT1 var hindrað fannst aukning á ótengdri hvatberaöndun og oxunarálagi í nýrnapíplum, sem styður hlutverk vanstarfsemi hvatbera í meinalífeðlisfræði nýrnabilunar. Þannig bendir rannsókn okkar til þess að pípulaga hvatbera AKT1 merkjaleiðin gæti verið nýtt markmið fyrir þróun nýrra aðferða til að koma betur í veg fyrir og meðhöndla nýrnaskaða.
Þýðingaryfirlýsing
Bráð nýrnaskaða (AKI) og síðari þróun langvinns nýrnasjúkdóms (CKD) eru mikil heilsufarsvandamál. Við þróuðum erfðabreytt músamódel og ákváðum hlutverk AKT virkjunar á nærliggjandi nýrnapíplum hvatberum í AKI og CKD. Þessi björgunarbúnaður nýrnaverndar gæti verið nýtt markmið til að þróa nýjar aðferðir til að koma betur í veg fyrir og meðhöndla AKI og langvinnan nýrnasjúkdóm. Framtíðarrannsóknir ættu að staðfesta þátttöku AKT-boðaleiðarinnar í hvatbera í nýrnaskaða manna og kanna lyfjamarkmið AKT1-ferilsins í hvatbera.
Leitarorð
Hvatbera Akt1; Blóðþurrðarafnámsáverka; Bráð nýrnaskaði; Langvinn nýrnasjúkdómur;Cistanche þykkni.
Smelltu hér til að fáCistanche ávinningur fyrir nýru
Kynning
Bráð nýrnaskaða (AKI) og síðari þróun langvinns nýrnasjúkdóms (CKD) eru mikil heilsufarsvandamál. Eins og er eru sértækar læknismeðferðir við þessum sjúkdómsástandum takmarkaðar, að hluta til vegna skorts á skilningi á sameindaháttum sem liggja að baki nýrnaskaða. Nýrað er eitt af orkuþörfustu líffærum líkamans og hvatberar, sem eru nauðsynlegir til að auðvelda virkan flutning, viðhalda réttum rafefnafræðilegum halla og stjórna vökvajafnvægi, eru aðal uppspretta ATP-framleiðslu frumna með oxandi fosfórun. truflanir á ATP-framleiðslu og truflun á starfsemi hvatbera geta leitt til aukinnar framleiðslu á hvarfgefnum súrefnistegundum (ROS), sem aftur skerðir nýrnafrumuvirkni og veldur frumudauða. Þrátt fyrir að greint hafi verið frá hvatberaskemmdum og vanstarfsemi hjá sjúklingum með nýrnasjúkdóm og dýralíkön af bráðum og langvinnum nýrnaskaða, er þekking á meinalífeðlisfræðilegu hlutverki hvatbera við nýrnaskaða enn ófullkomin.
Aukin starfsemi hvatbera getur komið í veg fyrir blóðþurrðar-endurflæðisskaða (IRI). Í blóðþurrðarfasa IRI hamlar súrefnisskortur rafeindaflutning í hvatbera öndunarkeðjunni og dregur úr ATP framleiðslu. Eftirfarandi innstreymi natríumjóna og útstreymi róteinda hjálpar til við að endurheimta eðlilegt pH og getur stuðlað að lifun frumna með því að endurheimta innanfrumurúmmál Við endurflæði tengist endurheimt blóðflæðis auknu hvarfgefna súrefnistegundum (ROS), Ca2 plús innflæði til hvatbera, tap á rafefnafræðilegir hallar yfir himnu hvatbera og virkjun apoptótískra ferla. Þessar innanfrumubreytingar geta verið skaðlegar frumum sem lifa af eftir upphaf blóðþurrðarskaða.
AKI er algengara hjá sjúklingum á sjúkrahúsi og getur flýtt fyrir upphaf nýs langvinnrar lungnateppu, aukið á núverandi langvinnan nýrnasjúkdóm og leitt til nýrnadauða. Aðferðirnar sem liggja að baki breytinga frá AKI til CKD eru óljósar. Nýlegar dýrarannsóknir benda til þess að vanstarfsemi nýrnapípla gegni mikilvægu hlutverki í framgangi AKI til CKD, sem endurspeglar umskiptin frá AKI til CKD hjá mönnum. Skilningur á boðleiðum sem stjórna nýrnaskaða mun gera okkur kleift að bera kennsl á ný lækningaleg markmið til að draga úr nýrnaskaða og koma í veg fyrir framgang AKI í langvinnan nýrnasjúkdóm.
Tengsl milli umfrymisboðaleiða og starfsemi hvatbera við nýrnaskaða eru að mestu óþekkt. Virkni hvatbera er nátengd umfrymisboðum, öðrum frumulíffærum og kjarnaferlum Rannsóknarstofa okkar hefur greint virkjun og flutning AKT1 yfir í hvatbera sem lykilskref til að vernda hjartavöðvafrumur gegn IRI meiðslum með því að stjórna oxandi fosfórunarfléttum, auka skilvirkni oxunar fosfórunar og draga úr ROS. Hins vegar er ekki vitað hvort IRI geti hrundið af stað flutningi virkjaðs AKT1 frá umfrymi til hvatbera í nýrnapíplum. Ef hægt er að virkja hvatbera AKT1 í nýrnapíplum til að bregðast við nýrnaskaða, væri mikilvægt að meta meinalífeðlisfræðilegt hlutverk hvatbera AKT1 í þróun bráðs nýrnaskaða (AKI) og langvinns nýrnasjúkdóms (CKD). Hér notuðum við tvö framkallanleg nýrnapíplu-sértæk erfðabreytt múslíkön sem móta hvatbera AKT1 boð in vivo og sýndu verndandi hlutverk nýrnapípla hvatbera AKT1 virkjunar meðan á IRI stendur gegn AKI og síðari CKD þróun.
Cistanche bætiefni
Niðurstöður
Virkjun hvatbera AKT1 í nýrnapíplum við IRI
Við könnuðum fyrst hvort IRI virkjar AKT1 í nýrnahvatberum. Í þessu skyni komum við á nýrna-IRI líkan með því að binda vinstri nýrnaslagæð í 30 mínútur og síðan gagnhliða nýrnabrottnám (Nx). Löndun vinstri nýrnaslagæðis var snúið við til að binda enda á blóðþurrðarfasa, endurflæði var framkvæmt og vinstra nýra var safnað á tilgreindu tímabili.
Nýrnaberki auðgað í nýrnapíplum var einangraður og hvatberar voru útbúnir með undirbroti. Við endurflæði jókst magn hvatbera pAKT1 og AKT1, sem bendir til flutnings virkjaðs AKT1 inn í hvatberana (Mynd 1A). Þetta er svipað því sem við sáum í hjartavöðvanum samanborið við sýndarstýrða viðmiðunarhópa eða skorið niður nýrnaeftirlit, þar sem hvatbera AKT1 var marktækt hækkað 30-60 mínútum eftir endurflæði (Mynd 1A og B) (n= 11-15). Hvatbera pAKT1 var einnig aukið. Þessar niðurstöður benda til þess að IRI hafi valdið virkjun og flutningi AKT1 yfir í hvatbera í nýrum. iHC litun staðfesti fosfórun á AKT1 í nýrnapíplum eftir IRI (Mynd 1C). Bakgrunnslitun fyrir pAKT1 var í lágmarki í nýrnapíplum hjá sham-knúnum samanburðarhópum, en pAKT1 var verulega hækkað í nýrnapíplum eftir IRI (myndir 1C og 1D). Ekkert pAKT1 sást á neinu nýrnasvæði nema píplunum. til að staðfesta undirfrumustaðsetningu pAKT1 í píplunum var pAKT1 litað ásamt hvatberamerkjum. marktæk samstaðsetning pAKT1 og hvatbera sást í nýrnapíplufrumum við IRI (Mynd 1E). Saman benda þessar niðurstöður til IRI umfærslu og virkjun AKT1 í hvatbera.
Mynd 1. Bráð flutningur og virkjun AKT1 af völdum blóðþurrðar í hvatberum í nýrum.
Myndun erfðabreyttra músa með framkallanlega nýrnapíplusértæka tjáningu á ríkjandi neikvæðum AKT í hvatberum
Til að prófa tilgátuna um að virkjun nýrnapípluhvatbera AKT1 meðan á IRI stendur verndar nýrun gegn AKI og síðari CKD þróun, bjuggum við til erfðabreytt músamódel sem gerir tamoxifen (TAM) framkallaða tjáningu á pípulaga-sértækri hvatberamiðun á ríkjandi-neikvæðum AKT1. Ríkjandi neikvæð AKT1 (mdnAKT) og hvatbera miðunarröð var bætt við N endastöðina. Skilyrt tjáning tamoxifens af AKT1 transgenum var miðlað með því að nota pCALNL (sjá Efni og aðferðir). Til að útiloka truflandi áhrif sem tengjast handahófskenndri samþættingu transgena fylkja innan erfðamengisins, var eitt eintak af transgeninu kynnt með samhljóða endurröðun í ES frumum með markvissa transgenum á Gt(ROSA) 26 eða stað á litningi. Tveggja gena mýs (KMDAKT) voru fengnar með því að krossa tam-framkallaðar af mdnAKT-músum með hálfsýknar KSP-CreERT2 músum, þar sem tam-framkallað Cre virkni var knúin áfram af nýrnapíplufrumu-sértæku calmodulin 16 hvata. tam innspýting framkallaði Cre virkni, einangraðir hvatberar og SDS-PAGE aðskilin hvatberaprótein fyrir ónæmisblettingu. Niðurstöðurnar sýndu að TAM framkallaði tjáningu stökkbreytts AKT1 með góðum árangri. Stökkbreytta próteinið var ógreinanlegt í KMDAKT músum, KSPCreERT2 músum og villigerð músum (maisolíusprauta).
Til að sannreyna nýrnasértæka tjáningu voru hvatberaprótein dregin út úr mismunandi vefjum eftir TAM inndælingu. hans-merkta stökkbreytta AKT1 kom aðeins fram í nýrum. Nýrnaskurðir voru litaðir með anti-his-tag mótefnum og hvatbera Mitotracker fyrir ónæmisflúrljómun. Niðurstöðurnar sýndu að öll stökkbrigði AKT1 voru lituð með His-tag mótefni og staðbundin í hvatbera. Engar AKT1 stökkbreytingar greindust í gaukla. Ensímvirkni hvatbera AKT1 var greind með því að nota raðbrigða GSK3 til að staðfesta meiriháttar neikvætt hlutverk í hvatberum tam-meðhöndlaðra KMDAKT pípla. Þar sem nýrnapípla hvatbera AKT1 er virkjað af IRI, bárum við saman ensímvirkni AKT1 í hvatberum einangruðum úr tam-meðhöndluðum músum og maísolíu-meðhöndluðum músum eftir IRI. Niðurstöðurnar sýndu að nýrnahvatbera AKT1 virkni var marktækt hindruð í TAM-meðhöndluðum KMDAKT músum. Þess vegna er þessi erfðabreytta músalína góð fyrirmynd til að rannsaka hlutverk AKT1 í pípulaga hvatberum.
Cistanche ávinningur
Hömlun á nýrnapíplum hvatbera AKT versnaði IRI in vivo
IRI var framkallað í einhliða nýrnablóðþurrð. Í síðustu röð tilrauna var fosfórýlerað AKT1 varla greinanlegt í hvatberum í nærliggjandi nýrnapíplum. Enginn marktækur munur á nýrnavefjafræði, þvagefni köfnunarefnis í blóði (BUN) og kreatíníns í sermi (Cr) sást í maísolíusprautuðum og tam-sprautuðum KMDAKT músum, sem bendir til þess að hvatbera AKT1 boð hafi ekkert marktækt hlutverk í uppbyggingu og nýrnastarfsemi við grunnlínu. fyrir framköllun IRI. Til að kanna hvort hvatbera AKT1 gegni verndandi hlutverki meðan á IRI stendur, var einhliða IRI notað til að framkalla AKI í maísolíumúsum eða TAM-KMDAKT músum. enginn munur var á BUN- eða Cr-gildum sem fengust strax eftir IRI-örvun, en hjá TAM-KMDAKT-músum voru bæði BUN- og Cr-gildi marktæk hækkuð eftir 45 daga. Þessar niðurstöður benda til þess að læst virkjun AKT1 í hvatbera í nýrnapíplum meðan á IRI stóð hafi aukið seint þróun nýrnabilunar. vefjafræðileg greining á H&E-lituðum nýrnasköftum sýndi að nýrnaskaðar versnuðu í TAM-KMDAKT músum. Jablonski skorar á nýrnapípluskaða var hærra með tapi á pípulaga burstakanti, pípulaga leysi og meira rusl í pípulaga holrýminu (p=0.018). Til að útiloka áhrif TAM eða Cre recombinasa, greindum við einnig TAM-sprautaðar KSP/CreERT2 mýs, og Jablonski stig voru svipuð í maísolíu KMdakt og TAM-KSP/CreERT2 músum á 7. degi eftir IRI (Mynd 3D) (p{{ 19}}.7613). Þessar upplýsingar benda til þess að niðurstöður okkar hafi ekki verið ruglaðar af áhrifum TAM eða Cre recombinasa. Hjá TAM-KMDAKT músum eftir IRI sýndi Masson þríkróm litun hærra trefjasvæði (prósent) (p<0,001), ásamt óreglulegum pípulaga byggingum með steypum í augum og rusl. col1a tjáning var aukin, í samræmi við Masson þríkróm litun. tGF tjáning var ekki aukin, sem bendir til þess að hvatbera AKT1 hafi ekki stjórnað bólgusvöruninni. Eftir IRI var tjáning pípulaga áverkamerkis- KIM -1 aukin í TAM-KMDAKT hópnum, sem staðfestir aukinn nýrnaskaða í TAM-KMDAKT hópnum (p=0.002).
TUNEL litun var notuð til að meta nýrnafrumufrumumyndun. Fjöldi apoptotic frumna var marktækt aukinn í píplum (p{{0}}.0054) og glomeruli (p<0.001) í TAM-KMDAKT músum samanborið við samanburðarhópinn. Lagt er til að hömlun á pípulaga hvatbera AKT1 meðan á IRI stendur auki píplufrumudauða og gauklaskaða. Í samræmi við þetta jókst virkjun bæði kaspasa 9 (promoter) og caspasa 3 (executor) marktækt í TAM-KMDAKT nýrnapípluþekjufrumum. Til að kanna frekar langvarandi gauklabreytingar, var periodic acid-Schiff (PAS) litunargreining gerð á nýrnaskurðum til að mæla gauklakölkun. Þrátt fyrir að enginn munur hafi sést á glomerulosclerosis 7 dögum eftir IRI (p=0.2634), fannst meira glomerulosclerosis í TAM-KMDAKT músum 45 dögum eftir IRI (p<0,001). Þessi niðurstaða bendir til þess að nýrnapípulaga hvatbera AKT boðleiðin geti stjórnað gauklaörmyndun meðan á þróun nýrnasjúkdóms stendur. Kaplan-Meier lifunargreining sýndi áhrif hömlunar á pípulaga hvatbera AKT á útkomu IRI. Lifun minnkaði eftir IRI í TAM-KMDAKT músum samanborið við viðmið (p=0.0013).
Lifunarhlutfall TAM-KMDAKT músa var marktækt lægra en samanburðar innan 7 daga eftir IRI, en BUN/Cr gildi TAM- og maísolíu-KMDAKT músa voru svipuð á þessu tímabili. Tilkynntar BUN/Cr breytingar í TAM-meðhöndluðum músum kunna að hafa verið vanmetnar vegna þess að BUN/Cr gögn frá dauðum músum eru ekki tiltæk. Að auki getur hærri dánartíðni í TAM-KMDAKT músum stafað af truflun á fjarlægum líffærum (lungum, hjarta, heila) frekar en bara BUN/Cr breytingum.
Hlutverk pípulaga hvatbera AKT1 var einnig metið í kvenkyns KMDAKT músum. BUN/Cr í sermi og vefjafræði nýrna voru hlutfallslega hærri í TAM-KMDAKT kvenkyns músum 45 dögum eftir IRI. Engin marktæk kynlífsáhrif komu fram.
Herbal Cistanche
HEIMILDIR
1. Yang JY, Deng W, Chen Y, o.fl. Skert yfirfærsla og virkjun Akt1 hvatbera dró úr oxandi fosfórun hvatbera Complex V virkni í hjartavöðva með sykursýki. J Mol Cell Cardiol. 2013;59:167–175.
2. Wang Z, Ying Z, Bosy-Westphal A, o.fl. Sérstakur efnaskiptahraði helstu líffæra og vefja yfir fullorðinsár: mat með vélrænu líkani um orkunotkun í hvíld. Am J Clin Nutr. 2010;92(6):1369–77.
3. Li SY, Susztak K. Hlutverk Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Gamma Coactivator 1alpha (PGC-1alpha) í nýrnasjúkdómum. Semin Nephrol. 2018;38(2):121–6.
4. Portilla D, Dai G, McClure T, o.fl. Breytingar á PPARalpha og samvirkjandi þess PGC-1 í bráðri nýrnabilun af völdum cisplatíns. Nýra Int. 2002;62(4):1208–18.
5. Forbes JM. Hvatbera-kraftspilarar í nýrnastarfsemi? Trends Endocrinol Metab. 2016;27(7):441–4425.
6. Szeto HH, Liu S, Soong Y, o.fl. Að bæta líforku hvatbera við blóðþurrðaraðstæður eykur þol gegn blóðþurrð í nýrum. Am J Physiol Renal Physiol. 2015;308(1):F11– F21.6.
7. Kalogeris T, Baines CP, Krenz M, o.fl. Frumulíffræði blóðþurrðar/endurflæðisskaða. Int Rev Cell Mol Biol. 2012;298:229–317.
8. Gracia-Sancho J, Casillas-Ramirez A, Peralta C. Sameindaleiðir til að vernda lifrina gegn blóðþurrð/endurflæðisskaða: 2015 uppfærsla. Clin Sci (Lond). 2015;129(4):345–62.
9. Sjá EJ, Jayasinghe K, Glassford N, o.fl. Langtímaáhætta á skaðlegum afleiðingum eftir bráðan nýrnaskaða: kerfisbundin endurskoðun og meta-greining á hóprannsóknum með því að nota samhljóða skilgreiningar á útsetningu. Nýra Int. 2019;95(1):160–72.
10. Szeto HH, Liu S, Soong Y, o.fl. Hvatberavörn eftir bráða blóðþurrð kemur í veg fyrir langvarandi uppstjórnun IL-1beta og IL-18 og hindrar langvinnan nýrnasjúkdóm. J Am Soc Nephrol. 2017;28(5):1437–49.
11. Tran MT, Zsengeller ZK, Berg AH, o.fl. PGC1alpha knýr NAD lífmyndun sem tengir oxunarefnaskipti við nýrnavernd. Náttúran. 2016;531(7595):528–32.
12. Tait SW, Green DR. Hvatbera og frumuboð. J Cell Sci. 2012;125(Pt 4):807–815.
13. Deng W, Leu HB, Chen Y, o.fl. Prótein kínasi B (PKB/AKT1) myndaði merkjafléttur með hvatberapróteinum og kom í veg fyrir truflun á glýkólýtískri orku í ræktuðum hjartavöðvafrumum við blóðþurrðar-endurflæðisskaða. Innkirtlafræði. 2014;155(5):1618–28.
14. Kanegae Y, Lee G, Sato Y, o.fl. Skilvirk genavirkjun í spendýrafrumum með því að nota raðbrigða adenoveiru sem tjáir staðsérhæfðan Cre recombinasa. Nucleic Acids Res. 1995;23(19):3816–21.
15. Matsuda T, Cepko CL. Stýrð tjáning transgena sem komið er fyrir með in vivo rafporun. Proc Natl Acad Sci US A. 2007 1 16;104(3):1027–32.
16. Lee SA, Cozzi M, Bush EL, o.fl. Fjarlæg líffæravandamál í bráðum nýrnaskaða: umsögn. Am J Kidney Dis. 2018;72(6):846–856.
Hugo YH Lin1,2,3,4, Yummy Chen1, Yu-Han Chen1, Albert P. Ta1,2, Hsiao-Chen Lee1,5, Grant R. MacGregor6, Nosratola D. Vaziri1,2, Ping H. Wang1,2,7
1. UC Irvine sykursýkismiðstöð og læknadeild, Kaliforníuháskóli, Irvine, Kalifornía
2. Lífeðlis- og lífeðlisfræðideild, University of California, Irvine, Kaliforníu
3. Læknadeild, Kaohsiung Medical University, Kaohsiung, Taívan
4. Innri læknadeild, Kaohsiung Municipal Ta-Tung sjúkrahúsið, Taívan
5. Lýtaskurðdeild, Kaohsiung Medical University, Kaohsiung, Taívan
6. Þroska- og frumulíffræðideild Kaliforníuháskóla, Irvine, Kaliforníu
7. Sykursýkisdeild, innkirtlafræði og efnaskipti, City of Hope National Medical Center, Duarte, Kaliforníu
