Part 2|Glýkógen syntasa kínasa 3b ofvirkni í flögguðum frumum í þvagi spáir fyrir um framvindu nýrnasjúkdóms af völdum sykursýki

Smelltu hér til að hluta 1

Fyrir frekari upplýsingar vinsamlega hafið samband við:emily.li@wecistanche.com

UMRÆÐA

Í Bandaríkjunum og öðrum vestrænum löndum er DKD áfram leiðandi orsök framsækinnalangvinnan nýrnasjúkdómog leggur miklar byrðar á ríkissjóð og heilbrigðiskerfi án endanlegrar meðferðar enn sem komið er.5 Það hefur lengi verið viðurkennt að ekki allir sjúklingar með sykursýki munu halda áfram að þróa DN.5 Það fer eftir hópnum sem rannsakað var, það hefur verið áætlað að DN hrjáir 30 prósent til 50 prósent sykursjúkra. Þær ráðstafanir sem núgildandi klínískar venjur nota til að bera kennsl á sykursýkissjúklinga sem eru í hættu á að fá DKD takmarkast að mestu við augnrannsóknir vegna sjónhimnukvilla og þvaggreiningu fyrir albúmínmigu.5 Samt sem áður benda faraldsfræðilegar vísbendingar til þess að öræðakvilli utan nýrna eða albúmínmigu sé verulega ósamræmi við framvindu í kjölfarið DKD.12,13,26,27 Sem slík er brýn þörf á að þróa nýtt lífmerki fyrir nákvæma lagskiptingu sykursýkissjúklinga í hættu á DN. Þessi rannsókn, í fyrsta skipti, greinir frá því að GSK3b sé oftjáð og ofvirkt í parenchymalnýrufrumur í bæði tilrauna- og klínískum DN, sem tengjastframgang nýrnasjúkdóms. Þar að auki er líklegt að GSK3b ofvirkni í flögguðum frumum í þvagi geti sagt fyrir um framvindu DN.

Cistanche tubulosa kemur í veg fyrir nýrnasjúkdóm, smelltu hér til að fá sýnishornið

GSK3b, mjög varðveittur, redox-næmur serín/þreónín-prótein kínasi, tekur miðlægt þátt í insúlínboðum sem og fjölda annarra frumuboðaleiða sem skipta sköpum fyrir meinalífeðlisfræðilega ferla sem tengjastnýrumeiðsli, viðgerðir og endurnýjun. Í insúlínviðkvæmum vefjum, eins og lifur og beinagrindarvöðvum, er GSK3b virkt við grunnskilyrði og bælir virkni glýkógensyntasa.19,28 Insúlín óvirkjar GSK3b hratt með hamlandi fosfórýleringu við serín 9, sem leiðir til glýkógenlífmyndunar. Sífellt fleiri vísbendingar benda til þess að vanstjórnun GSK3b tengist sykursýki af tegund 2.19,29–31 Reyndar eru til gögn sem benda til oftjáningar og ofvirkni GSK3b í vöðvum sykursýkissjúklinga31–33 og í fituvef offitu sykursýkismúsa.34 Þar að auki , erfðabreytt oftjáning á GSK3b í beinagrindarvöðvum músa veldur skertu glúkósaþoli, insúlínviðnámi og insúlínhækkun.29,35 Aftur á móti sýndu mýs sem skorti GSK3b í beinagrindarvöðvum bætt glúkósaþol.36 Í samræmi við það eru GSK3 hemlar, td lithium hemlar, líkja eftir insúlínverkun í frumulínum og vefjum.37 Þar að auki, í offitu sykursýkismúsum, bættu GSK3 hemlar insúlínnæmi og glúkósajafnvægi.38 Thenýruhefur jafnan ekki verið talið marklíffæri insúlínverkunar. Hins vegar bentu sannfærandi vísbendingar nýlega til þess að insúlín boðaði innnýrufrumur, einkum í fræfrumum, gegna lykilhlutverki við að viðhalda gaukla ognýruhomeostasis.39–41 Gölluð insúlínboð í fræfrumum, vegna insúlínskorts eða insúlínviðnáms, er líklega mikilvægur upphafsmaður margra meinafræðilegra sára sem sjást í DN. Ennfremur hafa klínískar rannsóknir sýnt að insúlínviðnám tengist upphaf og alvarleika albúmínmigu jafnvel hjá sjúklingum með blóðþrýsting sem ekki eru með sykursýki, sem bendir til þess að insúlínviðnám í sjálfu sér geti valdið albúmínmigu.42 Á sama hátt hafa mýs með fræfrumnasértækt insúlínviðnám, náð með skilyrt útsláttur á insúlínviðtakanum í gauklafrumur, þróað albúmínmigu og gauklaskemmdir sem endurskoða DN, þrátt fyrir að ekki sé um of háan blóðsykur eða sykursýki að ræða.41 Hins vegar geta insúlínnæmir hjá dýrum með sykursýki hægt á framgangi DN óháð blóðsykursstjórnun.43 Þessar niðurstöður benda til þess að insúlínboð stjórna starfsemi fræfrumna óháð blóðsykri. Hins vegar, sem lykilbreytir insúlínboðaleiðarinnar, hefur hlutverk GSK3b í meingerð og framvindu DN verið mikið vanrannsökuð.

Ínýru, GSK3b er aðallega tjáð í fræfrumum og, í minna mæli, í mesangial- og æðaþelsfrumum í gaukla20,21 og tjáð mikið af nýrnapíplufrumum. Það eru til gögn frá okkar og öðrum hópum sem benda til þess að GSK3b miðli sjálfvirkum skaða á fræfrumum með því að samþætta margar podocytar topathic boðleiðir.17,20,44,45 Ósamræmi, erfðafræðileg eða lyfjafræðileg blokkun á GSK3b getur verndað gegn podocyte skaða og dregið úr próteinmigu í dýralíkönum ýmsar gauklakvilla án sykursýki.21 Þar að auki, í framsæknumlangvarandinýrusjúkdómur, GSK3b reyndist vera mótandi á nýrnapíplum og millivefsskaða. Hins vegar, hvort og hvernig GSK3b tekur þátt í DN hefur verið óvíst og mjög umdeilt, jafnvel þó að þessi rannsókn hafi sýnt að aukin GSK3b virkjun ínýruog í þvagi afhúðaðar frumur geta tengst þróun eða framvindu DKD. Til dæmis, hjá rottum með sykursýki af völdum streptósótósíns, komust Lin et al.46 að því að hömlun á GSK3b með adenósín þrífosfat-samkeppnishemli (20 Z,30 E)-6- Bróm í indirúbíni-30 -oxím ( BIO) veikt próteinmigu og bætt gauklaskemmdir á DN án leiðréttingar á blóðsykri, sem bendir til þess að GSK3b gegni skaðlegu hlutverki í DN. Einnig, hjá rottum með sykursýki af völdum streptósótósíns, gerðu Paeng et al.22 svipaðar niðurstöður með því að nota BIO og komust að þeirri niðurstöðu að aukin GSK3b virkni innan fræfrumna við sykursýki tengist frumudruflunum og tapi í DN. Þetta er í samræmi við aðra in vitro rannsókn, þar sem kom í ljós að GSK3b miðlaði aðgreiningu fræfrumna og skaða eftir útsetningu fyrir háum glúkósamiðli.47 Þvert á móti fullyrtu Mariappan o.fl.48 að virkjun GSK3b bæti í staðinn af völdum sykursýki.nýrumeiðsli. Í rannsókn þeirra voru sykursýkismýs af völdum streptósótósíns meðhöndluð með natríumnítróprussíði, nituroxíðgjafa sem getur virkjað GSK3b. Þeir komust að því að albúmínmía, nýrnastækkun og uppsöfnun utanfrumufylkis í hnoðrum batnaði öll án bata á háþrýstingi eða blóðsykri. Þessar niðurstöður stangast hins vegar verulega á við gögn frá genamiðuðum knock-in músum með virkt GSK3 sem myndaði sjálfkrafa albúmínmigu og frumuskaða.49 Til að samræma misvísandi niðurstöður skal gæta varúðar við að túlka gögnin sem myndast með því að nota efnahemla eða virkja. af GSK3b. Þrátt fyrir að BIO hafi ítrekað verið staðfest að það sé mjög sértækur lítill sameinda hemill á GSK3b, er natríumnítróprússíð ekki sérstakur virkjandi GSK3b heldur er vitað að það hefur öflug blóðaflfræðileg áhrif,50 sem er líklegt til að rugla albúmínúríuminnkandi og endurvörnandi verkun þess í sykursýkis mýs. Samanlagt, þrátt fyrir misvísandi gögn, hafa ríkjandi sönnunargögn tilhneigingu til að styðja að GSK3b tengist líkleganýrumeiðsliog próteinmigu í DN. Nauðsynlegt er að nefna nokkrar takmarkanir á þessari rannsókn. Í fyrsta lagi voru forklínísku gögnin aðeins takmörkuð við DB/DB múslíkönin. Til að ákvarða alhæfanleika hlutverks GSK3b ínýrnaáverka af völdum sykursýki, það er nauðsynlegt að sannreyna niðurstöður í öðrum gerðum af DN, þar á meðal gerð 1 DN módel. Í öðru lagi voru klínískar athuganir hér fengnar úr afturskyggnum hópum sykursjúkra sjúklinga með takmarkaða úrtaksstærð og tiltölulega stuttan eftirfylgnitíma. Að vísu er þörf á stórum, framsýnum, slembiröðuðum, fjölsetra rannsóknum til að sannreyna athuganir okkar og til að staðfesta kraft GSK3b í þvagflöguðum frumum við að spá fyrir um niðurstöðu DKD.

GSK3b, mjög varðveittur, redox-næmur serín/þreónín-prótein kínasi, tekur miðlægt þátt í insúlínboðum sem og fjölda annarra frumuboðaleiða sem skipta sköpum fyrir meinalífeðlisfræðilega ferla sem tengjastnýrumeiðsli, viðgerðir og endurnýjun. Í insúlínviðkvæmum vefjum, eins og lifur og beinagrindarvöðvum, er GSK3b virkt við grunnskilyrði og bælir virkni glýkógensyntasa.19,28 Insúlín óvirkjar GSK3b hratt með hamlandi fosfórýleringu við serín 9, sem leiðir til glýkógenlífmyndunar. Sífellt fleiri vísbendingar benda til þess að vanstjórnun GSK3b tengist sykursýki af tegund 2.19,29–31 Reyndar eru til gögn sem benda til oftjáningar og ofvirkni GSK3b í vöðvum sykursýkissjúklinga31–33 og í fituvef offitu sykursýkismúsa.34 Þar að auki , erfðabreytt oftjáning á GSK3b í beinagrindarvöðvum músa veldur skertu glúkósaþoli, insúlínviðnámi og insúlínhækkun.29,35 Aftur á móti sýndu mýs sem skorti GSK3b í beinagrindarvöðvum bætt glúkósaþol.36 Í samræmi við það eru GSK3 hemlar, td lithium hemlar, líkja eftir insúlíni

verkun í frumulínum og vefjum.37 Þar að auki, í offitu sykursýkismúsum, bættu GSK3 hemlar insúlínnæmi og glúkósajafnvægi.38 Nýrað hefur jafnan ekki verið talið marklíffæri insúlínverkunar. Hins vegar hafa sannfærandi vísbendingar nýlega bent til þess að insúlínboð í nýrnafrumum, einkum í kjarnafrumum, gegni lykilhlutverki við að viðhalda gaukla- og nýrnajafnvægi.39–41 Gölluð insúlínboð í fræfrumum, vegna insúlínskorts eða insúlínviðnáms, er líklega mikilvægur upphafsmaður fyrir margar meinafræðilegar skemmdir sem komu fram í DN. Ennfremur hafa klínískar rannsóknir sýnt að insúlínviðnám tengist upphaf og alvarleika albúmínmigu jafnvel hjá sjúklingum með blóðþrýsting sem ekki eru með sykursýki, sem bendir til þess að insúlínviðnám í sjálfu sér geti valdið albúmínmigu.42 Á sama hátt hafa mýs með fræfrumnasértækt insúlínviðnám, náð með skilyrt útsláttur á insúlínviðtakanum í gauklafrumur, þróað albúmínmigu og gauklaskemmdir sem endurskoða DN, þrátt fyrir að ekki sé um of háan blóðsykur eða sykursýki að ræða.41 Hins vegar geta insúlínnæmir hjá dýrum með sykursýki hægt á framgangi DN óháð blóðsykursstjórnun.43 Þessar niðurstöður benda til þess að insúlínboð stjórna starfsemi fræfrumna óháð blóðsykri. Hins vegar, sem lykilbreytir insúlínboðaleiðarinnar, hefur hlutverk GSK3b í meingerð og framvindu DN verið mikið vanrannsökuð.

Í nýrum er GSK3b aðallega tjáð í fræfrumum og í minna mæli í mesangial- og æðaþelsfrumum í gaukla20,21 og tjáð mikið af nýrnapíplufrumum. Það eru til gögn frá okkar og öðrum hópum sem benda til þess að GSK3b miðli sjálfvirkum skaða á fræfrumum með því að samþætta margar siðfrumuboðaleiðir.17,20,44,45 Ósamræmi, erfðafræðileg eða lyfjafræðileg blokkun á GSK3b getur verndað gegn skaða á fræfrumum og dregið úr próteinmigu í dýralíkönum ýmsir gauklakvilla án sykursýki.21 Þar að auki, í versnandi krónískumnýrusjúkdómur, GSK3b reyndist vera mótandi á nýrnapíplum og millivefsskaða. Hins vegar, hvort og hvernig GSK3b tekur þátt í DN, hefur verið óvíst og ákaflega umdeilt, jafnvel þó að þessi rannsókn hafi sýnt að aukin GSK3b virkjun í nýrum og í þvagflögnuðum frumum gæti tengst þróun eða framvindu DKD. Til dæmis, hjá rottum með sykursýki af völdum streptósótósíns, komust Lin et al.46 að því að hömlun á GSK3b með adenósín þrífosfat-samkeppnishemli (20 Z,30 E)-6- Bróm í indirúbíni-30 -oxím ( BIO) veikt próteinmigu og bætt gauklaskemmdir á DN án leiðréttingar á blóðsykri, sem bendir til þess að GSK3b gegni skaðlegu hlutverki í DN. Einnig, hjá rottum með sykursýki af völdum streptósótósíns, gerðu Paeng et al.22 svipaðar niðurstöður með því að nota BIO og komust að þeirri niðurstöðu að aukin GSK3b virkni innan fræfrumna við sykursýki tengist frumudruflunum og tapi í DN. Þetta er í samræmi við aðra in vitro rannsókn, þar sem kom í ljós að GSK3b miðlaði aðgreiningu fræfrumna og skaða eftir útsetningu fyrir háum glúkósamiðli.47 Þvert á móti fullyrtu Mariappan o.fl.48 að virkjun GSK3b bæti í staðinn af völdum sykursýki.nýrumeiðsli. Í rannsókn þeirra voru sykursýkismýs af völdum streptósótósíns meðhöndluð með natríumnítróprussíði, nituroxíðgjafa sem getur virkjað GSK3b. Þeir komust að því að albúmínmía, nýrnastækkun og uppsöfnun utanfrumufylkis í hnoðrum batnaði öll án bata á háþrýstingi eða blóðsykri. Þessar niðurstöður stangast hins vegar verulega á við gögn frá genamiðuðum knock-in músum með virkt GSK3 sem myndaði sjálfkrafa albúmínmigu og frumuskaða.49 Til að samræma misvísandi niðurstöður skal gæta varúðar við að túlka gögnin sem myndast með því að nota efnahemla eða virkja. af GSK3b. Þrátt fyrir að BIO hafi ítrekað verið staðfest að það sé mjög sértækur lítill sameinda hemill á GSK3b, er natríumnítróprússíð ekki sérstakur virkjandi GSK3b heldur er vitað að það hefur öflug blóðaflfræðileg áhrif,50 sem er líklegt til að rugla albúmínúríuminnkandi og endurvörnandi verkun þess í sykursýkis mýs. Samanlagt, þrátt fyrir misvísandi gögn, hafa ríkjandi sönnunargögn tilhneigingu til að styðja að GSK3b tengist líkleganýrumeiðsliog próteinmigu í DN. Nokkrar takmarkanir á

Þarf að nefna núverandi rannsókn. Í fyrsta lagi voru forklínísku gögnin aðeins takmörkuð við dB/dB múslíkönin. Til að ákvarða alhæfanleika hlutverks GSK3b ínýrnaáverka af völdum sykursýki, það er nauðsynlegt að sannreyna niðurstöður í öðrum gerðum af DN, þar á meðal gerð 1 DN módel. Í öðru lagi voru klínískar athuganir hér fengnar úr afturskyggnum hópum sykursjúkra sjúklinga með takmarkaða úrtaksstærð og tiltölulega stuttan eftirfylgnitíma. Að vísu er þörf á stórum, framsýnum, slembiröðuðum, fjölsetra rannsóknum til að sannreyna athuganir okkar og til að staðfesta kraft GSK3b í þvagflöguðum frumum við að spá fyrir um niðurstöðu DKD.

Í stuttu máli sýndu rannsóknir okkar að nýrnatjáning og virkni GSK3b magnast upp í tilrauna- og klínískum DN. Virkni GSK3b í flögguðum frumum í þvagi getur þjónað sem ný lífmerki til að spá fyrir um framvindu DN. Gögnin okkar gætu rutt brautina fyrir umfangsmikla, ítarlega skoðun á því gildi sem GSK3b í þvagflöguðum frumum gæti þjónað sem forspár lífmerki um DN.

AÐFERÐIR

Dýrarannsóknir

Dýrarannsóknir voru samþykktar af Institutional Animal Care and Committee og þær eru í samræmi við reglugerðir bandaríska landbúnaðarráðuneytisins og National Institute of Health's Guide for human Care and Use of Laboratory Animals. Karlkyns DB/DB mýs og samanburðar db/m gotfélagar á aldrinum 6 vikna voru keyptar frá Nanjing University Model Animal Research Center (Nanjing, Kína) og vistuð í Central Animal Facility Zhengzhou háskólans. Öllum músum var gefið að vild og 8 til 10 mýs voru drepnar á tilgreindum aldri. Þvag- og blóðsýni voru tekin á tilgreindum tímapunktum. Eftir aflífun voru nýru tekin til frekari skoðunar. Magn albúmíns í þvagi var mæld með því að nota músalbúmín ensímtengd magngreiningarsett fyrir ónæmissogandi efni (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX). Kreatínínmagn í þvagi var ákvarðað með kreatínínprófunarbúnaði (BioAssay Systems, Hayward, CA).

Frumuræktun

Skilyrt ódauðleg músarfrumnafruma á milli gönguleiða 21 og 25 voru ræktuð í Roswell Park Memorial Institute 1640 miðli ásamt 10 prósenta fóstursermi úr nautgripum við leyfilegar aðstæður eins og áður hefur verið lýst.22 Undirræktir fræfrumanna voru látnar sæta óleyfilegum skilyrðum til að framkalla aðgreiningu í 14 daga og voru síðan útsett fyrir venjulegu umhverfi/ræktunarmiðli sem innihélt 5 mM glúkósa, sykursýkis umhverfi sem samanstendur af glúkósa (25 mM) og umbreytandi vaxtarstuðli b1 (2 ng/ml), eða eftirlitsmiðli með hátt osmólavirkni sem inniheldur 20 mM mannitól fyrir 48 klukkustundir. Músa nærpípulaga þekjufrumum og músagungla mesangial frumum var haldið í Dulbecco's modified Eagle's medium/F12 bætt við 5 prósent fóstursermi úr nautgripum. Frumur voru húðaðar við w70 prósent samruna í miðlinum sem innihélt 5 prósent nautgripafóstursermi í 24 klukkustundir og fóru síðan í sermissvelti í aðra 24 klukkustundir, fylgt eftir með útsetningu fyrir eðlilegu umhverfi/ræktunarmiðli sem innihélt 5 mM glúkósa, sykursýkis umhverfi sem samanstendur af háu glúkósa (25 mM) og umbreytandi vaxtarþátt b1 (2 ng/ml), eða eftirlitsmiðil með háum osmólavirkni sem inniheldur 5 mM glúkósa og 20 mM mannitól í 48 klukkustundir. Lífvænleiki frumna var metinn með Trypan blue útilokun. Á tilgreindum tímapunktum voru frumur festar eða frumulýsum safnað til frekari rannsóknar.

Tímabundin ummyndun vigra

Ferjurnar sem kóða fyrir tóman vektor eða hemagglutinin (HA)-merkt constitutively active (S9A) stökkbrigði (S9A-GSK3b-HA/pcDNA3) af GSK3b voru útvegaðir af Dr. Gail VW Johnson (Birmingham, AL) og voru umbreyttir í ræktaðar fræfrumur, mesangial frumur og pípulaga þekjufrumur með því að nota Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA) eins og áður hefur verið lýst.44 Skilvirkni umbreytinga var sannreynd með ónæmisflúrljómun litun eða ónæmisblettingu fyrir HA eftir 12 klst. Í kjölfarið var frumum safnað og undirbúið fyrir Western blot greiningu eða aðrar prófanir.

RNAi

Safn af 3 músum GSK3b-sértækum litlum, truflandi RNA tvíhliðum—50-CUUGUCCUGUAGAACUUUCtt-30, 50-AUGAUCCAUUUCCAAUCACTt-30 og 50-AUACCGCAGUCGGACUAUGtt-30 — voru hönnuð og framleidd í samræmi við heildarkóðarröð músa GSK3b gensins (GenBank aðgangsnr.BC060743.1). Að auki var spæna lítil, truflandi RNA röð (50-GCGAGUAGCGCUAGGAAGUTt-30) án raðlíkingar við neina þekkta genaröð úr músum, rottum eða mönnum notuð sem stjórn fyrir RNAi. Skilvirkni lípofectamine (Invitrogen, Carlsbad, CA)-miðlaðrar genaþagnar var metin með ónæmisblóðgreiningu fyrir GSK3b. Viðunandi bæling á tjáningu GSK3b próteina sást í ræktuðum fræfrumum, mesangial frumum og pípulaga þekjufrumum 24 klukkustundum eftir RNAi. Frumur voru síðan látnar undirgangast eðlilegt umhverfi/ræktunarmiðil, sykursýkisumhverfi eða eftirlitsmiðil með háum osmólastyrk í 48 klukkustundir eins og fram kemur hér að ofan áður en frumurnar voru unnar fyrir frekari mælingar.

Klínískar rannsóknir

Klíníski hluti þessarar rannsóknar var í samræmi við siðferðisreglur Helsinki-yfirlýsingarinnar frá 1975 og var samþykktur af endurskoðunarnefnd stofnana á fyrsta tengda sjúkrahúsinu í Zhengzhou háskólanum. Þátttakendur í rannsóknum manna voru ekki sérstaklega ráðnir í þessa rannsókn. Öllum klínískum gögnum var safnað með afturskyggnri yfirferð á töflum og með skoðun á vefjasneiðum í geymslu eða þvagsýnum. Óhófleg eða fleygð nýrnasýni úr vefjasýni, svo og þvagprufum sem skipt hafa verið í sundur, hefur reglulega verið geymt á nýrnalækningastofnun fyrsta tengda sjúkrahússins í Zhengzhou háskólanum. Geymdur óþekktur formalínbundinn paraffín-innfelldur nýrnavefjasýnisvefur frá sjúklingum á mismunandi stigum DN voru valdir af handahófi til skoðunar. Fleiri nýrnasýni án vefjaskemmda voru tekin úr nýrum sem hent var til ígræðslu vegna æðafrávika eða úr vefjasýnisvef fyrir ígræðslu og virkuðu sem eðlileg viðmið. Í afturskyggnu hóprannsókninni voru alls 127 sjúklingar með sykursýki af tegund 2, sem höfðu verið fylgt eftir síðan 2010 með innbyggðum sýnum af brotnu þvagi, skimaðir afturvirkt til að taka þátt í þessari rannsókn. Sjúklingarnir sem voru rannsakaðir voru á aldrinum 29 til 80 ára og greindust með sykursýki af tegund 2 samkvæmt viðmiðum American Diabetes Association. Útilokunarviðmið innihéldu tap á eftirfylgni, ófullnægjandi upplýsingar,nýruvanstarfsemi, or overt proteinuria at baseline, or other superimposed kidney diseases such as acute kidney injury or glomerulopathies. Finally, 60 patients have enrolled in this study for further assessment. All patients had been followed up for >5 ár. Við hefðbundna eftirfylgni voru lýðfræðilegar upplýsingar, sem og klínískar breytur, skjalfest, þar á meðal kyn, aldur, fylgikvilla, lyf, lengd sykursýki, blóðþrýstingur, blóðsykursgildi, kreatínínmagn í sermi, gögn um þvaggreiningu, UAE og eGFR. Klíníska niðurstaðan eftir 5 ára eftirfylgni var tilvist eða engin versnun skertrar nýrnastarfsemi, sem var skilgreint sem annaðhvort 25 prósenta lækkun á eGFR eða versnun albúmínmigu eins og tilgreint er af aukningu alvarleika albúmínmigu á ýmsum klínískum stigum DN, það er normoalbuminumia, microalbuminumia, macroalbuminumia eða augljós próteinmiga. Allir sjúklingar veittu skriflegt upplýst samþykki.

Mat á formgerð nýrna og ónæmisvefjaefnagreining

Parafín-innfelldir formalínfastir nýrnavefsblokkir úr músum voru skornir í 3-mm hluta. Fyrir almenna vefjafræði voru hlutar unnar fyrir periodic acid-Schiff litun. Ónæmisvefjaefnafræðileg litun fyrir GSK3b og p-GSK3b var framkvæmd með því að nota VECTASTAIN ABC sett (Vector Laboratories, Burlingame, CA) eins og áður hefur verið lýst.20 Sem neikvæð viðmiðun var aðal mótefnið skipt út fyrir ónæmissermi frá sömu tegund; engin litun varð. Formfræðileg einkenni allra hluta voru metin af einum áhorfanda á blindan hátt með aðstoð nýrnasjúkdómafræðings.

Ónæmisflúrljómandi litun

Ræktaðar frumur eða frystar kryostatískir hlutar voru festir og litaðir með aðal mótefnum og fylgt eftir með því að beita Alexa Fluor-conjugated secondary mótefnum (Invitrogen). Sem neikvæð viðmiðun var frummótefni skipt út fyrir fornæmis IgG frá sömu tegund; engin litun varð. Að lokum voru hlutar mótlitaðir með 40,6-diamidino-2-fenýlindóli eða própídíumjoðíði og settir fyrir með VECTASHIELD festingarmiðli (Vector Laboratories). Fyrir FL flúrljómunarsmásjárskoðun voru allir hlutar greindir á sama tíma til að útiloka gripi vegna breytilegrar rotnunar flúorókrómsins. Hlutar voru skoðaðir með Olympus FL flúrljómunarsmásjá með Spot II stafrænni myndavél (Olympus, Tókýó, Japan). Fyrir tvílita litun voru myndir teknar í röð til að forðast truflun á litarefni. ImageJ hugbúnaður (National Institute of Health, Bethesda, MD) var notaður við eftirvinnslu myndanna, til dæmis, mælikvarða, sameiningu og sameiningargreiningu.

Tölvustýrð formgreining

Myndir af litun með ónæmisvefjaefnafræði voru teknar og stafrænar með því að nota tölvustýrt myndgreiningarkerfi sem samanstendur af háupplausnar hleðslutengdri stafrænni myndavél tengdri smásjá (Olympus BX41, Olympus) og við tölvu. Myndir voru sýndar í pixlaupplausninni 1024 768 pixlum (rýmisupplausn, 0,24 mm/pixla). Fyrir myndir af ónæmisvefjaefnafræðilegri litun á nýrnavef úr mönnum var ImageJ hugbúnaður notaður fyrir myndskiptingu, þröskuldsuppbyggingu og mælingar á merkjastyrk. Handvirkar leiðréttingar voru gerðar eftir þörfum. Á heildina litið voru tekin sýni úr 10 glomeruli eða 10 tilviljanakenndum tubulointerstitial sviðum til formfræðilegrar greiningar og endanleg gögn voru gefin upp sem gildi samþættrar pixlaþéttleika miðað við samanburðarhópinn.

Western immunoblot greining

Ræktaðar frumur voru ljósaðar;nýruvefjumeða einangruð nýrnahnoðra voru gerð einsleit í geislaónæmisútfellingarprófunarbuffi ásamt próteasahemlum og sýni voru unnin til ónæmisblóðgreiningar. Fyrir ónæmisflögugreiningu á takmörkuðum fjölda skrúfaðra frumna í þvagi var samskiptareglum Western blotsins breytt eins og áður hefur verið lýst með því að nota hágæða NuPAGE Bis-Tris hlaup (Invitrogen) og hágæða flutningshimnur.25 Fáguð ónæmisbletting gæti greina hóflega tjáð prótein í allt að 1000 frumum. Mótefnin gegn GSK3b, fíbrónektíni, kollageni IV, aktíni og glýseraldehýð-3-fosfat dehýdrógenasa (GAPDH) voru keypt frá Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA); þær sem voru á móti synaptópódíni voru keyptar frá PROGEN Biotechnik GmbH (Heidelberg, Þýskalandi); og þeir sem eru á móti ZO-1 og p-GSK3b voru keyptir frá Cell Signaling Technology (Danvers, MA).

tölfræðigreining

All in vitro studies were repeated 3 to 6 times. For immunoblot analysis, bands were scanned and the integrated pixel density was determined using a densitometer and the ImageJ analysis program, version 1.48 (National Institutes of Health). Data were expressed as mean -SD or median (interquartile range). All included patients had baseline data. Patients with missing data or lost to follow-up were excluded from this study. Continuous variables were analyzed as appropriate by using the t-test, Mann-Whitney U test, or 1-way analysis of variance (ANOVA) followed by the Student-NewmanKeuls test if there were 3 comparisons or by the Scheffé test if there were >3 samanburður. Flokksgögn voru borin saman milli hópa með því að nota kí-kvaðrat prófið. Línulegri aðhvarfsgreiningu var beitt til að skoða möguleg tengsl milli 2 breytu. Univariate Cox proportional hazards aðhvarfsgreiningar voru gerðar til að meta tengslin milli viðkomandi breyta og hættu á versnun skerðingar á nýrnastarfsemi, fylgt eftir með fjölþátta greiningum með tilliti til hugsanlegra ruglings. ROC ferilgreining var framkvæmd og svæðin undir ROC kúrfunum voru mæld til að greina kraft ákveðinna breyta til að spá fyrir um framvindu skerðingar á nýrnastarfsemi hjá sykursjúkum. Óeðlilega dreifðar breytur, eins og UAE, var umbreytt með lógaritma til að ná eðlilegum hætti fyrir Cox hlutfall hættur aðhvarfsgreiningar ROC ferilgreiningar. Allar tölfræðilegar greiningar voru gerðar með PSS útgáfu 22 (IBM Corporation, Armonk, NY). P gildi<0.05 in2-tailed="" tests="" were="" considered="" statistically="" significant="" in="" all="">

UPPLÝSINGAR

Allir höfundar lýstu ekki yfir hagsmunum í samkeppni.

VIÐTAKNINGAR

Hluti þessarar rannsóknar var kynntur sem munnleg kynning á KidneyWeek 2016: American Society of Nephrology Annual Meeting, 15.–20. nóvember 2016, Chicago, IL. RG var að hluta styrkt af sjóðnum um heilsu. XL var styrkt af rannsóknarstyrk til að fá utanskólaþjálfun. ZL var studd af National NaturalScience Foundation of China styrkir U1604284, 81770672 og 81873612. Fjármögnunaraðilar höfðu ekkert hlutverk í hönnun og framkvæmd þessarar rannsóknar, söfnun og túlkun gagnanna, eða undirbúning og samþykki handritsins.

HÖFUNDARFRAMLAG

RG hannaði hugmyndahugmyndirnar. XL, ZL og RG lögðu sitt af mörkum við hönnun náms. XL, PW, BC, YG, AYG og BF framkvæmdu frumuræktunartilraunirnar. XL og ZL gerðu dýratilraunirnar og söfnuðu gögnum frá sykursjúkum. XL, LJW, DKM, LDD, ZL, og stuðlaði að umræðu og túlkun á niðurstöðum. hafði forgöngu um ritun handritsins. XL, BC og BF lögðu sitt af mörkum til handritagerðar. Allir höfundar voru sammála um að allt hugmyndin og eignarhald þessa verks tilheyri RG. Allir höfundar samþykktu lokahandritið.

VIÐBÓTAEFNI

Viðbótaraðferðir.

Tafla S1. Eiginleikar viðmiðunarþega og sjúklinga með nýrnakvilla af völdum sykursýki, lagskipt eftir vefjafræðilegum flokkum nýrnakvilla með sykursýki. Tafla S2. Lýðfræðilegar upplýsingar, klínískar og rannsóknarstofuupplýsingar um afturskyggnt hóp sykursýkissjúklinga á fyrstu stigum með engin merki um DKD. Tafla S3. Lýðfræðilegar, klínískar og rannsóknarstofuupplýsingar um sjúklinga með sykursýki á fyrstu stigum tegund 2, lagskipt í samræmi við nýrnaárangur þeirra eftir 5 ára eftirfylgni. Mynd S1. Aukin nýrnavirkni GSK3b spáir fyrir um þróun og alvarleikasykursýkinýrusjúkdómurí db/db músum. Karlkyns db/db og db/m músum var fylgt eftir á milli 4 og 13 vikna aldurs. (A) Blóðsýni var tekið úr músum sem ekki voru á fastandi maga við 4 og 7 vikna aldur og blóðsykursgildi voru metin. *P < 0.001="" á="" móti="" db/m="" músum="" við="" 7="" vikna="" aldur.="" n="" ¼="" 15–18.="" (b)="" blettþvag="" var="" tekið="" við="" 4,="" 7,="" 10="" og="" 13="" vikna="" aldur="" og="" það="" var="" gert="" með="" albúmíni="" og="" þvagkreatínínprófi="" til="" að="" ákvarða="" albúmín-til-kreatínín="" hlutföll="" í="" þvagi="" (uacr).="" *p="">< 0,001="" á="" móti="" db/m="" músum="" við="" 10="" vikna="" aldur="" (n="" ¼="" 15–18);="" #p="">< 0,001="" á="" móti="" db/m="" músum="" við="" 13="" vikna="" aldur.="" n="" ¼="" 15–18.="" (c)="" allar="" mýs="" fengu="" opna="" nýrnavefsýni="" við="" 7="" vikna="" aldur="" og="" vefjasýnissýni="" voru="" unnin="" fyrir="" ónæmisblottagreiningu="" fyrir="" p-gsk3b,="" gsk3b="" og="" gapdh.="" (d)="" immunoblots="" voru="" látin="" fara="" í="" þéttleikagreiningu.="" hlutfallslegt="" magn="" gsk3b="" og="" p-gsk3b="" var="" ákvarðað="" sem="" þéttleikahlutföll="" viðkomandi="" sameindar/gapdh="" sem="" faltbreytingar="" samanborið="" við="" samanburðar="" db/m="" músa.="" hlutfallsleg="" virkni="" gsk3b="" var="" reiknuð="" út="" sem="" hlutföll="" p="" gsk3b="" á="" móti="" gsk3b="" sem="" fellingar="" á="" db/m="" samanburðarmúsum.="" (e)="" línuleg="" aðhvarfsgreining="" sýndi="" fram="" á="" tölfræðilega="" marktæka="" jákvæða="" fylgni="" milli="" gsk3b="" virkni="" í="" nýrum="" við="" 7="" vikna="" aldur="" í="" db/db="" músum="" og="" þróun="" og="" alvarleika="" albúmínmigu,="" sem="" er="">sykursýkinýrusjúkdómurvið 13 vikna aldur. R ¼ 0.699; P ¼ 0.0{{20}}1. (F) Kúrfugreining á rekstri móttakara sýndi fram á að GSK3b nýrnavirkni á fyrstu stigum sykursýki (7 vikna aldur) veitir framúrskarandi nákvæmni og kraft við að spá fyrir um þróun albúmínmigu og DKD við 13 vikna aldur í db/db músum. Mynd S2. Insúlínviðnám og hátt glúkósa í umhverfinu virkja GSK3b í nýrnafrumum. (A) Ræktaðar músafrumur, (B) glomerular mesangial frumur í þvagi (MMCs) og (C) nýrnapíplar þekjufrumur (TECs) voru umbreyttar með spæna siRNA fákirni (siCon) eða siRNA fákirni (siIRb) sem eru sértæk fyrir b ísóformið insúlínviðtaka (IRB) til að móta ástand insúlínviðnáms in vitro. Frumurnar voru síðan útsettar í 48 klukkustundir fyrir eðlilegu umhverfi sem inniheldur glúkósa (NG) eða sykursýkisumhverfi sem inniheldur háan glúkósa (HG). Frumulýsum var safnað og þeim sett í ónæmisblottagreiningu fyrir IRB, p-GSK3b, GSK3b og GAPDH og fylgt eftir með þéttleikagreiningu á blettunum. *P < 0,01="" á="" móti="" irb="" tjáningu="" í="" sicon-meðhöndluðum="" frumum="" sem="" verða="" fyrir="" sama="" umhverfi="" (n="" ¼="" 3),="" #p="">< 0,05="" á="" móti="" sömu="" próteintjáningu="" í="" siirb="" þ="" ng="" eða="" sicon="" þ="" hg="" hópnum="" (n="" ¼="" 3),="" &p="">< 0,05="" á="" móti="" sömu="" próteintjáningu="" í="" öðrum="" þ="" hg="" eða="" siirb="" þ="" ng="" hópnum="" (n="" ¼="" 3).="" mynd="" s3.="" tjáningarmagn="" gsk3b="" mrna="" í="" nýrnasýnum="" úr="" mönnum="" sem="" fengust="" frá="" heilbrigðum="" lifandi="" gjöfum="" og="" sjúklingum="" með="" nýrnakvilla="" af="" völdum="" sykursýki.="" gögn="" voru="" fengin="" frá="" www.nephroseq.org="" á="" grundvelli="" ju="" ckd="" glom="" gagnapakkanum51="" og="" gefin="" upp="" sem="" log2="" miðgildi-miðjustyrkur.="" mynd="" s4.="" aukin="" virkni="" gsk3b="" í="" flögguðum="" þvagfrumum="" sem="" safnað="" er="" frá="" sykursýkissjúklingum="" á="" fyrstu="" stigum="" spáir="" fyrir="" um="" þróun="" nýrnasjúkdóms="" af="" völdum="" sykursýki.="" (a,="" b)="" greining="" á="" gsk3b="" og="" virkjaðri="" gsk3b="" í="" þvagflöguðum="" frumum="" sem="" safnað="" er="" frá="" sykursjúkum="" á="" fyrstu="" stigum="" (pts)="" og="" heilbrigðum="" viðmiðunarhópum="" (ctrls).="" þvagflögunarfrumum="" var="" safnað="" og="" þær="" leystar.="" frumulýsi="" voru="" unnin="" fyrir="" ónæmisblottagreiningu="" fyrir="" gsk3b,="" p-gsk3b="" og="" gapdh.="" (c)="" ónæmisflögur="" voru="" gerðar="" í="" þéttleikagreiningu.="" hlutfallslegt="" magn="" af="" gsk3b="" og="" p-gsk3b="" var="" ákvarðað="" sem="" þéttleikahlutföll="" viðkomandi="" sameindar/gapdh="" sem="" faltbreytingar="" samanborið="" við="" viðmið="" (ctrls).="" hlutfallsleg="" virkni="" gsk3b="" var="" reiknuð="" út="" sem="" hlutföll="" p-gsk3b="" og="" gsk3b="" sem="" fold="" of="" normal="" control="" (ctrls).="" (d)="" kúrfugreining="" á="" rekstrareinkennum="" móttakara="" sýndi="" fram="" á="" að="" hlutfallsleg="" gsk3b="" virkni="" (p-gsk3b/gsk3b="" hlutfall)="" í="" flögguðum="" þvagfrumum="" sem="" safnað="" er="" frá="" sykursýkissjúklingum="" á="" byrjunarstigi="" veitir="" framúrskarandi="" nákvæmni="" við="" að="" spá="" fyrir="" um="">nýrnasjúkdómur af völdum sykursýkieftir 5 ár, þar sem flatarmálið undir ferlinum (AUC) er 0.886.

HEIMILDIR

1. Umanath K, Lewis JB. Uppfærsla um nýrnakvilla með sykursýki: Grunnnámskrá 2018. Am J Kidney Dis. 2018;71:884–895.

2. Gregg EW, Li Y, Wang J, o.fl. Breytingar á fylgikvillum tengdum sykursýki í Bandaríkjunum, 1990-2010. N Engl J Med. 2014;370:1514–1523.

3. Haller H, Ito S, Izzo JL Jr, o.fl. Olmesartan til að tefja eða koma í veg fyrir öralbúmínmigu í sykursýki af tegund 2. N Engl J Med. 2011;364:907–917.

4. Schena FP, Gesualdo L. Sjúkdómsfræðilegar aðferðir við nýrnakvilla með sykursýki. J Am Soc Nephrol. 2005;16 (fylgi 1):S30–S33.

5. Ritz E, Zeng XX, Rychlik I. Klínísk birtingarmynd og náttúrusaga nýrnakvilla með sykursýki. Framlag Nephrol. 2011;170:19–27.

6. Holman RR, Paul SK, Bethel MA, o.fl. 10-árs eftirfylgni með mikilli glúkósastjórnun við sykursýki af tegund 2. N Engl J Med. 2008;359:1577–1589.

7. Perkins BA, Ficociello LH, Ostrander BE, o.fl. Öralbúmínmía og hætta á snemma versnandi nýrnastarfsemi í sykursýki af tegund 1. J Am Soc Nephrol. 2007;18:1353–1361.

8. Koye DN, Magliano DJ, Reid CM, o.fl. Hætta á versnun á nýrnabilun í nýrnabilun á lokastigi hjá fólki með sykursýki: CRIC (Chronic Renal Insufficiency Cohort) rannsóknin. Am J Kidney Dis. 2018;72:653–661.

9. Caramori ML, Fioretto P, Mauer M. Þörfin fyrir snemma spár um hættu á nýrnakvilla sykursýki: er útskilnaðarhraði albúmíns nægjanlegur? Sykursýki. 2000;49:1399–1408.

10. Caramori ML, Fioretto P, Mauer M. Lágt gauklasíun hjá sjúklingum með normoalbuminuric tegund 1 sykursýki: vísbending um lengra komna gauklaskemmdir. Sykursýki. 2003;52:1036–1040.

11. Krolewski AS. Framsækin nýrnabilun: nýja hugmyndafræði sykursýkisnýrnakvilla í sykursýki af tegund 1. Umönnun sykursýki. 2015;38:954–962.

12. Robles NR, Villa J, Gallego RH. Sykursýkisnýrnakvilli sem ekki er próteinþvag. J Clin Med. 2015;4:1761–1773.

13. Adler AI, Stevens RJ, Manley SE, o.fl. Þróun og framgang nýrnakvilla í sykursýki af tegund 2: Bretlandi tilvonandi sykursýkisrannsókn (UKPDS 64). Nýra Int. 2003;63:225–232.

14. Gluhovschi C, Gluhovschi G, Petrica L, et al. Þvagvísar við mat á nýrnakvilla af völdum sykursýki. J Sykursýki Res. 2016;2016: 4626125.

15. Doi T, Moriya T, Fujita Y, o.fl. IgG4 og Smad1 í þvagi eru sértæk lífmerki fyrir uppbyggingu og virkni nýrnabreytinga á fyrstu stigum nýrnakvilla með sykursýki. Sykursýki. 2018;67:986–993.

16. De S, Kuwahara S, Hosojima M, o.fl. Útskilnaður megalíns í fullri lengd í þvagi vegna útfrumnamiðlunar er tengdur meingerð nýrnakvilla af völdum sykursýki. Sykursýki. 2017;66:1391–1404.

17. Xu W, Ge Y, Liu Z, o.fl. Glýkógen syntasa kínasi 3b ræður hreyfanleika frumufrumna og viðloðun um brennistein með því að móta virkni paxillins: áhrif á verndandi áhrif lágskammta litíums við frækvilla. Am J Pathol. 2014;184:2742–2756.

18. Ali A, Hoefiich KP, Woodgett JR. Glýkógen syntasa kínasi-3: eiginleikar, virkni og stjórnun. Chem Rev. 2001;101:2527–2540.

19. Beurel E, Grieco SF, Jope RS. Glýkógen syntasa kínasi-3 (GSK3): stjórnun, aðgerðir og sjúkdómar. Pharmacol Ther. 2015;148:114–131.

20. Li C, Ge Y, Dworkin L, o.fl. B ísóformið af GSK3 miðlar sjálfvirkum skaða á frumufrumum í próteinþvaga glomerulopathy. J Pathol. 2016;239:23.