Hluti 1: Greining á dópamínvirkum taugum sem geta bæði komið á tengslum minni og stöðvað hegðunartjáningu þess á bráð
Mar 19, 2022
Tengiliður:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Michael Schleyer, 1* Alice Weiglein, 1 Juliane Thoener, 1 Martin Strauch, 2 Volker Hartenstein, 3
Melisa Kantar Weigelt, 1 Sarah Schuller, 1 Timo Saumweber, 1 Katharina Eichler, 4,5,6 Astrid Rohwedder, 4,7 Dorit Merhof, 2 Marta Zlatic, 5,7 Andreas S. Thum, 4,8 og Bertram Gerber1,9 ,10*
1Leibniz Institute for Neurobiology, Department Genetics of Learning ogMinni, 39118 Magdeburg, Þýskalandi, 2Institute of Imaging & Computer Vision, RWTH Aachen University, 52056 Aachen, Þýskalandi, 3Department of Molecular, Cell and Developmental Biology, University of California, Los Angeles, California 90095-1606, 4University of Konstanz, Institute fyrir líffræði, 78464 Konstanz, Þýskalandi, 5HHMI Janelia Research Campus, Ashburn, Virginia 20147, 6Institute of Neurobiology, University of Puerto Rico Medical Science Campus, Old San Juan, Puerto Rico 00901, 7Department of Zoology, University of Cambridge, Cambridge, CB{ {12}}EJ, Bretland, 8University Leipzig, Institute for Biology, 04103 Leipzig, Þýskalandi, 9Centre for Behavioral Brain Sciences, 39108 Magdeburg, Þýskalandi, og 10Institute for Biology, Otto von Guericke University Magdeburg, 39106 Magdeburg, Þýskalandi
Aðlögunarhæf umskipti frá því að kanna umhverfið í leit að mikilvægum auðlindum yfir í að nýta þessar auðlindir þegar leitin hefur heppnast er mikilvæg fyrir öll dýr. Hér erum við að rannsaka taugakerfi sem gerir lirfu Drosophila melanogaster af öðru kyni kleift að semja um þessa könnun-nýtingu umskipti. Við gerum það með því að sameina Pavlovian skilyrðingu með hegðunarmælingu í mikilli upplausn, sjónræna meðferð á einstaklingsgreindum taugafrumum og EM gagnatengdar greiningar á synaptic skipulagi. Við komumst að því að optogenetic virkjun dópamínvirku taugafrumunnar DAN-i1 getur bæði komið á fótminnimeðan á þjálfun stendur og binda bráðan niður lærða leitarhegðun í síðari innköllunarprófi. Virkjun þess skilur hins vegar meðfædda hegðun óbreytt. Nánar tiltekið getur DAN-i1 virkjun komið á fót tengdum minningum um gagnstæða gildi eftir pöruð og ópöruð þjálfun með lykt, og virkjun hennar meðan á innköllunarprófinu stendur getur stöðvað leitarhegðun sem stafar af annarri hvorri þessara minninga. Niðurstöður okkar benda ennfremur til þess að í hegðunarþýðingu sinni líkist DAN-i1 virkjun, en sé ekki jafngild sykurlaun. Dendrogram greiningar á öllum taugamótunartengingum milli DAN-i1 og tveggja meginmarkmiða þess, Kenyon frumanna, og líkamsútgangstaugafrumu sveppa MBON-i1, benda ennfremur til þess að DAN-i1 merki á meðan á þjálfun og innköllunarprófi stendur gætu borist til Kenyon frumurnar og til MBON-i1, í sömu röð, innan áður óþekktra, staðbundinna greinarvirkja. Þetta myndi veita glæsilegt hringrásarmótíf til að binda enda á leitina þegar henni lýkur.
Lykilorð: dópamín; könnun-nýting; sveppir líkami; optogenetics; styrking; leit
Mikilvægisyfirlýsing
Í lífsbaráttunni þurfa dýr að kanna umhverfi sitt í leit að æti. Þegar maturinn hefur fundist er hins vegar aðlögunarhæft að forgangsraða því að nýta hann fram yfir að halda áfram leit sem væri nú jafn tilgangslaus og að leita að gleraugunum sem þú ert með. Þessi málamiðlun könnunar og nýtingar er mikilvæg fyrir dýr og menn, sem og fyrir tæknileg leitartæki. Við könnum hverjar af aðeins 10,000 taugafrumum ávaxtaflugulirfu geta velt jafnvæginu í þessu skipti og auðkennum eina dópamíntaugafrumu sem kallast DAN-i1 sem getur gert það. Miðað við líkindin í starfsemi dópamíntaugafruma yfir dýrakónginum-
dom, þetta gæti endurspeglað almenna meginreglu um hvernig leit er hætt þegar hún hefur heppnast.
Kynning
Dýr sem kannar umhverfi sitt getur notað fyrri reynslu til að leiðbeina leit sinni að fæðu. Þegar fæða finnst er hins vegar aðlögunarhæft að hætta leitinni og nýta fæðugjafann í staðinn. Hér erum við að rannsaka hringrásirnar sem gera lirfu Drosophila melanogaster kleift að semja um þessa könnun og nýtingu umskipti. Tölulegur einfaldleiki lirfuheilans, ásamt frumusértækri tjáningu transgena og þekkingu á synaptic tengingu hans (Pfeiffer o.fl., 2010; Li o.fl., 2014; Eichler o.fl., 2017; Saumweber o.fl., 2018; Eschbach o.fl., 2020), gerir kleift að rannsaka þetta á stigi einstaklingsgreindra taugafrumna.
D. melanogaster lirfur tengja lykt auðveldlega við matarverðlaun (Scherer o.fl., 2003; Gerber og Hendel, 2006; Schipanski o.fl., 2008; Rohwedder o.fl., 2012; Apostolopoulou o.fl., 2014; Kudow o.fl. , 2017, 2019). Mikilvægt er að lærð hegðun sem byggir á þessum lykt-matarsamböndum hættir ef verðlaunin eru til staðar á meðan á innköllunarprófi stendur (mynd 1A). Því er hægt að líta á lærða hegðun sem leit sem lýkur aðlögunarhæfni með þeirri niðurstöðu sem leitað er eftir (þ.e. með verðlaununum) (Schleyer o.fl., 2011, 2013, 2015a). Meðfædd lyktarhegðun hefur ekki sömu áhrif (Mynd 1B), sem bendir til þess að slík meðfædd hegðun sé skipulögð á viðbragðslíkan hátt (Schleyer o.fl., 2011, 2013, 2015a,b). Þannig geta náttúruleg umbun valdið tvenns konar áhrifum: meðan á þjálfun stendur gefa þau verðlaunamerki sem hægt er að tengja við vísbendingar sem síðan leiðbeina verðlaunaleit; og meðan á innköllunarprófinu stendur geta þeir hætt þessari lærðu leit bráðlega og komið í veg fyrir að dýrin reki í burtu frá auðlind þegar hún hefur fundist. Þessi umskipti endurspegla þannig breytingu á stefnunni til að fá verðlaun, ekki breytingu á hvatningu (þ.e. ekki tap á áhuga á verðlaununum).
Jafnt hryggleysingja og hryggleysingja, dópamínvirkar taugafrumur (DAN) veita styrkjandi merki fyrir tengslanám (Waddell, 2013; Schultz, 2015; Kaun og Rothenfluh, 2017). Í D. melanogaster, aðgreindar DAN-samstæður gefa lystarstyrkingu og andúð, í sömu röð (lirfur: Schroll o.fl., 2006; Rohwedder o.fl., 2016; Saumweber o.fl., 2018; Eschbach o.fl., 2020; fullorðnar flugur. Schwaerzel o.fl., 2003; Claridge-Chang o.fl., 2009; Liu o.fl., 2012) (svipað atburðarás gæti líka verið að koma upp hryggleysingja: Lammel o.fl., 2012; Groessl o.fl., 2018; Menegas o.fl. al., 2018). Með því að koma á hólfum, skera þessar DAN-þræðir samhliða trefjar Kenyon frumna (KCs), innri taugafrumna í hæstu gráðu lyktarskyns miðju skordýranna, sem kallast sveppalíkaminn. Með virðingu fyrir sömu hólfsbyggingu, safna líkamsútgangstaugafrumum úr sveppum (MBONs) upplýsingum um KCs og senda hana í átt að efferent rafrásum (sjá mynd 2A–D) (lirfur: Selcho o.fl., 2009; Pauls o.fl., 2010 ; Eichler o.fl., 2017; Saumweber o.fl., 2018; Eschbach o.fl., 2020; fullorðnir: Sejourne o.fl., 2011; Places o.fl., 2013; Aso o.fl., 2014a,b; Oswald og Waddell , 2015; Takemura o.fl., 2017). Athyglisvert er að nýleg endurgerð rafeindasmásjár leiddi í ljós að DAN hafa tvö meginmarkmið: KC og MBON (sjá mynd 2B) (lirfur: Eichler o.fl., 2017; fullorðnir: Takemura o.fl., 2017).
Í lirfu D. melanogaster getur virkjun DAN frá pPAM klasanum haft gefandi áhrif á þjálfun (Rohwedder o.fl., 2016). Frá fjórum dögum þessa klasa geta tveir hver fyrir sig veitt slík gefandi áhrif (DAN-h1 og DAN-i1) (Saumweber o.fl., 2018). Hér völdum við að einbeita okkur
Mynd 1. Sykur getur gefið umbunar- og leitarlokunarmerki. Lirfur voru þjálfaðar þannig að lykt kom fram annað hvort pöruð eða ópöruð við sykur. Í síðari innköllunarprófi voru þau prófuð með tilliti til lyktarvals þeirra annaðhvort í fjarveru eða í viðurvist sykrsins (teikning að ofan). Prófun án sykurs leiddi í ljós tengd lyktarlyktminni, magngreind sem jákvæð PI. Hegðun tjáning þessaminnivar hætt í viðurvist sykurs. Þannig getur sykur gefið tvenns konar merki: meðan á þjálfun stendur gefur hann verðlaunamerki sem hægt er að tengja við lyktina til að leiðbeina dýrunum síðar í verðlaunaleitinni; og meðan á innköllunarprófinu stendur gefur sykurinn sem eftirsótt verðlaun merki um að hætta þessari lærðu leit. Sýnisstærðir: N=29, N =28. B, Lirfur voru prófaðar með tilliti til meðfædds lyktarvals, annaðhvort í fjarveru eða í viðurvist sykurs (skissa að ofan). Sykur hafði ekki áhrif á meðfædda lyktarhegðun, sem gefur til kynna viðbragðslíkt skipulag hans. Sýnastærðir: N=20 hver. Mismunandi letur fyrir ofan kassaritin gefa til kynna paralega þýðingu (Mann–Whitney U próf, bls, 0.05, leiðrétt samkvæmt Bonferroni-Holm). *Marktekt frá núlli (einsýnismerkispróf, p, 0,05, leiðrétt samkvæmt Bonferroni-Holm). ns, ekki marktækt. Allar tölfræðilegar prófanir og niðurstöður þeirra eru tilkynntar ásamt upprunagögnum á mynd útbreiddra gagna 1-1. Fyrir lyktarvalgildin sem liggja til grundvallar PI stigum þessarar tilraunar, sjá mynd 9A.
Mynd 2. Hringrás DAN-KC-MBON fylkisins. Miðlægsblaða-chiasm. Lyktarupplýsingar eru unnar til að framkalla meðfædda nálgun, sem og í átt að bikarsvæði sveppalíkamans KCs (fjólublátt; birt í heild sinni er eitt dæmi KC hægra megin). Upplýsingar um bragðlaun eru sömuleiðis unnar til að leiðbeina meðfæddri hegðun, sem og í gegnum aðallega amínvirkar mótandi taugafrumur (sýnt er DAN-i1, grænblár/svartur) í átt að einstökum hólfum líkamsleifa sveppa (vinstra megin eru hólf sýnd). Hvert af fjórum hólfum miðlungsblaðsins (hk) fær inntak frá einum DAN sem einnig inntaugar sama hólf í andstæða heilahvelinu. MBON miðlungsblaðsins draga úr stökum hólfum, venjulega af báðum heilahvelum (sýnt er MBON-i1, magenta/gult), og skila afköstum sínum, í stillingum sem eru mismunandi milli hólfa, yfir hálfkúluskilin. Sameiginlega eru MBON ábyrg fyrirminni-byggð leitarhegðun. Gögnin eru byggð á Eichler o.fl. (2017) og Saumweber o.fl. (2018). B, DAN-KC-MBON fylkið í i-hólfinu. DAN-i1 og flestir KCs koma á gagnkvæmum efnasammótum og bæði DAN-i1 og KCs veita úttak til MBON-i1. Til einföldunar eru aðeins synapses með vinstri DAN-i1 og MBON-i1 taugafrumunum sýndar í smáatriðum. Sama tenging er að finna í flestum, ef ekki öllum, öðrum hólfum (Eichler o.fl., 2017; Saumweber o.fl., 2018). C, DAN-i1 (grænblár) fær inntak utan frá sveppum (dökkgráum) í hliðarhlið frumuhluta hans (svæði merkt 1) og ítaugar síðan i-hólfið í báðum heilahvelum (merkt 2 og 3). MBON-i1 (magenta) fer tvisvar yfir miðlínuna; það fær inntak í i-hólf beggja heilahvela og gefur úttak á svæðum sem liggja að sveppaboli beggja heilahvela. D, Sama og í C, en í örlítið hallaðri mynd, sýnir beinagrind endurgerð vinstri DAN-i1 og MBON-i1 taugafrumna og eitt dæmi KC (svart). Gögnin eru byggð á Eichler o.fl. (2017). E, Dendrogram af vinstri DAN-i1 taugafrumu. Litaðir punktar tákna framleiðsla taugamóta frá DAN-i1. Þríhyrningar tákna inntaks taugamót í DAN-i1. Litir tákna maka taugafrumu viðkomandi taugamóta. Öll önnur taugamót innan sveppa líkamans eru merkt „Annað“. Ekki birtast taugamót sem DAN-i1 myndar með taugafrumum utan sveppalíkamans, sérstaklega á svæði 1 (Eschbach o.fl., 2020). Stiplaðar línur gefa til kynna svæði þar sem taugafruman fer yfir miðlínu heilans. F, Sama og í E, en fyrir vinstri MBON-i1 taugafrumu. Ekki birtast taugamót sem MBON-i1 myndar með taugafrumum utan sveppalíkamans. Fyrir háupplausnarútgáfur af DAN-i1 og MBON-i1 taugafrumum beggja heilahvela, auk allra þroskaðra KCs, sjá auknar gagnamyndir 2-1, 2-2 og 2-3, í sömu röð .
á DAN-i1 vegna þess að það hefur áður verið greint nánar (Saumweber o.fl., 2018) og vegna þess að það skilar öflugri verðlaunaáhrifum en DAN-h1 (Saumweber o.fl., 2018; óbirt gögn). Við gefum fyrst ítarlega grein fyrir staðbundnu fyrirkomulagi allra synapses milli DAN-i1 og beggja helstu framleiðslu samstarfsaðila þess, MBON-i1 og KCs. Síðan spyrjum við hvort optogenetic virkjun DAN-i1 geti miðlað ekki aðeins verðlaunamerki meðan á þjálfun stendur heldur einnig merki um að hætta bráðlega sem lærði að leita að verðlaununum meðan á innköllunarprófinu stendur.
cistanche líkamsbygging
Efni og aðferðir
Tilraunalíkan og upplýsingar um viðfangsefni. Lirfur á þriðja stigi fóðrunarstigs af báðum kynjum (D. melanogaster), 5 daga gömul eftir eggjavarp, voru notaðar í gegn. Flugum var haldið á stöðluðu miðli, í fjöldaræktinni við 25 gráður, 60 prósent -70 prósent hlutfallslegan raka og 12/12 klst. ljós/myrkur hringrás. Við tókum skeið af æti úr matarhettuglasi, völdum af handahófi þann fjölda lirfa sem óskað var eftir, skoluðum þær í stutta stund í kranavatni og hófum tilraunina.
Við notuðum erfðabreyttar lirfur til að tjá ChR2-XXL ljósstýrða jónarásina í DAN. Í þessu skyni var áhrifastofninn UAS-ChR2-XXL (Dawydow o.fl., 2014) (vinsamlega veittur af R. Kittel, háskólanum í Leipzig), settur yfir í annan af tveimur drifstofnum: annað hvort 58E{{6 }}Gal4 (Pfeiffer o.fl., 2008; Liu o.fl., 2012; Rohwedder o.fl., 2016) (Bloomington Stock Center nr. 41347) eða split-Gal4 ökumannsstofninn SS00864 (Eichler o.fl., 2017; Saumweber. et al., 2018) til að fá tvöfalt arfblendið afkvæmi. Ökumaður stjórnar ökumannsstofnum sem voru færðir yfir í staðbundið eintak af w1118 (Bloomington Stock Center #3605, #5905, #6326). Sem áhrifavaldur stjórnar stofni sem ber lendingarstaðina sem notaðir eru fyrir Gal4 (attP2) eða split-Gal4 (attP40/attP2), en þó án Gal4 léns sett inn ("tómt") (Pfeiffer o.fl., 2010), var farið yfir í UAS- ChR2-XXL. Við staðfestum tjáningarmynstrið 58E02 og SS00864 með því að krossa þau yfir í pJFRC-10xUAS-IVS-mCD8::GFP (Pfeiffer o.fl., 2010) (Bloomington Stock Center #32185). Vegna þess að ChR2-XXL er nógu viðkvæmt til að hægt sé að virkja það með dagsbirtu (ekki sýnt), voru flugur aldar upp í hettuglösum sem voru stöðugt myrkvaðar með svörtum pappaumbúðum. Fyrir tilraunina sem sýnd er á mynd 8E var UAS-ChR2 (Schroll o.fl., 2006) sett yfir í 58E02-Gal4.
Tilraunauppsetning. Fyrir hegðunartilraunir voru lirfur þjálfaðar í Petri-skálum með 9 cm innra þvermál og prófaðar í Petri-skálum með annaðhvort 9 eða 15cm innra þvermál (báðar frá Sarstedt) eins og getið er um í myndsögunum, í öllum tilfellum fylltar með 1 prósent agarósa (rafmagnsgráðu). ; Roth). Eins og lyktin notuðum við n-amýlasetat þynnt 1:20 í paraffínolíu (AM; CAS: 628-63-7; Merck), og í sumum tilfellum til viðbótar óþynnt 1-oktanól (OCT; CAS: {{ 9}}; Merck).
Tilraunir voru gerðar inni í 43 43 73cm umhverfis kassa með sérsmíðuðu ljósaborði með 24 12 LED fylki (470nm; Solarox) og 6-mm þykkri dreifingarplötu úr matt plexigleri ofan til að tryggja einsleitt blátt ljós fyrir ChR2-XXL virkjun (120mW/cm2). Petrídiskar voru settir beint ofan á dreifingarplötuna. Petri diskarnir voru umkringdir pólýetýlendreifingarhring; á bak við dreifingarhringinn voru 30 innrauðir LED (850nm; Solarox) settir upp til að veita lýsingu sem var ósýnileg lirfunum en gerði samt kleift að skrá og rekja hegðun þeirra fyrir ótengda greiningu. Í þessu skyni var myndavél (Basler acA204090umNIR; Basler) búin innrauða síu sett fyrir ofan Petri-skálina. Fyrir frekari upplýsingar um tilraunauppsetningu, sjá Saumweber o.fl. (2018).
cistanche líkamsbygging
Sambandslykt-sykurnám. Námstilraunir fylgdu viðteknum samskiptareglum (Michels o.fl., 2017). Lyktarílát voru undirbúin með því að bæta 10 ml af lyktarefni í sérsmíðuð Teflon ílát (5 mm innra þvermál með loki gatað með 7 götum með 0,5 mm þvermál hvert). Petrí diskar voru þaktir breyttum lokum sem voru götótt í miðjunni með 15 holum með 1 mm þvermál hvert til að bæta loftun.
Til lyktar-sykurþjálfunar voru 20 lirfur settar í miðjan Petri fat fyllt með agarósa sem innihélt 2mól/L D-frúktósa (CAS: 57-48-7; Roth) sem verðlaun (1) og búnar tveimur lyktum ílát á gagnstæðum hliðum, bæði fyllt með AM (AM1). Eftir 2,5 mín voru lirfurnar færðar yfir á ferskan petrí-skál með látlausum, bragðlausum agarósa, útbúnum tveimur tómum ílátum (EM), þar sem þær voru einnig í 2,5 mín. Þrjár slíkar „pöraðar“ æfingalotur voru gerðar, í hverju tilviki með ferskum Petri réttum. Í helmingi tilfella hófst þjálfun með verðlaunum sem innihéldu petrí-skál eins og tilgreint er (AM1/EM), en í hinum helmingi tilvikanna var röðinni snúið við (EM/AM1). Fyrir hvern árgang lirfa sem þjálfaðir voru AM1/EM (eða EM/AM1), var annar hópur þjálfaður gagnkvæmt, það er með "ópöruðum" kynningum á lykt og umbun (AM/EM1, eða EM1/AM, í sömu röð).
Að lokinni þjálfun voru lirfurnar fluttar í miðjan Petri-skál og prófaðar með tilliti til lyktarvals. Mikilvægt er að innköllunarprófið var annað hvort framkvæmt á venjulegum petrí-skál til að metaminni-byggð leitarhegðun eða á petrí-disk sem inniheldur verðlaun til að ákvarða hvort tilvist verðlauna hafi stöðvaðminni-byggð leit. Í báðum tilfellum var önnur hliðin á prófunar-petrískálinni búin AM-íláti og hin hliðin með EM-íláti. Fjöldi lirfa á hvorri hlið var ákvarðaður út frá myndavélarmyndinni 3 mín eftir að prófið hófst. Út frá þessum tölum var lyktarval reiknað sem hér segir:
Þannig geta PI gildi verið á bilinu 1 til 1, með jákvæðum gildum sem gefa til kynna að lirfurnar vildu lyktina frekar eftir pöruð en ópöruð þjálfun. Jákvæð PI-gildi gefa því til kynna að það sé lystandi tengslminniþað er best túlkað semminni-byggð leitarhegðun. Neikvæð PI-gildi gefa aftur á móti til kynna andstyggilegt sambandminni.
Félagsnám með optogenetic DAN virkjun. Fyrir sjónrænar tilraunir voru þjálfun og próf framkvæmd á hliðstæðan hátt. Hins vegar voru allir Petri réttir fylltir með venjulegum agarósa (þ.e. engin gefandi bragðefni voru notuð). Þess í stað, fyrir pöruð þjálfun, var AM parað við stöðuga örvun með bláu ljósi til að virkja annað hvort 58E02-DAN eða 864- DAN í 2,5 mínútur, fylgt eftir af 2,5 mínútum af myrkri án lyktar (AM1/EM). Fyrir óparaða þjálfun átti sér stað lykt og ljósörvun (AM/EM1). Fyrir tilraunina sem sýnd er á mynd 8E, var lykt og ljós birt í 5 mín hvor; sú tilraun fylgdi að öðru leyti aðferðum sem lýst er af Rohwedder o.fl. (2016).
Eftir þrjár slíkar æfingalotur var innköllunarprófið framkvæmt og lyktarval og PI voru reiknuð út eins og lýst er. Mikilvægast var að innköllunarprófið var annað hvort framkvæmt án virkjunar bláu ljóss til að ákvarða hvort DAN-tækin miðla verðlaunamerki meðan á þjálfun stendur eða með virkjun bláu ljóss til að ákvarða hvort DAN-tækin geti auk þess miðlað merki um að stöðva leitina.
Afbrigði þessarar samskiptareglur eru sýndar í myndsögunum.
Meðfædd lyktarhegðun. Lyktarílát og petrídiskar voru útbúnir eins og lýst er hér að ofan. Hópum af 20 lirfum var safnað úr hettuglasinu, skolað í stutta stund í kranavatni og sett á Petri fat með AM ílát á annarri hliðinni og tómt ílát á hinni hliðinni. Eftir 3 mín var meðfædd lyktarval ákvörðuð samkvæmt jöfnu 1. Þetta kjörpróf var annað hvort framkvæmt í fjarveru eða viðveru sykurs, eða í fjarveru eða í viðurvist virkjunar blátt ljóss, til að ákvarða hvort þessar prófunaraðstæður breytast meðfædd lyktarhegðun.
Greining á hegðunarbreytingum eftir þjálfun með 864-DAN virkjun. Hegðun lirfa var fylgst með myndbandi og greind eins og lýst er ítarlega af Paisios o.fl. (2017). Í stuttu máli voru tveir þættir krabbameinslyfja í lirfu greindir. Í fyrsta lagi var mótun höfuðvönunar (HC á sekúndu) (HC/s) reiknuð út sem hér segir:
Í þessum mælikvarða lýsir stefnishornið (HA) stefnu höfuðs dýrsins miðað við lyktina, með algjörum stefnuhornum (abs (HA)) sem er 0 gráðu eða 180 gráður, til dæmis, sem gefur til kynna að lyktin er að framan eða aftan á lirfurnar, hvort um sig. Þessi mælikvarði gefur því jákvæða einkunn fyrir aðdráttaraflið (þ.e. þegar HC beinir lirfunum frekar en í burtu frá lyktarmarkinu), en hún gefur neikvæða einkunn fyrir andúð.
Ónæmisvefjafræði. Lirfuheilir voru krufnir í Ca{0}}lausri saltlausn og festur í Bouin's lausn þynnt 1:2 með Ca21-lausri saltlausn í 7 mín. Þrjú þvottaskref (hver 10 mín) í PBST (0,3 prósent Triton-X 100 í PBS) var fylgt eftir með ræktun með aðal mótefnin yfir nótt við 4 gráður. Eftir þrjá þvotta (hverja 10 mín) í PBS, var vefurinn ræktaður með auka mótefnum í 1 klst við stofuhita. Eftir þrjú lokaþvottaskref í PBS (hverjar 10 mín.) voru sýni sett upp í Vectashield (Vector Laboratories). Undirbúningur var skoðaður undir DM 6000 CS confocal smásjá (Leica Microsystems).
cistanche líkamsbygging
Sem mótefni notuðum við annað hvort einstofna and-FASII músamótefni (DSHB, þynnt 1:50 í blokkunarlausn sem innihélt 4 prósent eðlilegt geitasermi) og and-GFP kanínumótefni (A11122, Invitrogen, þynnt 1:1{ {28}}00 í blokkunarlausn sem inniheldur 4 prósent venjulegt geitasermi) sem aðal mótefni og Cy3 mótefni gegn músum (715-165-150, Jackson ImmunoResearch Laboratories) og Alexa-488 gegn kanínu mótefni (A11034, Invitrogen), bæði þynnt 1:200 í PBS, sem aukamótefni; eða við notuðum einstofna and-ChR2 músamótefni (ProGen Biotechnik) þynnt 1:100 í 0,3 prósent PBST sem aðal mótefni, Cy3 mótefni gegn músum (715-165-150, Jackson ImmunoResearch Laboratories), þynnt 1:300 í 0,3 prósent PBST , sem annað mótefni, og Alexa-488 and-HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratories), þynnt 1:300 í 0,3 prósent PBST, til mótlitunar.
