Hluti 1: Stofnun á samhliða tilraunalíkani af beinþynningu ásamt Alzheimerssjúkdómi í rottum og tvíþættum áhrifum Echinacoside og Acteoside frá Cistanche Tubulosa
Mar 24, 2022
Tengiliður:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Yi Chen, Ying-Qi Li, Jia-Yi Fang, Ping Li, Fei Li
ÁSTANDUR
Etnólyfjafræðilegt mikilvægi: Cistanche tubulosaer dýrmætt hefðbundið kínverskt lyf sem hefur verið mikið notað við meðhöndlun á beinþynningu ogAlzheimer-sjúkdómur. Echinacosideog akteósíð eru helstu virku innihaldsefnin í Cistanche tubulosa sem hafa lyfjafræðilega virkni með rannsóknargildi. Greint hefur verið frá því að echinacoside ogakteósíðgæti bætt náms- og minnisgetu, stuðlað að útbreiðslu og aðgreiningu beinþynningar. Markmið rannsóknarinnar: Echinacoside og acteoside fromCistanche tubulosahafa sýnt marktæka virkni gegn beinþynningu og gegn Alzheimerssjúkdómi, á meðan þessi áhrif hafa ekki verið rannsökuð samtímis í rottulíkani. Markmið þessarar rannsóknar var að koma á fót og sannreyna líkan beinþynningar ásamtAlzheimer-sjúkdómurhjá rottum og til að kanna tvöföld áhrif afechinacosideog acteoside á þessu samhliða líkani.
Efni og aðferðir:Þrír líkanhópar eggjastokkanáms (OVX), sýndarskurðaðgerða með D-galaktósa og AlCl3 (D), eggjastokkanáms með D-galaktósa og AlCl3 (OVX plús D) voru settir á sama tíma. Rotturnar í lyfjameðferðarhópum voru teknar úr eggjastokkum. Meðan inndæling D-galaktósa í kviðarhol og AlCl3 í maga var sprautað í kviðarhol hjá rottum í lyfjameðferðarhópum voru rotturnar gefnar til inntöku.echinacoside(90 mg/kg/d),akteósíð(90 mg/kg/d), og jákvæðu viðmiðunarlyfið estradíólvalerat (0,6 mg/kg/d), dónepezíl HCl (0,8 mg/kg/d), í sömu röð. Eftir 8 vikna lyfjameðferð var Morris Water Maze (MWM) próf í 6 daga fyrst gert. Rottunum var síðan fórnað til að uppskera blóð, leg, lærlegg, sköflunga og heilavef. Serumið var notað til lífefnafræðilegra prófana. Legið var notað við vefjagreiningu. Hægri lærleggurinn var notaður fyrir Micro-CTog vefjafræði, í sömu röð. Réttur sköflungur var notaður fyrir líffræðilega prófið. Hippocampus sem safnað var á ísskápnum var notað til lífefnafræðilegra prófana. Heilinn 41 sem safnað var með gegnflæði var notaður til vefjagerðar.
Niðurstöður:Í samanburði við Sham hópinn gæti OVX plús D hópurinn dregið verulega úr náms- og minnisgetu með því að valda oxunarskemmdum, skerða taugafrumur í hippocampus og hafa áhrif á vatnsrof og nýmyndun asetýlkólíns. Á sama tíma jókst starfsemi BALP og TRAP í OVX plús D hópnum verulega (P<0.001) as="" compared="" to="" the="" sham="" group.="" in="" addition,="" compared="" with="" the="" sham="" group,="" the="" mean="" bone="" mineral="" density="" obviously="" decreased=""><0.05), the="" trabecular="" bone="" mass="" and="" microarchitecture="" were="" also="" destroyed="" significantly="" in="" the="" ovx+d="" group.="" furthermore,="" the="" maximum="" load="" and="" maximum="" stress="" significantly="" reduced=""><0.01) and="" the="" energy="" 50="" absorption="" also="" decreased="" greatly="" as="" compared="" to="" the="" sham="" group.="" after="" being="" administrated="" with="">echinacosideogakteósíð, dæmigerð sjúkleg einkenni beinþynningar ogAlzheimer-sjúkdómurvoru bættar.
Ályktanir:Líkanið af beinþynningu ásamtAlzheimer-sjúkdómurí rottum var framkvæmanlegt og tókst að koma á fót.Echinacosideog akteósíð sýndu einnig nokkur marktæk áhrif á þetta samhliða líkan, og þeir gætu verið hugsanlegir 56 frambjóðendur fráCistanche tubulosameð tvöföldum áhrifum til frekari rannsókna.
Leitarorð:beinþynning; Alzheimer-sjúkdómur; tvöföld áhrif; echinacoside; akteósíð; Cistanche tubulosa
Cistanche lost empire jurtir bæta Alzheimerssjúkdóm
1. Inngangur
Beinþynning er hrörnunarsjúkdómur í beinum sem einkennist af versnandi tapi á beinmassa og eyðileggingu á örarkitektúr, sem getur aukið hættuna á brothættu broti (Rachner o.fl., 2011).Alzheimer-sjúkdómur(AD) er algengur taugahrörnunarsjúkdómur hjá öldruðum sem einkennist af stöðugri andlegri hnignun, vitrænni skerðingu og tapi á sjálfstæðri lífsgetu í klínískum sjúkdómum (Reitz 76 o.fl., 2011). Myndun aldraðra skellu af völdum -amyloid útfellingar, taugatrefjaflækja af völdum tau offosfórunar og hrörnun taugafrumna í heila eru dæmigerð sjúkleg einkenni AD (Serrano-Pozo o.fl., 2011). Yfirborðslega séð eru OP og AD algjörlega sjálfstæðir sjúkdómar með mismunandi meinafræði og klíníska eiginleika. Hins vegar sést oft að OP og AD eiga sér stað samhliða klínískri starfsemi (Zhang o.fl., 2001; Lui o.fl., 2003; Luckhaus o.fl., 2009). Algengi beggja sjúkdómanna jókst með aldrinum, sérstaklega hjá konum eftir tíðahvörf (Li o.fl., 2017; Stern, 2012). Sífellt fleiri vísbendingar bentu til þess að fólk sem greinist með AD sé í aukinni hættu á OP (Zhou o.fl., 2014).
Nauðsynlegt er að rannsaka og skýra tengsl beinþynningar ogAlzheimer-sjúkdómurin vitro og in vivo. Áður en rannsóknirnar eru gerðar in vivo er mikilvægt að velja viðeigandi dýralíkön af beinþynningu eða Alzheimerssjúkdómi. Beinþynningarlíkanið gæti komið á fót með ýmsum aðferðum eins og gjöf sjónusýru í maga, skurðaðgerð á eggjastokkum og inndælingu sykurstera í vöðva (Wei o.fl., 2007; Komori, 2015). Einkum var beinþynningarlíkan eftir tíðahvörf framkallað af eggjastokkatöku hjá rottum klassískt oghefur verið mikið notað í flestum rannsóknunum (Miao o.fl., 2012; Liu o.fl., 2017).Sporadískur Alzheimerssjúkdómur er aðaltegund Alzheimerssjúkdómsins. Dýriðmódel af SporadicAlzheimer-sjúkdómurgæti verið framkallað með ýmsum aðferðum eins oginndælingu D-galaktósa eða -amyloid, gjöf AlCl í maga3,og svo framvegis(Bagheri o.fl., 2011; Gao o.fl., 2015; Justin Thenmozhi o.fl., 2017). Að auki ersamtengingarlíkan af Alzheimerssjúkdómi framkallað af langtíma kviðarholiinndæling á D-galaktósa ásamt eggjastokkatöku hefur einnig verið rannsökuð mikið (Liuo.fl., 2010; Zhao o.fl., 2012). Til þess að sýna fram á mikilvægi beinþynningar ogAlzheimerssjúkdómur, það er nauðsynlegt að koma á líkaninu af beinþynningu samanlagtmeð Alzheimerssjúkdóm til að rannsaka algengar aðferðir lyfja ábeinþynningu ogAlzheimer sjúkdómurase.
Cistanche tubulosa(Schenk) Wight er sníkjudýr planta, sem er aðallega dreift í eyðimörkum í Norðvestur Kína. Þurrkaðir safaríkur stilkar afCistanche tubulosa(CT) eru notuð sem frægt tonic lyf sem kallast Cistanches Herba með kínverska nafninu Roucongrong í kínversku lyfjaskránni (2015). Það hefur verið heiðrað sem „ginseng eyðimerkuranna“ og er mikið notað til meðferðar á verkjum í mitti og hné, ófrjósemi kvenna og hægðatregðu í hefðbundinni kínverskri læknisfræði (Jiang og Tu, 2009). Helstu virku innihaldsefni CT eru fenýletanóíð glýkósíð (PhGs), echinacoside (ECH) ogakteósíð(ACT) eru dæmigerð efnasambönd í PhGs (Morikawa o.fl., 2014). Sérstaklega eru ECH og ACT venjulega valin sem merki fyrir gæðaeftirlit í CT vegna mikils innihalds þeirra og ýmissa lyfjafræðilegra virkni eins og áhrifa taugaverndar, beinaverndar,
andoxunarefni, öldrun og bætt náms- og minnisgetu (Wang o.fl.,2012; Li o.fl., 2016). Hins vegar áhrif ECH og ACT á beinþynninguásamtAlzheimer-sjúkdómurhafði ekki enn verið rannsakað saman í rottulíkani.Þannig var tilgangur þessarar rannsóknar að koma á fót rottulíkani af beinþynningu samanlagtmeð Alzheimerssjúkdóm og kanna áhrif afechinacosideog acteoside á þessusamhliða líkan, til að veita tilraunagögn til frekari rannsókna ásameindakerfi echinacoside eða acteoside í eftirfarandi rannsóknum.
cistanche pharma sérstaktfyrirAD
2. Efniviður og aðferðir
2.1. Dýr
Áttatíu 8- vikna Wistar kvenkyns rottur (vottorðsnúmer: SCXK 2018-0006), sem vógu 180~200 g, voru keyptar frá kínversk-bresku SIPPR/BK Lab. Animal Ltd (Shanghai, Kína) og alin upp í tilraunamiðstöð lyfjadýra í lyfjaháskóla Kína.
2.2. Efni og hvarfefni
Klórhýdrat, penicillín G natríum, D-galaktósi, álklóríðhexahýdrat, estradíólvalerat, dónepezíl HCl voru keypt frá Aladdin Industrial Corporation (Shanghai, Kína).Echinacoside(HPLC 94 prósent) var fengin frá Chengdu Wecistanche Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, Kína).Akteósíð(HPLC 98 prósent) var keypt frá Baoji Herbest Bio-Tech Co., Ltd. (Baoji, Kína). Beinsértækur basískur fosfatasi (BALP), tartrat-ónæmur sýrufosfatasi (TRAP), súperoxíð dismutasi (SOD), malónaldehýð (MDA), asetýlkólínesterasa (AChE) og kólínasetýltransferasa (ChAT) ensímtengd ónæmissogandi prófun (ELISA) voru sett. keypt af Shanghai Enzyme-tengt Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, Kína). Alhliða vefjafesta var fengin fráChengdu Wecistanche Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, Kína).
echinacoside
2.3. Dýralíkön og meðferðir
Allar dýratilraunir voru heimilaðar og undir eftirliti dýrasiðanefndar Kína lyfjaháskólans. Rottunum var haldið með 12 klst ljós/myrkri hringrás í hitastýrðu herbergi (22±2 gráður) og þær gefnar með venjulegu kornfóðri og kranavatni.
Eftir aðlögun í eina viku var beinþynningarlíkaninu náð með skurðaðgerð á eggjastokkum (French o.fl., 2008). Eftir að aðgerðinni lauk var pensilín G natríum stráð á sárasauminn í eitt skipti til að koma í veg fyrir sýkingu. Rottunum var síðan gefið venjulega í þrjár vikur. Samkvæmt tilvísuninni (Hua o.fl., 2007; Alawdi o.fl., 2017) er líkanið afAlzheimer-sjúkdómurgæti verið framkallað með langtíma inndælingu D-galaktósa í kviðarhol ásamt eggjastokkatöku eða langtímagjöf AlCl3 í maga. Til að kanna hagkvæmni líkansins um beinþynningu ásamt Alzheimerssjúkdómi, þrír líkanhópar eggjastokkanáms (OVX hópur), sýndaraðgerð með inndælingu í kviðarholi af 150 mg/kg/d D-galaktósa og gjöf 30 mg/kg/d AlCl3 í maga. (D hópur), eggjastokkanám með inndælingu í kviðarholi af 150 mg/kg/d D-galaktósa og gjöf í maga á 30 mg/kg/d AlCl3 (OVX plús D hópur) voru sett í þessari rannsókn.
Þess vegna var rottum skipt af handahófi í átta hópa (n{{0}} fyrir hvern hóp) eftir 3 vikur og meðhöndlaðar til inntöku með lyfjum í 8 vikur: Sýndarhópur; OVX hópur; D hópur; OVX plús D hópur; estradíólvalerat meðferðarhópur (EV hópur, OVX plús D plús 0,6 mg/kg/d estradíólvalerat); donepezil HCl meðferðarhópur (DPZ hópur, OVX plús D plús 0,8 mg/kg/d donepezil HCl);echinacosidemeðferðarhópur (ECH hópur, OVX plús D plús 90 mg/kg/d echinacoside);akteósíðmeðferðarhópur (ACT hópur, OVX plús D plús 90 mg/kg/d akteósíð). Samkvæmt meginreglunni um jafngilda umbreytingu skammta manna og rotta og skammtinum frá skyldri tilvísun (Li o.fl., 2013; Gao o.fl., 2014) voru skammtar lyfjameðferðarhópa í þessari rannsókn teknir upp.
Líkamsþyngd hverrar rottu var mæld í hverri viku. Eftir alla meðferðina með lyfjum sem stóðu í 8 vikur var Morris Water Maze (MWM) próf í 6 daga fyrst gert. Eftir það var 6 rottum úr hverjum hópi fórnað til að uppskera efnin. Rotturnar voru svæfðar með inndælingu í kviðarholi með 3,0 ml/kg 10 prósenta klóralhýdrati og blóði var safnað úr ósæð í kviðarholi. Blóðið var sett við stofuhita til að storkna og skilið í skilvindu við 3500 r/mín í 10 mín. Sermiið var safnað í 1,5 ml skilvinduglas (NEST Biotechnology) og geymt við -80 gráðu þar til það var notað í lífefnafræðilegar prófanir. Þá var legi, lærlegg, sköflungi og heilavef safnað saman. Legið var notað við vefjagreiningu. Hægri lærleggurinn var notaður fyrir Micro-CT og histomorphometry, í sömu röð. Réttur sköflungur var notaður fyrir líffræðilega prófið. Hippocampus sem safnað var á ísskápnum var notað til lífefnafræðilegra prófana. Eftir það voru hinar þrjár rotturnar úr hverjum hópi geymdar úr hjartanu með saltvatni og alhliða vefjafestingarefni til að uppskera heilann fyrir vefjagreiningu.
2.4. Morris Water Maze (MWM) próf
Rottur voru látnar fara í staðbundið viðmiðunarnám og minnispróf í MWM prófinu eftir 8 vikna íhlutun. MWM prófið var framkvæmt eftir þeim aðferðum sem áður var greint frá (Morris, 1984; Gao o.fl., 2016). Í stuttu máli, 5 daga samfleytt með fjórum tilraunum á dag, voru rottur þjálfaðar í að nota margs konar sjónrænar vísbendingar staðsettar á laugarveggnum til að finna falinn vettvang á kafi (þvermál 11 cm, hæð 29 cm) í hringlaga laug (þvermál 130 cm, hæð 50 cm) fyllt með óeitruðu kolefnisbleklituðu vatni. Laugin var ímyndaða skipt í fjóra fjórðunga og fjórar upphafsstöður voru staðsettar á gatnamótum fjórðunganna. Pallurinn var staðsettur í miðju eins fjórðunganna og var staðan stöðug meðan á tilraununum stóð. Í hverri tilraun voru rottur settar af handahófi á völdum stöðum, snúið að laugarveggnum. Hverri tilraun var hætt þegar rottan var komin á pallinn eða eftir 60 sekúndur og tíminn sem liðinn var skráður sem leynd á flótta. Rottum sem náðu ekki pallinum var vísað á hann. Eftir hverja tilraun með falinn pall var rottan áfram á pallinum í 10 sek. Meðal leynitími fjögurra tilrauna á dag var reiknaður út sem þjálfunarniðurstöður. Á 6. degi voru allar rotturnar látnar fara í könnunarpróf þar sem þær syntu í 60 sekúndur í lauginni án palls. Yfirferðartímar á staðsetningu pallsins og ferðatími í markfjórðungnum voru skráðir sem lokaniðurstöður. Fylgst var með rottum með myndavél sem var fest í loftinu beint fyrir ofan laugina og allar tilraunir voru skráðar og greindar með MORRIS MAZE forritinu sem útvegað er af Beijing zhongshidichuang science and technology development Co., Ltd. (Peking, Kína)
2.5. Lífefnafræðileg próf með ELISA
Samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda um ELISA pökkum voru beinsérhæfð basísk fosfatasa (BALP) virkni, tartrat ónæm sýrufosfatasa (TRAP) virkni, súperoxíð dismutasa (SOD) virkni og malondialdehýð (MDA) innihald í sermi prófuð af BioTek Synergy 2 fjölstillingar örplötulesari (BioTek, Bandaríkin). Hippocampus vefirnir úr hverjum hópi voru þvegnir með PBS (0.01 M, pH 7.4) til að fjarlægja blóðið eða óhreinindi sem eftir voru á vefjayfirborðinu. Hippocampus vefirnir á annarri hliðinni voru vigtaðir og síðan skornir í eins litla bita og hægt var. Hippocampus vefirnir voru einsleitir í samræmi við hlutfallið 1: 9 (vefjaþyngd: PBS rúmmál). Einsleitt efni var skilið í skilvindu við 4 gráður, 3000 sn/mín í 15 mín. Yfirvatninu var safnað og þynnt til að mæla próteinstyrkinn með BCA aðferðinni. Virkni asetýlkólínesterasa (AChE), virkni kólínasetýltransferasa (ChAT), virkni súperoxíð dismutasa (SOD) og malondialdehýðs (MDA) innihald í vefjum hippocampus voru síðan prófuð með ELISA aðferðum.
2.6. Hippocampus histomorphometry
Heilavefirnir (n=3/hópur) voru festir í alhliða vefjafestingarefni. Heilavefssýnin voru síðan þvegin, þurrkuð með hallandi etanóli, felld inn með paraffínvaxi og sneið í 5 míkrónála hluta. Hlutarnir voru litaðir með hematoxýlíni og eósíni (HE). Eftir það voru kórónuhlutar heilavefjanna myndaðir með öfugum flúrljómunarsmásjá (Nikon, Japan). Sérstaklega komu fram formfræðilegar breytingar CA1, CA2, CA3 og DG í hippocampus.
2.7. Vefjamæling og formgreining á legi
Valin leg (n{{0}}/hópur) var festur í alhliða vefjafestingu. Legvefssýnin voru síðan þvegin, afvötnuð með hallandi etanóli, sett inn í paraffínvax og sneið í þversnið sem er 5 μm. Hlutarnir voru litaðir með hematoxýlíni og eósíni (HE). Þverskurðir legsins voru skoðaðir og myndaðir. Fimm sjónsvið voru valin af handahófi, þvermál legs þversniðs og þykkt legslímhúðarþekju var síðan mæld með Image-Pro Plus 6.0 hugbúnaði. Fjöldi legkirtla í lamina propria var einnig talinn.
2.8. Ör-CT
Valið hægra lærlegg (n=3/hópur) var skannað í stöðu þar sem fjarlægð hlutarins að upptökum var 121 mm og fjarlægð myndavélarinnar að upptökum 171 mm með SkyScan 1176 micro X- geislasneiðmyndafræði (ör-CT) skanni (Bruker, Þýskalandi). Fjarlæga vaxtarplatan var valin sem viðmiðunaryfirborð. Með fjarlægð 1 mm undir viðmiðunaryfirborðinu var 1,8 mm þykkt svæði valið sem rúmmál sem vekur áhuga (VOI, 100 lög). Grátónamyndirnar sem fengust voru með pixlastærð 17,76 μm frá beinauppbyggingu (65 kV, 385 μA). Hálfsjálfvirk útlínuaðferð var notuð til að velja æðar úr barkarbeini. Beinar 3D mælingaraðferðir voru notaðar til að meta prósentu af beinrúmmáli (BV/TV), beinyfirborðsþéttleika (BS/TV), trabecular aðskilnað (Tb. Sp), trabecular number (Tb. N), trabecular þykkt (Tb. Th) , byggingarlíkanvísitölu (SMI), trabecular pattern factor (Tb. Pd) og meðalbeinþéttni (meðal BMD) fyrir sama VOI með því að notaCTGreiningarforrit (Bruker, Þýskalandi). Þrívíddarsýn á VOI með því að nota aðlagandi flutningsreiknirit var gert með CTvol hugbúnaðinum (Bruker, Þýskalandi).
cistanche plöntuþykkni
2.9. Vefjafræði beina
Valið hægra lærlegg (n=3/hópur) var fest í alhliða vefjafestingarefni og síðan afkalkað í 10 prósenta lausn af EDTA-2Na í 3 vikur. Afkalkuðu sýnin voru þvegin, afvötnuð með hallandi etanóli, felld inn með paraffínvaxi og sneið í 5 míkrómetra langsum hluta. Hlutarnir voru litaðir með hematoxýlíni og eósíni (HE). Lengdarhlutar lærleggsins voru ljósmyndaðir. Beinvefsbygging hvers hóps, sérstaklega beinskipan, var fylgst með.
2.10. Lífeðlisfræðileg próf
Hægri sköflungur (n=4/hópur) sem valdir voru af handahófi voru metnir fyrir þriggja punkta beygjuprófið með því að nota alhliða prófunarvél (SHIMADZU, Japan). Þvermál þessara sýna var mæld með þvermáli á bilinu 2.16-2.38 mm (d). Sýnið var síðan sett á tvær burðarþverstangir með 25 mm (L) fjarlægð á milli teinanna tveggja og lífeðlisfræðileg sveigja sýnisins var upp á við. Hleðslustangur hleðslunnar var staðsettur í miðju sýnisins og lækkaði með jöfnum hraða 1,5 mm/mín þar til sýnishornið brotnaði. Krafturinn (F) og tilfærslugögnin voru sjálfkrafa skráð í tölvu sem var tengd við prófunarvélina og álags-aflögunarferillinn var teiknaður samtímis. Gildin fyrir hámarksálag (N) og orkugleypni (mJ) voru skráð með efnisprófunarhugbúnaðinum TRAPEZIUM X á sama tíma. Gildi hámarksspennu (MPa) voru reiknuð út samkvæmt eftirfarandi formúlu: Streita (σ)=beygjukraftur (M) / Snitstuðull (Z)=(8×L×F) / ( π×d3 )
2.11. tölfræðigreining
Niðurstöður líkanahópanna voru bornar saman við Sham hópinn og niðurstöður hópanna sem fengu lyf voru bornar saman við OVX plús D hópinn. Gögnin voru greind með einstefnu ANOVA og fylgt eftir með margfeldissamanburðarprófi Bonferroni með Graph Pad Prism 5.0 hugbúnaði. Gögnin voru gefin upp sem meðaltal ± SD og P gildi undir 0.05 voru talin tölfræðilega marktæk.
myricetinogcistanche
