Hluti 1:Acteoside vinnur gegn interleukin-1 -framkölluðum niðurbrotsferlum með mótun mítógenvirkja próteinkínasa og NFκB frumuboðaleið

Acteoside vinnur gegn interleukin-1 -framkölluðum niðurbrotsferlum með mótun mítógenvirkja próteinkínasa og NFκB frumuboðaleið

HyangI Lim ,1 Do Kyung Kim ,1 Tae-Hyeon Kim ,1 Kyeong-Rok Kang ,1 Jeong-Yeon Seo ,1,2 Seung Sik Cho ,3 Younghee Yun ,4,5 Ye-yong Choi ,4,5 Jungtae Leem ,4,5 Hyoun-Woo Kim ,6 Geon-Ung Jo ,6

Chan-Jin Oh ,6 Deuk-Sil Oh ,6 Hong-Sung Chun ,2 og Jae-Sung Kim 1

Tengiliður:joanna.jia@wecistanche.com

1Institute of Dental Science, Chosun University, Gwangju 61452, Lýðveldið Kóreu

2Departments of Biomedical Science, Chosun University, Gwangju 61452, Lýðveldið Kóreu

3Department of Biomedicine, Health & Life Convergence Sciences, BK21 Four, College of Pharmacy, Mokpo National University,

Jeonnam 58554, Lýðveldið Kóreu

4Chung-Yeon Medical Institute, Gwangju 61949, Kóreu

5Research and Development Institute, CY Pharma Co., Seoul 06224, Lýðveldið Kóreu

6Jeollanamdo Forest Resources Institute, Naju, Jeollanamdo, 58213, Lýðveldið Kóreu

Senda skal bréfaskriftum til Jae-Sung Kim; js_kim@chosun.ac.kr

Móttekið 2. júlí 2020; Endurskoðað 15. febrúar 2021; Samþykkt 6. mars 2021; Birt 25. mars 2021

Akademískur ritstjóri: Joël R. Drevet

Höfundarréttur © 2021 HyangI Lim o.fl. Þetta er grein með opnum aðgangi sem dreift er undir CreativeCommonsAttributionLicense,

sem leyfir ótakmarkaða notkun, dreifingu,og endurgerð á hvaða miðli sem er, að því gefnu að rétt sé vitnað í upprunalega verkið.

cistanche getur meðhöndlað nýrnasjúkdóm og bætt nýrnastarfsemi

Slitgigt (OA) er algengasti hrörnunarsjúkdómurinn í liðum með langvarandi liðverkjum sem orsakast af versnandi hrörnun liðbrjósks í liðum liðanna.Akteósíð, kaffeóýlfenýletanóíð glýkósíð, hefur ýmsa líffræðilega virkni eins og örverueyðandi, bólgueyðandi, krabbameinslyf, andoxunarefni, frumuverndandi og taugaverndandi áhrif. Ennfremur inntöku áakteósíðí stórum skömmtum veldur ekki eiturverkunum á erfðaefni. Þess vegna er markmið þessarar rannsóknar að sannreyna niðurbrotsáhrifin afakteósíðgegn slitgigt og boðefnaferli hennar gegn niðurbroti.Akteósíðminnkaði ekki lífhæfi músafibroblast L929 frumna sem notaðar voru sem eðlilegar frumur og frumfrumur rotta.Akteósíðvirkaði á móti IL-1 -framkallaðri próteóglýkantapi í chondrocytes og liðbrjóski með því að bæla tjáningu og virkjun brjóskrýrnandi ensíma eins og matrix metalloproteinase- (MMP-) 13, MMP-1 og MMP{{ 6}}. Ennfremur,akteósíðbæla tjáningu bólgumiðla eins og framkallanlegs nituroxíðsyntasa, sýklóoxýgenasa-2, nituroxíðs og prostaglandíns E2 í frumfrumu rottum sem fengu meðferð með IL-1. Í kjölfarið minnkaði tjáning bólgueyðandi cýtókína umakteósíðí frumfrumu rottum sem eru meðhöndlaðir með IL-1. Þar að auki, akteósíð bældi ekki aðeins fosfórun á mítógenvirkjuðum próteinkínasa í aðal rottufrumur sem voru meðhöndlaðar með IL-1 heldur einnig flutning NFκB frá frumu til kjarna með bælingu á fosfórun þess. Inntaka 5 og 10 mg/kg akteósíðs dró úr stigvaxandi hrörnun liðbrjósks í slitgigtarmúsamódelinu sem myndast við óstöðugleika í miðlægum meniscus. Niðurstöður okkar benda til þess að akteósíð sé vænlegt hugsanlegt andoxunarefni eða viðbót til að draga úr eða koma í veg fyrir versnandi hrörnun liðbrjósks.

Vinsamlega smelltu hér að hluta 2

1. Inngangur

Slitgigt (OA) er algengasti hrörnunarsjúkdómurinn í liðum með langvarandi liðverkjum sem orsakast af versnandi hrörnun liðbrjósks í liðum liðanna [1].

Vegna hækkunar á lífslíkum er áætlað að algengi OA með skertri hreyfigetu og langvinnum liðverkjum af völdum versnandi hrörnunar liðbrjósks í liðliðaliðum sé 18 prósent og 9,6 prósent hjá konum eftir tíðahvörf og hjá körlum, í sömu röð [2 ]. Þrátt fyrir að algengi OA aukist árlega á heimsvísu er meinalífeðlisfræðileg orsök OA enn óþekkt. Það getur stafað af mjög flóknum og fjölþættum áhættuþáttum eins og öldrun, kyni, erfðafræðilegum erfðum, áverka á liðum og alvarlegu vélrænu álagi á liðum. Ennfremur eru taugasjúkdómafræðileg tengsl milli versnandi hrörnunar liðbrjósks og þróunar langvinnra liðverkja óþekkt [3]. Þess vegna er markmið klínískrar meðferðar hjá sjúklingum með OA að viðhalda hreyfigetu líkamans og vélrænni liðstarfsemi með því að lina langvarandi liðverki, með því að nota lyfjafræðilegar og ólyfjafræðilegar aðferðir og liðskiptaaðgerðir. Krafan um þróun skilvirkrar inngrips eða viðbóta, með langtíma líffræðilegu öryggi, til að koma í veg fyrir eða draga úr OA til að viðhalda lífsgæðum með viðhaldi á vélrænni liðvirkni hjá öldruðum eykst.

Eins og sýnt er á mynd 1,akteósíð(CAS nr. 61276-17-3; C29H36O15) er kaffeóýlfenýletanóíð glýkósíð einangrað úr nokkrum jurtaplöntum eins og Verbascum chlorides [4], Buddleja globosa [5] og Plantago australis [6]. Acteoide hefur ýmsa líffræðilega virkni eins og örverueyðandi [5], bólgueyðandi [7], krabbameinslyf [8], andoxunarlyf [9], frumuverndandi [9] og taugaverndandi áhrif [10]. Ennfremur inntöku áakteósíðí stórum skömmtum veldur ekki eiturverkunum á erfðaefni[11].

Þess vegna settum við fram þá tilgátu að akteósíð með bólgueyðandi líffræðilegt öryggi hafi stöðvunaráhrif sem tengjast vörn liðbrjósks gegn versnandi hrörnun liðbrjósks með bælingu á niðurbrotsþáttum eins og bólgueyðandi frumudrepum, bólgueyðandi ensímmiðlum og brjósklosandi brjóskliðamiðlum. . Þess vegna var markmið þessarar rannsóknar að kannaacteoside-framkallað varnarvirkandi áhrif og frumuboðsleið þess bæði in vitro, með því að nota frumfrumur einangraðar úr liðbrjóski í hnélið rottu, og in vivo, með því að nota OA dýralíkan sem myndast við skurðaðgerð óstöðugleika á miðlægum meniscus í hnélið músa.

akteósíðinncistanchedósbætafriðhelgi

2. Aðferðir

2.1. Frumumenning.

Aðal rottufrumur voru einangruð úr liðbrjóski rottu (5-dagsgamla; Sprague–Dawley) hnéliðum, í samræmi við siðareglur (CIA-CUC2019-A0027) samþykktar af stofnuninni Dýraumönnunar- og notkunarnefnd Chosun háskólans, Gwangju, Kóreu. Einangruðum aðal rottufrumur var viðhaldið í Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) ásamt 10 prósenta nautgripafóstursermi (FBS) (Life Technologies) , Grand Island, NY, Bandaríkjunum), sýklalyf (50U/mL penicillín og 50ug/mL streptomycin), og 50ug/mL askorbínsýra. Venjuleg músa fibroblast L-929 frumulína var keypt frá American Type Culture Collection (ATCC). Samkvæmt leiðbeiningunum frá ATCC voru L-929 frumur ræktaðar í lágmarks nauðsynlegum miðli Eagle, sem innihélt 10 prósent FBS, og voru ræktaðar í rakaðri hitakassa við 37 gráður með 5 prósent CO2.

2.2. Frumulífvænleikapróf.

Dímetýl þíasólýl dífenýl tetrasólíum salt (MTT) prófið var gert til að meta hæfileika músa fibroblast frumulínu L929 frumna sem notaðar eru sem venjuleg fruma og aðal rottufrumur meðhöndlaðar með akteósíði. Í stuttu máli voru L929 frumur og aðal rottufrumur ræktaðar með frumuþéttleika 8×105 frumur/ml í ræktunarplötum í 24 klst og síðan meðhöndluð með 2,5, 5, 10, 25, 50 og 100μMakteósíðí 24 klst. Eftir meðferð með MTT lausn voru bæði L929 frumur og chondrocytes ræktaðar frekar í 4 klst. Eftir ræktun voru mynduðu MTT kristallarnir suspendaðir algjörlega í dímetýlsúlfoxíði og mældir með tilliti til gleypni við 570nm með litrófsmæli (Epoch microplate spectrophotometer, BioTek®, Winooski, VT, USA) til að meta lífvænleika frumna.

2.3. Cell Live/Dead Assay.

Frumulifun var framkvæmd með því að nota Cell Live/Dead prófunarbúnað (Molecular Probes, Carlsbad, CA, USA), sem er samsett úr grænu kalsín-AM til að merkja lifandi frumur (með grænu flúrljómun) og etídíum homodimer-1 til að merkja dauðar frumur frumur (með rauðu flúrljómun). Í stuttu máli voru bæði L929 frumur og frumur rottufrumur ræktaðar við frumuþéttleika 8×105 frumur/ml á hólfaglasum (Nunc® Lab-Tek® Chamber Slide™ system; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) í 24 klst. og síðan meðhöndluð með 50 og 100μM akteósíð í 24 klst. Eftir ræktun var frumulifunarpróf gerð samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Eftir það voru litaðar frumur myndaðir með flúrljómunarsmásjá (Eclipse TE200; Nikon Instruments, Melville, NY).

2.4. Dímetýlmetýlenblátt (DMMB) próf.

DMMB próf var gert til að meta breytingu á próteóglýkaninnihaldi í frumfrumur rotta sem voru meðhöndlaðar með akteósíði í 21 dag í nærveru eða fjarveru IL-1. Til að viðhalda eiginleikum frumkorna rotta í 21 dag voru frumfrumur rottu (2×106 frumur) sviflausnar í 1mL af 1,2 prósent algínati og síðan hjúpaðar með því að dreypa frumu/algínat sviflausninni í lausn af 105mM CaCl2. Aðal rottufrumur sem hjúpaðar voru í algínati voru ræktaðar í 24 klst. í DMEM/F12 (innihalda 10% FBS, 50U/mL penicillín, 50ug/mL streptomycin og 50ug/mL askorbínsýru) og síðan aðlagaðar í 24h/mL með DMEM mini-insúlín-transferrín-selen (mini-ITS) og 50ug/mL askorbínsýra. Í kjölfarið voru chondrocytes meðhöndlaðir með 50 eða 100μMakteósíðí nærveru eða fjarveru 1ng/ml IL-1 í 21 dag. Á degi 21 var aðal rottufrumur safnað fyrir mat á próteóglýkaninnihaldi með því að nota DMMB prófið, eins og áður hefur verið lýst [12]. Að auki, til að mæla innihald próteóglýkans í hverri frumu og meta fjölgun frumkorna rotta, var frumufjöldi mældur með DNA prófun með PicoGreen (Molecular Probes, Carlsbad, CA), samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. tilvist eða fjarvera 10ng/ml IL-1 í 7 daga. Í lok ræktunartímabilsins var sýnunum safnað og fest í 4 prósent paraformaldehýði í 72 klst. til vefjagreiningar.

2.6. Vefjafræðileg greining.

Vefjafræðileg greining með safranín-O og hröðum grænum litun var framkvæmd til að sannreyna tap á próteóglýkani í liðbrjóski sem var meðhöndlað með 100μM akteósíði í nærveru eða fjarveru 10ng/ml IL-1 í 7 daga. Í stuttu máli voru föst liðbrjósksýni kalkuð í etýlendíamíntetraediksýru og síðan sett í parafin. Síðan voru tilbúnu paraffin blokkirnar sem innihéldu liðbrjósk skornar í röð í 5μm þykkt og settar á glærur. Safranin-O og hröð græn litun voru í kjölfarið gerðar til að meta próteóglýkan tap í liðbrjóskgrunninu. Að auki var hematoxýlín og eósín litun gerð til að fylgjast með almennri formgerð liðbrjósksins.

2.7. Western Blotting.

Western blotting var gerð til að kanna tjáningu niðurbrotsþátta þar á meðal MMP-13, MMP-1, MMP-3, framkallanleg nituroxíðsyntasa (iNOS) og sýklóoxýgenasa-2 (COX) -2) og breyting á frumuboðsameindum eins og mítógenvirkjaðri próteinkínasa og kjarnaþátt-kappa B (NFκB). Í stuttu máli voru frumfrumur rotta meðhöndlaðar með 50 eða 100μM akteósíði við eða án 10ng/ml IL-1 í 24 klst. Eftir það voru frumfrumur úr rottum safnað með skilvindu og voru leystar með því að nota leysistuðara (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Að auki, til að sannreyna kjarnaflutning NFκB, voru frumfrumur rotta meðhöndlaðar með 50 eða 100μM akteósíði í nærveru eða fjarveru 10ng/mL IL-1 í 24 klst. Eftir það voru frumu- og kjarnabrot dregin út með því að nota NE-PER™ kjarna- og frumuútdráttarhvarfefni (Thermo Sci- entific, Rockford, IL, USA) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Styrkur heildarpróteins sem dregin var út úr frumfrumu rottum var ákvarðaður með því að nota bicinchoninsýru próteinprófunarsett (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Að auki var skilyrta miðlinum safnað til að greina magn brjóskrýrnandi ensíma sem seytt er út úr chondrocytes. Jafnt magn af próteini og skilyrt miðli var rafskorið á natríumdódecýlsúlfat-pólýakrýlamíð gel rafdrætti (SDS-PAGE) og síðan flutt yfir á nítrósellulósahimnur. Síðan var Western blotting framkvæmd með því að nota miðuð aðal mótefni gegn MMP-13, MMP-1, MMP-3, iNOS, COX-2, fosfó-ERK1/2, samtals -ERK1/2, fosfó-p38, heildar-p38, fosfó-JNK, heildar JNK, fosfó-NFκB, heildar NFκB, - aktín og lamin B. Ónæmisvirkar hljómsveitir voru sýndar með því að nota aukið efnaljómunarkerfi (Thermo Sci- entific, Rockford , IL, USA) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda og síðan myndað af Microchemi tæki (DNR Bioimaging Systems, Jerúsalem, Ísrael).

2.8. Quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR) og Quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR).

Aðal rottufrumur voru meðhöndlaðir með 50 eða 100μMakteósíðí nærveru eða fjarveru 10ng/mL IL-1 í 24 klst. Eftir það var heildar-RNA einangrað úr aðal rottufrumur með því að nota TRIzol hvarfefni (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Heildarstyrkur RNA var mældur með NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Rockford, IL, Bandaríkjunum). Til að búa til cDNA var 1 ug RNA öfugt umritað með því að nota ThermoScript öfugt umritun-PCR kerfi (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. qPCR af cDNA var framkvæmt með því að nota 2× TOPsimple™ DyeMIX-Taq (Enzynomics, Seoul, Lýðveldið Kóreu) og tiltekna primera á TaKaRa PCR Thermal Cycler tæki (TaKaRa Bio Inc., Shiga, Japan). Eftir það voru PCR afurðirnar rafskornar á agarósa hlaupi til að ákvarða tjáningarstig markgena. Glýseraldehýð 3-fosfat dehýdrógenasi (GAPDH) var notað sem innræn viðmiðun. Að auki, fyrir qRT-PCR, var cDNA magnað með því að nota Eco™ rauntíma PCR kerfi (illumine Inc., San Diego, CA, Bandaríkjunum). -Actin var notað sem innræn stjórn. Röð frumrana sem notuð eru í qPCR og qRT-PCR eru teknar saman í töflu 1 og 2, í sömu röð.

2.9. Gelatín Zymography.

Gelatínsímmyndataka var gerð til að meta virkjun MMP í frumfrumur rotta. Í stuttu máli voru frumfrumur úr rottum meðhöndlaðar með 50 eða 100μM akteósíði í nærveru eða fjarveru 10ng/mL IL-1 í 24 klst. Eftir það var jafnt rúmmál af skilyrt miðli rafskorið á 10 prósent pólýakrýlamíð hlaupi samfjölliðað með 0,2 prósent (1mg/ml) gelatíni úr svínahúð. Eftir rafdrætti var hlaupið ræktað í zymogram endurnáttunarbuffer (50mM Tris–HCl (pH7,6), 10mM CaCl2, 50mM NaCl og 0,05 prósent Brij-35) við 37 gráður í 72 klst. Eftir endurgerð MMPs var hlaupið litað með 0,1 prósent Coomassie Brilliant Blue R250. Gelatínhreinsandi bönd komu í ljós sem skýrar bönd á bakgrunni sem var jafnlitað ljósbláum og síðan myndað með stafrænni myndavél.

2.10. Mæling á nituroxíði (NO).

Aðal rottufrumur voru meðhöndlaðir með 50 eða 100μM akteósíði í nærveru eða fjarveru 10ng/mL IL-1 í 24 klst. Síðan var 50μL af skilyrta miðlinum látið hvarfast við 50μL hvor af súlfanílamíði og N-1-naftýletýlendíamíndíhýdróklóríði. Frásog var síðan mæld við 540nm bylgjulengd með litrófsmæli (Epoch Spectrophotometer, BioTek, Winooski, VT, Bandaríkjunum).

2.11. Prostaglandín E2 (PGE2) próf.

Aðal rottufrumur voru meðhöndlaðir með 50 eða 100μMakteósíðí nærveru eða fjarveru 10ng/mL IL-1 í 24 klst. Eftir það var styrkur PGE2 mældur með því að nota PGE2 færibreytugreiningarsett (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda.

2.12. Cytokine fylki.

Aðal rottufrumur voru meðhöndlaðir með 50μM akteósíði í nærveru eða fjarveru 10ng/mL IL-1 í 24 klst. Eftir það voru heildarprótein dregin út og magngreind eins og áður hefur verið lýst [13]. Næst var gerð frumuefnafylking til að kanna breytingu á frumumyndun, samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda (RayBiotech, Inc., Norcross, GA, Bandaríkjunum).

2.13. Nuclear Translocation Assay.

Aðal rottufrumur voru meðhöndlaðir með 50 og 100 ug/mLakteósíðí viðurvist 10ng/mL IL-1 . Eftir 30 mínútur voru frumfrumur rotta festar með 1 prósent paraformaldehýði, gegndræpnar í 0,2 prósent Triton X-100 og þvegnar ítarlega með fosfatbúruðu saltvatni. Ósértæk merki voru læst með venjulegu geitasermi. Eftir marga þvott voru kondrocyturnar ræktaðar með kanínum and-NFκB mótefnum og fylgt eftir með ræktun með FITC-tengdu geita-anti-kanínu IgG (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) yfir nótt við 4 gráður. Eftir það voru litaðar frumur teknar af myndum með því að nota leysisfókus skannasmásjárkerfi (Leica Microsystems, Wetzlar, Þýskalandi) í Gwangju útibúi Kóreu Basic Science Institute (Gwangju, Lýðveldinu Kóreu).

2.14. Kynslóð slitgigtardýra.

Til að mynda slitgigt dýr, var miðlægi meniscus (DMM) óstöðugleiki í hnéliðum BALB/c músa (meðallíkamsþyngd 19:3±0:5g) í samræmi við IACUC leiðbeiningar (CIACUC{{4} }A0029). Dýrin af völdum OA voru meðhöndluð til inntöku með 5 og 10 mg/kg akteósíði uppleyst í 5 prósent etanóli (tilraunahópur; n =5) eða burðarefni (5 prósent etanól) (DMM hópur; n =5) á hverjum tíma annan dag í 8 vikur. Í lok ræktunartímabilsins voru hnéliðir krufnir og festir með því að nota 5 prósent paraformaldehýð í 7 daga til að framkvæma vefjafræðilegt mat. Eftir safranín-O og hraða græna litun voru sýndir vefir úr liðbrjóski skoðaðir í samræmi við Mankin einkunn [14, 15].

2.15. Tölfræðigreining.

Tilraunagögnin eru sett fram sem meðaltal ± staðalfrávik og voru borin saman með því að nota dreifnigreiningu, fylgt eftir með margfeldissamanburði (Tukey's próf) með SPSS hugbúnaðarútgáfu 25 (IBM Corp.) Öll gögnin, nema dýrarannsóknin, voru fengin úr þremur sjálfstæðum tilraunum.

akteósíðinncistanche

3. Úrslit

3.1. Acteoside hefur ekki áhrif á L929 frumu- og frumfrumulífveru rotta.

Mústrefjafrumulínan L929 sem notuð var sem eðlilegar frumur var meðhöndluð með 2,5, 5, 10, 25, 50 og 100μM akteósíði í 24 klst. Eftir það var MTT prófið framkvæmt til að meta frumueiturhrif akteósíðs á L929 frumum. Eins og sýnt er á mynd 2(a), var hlutfallslegur lífvænleiki L929 frumna ákvarðaður vera 94:8±8 prósent, 93:6±7 prósent, 100 ± 5 prósent, 103:9± 5 prósent, 126:1±8 prósent , og 122:7±4 prósent við 2,5, 5, 10, 25, 50 og 100μM akteósíð, í sömu röð, samanborið við samanburðarhóp (100:02 ± 3 prósent). Ennfremur, til að sannreyna frumueiturhrif akteósíðs á frumfrumur rotta, var MTT prófið framkvæmt eins og sýnt er á mynd 2(b). Lífhæfir frumfrumur rotta sem voru meðhöndlaðir með 2,5, 5, 10, 25, 50 og 100μM akteósíði voru ákvarðaðir sem 114 ± 4 prósent, 117:8±6 prósent, 123:9± 5 prósent, 132:6±4 prósent, 153:1± 7 prósent og 142:1±6 prósent, í sömu röð, samanborið við samanburðarhóp (100:4±5 prósent). Ennfremur, til að staðfesta áhrif akteósíðs á lífvænleika bæði L929 frumna og frumfruma rotta, var frumu lifandi/dauð próf gerð eins og sýnt er á mynd 2(c). Fjöldi dauðra frumna litaðra sem rauða flúrljómun jókst ekki fyrir bæði L929 frumur og frumfrumur rottu sem voru meðhöndlaðar með 50 og 100μM akteósíði í 24 klst. Þessar upplýsingar sýndu stöðugt fram á að skilgreindur skammtur afakteósíðhafði ekki áhrif á lífvænleika L929 frumna og frumfruma rottufruma. Þannig voru 50 μM akteósíð og 100 μM akteósíð, sem eru óeitruð skammtar í bæði L929 frumum og aðal rottufrumur, notaðir til að sannreyna varnarvirkandi áhrif þess in vitro rannsóknir með því að nota aðal rottufrumur.

3.2. Acteoside vinnur gegn IL-1 -Valdu próteóglýkantapi í frumfrumur rotta.

Aðal rottufrumur sem eru innbyggðar í algínatperlur voru meðhöndlaðar með 50 og 100μM akteósíði í nærveru eða fjarveru 1ng/mL IL- 1 í 21 dag. Eftir það var DMMB próf gerð til að meta breytinguna á próteóglýkaninnihaldi eins og sýnt er á mynd 3(a). Hlutfallslegt próteóglýkaninnihald var ákvarðað sem 88:3±18:1 prósent og 86:8±16:3 prósent í aðal rottufrumur sem voru meðhöndlaðar með 50 og 100μM akteósíði, í sömu röð, samanborið við samanburðarhóp (103:8± 32:3 prósent). Þrátt fyrir að hlutfallslegt próteóglýkaninnihald hafi minnkað vegna akteósíðs, voru þessar niðurstöður ekki marktækar. Hins vegar lækkaði hlutfallslegt próteóglýkaninnihald marktækt um 37:1± 14:7 prósent í aðal rottufrumur sem voru meðhöndlaðar með 1ng/mL IL-1, en 50 og 100μM akteósíð dró verulega úr próteóglýkaninnihaldinu um ±125:7 prósent og 64 ± 14:5 prósent, í sömu röð, í viðurvist 1ng/mL IL-1. Í kjölfarið, til að sannreyna hvort akteósíð bæli niður IL-1 - framkallað próteóglýkan tap, var liðbrjósk sem skorið var úr hnéliðum rottu meðhöndlað með 100μM akteósíði í nærveru eða fjarveru 10ng/mL IL-1 í 7 daga. Eftir það var vefjafræðilegt mat með H&E litun og safranín-O og hröðum grænum litun gerð eins og sýnt er á mynd 3(b). Formfræðilega breytingin sást ekki með H&E litun; hins vegar, safranín-O og hröð græn litun leiddi í ljós að próteóglýkan litað sem rauði liturinn breyttist ekki í liðbrjóskunum sem voru meðhöndlaðir með 100μM akteósíði samanborið við það sem var í samanburði. Hins vegar var alvarlegt próteóglýkan tap framkallað af 10ng/mLIL-1 í liðbrjóski og 100μM akteósíð bældi marktækt próteóglýkan tap í liðbrjóski sem var meðhöndlað með 10ng/ml IL- 1. Samanlagt sýna þessar upplýsingar stöðugt að akteósíð hefur afbrotsáhrif sem hægir á hrörnun liðbrjósks með því að vinna gegn IL-1 -framkölluðu próteóglýkantapi.

akteósíðinncistanchehafa góð áhrif áandoxunarefni

3.3. Acteoside hefur varnarvirkandi áhrif sem bælir MMP tjáningu og virkjun í frumfrumu rottum sem eru meðhöndlaðir með IL-1.

Til að kanna hvort akteósíð-framkallað varnarleysisáhrif tengist bælingu á MMP tjáningu og virkjun, voru frumfrumur rotta meðhöndlaðar með 50 og 100μM akteósíði í nærveru eða fjarveru 10ng/mL IL-1 í 24 klst. Í kjölfarið voru breytingar á MMPs rannsakaðar. Eins og sýnt er á mynd 4(a), þó að tjáning brjóskrýrnandi ensíma eins og MMP-13, MMP-1 og MMP-3 hafi verið marktæk aukin í skilyrtum miðlum frumrottna chondrocytes meðhöndlaðar með 10ng/mL IL-1, það var minnkað umakteósíðá skammtaháðan hátt. Ennfremur leiddu niðurstöður bæði qPCR (Mynd 4(b)) og qRT-PCR (Mynd 4(c)) í ljós að IL-1 jók marktækt mRNA gildi MMP eins og MMP-13, MMP{ {6}} og MMP-3 í frumfrumu rottum. Hins vegar lækkuðu þau skammtaháð í frumfrumu rottum sem fengu meðferð með 50 og 100μM akteósíði. Þar að auki, 50 og 100μM akteósíð bældu á áhrifaríkan hátt virkjun MMPs í frumfrumur rotta sem voru meðhöndlaðar með 10ng/mL IL-1 (Mynd 4(d)). Samanlagt benda þessar upplýsingar stöðugt til þess að akteósíð hafi andoxunaráhrif sem bælir tjáningu og virkjun brjóskrýrnandi ensíma.