Oleanolic Acid Nanofibers dempað agnir af völdum oxunarálags í keratínfrumum

Vinsamlegast hafðu samband við oscar.xiao@wecistanche.com til að fá frekari upplýsingar

Ágrip:Svifryk í lofti (PM) er málmgrýti af vísbendingum um loftmengun, og það er einnig aðalþátturinn sem veldur oxunarálagi í húðinni. Oleanolic acid (OA), náttúrulegt terpenoid efnasamband, hamlaði á áhrifaríkan hátt öldrun húðar af völdum PM; hins vegar hefur OA lélega vatnsleysni og frásog húðar, sem takmarka notkun þess í lyfjum og snyrtivörum. Markmið þessarar rannsóknar var að undirbúa oleanolic acid nanofrefjar (OAnf) og meta áhrif OA og OAnf í PM-meðhöndlaðar keratínfrumur. Niðurstöðurnar sýndu að (OA uppleyst í uppleyst í dímetýlsúlfoxíði (DMSO) dregur úr PM-framkallaðri viðbrögðum súrefnistegunda offramleiðslu, streituvirkjaðan próteinkínasa/Jun-amínóendakínasa (SAPK/JNK) virkjun og tjáningu bólgu og húð. -öldrunartengd prótein. Að auki bætti nanófrefjaferli OA vatnsleysni OA meira en 99,000-falt í gegn með því að breyta eðlisefnafræðilegum eiginleikum þess, þar á meðal aukningu yfirborðsflatarmáls, minnkun kornastærðar, myndlaus umbreyting og myndun vetnisbindinga með hjálparefnum. Getu OAnf í gegnum húð var stöðugt meira en 10-falt meiri en OA. Þar að auki, þegar það var leyst upp í PBS, sýndi OAnf yfirburða andoxunarefni, bólgueyðandi og öldrun húðarvirkni í PM -meðhöndlaðar keratínfrumur en OA. Að lokum benda niðurstöður okkar til þess að OAnf gæti verið staðbundið andoxunarefni til að draga úr húðvandamálum af völdum PM.

Leitarorð:svifryk; óleanólsýra; nalfrefjar; andoxunarefni; bólgueyðandi; gegn öldrun

1. Inngangur

Loftmengun er nú lýðheilsuvandamál um allan heim. Með þróun tækninnar safnast ýmis skaðleg efni, þar á meðal lofttegundir, kemísk efni, líffræðileg mengunarefni og agnir, upp í andrúmsloftið og hafa alvarleg áhrif á líf og heilsu fólks. Svifryk (PM), vísbending um loftmengun, er samsetning ýmissa lífrænna efnasambanda, líffræðilegra efna og agna kolefniskjarna[1]. PM fer inn í lungun með innöndun og fer inn í blóðrásina sem veldur kerfislægri heilsuáhættu eins og líffærabólgu og hjarta- og æðasjúkdómum og öndunarfærasjúkdómum [2,3]. Að auki getur PM farið í gegnum húðhindrunina og safnast fyrir í hársekkjunum og jafnvel farið inn í húðina við endurtekna snertingu; því hefur of mikil útsetning á húð fyrir PM verið tengd ytri öldrun húðar, breytingum á litarefni, ofnæmishúðbólgu, unglingabólur og psoriasis [2,4]. Langvarandi snerting við PM veldur offramleiðslu hvarfgjarnra súrefnistegunda (ROS) í keratínfrumum, sem kallar fram nokkrar boðleiðir, þar á meðal frumudfjóluferilinn, mítógenvirkjaðan próteinkínasa (MAPK) ferla og bólgu. Aukin tjáning sýklóxýgenasa-2 (COX-2), æxlisdrepsþáttar- (TNF-a) og interleukíns-1 (IL-1) sést almennt í keratínfrumum sem verða fyrir PM. Þar að auki virkjar PM einnig matrix metalloproteinasa (MMPs) og leiðir til taps á mýkt í húð og öldrun [5].

Vinsamlegast smelltu hér til að vita meira

Náttúruvörur hafa lengi verið notaðar sem áhrifarík snyrtivöruefni. Oleano-lic acid (OA, 3 -hydroxyolean-12-en-28-oicacid), fimm hringa triterpenoid efnasamband, er víða til staðar í plöntum, ávöxtum og grænmeti [6]. OA er vel þekkt fyrir verndandi áhrif á lifur eins og að draga úr bráðum lifrarskemmdum af völdum efna og bandvefs/skorpulifur í langvinnum lifrarsjúkdómum [6,7]. Að auki hafa fyrri rannsóknir leitt í ljós að OA hefur andoxunarefni, krabbameinslyf, bólgueyðandi, sykursýkislyf og örverueyðandi áhrif [8]Kim o.fl. leiddi í ljós að OA gæti dregið úr tjáningu bólgueyðandi cýtókíns (TNF-a,IL-6) og húðöldrunarpróteins (MP-1) í PM-meðhöndluðum keratínfrumum [9]. Hins vegar gera eðlisefnafræðilegir eiginleikar OA erfitt fyrir að leysast upp í vatni, sem takmarkar notkun þess í lyfjum, matvælum og snyrtivörum.

Samsetningarhönnun lyfjagjafar eins og nanóberar sem byggjast á fjölliðum, li. posome og nanófrefjar eru venjulega notaðar til að bæta eðlisefnafræðilega eiginleika virku innihaldsefnanna. Innihald virkra innihaldsefna með hjálparefnum í þessum lyfjaformum gæti aukið vatnsleysni þeirra og frásog húðar og dregið úr hugsanlegum eiturverkunum og ertingu á húðinni. Meðal þeirra eru nanófrefjar að koma fram nanóstærð samsetning, með stórt yfirborð, lítinn þéttleika og mikið svitarúmmál, og eru nú þegar mikið notaðar í líflæknisfræði, sem getur dregið úr rúmmáli lyfja til inntöku, aukið stöðugleika virkra innihaldsefna, stjórnað losa, bæta aðgengi og búa til gervi vefi [10]. Rafspinning er algeng tækni sem notuð er til að framleiða nanófrefjar og er mjög samhæf við fjöldaframleiðslu [1]. Þess vegna getur undirbúningur nanófrefja með því að nota rafspinningarferlið samtímis bætt aðgengi. virkni og framleiðsluhagkvæmni virks efnis með lélega vatnsleysni. Pólývínýlpýrrólídón (PVPK90) og 2-hýdroxýprópýl- -sýklódextrín (HPBCD) eru FDA-samþykkt efnasambönd til að leysa upp og gefa vatnsfælin virkt lyfjaefni í mönnum.cistanche kólesterólFyrri rannsóknir sýndu að nanófrefjar sem voru unnar með HPBCD og PVPK90 bættu marktækt vatnsleysni og skarpskyggni í húð resveratrols [12] og plai olíu [13]. Þannig var markmið þessarar rannsóknar að nota PVPK90 og HPBCD sem sendingarbera til að undirbúa oleanolic acid nanofrefjar (OAnf) og meta áhrif OA og OAnf í PM-meðhöndlaðar keratínfrumur.

Cistanche getur gegn öldrun

Markmið þessarar rannsóknar var að meta líffræðileg áhrif OA leyst upp í DMSO í skemmdum á keratínfrumum af völdum PM. Til að vinna bug á lélegri vatnsleysni OA, notuðum við PVPK90 og HPBCD sem flutningsefni til að búa til oleanolic acid nanofribs (OAnf) með rafspinningarferli og ákváðum síðan breytingar á eðlisefnafræðilegum eiginleikum milli hrár OA og OAnf til að skýra betur vatnsleysni og húðgengni. Til að bera saman líffræðileg áhrif eftir nanófrefjaferli OA var PM-framkallað keratínfrumnaskemmdalíkan notað til að meta andoxunar-, bólgueyðandi og öldrunarvirkni OAnf og OA.

2. Efni og aðferðir

2.1.Efni

Óleanólsýruhýdrat (OA) var keypt frá Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. (Tókýó, Japan). Polyvinyl pyrrolidon (Luviskol" K90 Powder, PVP) var keypt frá Wei Ming Pharmaceutical Mfg. Co., Ltd. Taipei, Taívan). Hýdroxýprópýl-beta-sýklódextrín (HPBCD) var fengið frá Zibo Qianhui (Zibo, Kína). Metanól og dímetýl súlfoxíð (DMSO) var keypt frá Aencore Chemical (Surrey Hills, Ástralíu) Öll kemísk efni eða hvarfefni fyrir frumuræktun voru líffræðilega og önnur efni til eðlisefnafræðilegrar ákvörðunar voru af hágæða vökvaskiljun (HPLC).

2.2.Frumulífvænleikapróf

Ákvörðun frumulífvænleika virks efnis er algeng aðferð sem notuð er til að velja rétta styrkleikasvið fyrir virk efni til að meta líffræðilega virkni þeirra. HaCaT keratínfrumur voru keyptar frá Istituto Zooprofilattico Sperimen-tale della Lombardia edell'Emilia Romagna (Brescia, Ítalía). HaCaT frumur voru ræktaðar í DMEM (Himedia Laboratories, Mumbai, Indlandi) sem innihélt 10 prósent nautgripafóstursermi (Hazelton Product, Denver, PA, USA) með 1 prósent penicillin-streptomycin (Biological Indus-tries, Connecticut, NE) , Bandaríkjunum), og HaCaT frumur voru ræktaðar í hitakassa (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Bandaríkjunum) með skilyrðum stillt á 37 gráður með 5 prósent COz. Til að undirbúa prófunarsýnin voru OA og OAnf leyst upp í DMSO og PBS, hvor um sig, og síðan var hvert sýni þynnt í DMEM án nautgripasermis fósturs til að ákvarða lífvænleika frumna. HaCaT frumunum var sáð í 96-brunnsplötur með þéttleikanum 1 × 104 frumur/100 μL/brunn í 24 klst. Ræktunarmiðillinn var síðan fjarlægður og frumurnar voru meðhöndlaðar með mismunandi styrkleika OA og OAnf á bilinu 5 til 80 uM í sermifríu DMEM í 24 klst. Þegar greiningin var gerð var meðferðarmiðillinn fjarlægður og 150 μL af 0,5 mg/ml MTT lausn var bætt í hvern brunn. Eftir 3 klst ræktun var MTT lausnin fjarlægð og fjólubláu formazan kristallarnir í hverri brunn voru leystir upp í 100 ul af DMSO. Gleypið við 550 nm hverrar holu var síðan mælt með því að nota örplötulitrófsljósmæli (BioTek uQuant, Winoski, VT, USA). Lífvænleiki frumunnar var reiknaður út með eftirfarandi formúlu:

2.3.Ákvörðun á innihaldi hvarfgjarnra súrefnistegunda (ROS).

PM (Standard Reference Material, SRMB1649b) var keypt frá National Institute of Standards and Technology. Þessari vöru var safnað 1976 og 197 í Washington, DC Made. Alls 10 mg/mL af PM var dreift í PBS og síðan hljóðbeitt í 10 mínútur fyrir notkun. Alls voru 1 × 10 plús HaCaT keratínfrumur ræktaðar í 96-brunnsplötum í 24 klst við 37 gráður og 5 prósent CO2 aðstæður. Frumur voru meðhöndlaðar með mismunandi styrk af OA í DMSO, OA í PBS og OAnf í PBS í 24 klst. Síðan voru þau ræktuð með 20 uM díklórtíhýdróflúoresceín díasetati (DCFH-DA; Sigma, Tókýó, Japan) lausn í 30 mínútur. Því næst var 50 ug/cm² PM bætt í hvern brunn og ræktað í 1 klst. Eftir það voru frumur þvegnar tvisvar með PBS, og flúrljómunarstyrkur hvers sýnis var greindur með því að nota flúrljómandi plötulesara (örvun: 485 nm; losun: 528 nm) (BioTek, Winooski, VI, USA). Eftirfarandi jafna var notuð til að reikna út hömlunarprósentu af ROS framleiðsla:

2.4. Western Blot greining

Alls voru 4 × 105 HaCaT keratínfrumur ræktaðar í 6-brunnsplötum í 24 klst. Frumur voru síðan meðhöndlaðar með OA eða OAnf í sermifríum miðli í 24 klst. fylgt eftir með því að bæta við PM. Eftir ýmsa tímapunkta voru frumur ljósaðar með RIPAlysis biðminni (Merck Millipore, Burlington, MA, USA), síðan skilið í skilvindu við 12,000 snúninga á mínútu í 10 mínútur. BCA próteingreiningarsett (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Bandaríkjunum) var notað til að ákvarða próteinstyrk. Síðan voru próteinin aðskilin með natríumdódesýlsúlfat-pólýakrýlamíð gel rafdrætti (SDS-PAGE) og síðan þeytt á pólývínýlíden tvíflúoríð (PVDF) himna (Merck Millipore). Himnur voru stíflaðar í 1 klst og skolaðar með Tris-bufferuðu saltvatni ( TBS) með 1 prósent Tween-20. Himnur voru ræktaðar með frummótefnum við 4 gráður yfir nótt. Aðalmótefnin sem notuð voru í þessari rannsókn voru meðal annars sýklóoxýgenasa-2 (COX-2),matrix metalloproteinasi-9 (MMP-9), vefjahemli málmpro-teinasa-1 (TIMP-1), streituvirkjaður próteinkínasi/Jun-amino-terminal kínasi (SAPK/JNK)(Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA),GAPDH(Santa Cruz Bi-otechnology, Dallas,TX, USA), fylki metalloproteinasi-1 (MMP-1) (Proteintech Group, Rosemont, IL, Bandaríkjunum), p380, utanfrumu-stýrðir próteinkínasar (ERK), og kjarnaþáttur kappa-léttkeðju- efla virkjaðar B frumur (NF-kB) (Merck Millipore, Burlington, MA, Bandaríkjunum). Því næst var auka mótefnum bætt við í 1 klst við stofuhita og brugðist við með auknum efnafræðilegum minescence hvarfefnum (ECL; Thermo Fisher Scientific). Mótefni gegn GAPDH voru notuð sem innra eftirlit. Tjáning hvers próteins var greind með Touch Imager (e-BLOT; Shanghai, Kína) og tjáningin var magngreind með ImageJ.

2.5. Undirbúningur olíusýru nanófrefja (OAnf)

OAnfs voru rafspunnin með mismunandi hlutföllum OA:PVP:HBPCD (1:8:5,1:8:10 og 1:8:20). Rafspunna lausnin var útbúin sem hér segir: 25 mg af OA var leyst upp í 5 ml af metanóli og HPBCD var bætt við og hrært með segulhræru til að fá tæra lausn; síðan var PVPK90 strax bætt við og hrært í blöndunni í 1 klst.cistanche deserticola aukaverkanirNanótrefjurnar voru ofnar með FES-COS rafsnúningsbúnaði (Falco Tech Enterprise Co., Taipei, Taívan) við eftirfarandi skilyrði: 10 ml sprautu með nál með innra þvermál 0. 22 mm var notað fyrir rafsnúning; flæðishraðinn var stilltur á 0,2 ml/klst.; beitt spenna var stillt á 12 KV; fjarlægð oddsins var 10 cm. Eftir rafspunaferlið var nanófrefjunum safnað með álpappír. Nýgerðu nanófrefjarnar voru settar í lokaðan plastpoka og geymdar í rakaheldu íláti.

2.6.High-performance vökvaskiljun (HPLC) Greining á óleanólsýru

HPLC greiningarkerfið (LaChrom Elite L{{0}}, Hitachi, Tókýó, Japan) samanstóð af L-2130 dælu, L-2200 sjálfvirkri sýnatökutæki og L{{3 }} útfjólubláa skynjari (UV-vis). Greiningardálkurinn var Mightysil RP-18 GP dálkur (250×4,6 mm innd.,5 um). Hreyfanlegur fasi var samsettur úr metanóli og 0,1 prósenta ísediksýrulausn í föstu hlutfalli (95:5; w/v). Flæðishraði farsímafasans var 1 ml/mín og greiningarbylgjulengd UV skynjarans var stillt á 215 nm. Frásogstoppurinn fyrir óleanólsýru kom fram eftir 7,5 mín. Kvörðunarferill óleanólsýru sýndi góða línulega （r =0.999） á bilinu 0.01-100 ug/mL.

2.7. Formgerð, trefjaþvermál og kornastærðarmæling á OAnf

Mismunandi sýni af nanófrefjum voru húðuð með platínu með jónahúðara (E{{0}}, HITACH, Tókýó, Japan); ástandið var stillt á 10 mA 120 s síðar. Formgerð og lögun hvers sýnis var skoðuð með rafeindasmásjá (Hitachi S4700 Hitachi, Tókýó, Japan). Þvermál hvers sýnis var reiknað út með mynd j hugbúnaði. Zetasizer 3000HS greiningartæki (Malvern, Worcestershire, Bretlandi) var notað til að mæla kornastærð OAnf. Kornastærð OA og OAnf var mæld við styrkleikann 1 mg/mL og 0,1 mg/mL, í sömu röð.cistanche skammtur redditAð auki sáum við einnig einsleitni formgerðar OAnf eftir að hafa verið leyst upp í vatni með rafeindasmásjá (TEM,JEM{{0}}EXII tæki, JEOL Co., Tokyo, Japan). Prófunarsýnið var stillt á 1 ug/mL af OA í afjónuðu vatni og síðan dreypt í koparnetið og síðan var 0,5 prósent (w/v) fosfówolframsýru strax dreypt. Eftir þurrkun var hvert sýni sett á TEM til athugunar.

2.8. Lyfjahleðsla og hjúpun skilvirkni OAnf

Það er mjög mikilvægt að ákvarða lyfjahleðslu og hjúpun skilvirkni afhendingarkerfisins til að meta árangur lyfjaferlisins. Lyfjahleðslan var reiknuð út sem hlutfall af ákvörðuðu innihaldi og fræðilegu innihaldi OA sem er í OA nanófrefjunum. Til að ákvarða lyfjahleðslu var 100 μL af hverju sýni bætt út í 900 μL af metanóli og OA styrkurinn var þar sem CoA er styrkur OA frá OAnf, WoA er fræðilegt magn OA sem bætt er við, VoAnf er rúmmál OAnf lausnar.

Skilvirkni hjúpunar gefur til kynna hvort nanófrefjar hafi tekist að hjúpa virku efnasamböndin. OAnf sýni voru leyst upp í afjónuðu vatni og var bætt í miðflótta síunartækin (Microcon YM-10, Millipore, Billerica, MA, USA), og síðan skilið í skilvindu við 12,00 snúninga á mínútu í 10 mínútur með því að kæliskilvindan (Centrifuge 5430R, Eppendorf, Hamborg, Þýskalandi). Hjúpaði hlutinn var geymdur í efri túpunni og óhyljaða hlutanum var safnað úr neðri túpunni vegna mismunar á mólþunga. Magn óhjúpaðs OA var greint með áðurnefndri HPLC aðferð. Eftirfarandi jafna var notuð til að reikna út hjúpun skilvirkni:

þar sem AoA er fræðilegt magn OA (fengið úr fóðrunarskilyrðum) sem er fellt inn í nanófrefjarnar og Aunentrapped OA er magn OA sem ekki er hjúpað.

2.9.Vatnsleysni OAnf

Hrá OA (1 mg) og mismunandi hlutfallssamsetningar af OAnf (sem innihalda jafngildi 1 mg af oleanolic sýru) voru leyst upp í 1 ml afjónuðu vatni, í sömu röð, og síðan hljóðbeitt undir úthljóðstæki (Branson 5510, Emerson Electric, St. Louis, MO, Bandaríkjunum) í 20 mín. Hvert sýni var síað í gegnum 0,45 um himnu (Pall Corporation, Washington, NY, USA) og þynnt 10-falt. Þynntu lausnirnar voru greindar með HPLC og staðalferillinn var notaður til að ákvarða magn óleanólsýru til að bera saman vatnsleysni þeirra.

2.10. Ákvörðun kristallaðrar til formlausrar umbreytingar

Röntgendiffractómetía (Siemens D500, Karlsruhe, Þýskalandi) var notuð til að greina kristallað form OA, hjálparefna og OAnf. Greiningin var gerð með nikkel-síuðri Cu-Ka geislun, með 40 kV spennu og 25 mA straum. Skannahraði var 1 gráðu/mín og svið skannaðra horna var frá 5 gráður til 50 gráður. 2.11. Millisameindavíxlverkun milli OA og hjálparefna

Fourier umbreytingu innrauð litrófsgreining (FTIR) og 1HKjarnasegulómun (1H NMR) eru venjulega notuð til að staðfesta millisameindavíxlverkun virkra innihaldsefna og hjálparefna. Óleanólsýru, PVP, HPBCD og mismunandi hlutfallssamsetningum af OAnf var blandað saman við kalíumbrómíð (KBr) í rúmmálshlutfallinu 1:9 með mortéli og pressað í töflur. Hvert sýni var síðan greint með FTIR litrófsmælinum (Perkin-Elmer 200 litrófsmælir, Perkin-Elmer, Norwalk, CT USA). Skannasviðið var 400-4000 cm-4. Auk þess , hvert sýni var leyst upp í 0,8 ml af 99,8 prósent DMSO-dg (Merck, St.Louis, MO, USA) og greint með JEOL Alpha 400 litrófsmæli (Nihon Denshi Co., Tókýó, Japan).

2.12.Ex Vivo húðflæði olíusýru og nanófrefja hennar

Þessi tilraun var gerð í samræmi við staðlaða samskiptareglur European Cosmetic Toiletry and ilmvörusamtakanna (COLIPA). Franz dreifingarfrumukerfinu má skipta í glerílát í efra gjafahólfinu og neðra viðtakahólfinu. Alls 1,5 mL jafnalausn sem samanstendur af 0.14MNaCl,2mMK-HPO4, 0.4 mM KH2PO4 (pH7.4) var sett í viðtakahólfið og hrært með segulstöng við 600 sn.mín. tilrauninni. Nýtt hlífðarhúð úr svíni var fengið frá staðbundnum slátrara á markaðnum og geymt í kæli á tilraunatímabilinu. Hvert húðsýni var skorið í 2 cm × 2 cm bita og sett á milli hólfanna tveggja, með hornlaginu upp á við. Franz dreifingarfrumunni var haldið við 32 gráður með hringrásarvatnsbaði.cistanche þykkni kostirSíðan var 200 μL af 1 mg/ml af OA eða OAnf bætt við gjafahólfið í 1,2 eða 4 klst. Eftir það var svínaskinnið fjarlægt úr Franz-dreifingarfrumunni og hornlagið fékkst með því að líma 15 sinnum. Hvert leifar af húðsýni var hitað í 95 gráður með hitapúða og húðþekjan og húðhúðin voru aðskilin með því að nota skurðhníf. Hvert sýni var sökkt í metanól og hljóðblandað í 1 klst til að draga út OA og innihald óleanólsýru í hverju sýni var ákvarðað með HPLC aðferðinni. 2.13. Tölfræðigreining

Öll gögn voru sýnd sem meðaltal ± staðalfrávik (SD). Tölfræðilega marktektin milli mismunandi hópa var greind með dreifigreiningu (ANOVA) með Tukey's post hoc test.p<0.05 indicated="" statistical="" significance.="">

3.1. Óleanólsýra getur bælt bólgu, öldrun og ROS/MAPK boðleiðir í skemmdum á keratínfrumum af völdum PM

Til að finna rétta styrkleikasviðið fyrir mat á líffræðilegri virkni var frumudrepandi áhrif OA uppleyst í DMSO ákvörðuð í HaCaT keratínfrumum úr mönnum með því að nota MTT próf. Eins og sýnt er á mynd 1A, voru 40 og 80 μM af OA tengd 32 til 16 prósenta lífvænleika frumna. OA við minna en 20 μM voru enn með frumulifun yfir 85 prósent. Þessar niðurstöður gáfu til kynna að OA í styrknum 5-20 μM hafi engin frumudrepandi áhrif á HaCaT keratínfrumur úr mönnum (Mynd 1A). Í samræmi við það var OA rannsakað í styrknum 5-20 uM til að kanna andoxunar- og mengunarvirkni þess í skemmdum á keratínfrumum af völdum PM. Nýlega hafa margar rannsóknir sýnt fram á að PM er algengt loftmengunarefni sem veldur offramleiðslu ROS og í kjölfarið skemmdum á húðkerfinu með röð oxunarálags, þar á meðal lípíðperoxun, próteinkarbónýleringu og DNA stökkbreytingu [14-16]Eins og sýnt er í Mynd 1B, PM meðferð jók verulega ROS framleiðsluna samanborið við ómeðhöndlaða hópinn (bls<0.05).in contrast,="" pretreatment="" with="" oa="" effectively="" decreased="" pm-induced="" ros="" overproduction="" in="" a="" dose-dependent="" manner=""><0.05).there-fore, these="" results="" suggested="" that="" oa="" possessed="" antioxidant="" activity="" to="" prevent="" pm-induced="" oxidative="" stress="" by="" reducing="" the="" ros="" overproduction.="" in="" addition,="" ros="" overproduction="" after="" pm="" exposure="" can="" activate="" the="" phosphorylation="" of="" mapks="" proteins,="" including="" p-erk,="" p-p38,="" and="" p-jnk,="" triggering="" the="" protein="" expressions="" of="" inflammation="" and="" aging[17,18]the="" present="" study="" also="" found="" that="" pm="" treatment="" can="" increase="" the="" expression="" of="" inflam-matory="" proteins="" (cox-2="" and="" nf-kb),skin="" aging-related="" proteins="" (mp-1,mmp-9="" and="" timp-1),and="" phosphorylation="" of="" erk,jnk,="" and="" p38=""><0.05). our="" present="" results="" also="" demonstrated="" that="" oa="" at="" 10="" and="" 20="" um="" significantly="" inhibited="" the="" protein="" expression="" of="" nf-kb="" and="" cox-2="" when="" compared="" with="" the="" pm="" treatment="" group="" (p=""><0.05)(figure 1c)furthermore,="" oa="" pretreatment="" also="" effectively="" reversed="" pm-induced="" alteration="" on="" mmp-1="" and="" timp-1="" expression=""><0.05) but="" had="" no="" effect="" on="" mmp-9(figure="" 1d).="" we="" further="" de-termined="" the="" effects="" of="" oa="" treatment="" on="" phosphorylation="" of="" mapks="" during="" pm="" exposure,="" and="" our="" results="" indicated="" that="" oa="" could="" inhibit="" the="" phosphorylation="" of="" jnk=""><05), but="" had="" no="" effect="" on="" erk="" or="" p38="" (figure="" 1e).="" according="" to="" the="" above="" results,="" when="" dissolved="" in="" dmso,="" oa="" displayed="" good="" skin-protective="" activity="" and="" could="" ameliorate="" pm-induced="" ros="" overproduction,="" jnk="" activation,="" and="" inflammatory="" and="" skin-aging="" protein="" expression="" in="">

3.2. Oleanolic Acid Nanofibers jók vatnsleysni og húðgengni óunnar óleanólsýru með því að bæta eðlisefnafræðilega eiginleika

3.2.1.Yfirborðsformgerð olíusýru og nanófrefja hennar

Undir SEM athugun sýndi útlit HPBCD kúlulaga og gljúpt hjálparefni og stærð þess var um 20 til 50 μm (Mynd 2A). PVPK90 er hjálparefni með óreglulegum marghyrndum ögnum og kornastærð meira en 60 um (Mynd 2B) .Hrá óleanólsýra er óreglulega kringlótt kornduft með stærðinni 3-60 um. Mynd 2D-F sýnir meðalþvermál trefja mismunandi þyngdarhlutfalla óleanólsýru: HPBCD:PVPK90 voru 174,83±19,53nm, 219,23±18,93nm, og 403,17±32,99nm, í sömu röð. Það kom í ljós að hærra hlutfall af HPBCD (18 :20) leiddi til OAnf með stærra trefjaþvermál (tafla 1).

3.2.2.Agnastærð og formgerð OAnf endurbætt í vatni

Til að fylgjast með kornalögun og kornastærð OAnf (OA:PVP:HPBCD, 1:8:20) uppleyst í vatni sýndi myndin af OAnf undir rafeindasmásjánum (TEM) að óleanólsýruagnirnar væru kúlulaga og jafnt dreift í vatni (mynd 3). Kornastærðin var einnig staðfest með leysikornastærðargreiningartæki (tafla 2). Kornastærðir OA og OAnf voru 5079,50±384,87 nm og 302,37±11,91 nm, í sömu röð. Fjöldreifingarstuðull (PDI) OA og OAnf voru 1,63±0,21 og 0,32±0,02, í sömu röð. Þessar niðurstöður benda til þess að rafsnúningsferlið hafi í raun minnkað kornastærð OA með samræmdri agnadreifingu og leiddi til aukningar á yfirborðsflatarmáli.

3.2.3. Lyfjahleðsla, hjúpun og vatnsleysni olíusýru nanófrefja

Eins og sýnt er í töflu 3 voru hleðsluprósentur OA í mismunandi hlutföllum hjálparefna 72,36±10,45 prósent, 84,23±3,62 prósent og 98,19±4,82 prósent, í sömu röð. Niðurstöðurnar bentu til þess að hærra hlutfall HPBCD sýndi betri lyfjahleðsluáhrif. Hjúpun skilvirkni allra lyfjaformanna var meiri en 95 prósent, sem benti til þess að PVPK90 og HPBCD hjúpuðu OA á áhrifaríkan hátt. Auk þess var vatnsleysni OAnf með mismunandi hlutföllum hjálparefna 296,14±57,75 ug/mL, 395,87 ± 32 ug/mL. , og 998,7±58,32 ug/mL, í sömu röð.cistanche Genghis KhanÞessar niðurstöður sýndu að aukning á HPBCD í samsetningunni jók verulega vatnsleysni hrás OA. Aftur á móti var ekki hægt að ákvarða vatnsleysni óunnar OA vegna þess að það var undir greiningarmörkum (0.01 ug/mL) í HPLC aðferðinni. Þessi niðurstaða benti til þess að 1:8:20 OAnf hefði meira en 1000-falda aukningu á vatnsleysni miðað við óunnið OA. Þannig, í eftirfarandi rannsóknum, var 18:20 OAnf notað til að ákvarða líffræðilega virkni í PM-framkölluðum keratínfrumum skaða líkani.

3.2.4.Kristölluð breyting á óleanólsýru og nanófrefjum hennar

Röntgengeislunarmynstur (XRD) óunnar OA, hjálparefna og nanófrefja þess eru sýnd á mynd 4. Raw OA sýndi marga hástyrk einkennisbrotatoppa við skönnunarhornið 5 gráður -20 gráður, sem gefur til kynna að hrátt OA var kristallað efnasamband. Á hinn bóginn hafa dreifingarmynstur PVPK90 og HPBCD enga augljósa einkennisbrotstoppa. Þar að auki, fyrir hráan OA undir rafspinningarvinnslu, hurfu allir einkennandi dreifingartoppar hráa OA alveg, sem benti til þess að eðli hráefnisins. OA var umbreytt úr kristölluðu í myndlaust (Mynd 4). Samkvæmt þessum niðurstöðum gætum við ályktað að hrá óleanólsýra hafi tekist að hjúpa inn í HPBCD og hjúpað með PVPK90 eftir nanófrefjaferlið.

3.2.5.Vetnistengi milli sameindamyndunar milli olíusýru og hjálparefna

Millisameindavíxlverkun hráefnis OA og HPBCD við PVPK90 var ákvörðuð með FTIR litrófsgreiningu og niðurstöðurnar eru sýndar á mynd 5. FTIR litrófið sýndi greinilega frásog nokkurra efnafræðilegra starfrænna hópa af hráefni OA, þar á meðal frásogsband við 3463 cm{{ 3}} (——OH teygja titringur),1696 cm-1 (——C=O teygja titringur), og 1462 cm-l (—CHz teygja titringur)(Mynd 5). Þegar OA, PVPK90 og HPBCD voru blönduð til að mynda nanófrefjar breyttist frásog þessara efnafræðilegu virku hópa augljóslega í lægra frásog. Þessar niðurstöður bentu til víxlverkana milli sameinda vetnisbindinga milli OA og HPBCD við PVPK90. Að auki notaði þessi rannsókn einnig 'H NMR til að staðfesta millisameindavíxlverkun OA og hjálparefna. 1HNMR litróf hráefnis OA (Mynd 6C) sýndi karboxýlmerki við 812 ppm (H28), tvíbundnar róteindir við 85,15 ppm (H12), hýdroxýróteindamerki við 83,38 ppm (H3) og metýlróteindir (81 ppm). , HNMR litróf OA nanófrefja sýndi að karboxýlmerki OA hvarf og efnabreytingar á tvíbundnum, hýdroxý- og metýlróteindum voru augljóslega færðar upp á völlinn (mynd 6). Þessar niðurstöður sýndu fram á myndun millisameinda vetnistengja milli OA og hjálparefna, sem studdu árangursríka hjúpun OA með HPBCD og PVPK90.

3.2.6.In vitro húðflæði hráar óleanólsýru og nanófrefja hennar

Líffræðileg virkni staðbundinnar samsetningar veltur að mestu á frásogi húðarinnar. Húðgengnin á hráu OA og nanófrefjum þess voru ákvörðuð í ex vivo svínshúð. Eins og sýnt er á mynd 7, lægra innihald OA（<5 μg/cm2）was="" detected="" in="" the="" epidermis="" and="" dermis="" after="" 1,2,="" and="" 4h="" of="" topical="" administration,="" and="" these="" results="" also="" indicated="" that="" raw="" oa="" could="" not="" penetrate="" the="" skin="" in="" a="" time-dependent="" manner.="" the="" result="" showed="" that="" the="" skin="" absorption="" of="" raw="" oa="" was="" extremely="" poor.="" by="" contrast,="" the="" nanofiber="" formulation="" dramatically="" increased="" the="" content="" of="" oa="" in="" the="" epidermis="" and="" dermis="" with="" 19.63="" ug/cm2,31.56="" ug/cm2,and="" 45.27="" ug/cm2="" after="" 1,2,and="" 4h="" of="" topical="" administration,="" respectively.="" these="" results="" demonstrated="" that="" the="" oanf="" formulation="" significantly="" increased="" skin="" absorption="" when="" compared="" with="" the="" raw="" oa="" topical="" administration=""><>

3.3. Óleanólsýru nanótrefjar í styrk sem ekki var frumudrepandi höfðu betri virkni gegn mengunarefnum með því að bæta andoxunar-, bólgueyðandi og öldrunarvirkni

Svipað og OA leyst upp í DMSO, OAnf leyst upp í PBS við 40 uM og 80 uM minnkaði lífvænleika HaCaT frumna í 14,1 prósent og 5,6 prósent, í sömu röð (Mynd 8A). Þess vegna voru 10 uM af OAnf metin með tilliti til frekari andoxunar- og mengunarvarnarvirkni til að skilja hvort OA og nanófrefjar þess hafi getu til að hindra of mikla framleiðslu á ROS af völdum PM. Mynd 8B sýnir að OAnf við 10 uM minnkaði sérstaklega PM-framkallaða ROS offramleiðslu. Við reiknuðum einnig út hraða hömlunar á ROS framleiðslu til að bera saman andoxunarvirkni milli PBS-uppleysts OA og OAnf. Tíu míkrómolar OA í PBS leiddu til 28,3 prósenta hömlunar á ROS framleiðslu og OAnf náði 97,6 prósenta hömlun (Mynd 8B). Þessar niðurstöður bentu til þess að OAnf hefði betri andoxunarvirkni en OA í PBS í PM-völdum oxunarálagi í keratínfrumum. Að auki bárum við einnig saman bólgueyðandi virkni skemmda á keratínfrumum af völdum PM. Formeðferð með hráu OA í PBS gat ekki hindrað PM-framkallaða próteintjáningu NF-KB og COX-2 Aftur á móti dró formeðferð með OAnf í PBS marktækt úr tjáningu NF. kB og COX-2 í frumum sem fengu PM (bls<0.05).these results="" supported="" that="" oanf="" in="" pbs="" had="" better="" anti-inflammatory="" activity="" than="" raw="" oa="" in="" pbs="" (figure="" 8c).then,="" we="" also="" compared="" their="" anti-skin-aging="" activity.="" pretreatment="" with="" oa="" in="" pbs="" had="" no="" effects="" on="" pm-induced="" mmp-1="" or="" timp-1="" alteration.="" however,="" oanf="" in="" pbs="" could="" reduce="" the="" expression="" of="" mmp-1="" and="" rescue="" the="" expression="" of="" timp-1="" when="" compared="" with="" the="" pm-induced="" keratinocytes="" damage="" group=""><0.05)(figure 8d).these="" findings="" indicated="" that="" oanf="" possessed="" better="" anti-skin-aging="" properties="" than="" raw="" oa="" in="" pbs.="" finally,="" we="" analyzed="" the="" phosphorylation="" of="" erk,="" jnk,="" and="" p38="" to="" confirm="" the="" regulation="" of="" mapks="" signaling.="" figure="" 8e="" showed="" that="" the="" treatment="" of="" raw="" oa="" in="" pbs="" could="" not="" downregulate="" pm-induced="" phosphorylation="" of="" these="" mapks="" protein.="" however,="" pretreatment="" with="" oanf="" only="" reduced="" pm-induced="" phospho-jnk="" (p-jnk)="" expression="" but="" had="" no="" effect="" on="" p-erk="" and="" p-p38="" (figure="" 8e).the="" percentage="" changes="" of="" protein="" expression="" induced="" by="" oa="" in="" dmso,="" oa="" in="" pbs,and="" oanf="" in="" pbs="" are="" summarized="" at="" table="" 4.="" oanf="" in="" pbs="" markedly="" reversed="" pm-induced="" protein="" alterations,="" which="" was="" barely="" observed="" in="" oa="" in="" the="" pbs="" group.="" in="" addition,="" the="" effects="" of="" oanf="" in="" pbs="" were="" comparable="" to="" the="" equivalent="" amount="" of="" oa="" in="" dmso,="" which="" indicated="" that="" the="" electrospinning="" process="" increased="" the="" water="" solubility="" of="" oa="" without="" altering="" its="" bioactivities.="" accordingly,="" oanf="" effectively="" inhibited="" the="" expressions="" of="" inflammatory="" proteins="" and="" skin-aging="" proteins="" and="" downregulated="" the="" mapks="" signaling="" pathway="" in="" pm-induced="" keratinocytes="">

4. Umræður

Undanfarið hefur eftirlit með styrk svifryks í lofti orðið einn mikilvægasti mælikvarðinn sem notaður er til að meta loftgæðavísitöluna. Húðin er stærsta ónæmislíffæri manna og of mikil útsetning fyrir PM gæti skaðað starfsemi húðarinnar. Jin o.fl. leiddi í ljós að ýmsar gerðir af PM héldust ekki aðeins í ytra hornlagi yfirhúðarinnar heldur slógu einnig inn í stratum spinosum og hársekkinn [14]. Ef það er útsett fyrir of mikilli PIA í langan tíma mun þetta valda truflun á húðhindrunum og er tengt mörgum húðsjúkdómum, svo sem ofnæmishúðbólgu, psoriasis, unglingabólur og öldrun [19,20]. Dijkhoff o.fl. skýrt sýnt að PM getur kallað fram utanaðkomandi og innræna ROS myndun, sem leiðir til framvindu oxunarálags, þar með talið lípíðperoxun, próteinoxun, truflun á starfsemi hvatbera, DNA skemmdum, bólguvirkjun og hröðun öldrunarferlis [15]. Samkvæmt því er að vinna gegn offramleiðslu ROS af völdum PM góð aðferð og fyrsti kosturinn til að koma í veg fyrir oxunarálagsskemmdir við ofásetningu á PM. Fyrri rannsóknir hafa einnig sýnt fram á að andoxunarefnismeðferðir, eins og diphlorethohydroxycarmalol [21], dieckol [22], Opuntia humifusa þykkni [23] og tertukirsuberjaþykkni [24] geta á áhrifaríkan hátt dregið úr PM-framkölluðum vanstarfsemi keratínfrumna. Niðurstöður okkar komust einnig að því að OA í DMSO getur dregið úr PM-völdum ROS umfram framleiðslu og komið í veg fyrir skemmdir frá PM. Að auki er NF-kB alls staðar nálægur og framkallanlegur umritunarþáttur sem stjórnar tjáningu bólgueyðandi próteina, eins og COX-2, sem gegna mikilvægu hlutverki í mörgum húðsjúkdómum. Niðurstöður okkar nefndu að OA geti dregið úr PM-framkölluðu virkjun NF-kB til að hindra tjáningu bólgupróteins COX-2[25]. Þar að auki getur virkjun MAPK merkja aukið tjáningu AP-1 og leiðir til umritunarreglugerðar þingmanna[18]. Í þessari rannsókn tókst OA að bæla tjáningu á húðöldrunarpróteini MP-1 og auka tjáningu á and-húðöldrunarpróteini TIMP-1 til að koma í veg fyrir PM-framkallaða öldrun keratínfrumna. Endurniðurstöður okkar sýndu einnig fram á að OA hamlaði fosfórýleringu JNK á áhrifaríkan hátt. Þess vegna getur OA hindrað PM-framkallaða húðbólgu og öldrun með því að minnka ROS/JNK boðleiðina í skemmdum á PM-framkölluðum keratínfrumum.

Eftir því sem við best vitum er slæmt vatnsleysni virku efnasambandanna tengt lágu aðgengi, sem takmarkar notkun þeirra í læknisfræði, matvælum og snyrtivöruiðnaði [26,27]. Það er vel þekkt að efnasambönd með lélega vatnsleysni hafa nokkra algenga eðlisefnafræðilega eiginleika, svo sem of stóra kornastærð, lægra yfirborð, fitusækna uppbyggingu og kristallað form [28]. Niðurstöður okkar gáfu einnig til kynna að hrátt OA hefði þessa eðlisefnafræðilegu eiginleika, þar á meðal stóra kornastærð (5079,50±384,87 nm), 3-60 um óreglulegt kornduft með lægra yfirborðsflatarmáli (Mynd 2C) og augljóst kristallað form. Þessar niðurstöður gáfu til kynna að vatnsleysni OA væri lægri en 0,01 ug/mL og gæti flokkast sem nánast óleysanlegt virkt efnasamband samkvæmt vatnsleysniflokkun Bandaríkjanna Pharmacopeia(USP)[29]. Ef ekki er hægt að leysa þessa galla væri starfsemi OA á húð mjög takmörkuð. Þessi rannsókn notaði PVPK90 og HPBCD með góðum árangri sem burðarefni með því að nota rafsnúningsferli til að undirbúa OAnf. Vatnsleysnibótin er aðalstuðullinn sem notaður er til að staðfesta ákjósanlegasta lyfjaformið og niðurstöður okkar sýndu að OA:PVPK90:HPBCD við 1:8:20 hafði besta vatnsleysni. Þetta gaf til kynna að OAnf jók í raun vatnsleysni hráefnis. OA fer eftir HPBCD hlutfallinu. Á sama hátt hafa fyrri rannsóknir einnig leitt í ljós að hærra hlutfall sýklódextríns eykur hjúpunargetu blöndunnar og leiðir til marktækrar aukningar á vatnsleysni og líffræðilegri virkni curcumins [30], resvera-trol [12], týmóls [31] , og dífenókónazól[32]. Þar að auki bar þessi rannsókn einnig saman eðlisefnafræðilega eiginleika óunnar OA og nanófrefja þess til að skýra hvernig vatnsleysni batnar OA.OA nanófrefja sem framleidd voru í þessari rannsókn voru allir þræðir með samræmda nanóstærð. Niðurstöður kornastærðargreiningar nefndu einnig að OAnf, blandað í vatni, sýndi agnir í nanóstærð með yfirburða einsleitni í dreifingu. Þessar niðurstöður bentu til þess að OAnf væri með stærra yfirborð en óunnið OA. Auk þess gæti myndun millisameinda vetnisbindinga milli virkra efnasambanda og burðarefna einnig stuðlað að því að bæta vatnsleysni. Litróf FTIR og HNMR OAnf sýndi fram á að hrátt OA var á áhrifaríkan hátt hjúpað inn í HPBCD og myndaði stöðuga nanófrefjabyggingu með PVPK90 með því að mynda vetnistengingu milli sameinda milli OA og HPBCD/PVPK90. Kristallaða formið umbreytt í myndlaust form virka efnasambandsins var einnig vísbending um batnandi vatnsleysni. XRD mynstur OAnf sýndi að kristallabygging hráefnis OA var umbreytt í myndlausa uppbyggingu eftir myndun nanófrefja. Þessi svipaða niðurstaða kom einnig fram í nokkrum virkum efnasamböndum sem voru hlaðnir í nanófrefjum [12,30]. Samanlagt bætti nanófrefjasamsetningin í raun vatnsleysni hráefnis OA með því að bæta eðlisefnafræðilega eiginleika, þar með talið kornastærðarminnkun, aukningu á yfirborði, myndun vetnisbindinga við burðarefni og myndlaus umbreyting.

Staðbundnar samsetningar sem innihalda andoxunarefni eru áhrifaríkar til að koma í húðþekju og húð til að vinna gegn oxunarálagi af völdum PM, bólgu og öldrun húðar [33]. Byggt á þekkingu á frásog húðar, er hornlagið sá hraðatakmarkandi þáttur sem takmarkar innsog í húð og frásog virkra efnasambanda, sem leiðir til lækkunar á líffræðilegri virkni [34]. Niðurstaðan frá in vitro gegnumgangi í húð benti til þess að OAnf færi í gegnum hornlag auðveldara og hraðar en óunnið OA og hélst í húðþekju og húð í miklu magni. Þessi niðurstaða staðfesti að OAnf getur í raun bætt upptöku á hráu OA í húð. Næst, til þess að ákvarða hvort OAnf hefði betri mengunarvarnarvirkni en óunnið OA, í þessari rannsókn var PM-framkallað keratínfrumnaskemmdalíkan notað til að bera saman líffræðilega virkni þeirra. Niðurstöður okkar sýndu að OAnf í PBS hafði betri mengunarvarnaráhrif en óunnið OA, þar á meðal minni ROS offramleiðslu, minni bólgupróteintjáningu (COX-2 og NF-kB) og húðöldrunarprótein (MP-1), aukin próteintjáning gegn öldrun húðar (TIMP-1) og minnkaði JNK fosfórun. Þess vegna gæti OAnf verið staðbundin samsetning sem andoxunarefni til að koma í veg fyrir skemmdir á keratínfrumum af völdum PM.

Í stuttu máli bætti OAnf eðlisefnafræðilega eiginleika þess til að leysa lélegan vatnsleysni hrás OA og bætti einnig verulega frásog hrás OA í húð. OAnf hafði betri andoxunar-, bólgueyðandi og öldrunarvirkni í skemmdum á keratínfrumum af völdum PM. Þar af leiðandi leggjum við til að hægt sé að nota OAnf sem húðvörur eða sem lyfjaform til að koma í veg fyrir húðskemmdir af völdum PM í framtíðinni.

Þessi grein er unnin úr Andoxunarefnum 2021, 10, 1411. https://doi.org/10.3390/antiox10091411 https://www.mdpi.com/journal/antioxidants