Lyktarlausir glútaþíon örnálar plástrar til að hvítna húðina

Ágrip:

Glútaþíon er náttúrulegt efni gegn öldrun sem kemur í veg fyrir oxun próteinþíóla úr hvarfgjörnum súrefnistegundum. Í lyfjaiðnaðinum hefur minnkað glútaþíon (GSH) verið mikið notað til að hvíta húðina vegna getu þess til að hamla týrósínasa.

Hins vegar takmarka lélegt gegndræpi þess og vond lykt notkun þess í húðnotkun. Hérna greinum við frá GSH-hlaðinni uppleysandi míkrónál (MN) plástur sem er útbúinn með hýalúrónsýru (HA) sem gerir kleift að auka gegndræpi yfir húðina og dregur úr vondri lykt af GSH. HA var valið til að útbúa lyktarlausar GSH lausnir og notaðar fyrir MN framleiðslu sem burðarefni GSH. GSH-hlaðnar MN (GSH-MN) fylkingar sem eru unnar úr MN-myndandi lausn sem innihélt allt að 10 prósent GSH sýndu góða mynsturslíku og viðeigandi vélræna eiginleika til að setja inn í húðina. GSH-MN með 17,4 prósent hleðslugetu leysast upp innan 10 mínútna eftir að þau eru sett í húð svína og losa hlaðna GSH án þess að vera oxað. Þessi nýja nálgun sameinar hagnýtar líffjölliður til að draga úr einkennandi GSH lykt og háþróaðri gjöf um húð sem byggist á MN tækni til að auka gegndræpi húðarinnar án sársauka. Við teljum að þessi tækni gæti aukið notkun GSH á mörgum snyrtivörusviðum.

Til að hvítna komumst við að því að Cistanche hefur mjög góð hvítandi áhrif og fenýletanól heildarglýkósíðþykkni Cistanche hefur veruleg niður-stjórnunaráhrif á virkni tyrosinasa, aðalhraðatakmarkandi ensímið fyrir húðmelanínmyndun. Virk áhrif geta dregið úr innihaldi melanínkorna í húðinni (Yang Jianhua, o.fl. West China Pharmaceutical Journal, 2010, 25(05):533-535); rannsakað helstu fimm fenýletanól glýkósíð einliða í Cistanche deserticola og hreinsaða Cistanche deserticola bensen. Áhrif heildar etanól glýkósíða á innihald melanínkorna í frumræktuðum húðfrumum manna reyndust hafa marktæk hamlandi áhrif á myndun húðmelaníns; útfjólubláa litróf fenýletanól glýkósíða frá Cistanche deserticola var skannað og í ljós kom að það getur á áhrifaríkan hátt tekið upp útfjólubláa geislun á UVA og UVB svæðum (Yang Jianhua, o.fl. West China Pharmaceutical Journal, 2011, 26(3):{{9 }}); andoxunarvirkni fenýletanólglýkósíða frá Cistanche deserticola var rannsökuð og niðurstöður sýndu að þau höfðu öll sterkt hreinsandi frelsi. Base active, hefur hvítandi áhrif.

Smelltu hér til að kaupa cistanche tubulosa

Leitarorð:

Glútaþíon; lyfjagjöf um húð; hýalúrónsýra; örnál; húðhvíttun.

1. Inngangur

Glútaþíon, náttúrulegt þíól þrípeptíð af -glútamýl-sýsteinýl-glýsíni, gegnir mikilvægu hlutverki í frumu redox viðbrögðum og tekur þátt í hömlun á melanínmyndun, vernd gegn hvarfgefnum súrefnistegundum og frumuafeitrun [1,2]. Þó að glútaþíon sé til staðar í bæði oxuðu og afoxuðu formi í líkamanum, er minnkað glútaþíon (GSH) efnasamband með mikla líffræðilega gagnsemi [3,4].

Til dæmis, geta þess til að bæla melanínmyndun með týrósínasahömlun gerir það kleift að nota það sem húðhvítandi efni í snyrtivörum [5-7]. Að auki er hægt að nota GSH sem ónæmisörvun, móteitur við málmaeitrun og meðhöndlun á sjúkdómum eins og bandvefsbólgu, gláku og liðagigt [8-11]. Því miður takmarkar lélegt aðgengi þess og óþægileg lykt notkun GSH á heilsugæslustöðvum þrátt fyrir mörg lækningaleg notkun þess.

Lyfjapeptíð eru almennt gefin utan meltingarvegar með því að nota nálar. Hins vegar krefst þessi leið læknishjálpar fyrir hverja gjöf og hefur lélegt fylgi sjúklings vegna sársauka sem upplifir við inndælingu [12,13]. Þó staðbundin notkun hafi verið notuð til að gefa GSH yfir húðina, takmarkar ógeðsleg lykt þess og vanhæfni til að fara í gegnum hornlag (SC, ysta hindrun húðarinnar) notkun þess [14].

Nýlega hefur lítið ífarandi kerfi fyrir gjöf um húð með örnálum (MNs) fengið mikla athygli frá læknum, sérstaklega fyrir afhendingu lífvirkra efna eins og peptíða og próteina sem eru óviðkvæm fyrir pH í meltingarvegi og næm fyrir ensímniðurbroti [15].

Til að sigrast á takmörkunum sem tengjast núverandi aðferðum við afhendingu GSH, sáum við fyrir okkur hraðuppleysandi MN plástur sem útbúinn er með lyktaeyðingu líffjölliða til að bæta virkni GSH og fylgni sjúklinga. Hár lífsamrýmanleiki og stillanlegir eðlisefnafræðilegir eiginleikar líffjölliða eins og hýalúrónsýru (HA) gera þær hentugar umsækjendur sem MN efni [16,17]. Að auki geta líffjölliður með fjölvirka hópa haft samskipti við sameindir með afturkræfum jónavíxlverkunum, vetnistengingu og van der Waal krafta og stuðlað þannig að mikilli hleðslugetu þeirra og góðum aðsogseiginleikum [18]. Þar sem losunarhvörf lyfja hlaðin í MNs geta verið stjórnað með upplausn eða niðurbrotshraða fjölliðanna sem notaðar eru, er hægt að beita uppleysandi MN-pöllum fyrir viðvarandi og langtíma losun lyfja um húð [19-22].

Hér greinum við frá nýrri nálgun fyrir skilvirka og lyktarlausa gjöf GSH um húð með því að nota uppleysandi MN plástra sem eru útbúnir úr lyktarlausum líffjölliðum. Eftir að hafa skimað nokkrar líffjölliður fyrir lyktarlausum GSH samsetningum var HA valið sem efni fyrir MN og notað til að búa til GSH-hlaðna MN plástra. Magn GSH sem hlaðið var inn í HA MNs var ákvarðað hafa ákjósanleg and-melanogenic áhrif og minni frumueiturhrif, eins og staðfest var með frumudrepandi áhrifum og týrósínasa hömlunarrannsóknum. GSH-hlaðin HA MN (GSH-HA MN) fylkin voru metin fyrir einsleita áferð, rúmfræði, æskilegan vélrænan styrk og hæfileika til að komast í gegnum húðina. Eftir að GSH-HA MN plástrar voru settir á húðvef dýra voru leysnihæfileikar þeirra og lyfjalosunarmynstur rannsakað.

2. Efni og aðferðir

2.1. Efni

Minnkað glútaþíon (GSH), gelatín (úr húð úr svína), 3-(4,5-dímetýlþíasól-2-ýl)-2,5- dífenýltetrasólíumbrómíð (MTT) , og kojínsýra (KA) var keypt frá Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, Bandaríkjunum), natríumhýalúrónat (100 k, HA) var keypt frá SNVIA (Busan, Kóreu). Kondroitínsúlfat (CS) var keypt frá Wako Chemicals (Osaka, Japan). -Sortufrumnaörvandi hormón (-MSH) var keypt frá TOCRIS (Bristol, Bretlandi) og frumufrumugreiningarsett með FITC (fluorescein isothiocyanate)-merkt annexín V var keypt frá BD Biosciences (Bedford, MA, Bandaríkjunum). Fljótandi forfjölliða (Sylgard 184A) og lækningaefni (Sylgard 184B) fyrir pólýdímetýlsíloxan (PDMS) mótun voru keypt frá Dow Corning (Midland, MI, Bandaríkjunum). Öll efni voru notuð án frekari hreinsunar. Svínahúð (hár fjarlægt) var aflað frá slátrari á staðnum og haldið við -20 ◦C þar til það var notað í tilraunum.

2.2. Frumumenning

Keratínfrumur úr mönnum (HaCaT frumur) og sortuæxlisfrumulínur úr músum (B16F10), sem voru notaðar í in vitro rannsóknir, voru fengnar frá ATCC (Manassas, VA, Bandaríkjunum). Frumur voru ræktaðar í GSH-fríu DMEM miðli (Hyclone, Logan, UT, USA), bætt við 10 prósent nautgripafóstursermi (FBS, Hyclone), 2 mM glútamín (Sigma-Aldrich), 100 einingar/ml penicillín (Hyclone), og 100 ug/mL streptomycin (GenDEPOT, Barker, TX, USA) við 37 ◦C í rakaðri andrúmslofti með 5 prósent CO2.

2.3. Lyktarpróf

Lyktarstigsaðferðin var framkvæmd til að meta minnkandi áhrif líffjölliða á GSH lykt [4]. Magn líffjölliða (natríumhýalúrónats, gelatíns og kondroitínsúlfats) var ákveðið við 10 prósent miðað við þyngd í heildarlausninni og GSH var blandað í mismunandi styrkleika (1.0 prósent , 2.{ {9}} prósent , 2,5 prósent og 5,0 prósent miðað við þyngd) í afjónuðu (Di) vatni. Eftir 30 mín af blöndun fann prófunarhópur af 10 sjálfboðaliðum lykt af lausn sem innihélt blöndu af líffjölliða og GSH. GSH lausnin án líffjölliða var notuð sem viðmiðun til að bera saman brennisteinslykt blönduðu sýnanna.

Hver sjálfboðaliði var beðinn um að gefa til kynna skynjun sína á lykt blönduðu lausnarinnar með því að nota eftirfarandi 5-stigakvarða: 1: engin lykt, 2: auðþekkjanleg lykt, 3: auðskiljanleg lykt, 4: sterk lykt og 5: mikil lykt .

2.4. Gasskiljun (GC) Mælingar

Byggt á niðurstöðum stiga var magn losaðs H2S magnmælt fyrir allar GSH-HA samsetningar með gasskiljun (Shimadzu, Tókýó, Japan) með því að nota Pulsed Frame Photometric Detector (PFPD) [23,24]. Lausnum af 1 prósent, 2,5 prósent og 5 prósent (miðað við þyngd) af GSH var blandað saman við 10 prósent (miðað við þyngd) af HA og 1 ml var sprautað í 10 ml brúnt lofttæmi hettuglas. Hettuglasið var geymt í ofni við 40 ◦C í 1 klst og síðan tekið út. Gasinu sem myndast (100 µL) var safnað með sprautu og sprautað í Shimadzu GC með PFPD. Aðskilnaður helstu brennisteinsefnasambandanna náðist á 30 m × 0,25 mm innri glersúlu (DB-1, J&W) við 90 ◦C og burðarflæði (nitur) upp á 1 ml/mín. Uppgötvun og inndælingarhitastig var 250 og 150 ◦C, í sömu röð. Magn H2S var mælt með því að nota staðlaða sýnin. Næmni PFPD var 10 ppb fyrir H2S. Staðfest var að gögn allra sýna væru á bilinu staðalferilsins.

2.5. Frumueiturhrifapróf

Frumueiturhrif GSH voru metin með MTT prófi og annexín V-FITC litun. Í stuttu máli voru HaCaT frumur (frumunúmer: 1 × 104) meðhöndlaðir með 0.1, 0.25, {{10}}.5 , og 1.0 mg/ml af GSH í DMEM miðli. Eftir 24, 48 og 72 klst. meðferð var 50 µL af MTT lausn bætt við frumuna og ræktuð í 1 klst. áður en efnið var sogað upp. Eftir það var 100 µL af dímetýlsúlfoxíði (DMSO) bætt við og prósentuhlutfall lífvænlegra frumna var reiknað út með því að mæla gleypni 540 nm með MULTISKAN GO lesanda (Thermo Scientific, Waltham, MA, Bandaríkjunum). Apoptosis var mæld með samtímis litun með annexíni V-FITC og própidíumjoðíði (PI). HaCaT frumur (1 × 106) voru meðhöndlaðar með 0,1, 0,25, 0,5 og 1,0 mg/ml af GSH. Eftir 72 klst meðferð voru frumur teknar upp, trypsínaðar, þvegnar með köldu PBS og litaðar með 1X bindijafna sem innihélt annexín V-FITC lausn og PI. Í kjölfarið voru frumur ræktaðar við stofuhita í 15 mínútur í myrkri. Lituðu frumurnar voru greindar með frumuflæðismælingu innan 1 klst. Bæði apoptotic og lifandi frumur voru greindar með Becton Dickinson FACSscan flæðifrumumæli og BD FACSDiva hugbúnaði (BD Biosciences, San Jose, CA, Bandaríkjunum).

2.6. Ákvörðun á frumumelaníninnihaldi og virkni týrósínasa

Fyrirhuguð hvítandi áhrif GSH voru metin með því að mæla getu þess til að hindra virkni tyrosinasa. Í stuttu máli voru B16F10 sortuæxlafrumur úr músum sáð í 6-brunn ræktunarplötu í styrkleikanum 5.0 × 104 frumur/brunn og leyfðar að festa á einni nóttu. Frumur voru meðhöndlaðar með {{10}} (auðu), 0.1, 0.25, 0.5 og 1.0 mg/ml af GSH og 10 µM af kojínsýru ( KA) sem jákvæða stjórn í 4 klst, og í kjölfarið örvuð með -MSH (1 µM) í 72 klst til að framkalla tyrosinasavirkni. Eftir að miðill var fjarlægður voru frumurnar leystar upp í 500 µL af 1N NaOH og ræktaðar í 1 klst við 60 ◦C til að leysa upp melanín. Melaníninnihaldið var ákvarðað með mælingu á gleypni við 405 nm. Fyrir týrósínasavirkni voru frumurnar ljósaðar í 100 µL af 50 mM natríumfosfatbuffi (pH 6,5) sem innihélt 5 µL af 1 prósent Triton X-100 og 5 µL af 0,1 mM fenýlmetýlsúlfónýlflúoríði. Eftir skilvindu við 10,000 g (30 mín., 4 ◦C), var flotinu með 20 µL af l-3,4-díhýdroxýfenýlalaníni (l-DOPA) hlaðið í {{ 44}}brunnsplötu og gleypni var mæld við 492 nm við 37 ◦C.

2.7. Gerð GSH-MN plástra

Kúlulaga GSH-MN fylkin (10 × 10 MNs/cm2) voru framleidd með endurnýtanlegu PDMS móti með leysisteypu vatnslausnar af 10 prósent HA lausnir með mismunandi GSH styrk (0 prósent, 1,0 prósent, 2,5 prósent og 5,0 prósent miðað við þyngd). Neikvæðu PDMS mótin með kúlulaga holrúm voru endurtekin úr MN málmi fylkjum framleidd með örvinnslu [16]. MN-myndandi lausnir (350 µL af HA eða HA/GSH lausnum) voru pípettaðar í PDMS mótið og þurrkaðar við 40 ◦C í 12 klst eftir afgasun undir lofttæmi. Þurrkuðu MN fylkingarnar voru varlega skrældar af forminu. Formgerð tilbúnu MN fylkanna var einkennd með því að nota stafræna (AM413ZT, Dino-Lite, Taívan) og sjónræna (Eclipse TS100, Nikon, Japan) smásjá. HA MN sem innihéldu 0, 1, 2,5 og 5 mg/ml af GSH voru nefnd GSH0-HA MN, GSH1-HA MN, GSH2.5-HA MN og GSH5-HA MN, í sömu röð.

2.8. Brotpróf

Ein HA MN og GSH hlaðin HA MN (GSH0-HA MN, GSH1-HA MN og GSH2.5-HA MN) voru fest með sýanókrýlat lími (Loctite 4{{ 7}}1, Loctite Corp, Dublin, Írlandi) til að festa festingarstubbinn sem settur er á neðra handfang alhliða prófunarvélarinnar (UTM, A&D 5000H, A&D Sales Corp, Daegu, Kóreu). Efri grip vélrænni prófunartækisins var fært í ás niður í átt að MN-oddinum á hraðanum 0,1 mm/mín. Svigkrafturinn var mældur sem fall af hraða tilfærslu rannsakanda og gefinn upp í Newtons (N).

2.9. Húðinnsetningarpróf

Húðinnsetningarprófið var framkvæmt til að kanna ígengnisgetu MNs, líklegt umfang bjögunar og hugsanlega vefjabeygju við innsetningu þess. GSH0-HA MN, GSH1-HA MN og GSH2.5-HA MN voru fest með sýanókrýlat lími við málmflötinn með festingu með efri gripi UTM og sett í með kraftur sem nemur 10 mm/mín. inn í skorið svínahúð (3 × 3 cm2, ~2 mm þykkt) sem er komið fyrir við botn vélræna prófunartækisins [25]. Svínahúðin var notuð eftir að fitulagið undir húðinni var fjarlægt með því að nota skurðarhníf.

2.10. Upplausnarpróf

GSH2.5-HA MN var borið á svínahúð (3 × 3 cm2) á nokkrum fyrirfram ákveðnum tímapunktum (3, 5, 7 og 10 mín). Eftir að MN-plástrarnir voru fjarlægðir var uppleyst hæð MN-oddanna mæld með ljóssmásjá (Eclipse TS100, Nikon, Tokyo, Japan).

Til að staðfesta gatamerkið á GSH2.5-HA MN plástrum var 0,5 mg af litarefni (Rhodamine B) bætt við 1 ml af 2,5 prósent (miðað við þyngd) blönduð GSH lausn til að undirbúa MNs . Í kjölfarið var MN fylki tilbúningur með því að nota lausn blandað með litarefni framleidd með sömu aðferð og lýst er hér að ofan. Kýlamerkið sem myndaðist úr MN fylkingunum, staðsetning þeirra við þýðingu yfir í svínahúðina og gráðu vefjabeygju voru greind undir stafrænni smásjá (AM413ZT, Dino-Lite, Taívan). Sérhver breyting á formgerð MN eftir ísetningu var skoðuð undir sjónsmásjá.

2.11. Hleðslugeta og skilvirkni hjúpunar

Til að ákvarða magn GSH sem er hlaðið inn í HA MNs, voru MN ábendingar frá GSH{{0}}HA MN og GSH2.5-HA MN, hvort um sig, skornar og að fullu leystar upp í PBS (pH 7,4) ) í 24 klst. Magn GSH magns í MN oddunum var ákvarðað með því að greina 10 µL af sýnislausn með hágæða vökvaskiljun (HPLC, e2695, Waters, USA) á SunFire C18 súlu (100Å, 5 µm, 4,6) × 250 mm, Vatn). HPLC var stjórnað með því að nota asetónítrílvatn (5:95) og 0,1 prósent tríflúorediksýru (TFA) sem hreyfanlegur fasa með flæðihraða 0,8 ml/mín. Byggt á HPLC gögnum voru hleðslugetan (LC) og hjúpun skilvirkni (EE) reiknuð út með því að nota eftirfarandi jöfnur: Hleðslugeta ( prósent )=menn mtot × 100 (1). Skilvirkni hjúpunar ( prósent )=karlar mín. × 100 (2)

þar sem karlar tákna hjúpað lyfjamagn í MN-oddum, mest er heildarmassi MN-odda og min táknar lyfjamagnið í MN-myndandi lausnum [26].

2.12. In vitro GSH húð gegndræpi próf

Til að kanna ex vivo gegnumstreymishvörf yfir húðina á minnkaða GSH sem losað er frá GSH2.5-HA MN plásturinn, voru gerðar truflanir Franz frumupróf til að reikna út hraða tímaháðrar losunar GSH í gegnum GSH2.{ {5}}HA MN og dreifing þeirra í gegnum húðina ásamt GSH-HA viðmiðunarlausn. GSH2.5-HA MN plástrarnir og 350 µL GSH2.5-HA lausnin sem notuð var við MN-framleiðslu voru sett á útskorið Sprague-Dawley (SD) rottuhúð (~2 mm þykkt) komið fyrir á milli gjafa- og viðtakahólfsins í Franz dreifingarfrumunni, í sömu röð. Eftir að GSH2.5-HA MN plásturinn var settur í rottuhúðina var hýdrókolloid límplástur (NeoDerm Roll, EVERAID, Yangsan, Kóreu) settur á MN bakhliðina við lyfjagjöf. Viðtakahólfið með hliðararm var fyllt með 22 ml af ferskum PBS jafnalausn (pH 7,4) og haldið við 37 ◦C [27]. Einn millilítri af sýninu var tekinn á hverjum tímapunkti (0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 36 og 48 klst.) úr Franz frumuviðtakahólfinu og fyllt aftur með jöfnu magni af fersku PBS (pH 7,4) ). GSH2.5-HA MN plástrarnir voru fjarlægðir af rottuhúð eftir 1 klst. Magnið af GSH sem var losað úr MN-oddinum og gegnsýrt í gegnum rottuhúð var greint með HPLC með því að nota siðareglur sem lýst er hér að ofan. GSH var greint með því að mæla gleypni við 385 nm og styrkur lyfsins var gefinn upp í mg.

2.13. Tölfræðigreining

Allar niðurstöður eru gefnar upp sem meðaltal ± staðalfrávik (SD) og greindar með t-prófi nemandans. Mikilvægisstigið var stillt á p < 0.05.

3. Niðurstöður og umræður

3.1. Skimunarpróf til að velja lyktareyðandi fjölliður

Byggt á lyktarstyrk var stigagreiningin framkvæmd með kvarðanum 1–5 til að meta losun H2S frá sjálfvirku niðurbroti óbundins GSH og GSH-líffjölliða samsetninga. Tilraunin var framkvæmd með því að taka með 10 heilbrigðum sjálfboðaliðum af handahófi af öðru kyni. Sterk lykt tengdist meira magni losaðs H2S og öfugt. Allur styrkur (1.0–5.0 prósent miðað við þyngd) af gelatíni (4,75 ± 0.2) og CS-GSH (3.25 ± 0}.95) lyfjaform hafa fengið hærra skor á meðan HA-GSH (1,5 ± 0.35) fékk lægra skor en GSH eitt og sér (2,75 ± 0,61; mynd 1a). Hátt stig fyrir gelatín-GSH og CS-GSH samsetningarnar samanborið við GSH eitt og sér voru vegna einkennandi lyktar þeirra auk lyktarinnar af losuðu H2S.

Síðar, byggt á lyktarstigum, var magnmat á losuðu H2S (í ppm) framkvæmt af GC fyrir GSH-HA samsetninguna við mismunandi styrkleika. Magn losaðra H2S reyndist vera að lágmarki 1,0 prósent og 2,5 prósent (0.55 ± 0.01 og {{13} }.49 ± 0.03 ppm) og að hámarki 5.0 prósent (1.03 ± 0.{{27} }1 ppm) af GSH í samsetningunni. Í öllum styrkjum reyndust gildin vera minni en fyrir GSH eingöngu (0.59 ± 0.03, 0.75 ± 0.04 og 1.15 ± 0,05 fyrir 1,0 prósent, 2,5 prósent og 5 prósent af GSH, í sömu röð; mynd 1b). Ástæðan fyrir þessari niðurstöðu var sú að útskipt Na plús í HA hvarfast við tíólhópinn í GSH með hvarfformúlunni sem sýnd er á viðbótarmynd S1. Staðfest var að lyktarminnkunin stafaði af minni framleiðslu H2S (viðbótarmynd S1) [28,29]. Þessar niðurstöður sýna að HA hefur betri lyktaeyðandi áhrif samanborið við gelatín og CS, þess vegna var það valið til framleiðslu á MNs í þessari rannsókn. Þar sem hámarks lyktareyðandi getu HA fyrir losað H2S kom fram með 1,0 prósent, 2,5 prósent og 5,0 prósent GSH-HA samsetningum (Mynd 1b), voru þessir þrír styrkleikar valdir til að búa til MNs.

3.2. Áhrif GSH á frumueiturhrif og týrósínasavirkni

MTT prófið var notað til að ákvarða hvort GSH sé frumudrepandi fyrir HaCal. Flúrljómunarvirkjað frumuflokkunargreining (FACS) var gerð með því að nota annexín V, sem sérstaklega og sterkur vindur að frumuyfirborði PI til að staðfesta hvort apoptótísk eða drepandi frumudauði hafi komið fram (30meðhöndlun með GSH0 .2-1.0 mg/ml breytti ekki marktækt hlutfalli lífvænlegra frumna við 72 samanborið við frumur sem fengu burðarefni (Mynd 2a). Engin frumudrepandi áhrif GSH á HaCaT frumurnar voru staðfest með flæði frumugreining með annexíni V. Útsetning HaCaT frumna fyrir 0, 0.1, 0.25, 0.5 eða 1 mgmL GSH í 72 klst. leiddi til styrktarháð örvun apoptosis (Mynd 2b,c) Útsetning fyrir GSH olli ekki marktækri aukningu á apoptotic frumum (7,90 plús 1.02-13.99 plús 0,37 prósent ) og lækkun á hlutfalli lifandi frumna (88,38 plús 1.02-80.81 plús 0.67 prósent ) samanborið við frumur sem fengu burðarefni (4,85 plús 0,72 prósent og 90,47 plús 0,93 prósent fyrir apoptotic og lifandi frumur í sömu röð, mynd 2b, c. Þessar niðurstöður benda til þess að GSH sé ekki eitrað fyrir keratínfrumur úr mönnum og að óhætt sé að nota það á húð manna.

Týrósínasi er ensímið sem ber ábyrgð á myndun melaníns. Hvítunaráhrif GSH voru metin með því að mæla hömlunarhraða bæði melanínframleiðslu og virkni týrósínasa-hraðatakmarkandi ensíms við sortumyndun. B16F10 frumur voru formeðhöndlaðar með 10 uM KA og GSH (0,1–1,0 mg/ml) í 4 klst og síðan örvaðar með -MSH (1 µM) í 72 klst. GSH meðferð hamlaði marktækt melanínframleiðslu framkallað af -MSH (Mynd 3a). Með þessari niðurstöðu var virkni tyrosinasa af völdum -MSH (345,60 ± 18,29 prósent af engri GSH meðferð) marktækt minnkað.

3.3. Framleiðsla á GSH-hlaðnum HA MNs og vélrænni eiginleikar þeirra

Til að gefa GSH yfir húðina á lágmarks ífarandi hátt völdum við HA sem MN efni á grundvelli getu þess til að draga úr H2S sem var staðfest með stigaprófum og gasskiljunargögnum (mynd 1). MN-myndandi lausnirnar sem innihalda HA og GSH voru notaðar til að búa til GSH-hlaðna HA MN (GSH-HA MN) fylki. Fylkin voru útbúin með leysisteypuaðferð með því að nota PDMS mót með kúlulaga holrúm. GSH-MN fylkin (100 MNs/cm2) sýndu einsleitt mynstur með hæð 770 ± 5 µm, grunnþvermál 172,25 ± 2,5 µm og þvermál þjórfé 7,8 ± 2,5 µm með horninu 40 ± 2,5 µm (Mynd 4a). Rúmfræði MN var ákvörðuð til að tryggja gegnumgang SC lagsins og afhendingu GSH um húð með lágmarks æða- eða taugafrumum skaða til að forðast sársauka og háræðablæðingu á notkunarstað. Samræmdir eiginleikar GSH-HA MNs fengust þegar MNs voru útbúin með MN-myndandi lausnum sem innihéldu 2,5 prósent GSH, en nokkur beygð MNs sáust þegar þau voru útbúin með háum styrk (5 prósent) af GSH (viðbótarmynd S2).

Vélrænni eiginleikar GSH-HA MNs voru skoðaðir í þjöppunarham. Einn MN festur með sýanókrýlatlími á botnflöt UTM var þjappað saman með flatri málmplötu sem var fest með efri gripi vélarinnar á hraðanum 0,1 mm/mín. (Mynd 4a–c) . Svigkrafturinn, eða krafturinn sem þarf til að efni missi teygjanleika, var ákvarðaður vera 0.25, 0.39 og 0.4{{1{{17 }}}} N með fráviki ±0.03 fyrir GSH0-HA MNs, GSH1-HA MNs og GSH2.5-HA MNs, í sömu röð (Mynd 4d). Innsetningarkrafturinn reyndist vera 0.36 ± 0.003, 0,39 ± 0,015 og 0,37 ± 0,005 fyrir GSH0-HA MNs, GSH{{30 }}HA MNs og GSH2.5-HA MNs, í sömu röð. Bæði svigkrafturinn og ísetningarkrafturinn reyndust nægja til að setja MNs í húð svína án nokkurs brots, bjögunar eða vefjabeygju.

3.4. In Vitro upplausnarpróf á GSH-HA MNs

Upplausnartími líffjölliða ákvarðar mynstur losunar lyfja og upphaf verkunar fyrir hvaða lyfjaform sem er. Til að spá fyrir um þann tíma sem þarf fyrir losun GSH, var stakt MN (GSH, 5-HA) sett í húð svína, sem er sambærilegt við mannshúð. Smásjárgreining sýndi tímaháða upplausn MNs. Eftir að GSH-MNs hafa verið borin á húðina í 12 mínútur voru MN-oddarnir alveg uppleystir, sem hóf munstur þess með hraðri losun (Mynd 5a,b). Til að staðfesta gegnumgang GSH 5-HA MN plástra í húð, voru MN plástrar (1,5 x 1,5 cm) hlaðnir rhodamine litarefni settir á húð svína með innsetningarkrafti upp á 20 N í 1 mín. Eftir að hafa fjarlægt litarefnahlaðna MN plástra, sáum við fjölda litarbletta sem samsvara hverri nál, sem staðfestir innsetningu GSH 5-HA MNs í húðina (Mynd 5c).

Hleðslugetan vísar til hámarksmagns lyfs sem hægt er að setja í burðarefni og ákvarðar hleðsluvirkni þess. Hleðslugeta GSH-HA MN plástra er skilgreind sem massi hlaðna lyfsins (GSH) í MN oddum deilt með heildarmassa GSH-HA MN oddanna. Til að athuga skilvirkni hleðslunnar voru GSH-hlaðnir MN-oddar skornir og leystir upp í PBS (pH 7,4) og magn GSH sem hlaðið var í spjótana var greint með HPLC. Hleðslumagn GSH í 100 MN ábendingum var {{10}}.29 ± {{20}}.03 mg og 0,56 ± 0,03 mg fyrir GSH1-HA MN plástra og GSH2.5-HA MN plástra, í sömu röð. Miðað við heildarmassa GSH-MN oddanna (100 MNs, 2 ± 0,2 mg), var hleðslugetan 11,26 ± 1,24 prósent og 21,33 ± 1,13 prósent á meðan hjúpunin reyndist vera 8,36 ± 0,92 prósent og 6,34 ± 0 GSH1-HA MN og GSH2.5-HA MNs, í sömu röð (tafla 1). Svipuð gildi á milli þyngdarhlutfalls HA: GSH (10:1 eða 10:2,5) í MN-myndandi lausnum og hleðslugetu GSH í MN-plástri benda til jafnrar dreifingar GSH í MN-plástrinum.

3.5. Ex Vivo Skin Permeation Test of GSH-HA MN Patches

Til að áætla upphaf og tímalengd losunar GSH frá GSH,5-HA MNs, var Franz frumurannsóknin gerð í 48 klst. með því að setja húð SD rottu við eftirlíkingar lífeðlisfræðilegar aðstæður (mynd 6). GSH 5-HA MNs sýndu tiltölulega hraðvirka línulega losunarhvarfafræði fyrir upphafið12 klst fylgt eftir með hægum losunarhraða með tímanum.

Gegnsýrt magn GSH yfir húðina eftir MN notkun var ~1,4 mg fyrstu 12 klst. tilraunarinnar og náði ~1,6 mg í 48 klst. Magn af GSH meira en hlaðið magn í MN ábendingum var afhent. Þetta magn inniheldur ekki aðeins GSH sem er hlaðið í GSH2.5-HA MN ábendingar heldur einnig GSH sem er innbyggt í grunnlagið sem lyfjageymir. Aftur á móti var GSH-HA lausnin afhent hægt í litlu magni (~0,2 mg) vegna lélegrar gegndræpis GSH í húð. Þar sem gjöf vaxtarhormóns um húð með því að nota MNs framleidd með karboxýmetýlsellulósa og trehalósa sýndi stuttan tmax (~30 mín) eftir MN notkun og sýndi svipaða lyfjahvörf og SC inndælingin [19], GSH-HA plásturinn með fljótandi vatns- frásogseiginleikar ættu við um almenna GSH afhendingu. Byggt á in vitro rannsókn, hamlaði meðferð á 1 mg/ml GSH marktækt melanínframleiðslu og tyrosinasavirkni. Miðað við lítið rúmmál (~150 µL/cm2) af millivefsvökva í húðinni [31], gæti staðbundið afhent GSH með HA MN plástri (1,6 mg GSH/1 cm2 MN plástur) virkað sem andoxunarefni í MN upplausnarferlinu. Þar sem losunarhvörf GSH hlaðin í MNs er hægt að stjórna með þvertengingarþéttleika MN efnisins [32,33], væri stækkandi MN vettvangur gagnlegur fyrir skilvirka GSH afhendingu með lágmarks aukaverkunum.

4. Niðurstöður

Byggt á lyktareyðandi getu (stigagildi) og niðurstöðum GC, völdum við HA til að þróa lífbrjótanlega MN plástra fyrir lyktarlausa gjöf GSH um húð. HA dulaði vonda lykt GSH á skilvirkari hátt en gelatín og CS. HA-MNs plásturinn (GSH2.5-HA) hafði næga endingu til að komast í gegnum húðina án þess að skemmast. Losun GSH frá HA-MNs plástrum (GSH1-HA og GSH2.5-HA) reyndist vera einsleit yfir tiltekið tímabil, eins og sýnt er með tilraunum. Frumueyðandi og týrósínasahemjandi rannsóknirnar sýndu að GSH styrkur upp á 1 mg/ml væri öruggur og árangursríkur til að hvíta húðina. Á heildina litið hefur verið sýnt fram á hagkvæmni þróaðra HA MN plástra sem vænlegan vettvang fyrir gjöf GSH eða lyfja með skaðlegum eða óviðunandi líffæraeiginleikum um húð, byggt á tilraunagögnum sem haldið er fram í þessari rannsókn.

Viðbótarefni:

Mynd S1: Áhrif natríumhýalúrónats á lyktarminnkun, Mynd S2: GSH5 -HA MN fylkismyndir.

Framlög höfunda:

Hugmyndafræði, YL, Y.-SJ og SYY; Aðferðafræði, YL, SHK, K.-YS og SK; Gagnaöflun, CK og HL; Ritun—upprunaleg drög, YL, SK, SYY; endurskoðun og klipping, SK, Y.-SJ, K.-YS og SYY; Umsjón, SYY Allir höfundar hafa lesið og samþykkt útgáfu handritsins.

Fjármögnun:

Þessi rannsókn var studd af National Research Foundation of Korea (NRF) sem styrkt var af vísinda- og upplýsingatækniráðuneytinu (NRF-2018R1A4A1025623), og af National Creative Research Initiative Program í gegnum National Research Foundation of Korea (NRF) styrkt af vísinda-, UT- og framtíðarskipulagi (NRF-2017R1D1A3B03035360).

Hagsmunaárekstrar:

SYY er uppfinningamaður einkaleyfis sem leyfir fyrirtækinu (SNVIA) sem þróar lyktarlausar GSH snyrtivörur. Þessi hugsanlega hagsmunaárekstrar er stjórnað af Pusan ​​National University.

Heimildir

1. Forman, HJ; Zhang, H.; Rinna, A. Glutathione: Yfirlit yfir verndarhlutverk þess, mælingar og lífmyndun. Mol. Asp. Med. 2009, 30, 1–12. [Krossvísun].

2. Hayes, JD; McLellan, LI Glútaþíon og glútaþíonháð ensím tákna samræmda vörn gegn oxunarálagi. Free Radic. Res. 1999, 31, 273–300. [Krossvísun].

3. Rahman, I.; Kóði, A.; Biswas, SK próf til að ákvarða magn glútaþíons og glútaþíon tvísúlfíðs með því að nota ensím endurvinnsluaðferð. Nat. Protoc. 2006, 1, 3159. [Krossvísun].

4. Yano, H. Samanburður á oxað og minnkað glútaþíon í brauðgerðareiginleikum hrísgrjónadeigs. J. Food Sci. 2012, 77, C182–C188. [CrossRef] [PubMed].

5. Weschawalit, S.; Thongthip, S.; Phutrakool, P.; Asawanonda, P. Glutathione og andstæðingur-öldrun og and-melanogenic áhrif. Clin. Snyrtivörur. Rannsaka. Dermatol. 2017, 10, 147. [CrossRef] [PubMed].

6. Villarama, geisladiskur; Maibach, HI Glútaþíon sem litahreinsandi efni: Yfirlit. Alþj. J. Snyrtivörur. Sci. 2005, 27, 147–153. [CrossRef] [PubMed].

7. Arjinpathana, N.; Asawanonda, P. Glutathione sem hvíttunarefni til inntöku: Slembiraðað, tvíblind, samanburðarrannsókn með lyfleysu. J. Dermatol. Dekra við. 2012, 23, 97–102. [CrossRef] [PubMed].

8. Droge, W.; Breitkreutz, R. Glútaþíon og ónæmisvirkni. Frv. Nutr. Soc. 2000, 59, 595–600. [CrossRef] [PubMed].

9. Patrick, L. Kvikasilfurseitrun og andoxunarefni: Hluti 1: Hlutverk glútaþíons og alfa-lípósýru í meðhöndlun kvikasilfurseitrunar. Varamaður. Med. 2002, 7, 456–472.

10. Chen, JZ; Kadlubar, FF Ný vísbending um meingerð gláku. Am. J. Med. 2003, 114, 697–698. [Krossvísun].

11. Hassan, MQ; Hadi, RA; Al-Rawi, ZS; Padron, VA; Stohs, SJ Glútaþíon varnarkerfið í meingerð iktsýki. J. Appl. Toxicol. 2001, 21, 69–73. [CrossRef] [PubMed].

12. Seong, KY; Seo, MS; Hwang, DY; O'Cearbhaill, ED; Sreenan, S.; Karp, JM; Yang, SY Sjálflímandi, kúlulaga míkrónálarplástur fyrir stýrða gjöf insúlíns um húð. J. Stjórn. Útgáfa 2017, 265, 48–56. [CrossRef] [PubMed].

13. Jin, J.; Zhu, LL; Chen, M.; Xu, HM; Wang, HF; Feng, XQ; Zhu, XP; Zhou, Q. Ákjósanlegur val á lyfjagjafarleið varðandi inndælingu í bláæð, í vöðva og undir húð. Kýs sjúklingur. Fylgi 2015, 9, 923–942. [PubMed].

14. Bouwstra, JA; Honeywell-Nguyen, PL; Gooris, GS; Ponec, M. Uppbygging húðhindrunar og mótun hennar með blöðruformum. Prog. Lipid Res. 2003, 42, 1–36. [Krossvísun].

15. Jiskoot, W.; Randolph, TW; Volkin, DB; Middaugh, CR; Schöneich, C.; Winter, G.; Friess, W.; Crommelin, DJ; Carpenter, JF Próteinóstöðugleiki og ónæmisvaldandi áhrif: Vegahindranir í klínískri beitingu próteinagjafakerfa til inndælingar fyrir viðvarandi losun. J. Pharm. Sci. 2002, 101, 946–954. [Krossvísun].

16. Liu, S.; Jin, MN; Quan, YS; Kamiyama, F.; Katsumi, H.; Sakane, T.; Yamamoto, A. Þróun og eiginleikar nýrra örnálaflokka sem eru framleiddir úr hýalúrónsýru og notkun þeirra við gjöf insúlíns um húð. J. Stjórn. Útgáfa 2012, 161, 933–941. [Krossvísun].

17. Wang, C.; Já, Y.; Hochu, GM; Sadeghifar, H.; Gu, Z. Aukin ónæmismeðferð með krabbameini með örnálarplásturshjálp á and-PD1 mótefni. Nanó Lett. 2016, 16, 2334–2340. [Krossvísun].

18. Dassanayake, RS; Acharya, S.; Abidi, N. Efni sem byggjast á líffjölliða úr fjölsykrum: Eiginleikar, vinnsla, einkennisgreiningar og frásogsforrit. Í Advanced Sorption Process Applications; Edebali, S., Ed.; IntechOpen: London, Bretlandi, 2018; bls. 1–24.

19. Lee, JW; Choi, SO; Felner, EI; Prausnitz, MR Uppleysandi örnálarplástur til að gefa vaxtarhormón manna um húð. Lítil 2011, 7, 531–539. [Krossvísun].

20. Donnelly, RF; Singh, TRR; Garland, MJ; Migalska, K.; Majithiya, R.; McCrudden, CM; Kole, PL; Mahmood, TMT; McCarthy, HO; Woolfson, AD Vatnsgel-myndandi örnálar til að auka lyfjagjöf um húð. Adv. Virka. Mater. 2012, 22, 4879–4890. [Krossvísun].

21. Kim, JD; Kim, M.; Yang, H.; Lee, K.; Jung, H. Loftblástur sem fæddur er í dropum: Ný uppleysandi örnálarframleiðsla. J. Stjórn. Útgáfa 2013, 170, 430–436. [Krossvísun].

22. Kim, H.; Seong, KY; Lee, JH; Park, W.; Yang, SY; Hahn, SK Lífbrjótanlegur örnálarplástur sem gefur mótefnavaka peptíð-hýalúrónat samtengingu fyrir ónæmismeðferð með krabbameini. ACS Biomater. Sci. Eng. 2019, 5, 5150–5158. [Krossvísun].

23. Du, X.; Söngur, M.; Rouseff, R. Greining á nýjum rokgjörnum brennisteini í jarðarberjum og breytingum við þroska. J. Agric. Food Chem. 2011, 59, 1293–1300. [CrossRef] [PubMed].

24. Boczkaj, G.; Kaminski, M.; Przyjazny, A. Ferlisstýring og rannsókn á oxunarhvörfum eftiroxunar frárennslis með gasskiljun með púlsloga ljósmælingu (GC-PFPD). Ind. Eng. Chem. Res. 2010, 49, 12654–12662. [Krossvísun].

25. Davis, SP; Landis, BJ; Adams, ZH; Allen, MG; Prausnitz, MR Ísetning örnála í húð: Mæling og spá um ísetningarkraft og nálarbrotskraft. J. Biomech. 2004, 37, 1155–1163. [CrossRef] [PubMed].

26. Chandrasekharan, A.; Hwang, YJ; Seong, KY; Park, S.; Kim, S.; Yang, SY Sýrumeðhöndlað vatnsleysanlegt kítósan sem hentar til lyfjagjafar með örnálum í húð. Lyfjafræði 2019, 11, 209. [CrossRef] [PubMed].

27. Kim, B.; Seong, KY; Þú, ég.; Selvaraj, V.; Yim, SG; O'Cearbhaill, ED; Jeong, U.; Yang, SY Snertivirkur forðaplástur til að stjórna magni gegn gegndræpi í húð. Sens. Stýritæki B Chem. 2018, 256, 18–26. [Krossvísun].

28. Jensen, GA; Adams, DF; Stern, H. Frásog brennisteinsvetnis og metýlmerkaptans úr þynntum gasblöndum. J. Loftmengun. Control Assoc. 1966, 16, 248–253. [Krossvísun].

29. Onda, K.; Takeuchi, H.; Kobayashi, T.; Yokota, K. Samtímis frásog brennisteinsvetnis og koltvísýrings í vatnskenndum natríumhýdroxíðlausnum. J. Chem. Eng. Jpn. 1972, 5, 27–33. [Krossvísun].

30. Kabakov, AE; Gavai, VL Frumudauði og lifunarpróf. Í Chaperones; Humana Press: New York, NY, Bandaríkin, 2018; bls. 107–127.

31. Samant, PP; Prausnitz, MR Aðferðir við sýnatöku á millivefsvökva úr húðinni með því að nota örnálaplástur. Frv. Natl. Acad. Sci. Bandaríkin 2018, 115, 4583–4588. [Krossvísun].

32. Yang, SY; O'Cearbhaill, ED; Sisk, GC; Park, KM; Cho, WK; Villiger, M.; Bouma, BE; Pomahac, B.; Karp, JM Lífrænt stækkandi örnálalím fyrir vélræna samlæsingu við vef. Nat. Samfélag. 2013, 4, 1702. [Krossvísun].

33. Migdadi, EM; Courtenay, AJ; Tekko, ÍA; McCrudden, MT; Kearney, MC; McAlister, E.; McCarthy, HO; Donnelly, RF hydrogel-myndandi örnálar auka gjöf metformínhýdróklóríðs um húð. J. Stjórn. Útgáfa 2018, 285, 142–151. [CrossRef] [PubMed].

Yechan Lee 1, Sujeet Kumar 1, Sou Hyun Kim 2, Keum-Yong Seong 1, Hyeseon Lee 1, Chaerin Kim 1, Young-Suk Jung 2,* og Seung Yun Yang 1,*

1 Department of Biomaterials Science, Life and Industry Convergence Institute, Pusan ​​National University, Miryang 50463, Kóreu.

2 College of Pharmacy, Pusan ​​National University, Busan 46241, Kóreu.

Móttekið: 31. desember 2019; Samþykkt: 22. janúar 2020; Birt: 27. janúar 2020

For more information:1950477648nn@gmail.com