Ný raðbrigða Newcastle sjúkdóms veiru-undirstaða í eggfrumu bóluefni framhjá ónæmi móður til að veita fulla vernd gegn snemmbúnu meinlegu áskorun 1. hluti

Ágrip:

Newcastle-veiki (ND) er einn af efnahagslega mikilvægustu alifuglasjúkdómunum. Þrátt fyrir mikla viðleitni með núverandi bólusetningaráætlunum kemur þessi sjúkdómur enn fram um allan heim og veldur verulegum dánartíðni jafnvel í bólusettum hópum. Þetta hefur að hluta til verið rakið til ónæmisbils á tímabilinu eftir klak vegna nærveru móðurmótefna sem hafa neikvæð áhrif á afritun hinna almennu lifandi bóluefna. In ovo bóluefni hafa marga kosti og gefa tækifæri til að takast á við þetta vandamál.

Núverandi notuð í ovo ND bóluefni eru raðbrigða herpesveiru kalkúna (HVT)-vectored bóluefni sem tjá mótefnavaka Newcastle-veikiveiru (NDV). Þrátt fyrir að hafa reynst skilvirk, hafa þessi bóluefni ákveðnar takmarkanir, svo sem seinkaða ónæmingargetu og vanhæfni til að gefa annað HVT bóluefni eftir klak. Notkun lifandi ND bóluefna fyrir bólusetningu í eggjum á ekki við sem stendur, þar sem þau eru tengd háum fósturvísisdauða. Í þessari rannsókn voru raðbrigða NDV-vectored tilraunabóluefni sem innihéldu andskynjunarröð fugla interleukin 4 (IL4R) og burðarás þeirra gefin in ovo í mismunandi skömmtum í 18-dagsgömul auglýsing egg með háa mótefnatítra móður. Fuglarnir sem klakið var út fengu illvígt NDV við 2 vikna aldur. Útfelling bóluefnis eftir klak, lifun eftir áskorun, losun álagsveira og ónæmissvörun í húmor voru metin á mörgum tímapunktum. Raðbrigða NDV (rNDV) bólusettir fuglar höfðu marktækt dregið úr dánartíðni eftir klak samanborið við villigerð LaSota bóluefnisins.

Öll rNDV bóluefnin gátu komist inn í ónæmi móður og framkallað sterka snemmbúna ónæmissvörun. Ennfremur vernduðu rNDV bóluefnin gegn klínískum sjúkdómum og dró verulega úr útskilnaði vírusa eftir snemma illvíga NDV áreiti tveimur vikum eftir klak. Mótefnatítrar blóðglútínunar-hömlunar eftir áskorun í bólusettu hópunum héldust sambærileg við títra fyrir áskorun, sem bendir til getu rannsakaðra bóluefna til að koma í veg fyrir skilvirka eftirmyndun ögrunarveiru. Lifun eftir klak eftir bólusetningu með rNDV-IL4R bóluefninu var skammtaháð, með aukningu á lifun eftir því sem skammturinn minnkaði. Þessi bætta lifun og skammtaháð gögn benda til þess að ný veiklað bóluefni sem byggist á eggjum rNDV sem geta komist í gegnum ónæmi móður til að framkalla sterka ónæmissvörun strax 14 dögum eftir klak, sem leiðir til mikillar eða fullrar verndar gegn skaðlegum áföllum, sýna loforð sem framlag til að ná tökum á Newcastle-veikinni.

Til viðbótar við bólusetningu manna getur fólk einnig tekið inn mat og bætiefni. Cistanche inniheldur ýmis efnafræðileg efni eins og fjölsykrur, sterar, alkalóíðar, flavonoids o.fl. Þessi efni gegna mikilvægu hlutverki við að stjórna ónæmiskerfinu. Meðal þeirra geta fjölsykrur stuðlað að virkjun og fjölgun ónæmisfrumna og aukið ónæmi líkamans; sterar geta stjórnað starfsemi ónæmisfrumna og aukið ónæmissvörun; alkalóíðar og flavonoids geta staðist oxun, bólgueyðandi, bakteríudrepandi og aukið friðhelgi enn frekar. Þess vegna hefur Cistanche veruleg ónæmisstjórnunaráhrif og er hægt að nota sem heilsufæði og lyf til að bæta ónæmi.

Smelltu á heilsuávinning af cistanche

1. Inngangur

Newcastle-sjúkdómur (ND), hrikalegur alifuglasjúkdómur sem getur náð 100 prósenta dánartíðni hjá frumlegum fuglum, stafar af illvígum stofnum Newcastle-veikiveiru (NDV) [1]. Þessi veirutegund sem nýlega var endurnefnd fugla orthóavulavirus 1, er meðlimur fjölskyldunnar Paramyxoviridae [2,3]. Newcastle-veiki veirur eru með einþátta, óhlutbundið, RNA erfðamengi með neikvæðum skilningi sem kóðar fyrir að minnsta kosti sex byggingarprótein (30—kjarnaprótein [NP]— fosfóprótein [P]—fylkisprótein [M]—samrunaprótein [F]— hemagglutinin-neuraminidase [HN]—og stór RNA-pólýmerasa [L]—50) og samanstendur af einni af þremur erfðamengisstærðum (15.186, 15.192 og 15.198 núkleótíðum) [4,5]. Newcastle-sjúkdómurinn er talinn þriðji mikilvægasti alifuglasjúkdómurinn í heiminum [6] og er enn landlægur í mörgum löndum um Asíu, Afríku og Ameríku [7].

Eftirlit með ND felur í sér strangt líföryggi til að koma í veg fyrir innleiðingu meindýra NDV (vNDV) á alifuglabú [8,9] og rétta gjöf bóluefna [10]. Hins vegar eru mörg ND faraldur sem eiga sér stað um allan heim [11] benda til þess að núverandi bóluefni og bólusetningaraðferðir séu ekki fullkomlega árangursríkar. Til viðbótar við hefðbundin lifandi og óvirkjuð bóluefni, hafa mörg hugtök fyrir ND bólusetningu verið könnuð á síðustu tveimur áratugum, þar á meðal bóluefni með ferjuðum, mótefnavaka-mótefnafléttum, veirulíkum ögnum og tolllíkum viðtakabindilbóluefnum, meðal annarra [1, 8,9]. Nokkur fuglabóluefni, hönnuð til að tjá samhliða ónæmisörvandi frumudrep, hefur einnig verið stungið upp á til að bæta verndandi ónæmi [12]. Önnur nálgun sem hefur verið könnuð er notkun mótefnavaka bóluefna. Þrátt fyrir að litið sé á öll NDV sem meðlimi einni sermisgerð [3,13], er mótefnavakabreyting milli stofna [14]. Fyrri rannsóknir á kjúklingum á mismunandi aldri hafa sýnt fram á að kjúklingar sem bólusettir voru með stofnum sem voru mótefnavaka samsvörun við áskorunarveiruna losa marktækt minna magn af áskorun vNDV en það magn sem skilst út af kjúklingum sem eru bólusettir með ólíkum bóluefnum [15-17]. Athyglisvert er að óvirkt flutt and-NDV mótefni móður, þó að þau verndi hænur á mikilvægum fyrstu vikum lífsins, trufla þróun ónæmis hýsils eftir bólusetningu [18].

Bólusetning í eggi er nálgun sem skilar mörgum kostum - til dæmis verulega kostnaðarlækkun, stöðlun, fjöldabólusetningu, sjálfvirk bólusetning í klakstöðinni, samræmd afhending bóluefnisins í hverju eggi og engin streita fyrir fugla [19-21] - og er aðlaðandi bólusetningaraðferð fyrir alifuglaiðnaðinn [22]. Milli 80 prósent og 90 prósent af ræktunarhænsnum sem ræktaðar eru í Bandaríkjunum eru sem stendur bólusettar með egglos tveimur til þremur dögum fyrir klekjan [23,24], og sjálfvirkni ferlisins gerir ráð fyrir að allt að 70,000 egg vera bólusett á klukkustund [23].

Á heimsvísu er þessi bólusetningaraðferð notuð í 26 af 30 leiðandi alifuglaframleiðslulöndum í heiminum [23]. Nokkur in-ovo bóluefni gegn ND eru nú fáanleg, en þau eru öll framleidd með því að nota non-NDV ferjur. Sýnt hefur verið fram á að bóluefni sem byggjast á fuglabóluveiru (FPV) sem tjá NDV F og HN próteinin sem notuð eru í egglosi vernda alifugla gegn áskorun með vNDV [25,26].

Hins vegar eru raðbrigða FPV-ND bóluefni ekki mikið notuð vegna ónæmistruflana frá fyrri FPV bólusetningum eða útsetningu (FPV er almennt til staðar í umhverfinu) og skorts á hagræðingu fyrir notkun með massaaðferðum [9]. Mest notaða ferjan fyrir raðbrigða ND í egglos bóluefnisframleiðslu er Meleagrid alphaherpesvirus 1, almennt þekktur sem herpesveira kalkúna (HVT) eða sermisgerð 3 Mareks veira [12,23]. Í Bandaríkjunum einum voru framleiddir 8,2 milljarðar skammta af raðbrigða HVT (rHVT)-ND bóluefnum árið 2018 samanborið við 3,6 milljarða skammta af hefðbundnum ND bóluefnum [27].

Til viðbótar við þann kost að vera notaður í egglosi, kalla rHVT bóluefnin sem tjá NDV prótein fram sterkt og langtíma ónæmi eftir eina notkun [28]. Ennfremur verða þau fyrir tímabundnum áhrifum af nærveru and-NDV mótefna frá móður [8]. Hins vegar hafa rHVT-ND bóluefnin ákveðnar takmarkanir, svo sem seinkaða ónæmi, og fyrri HVT bólusetning virðist vera óþolandi fyrir notkun örvunar HVT bóluefna í sömu fuglum [9,29]. HV bóluefnin eru frumutengd og þurfa að vera geymd og flutt í fljótandi köfnunarefni, sem er takmörkun á notkun þeirra í mörgum löndum.

Líkurnar á nýjum bóluefnum í eggi fara vaxandi [23]. Mismunandi ferjur hafa verið kannaðar fyrir lyfjagjöf í eggi og greint hefur verið frá efnilegum niðurstöðum með bóluefnum sem ekki endurtaka sig gegn kirtilveiru [30] og alfaveiru-vectored bóluefnum [31]. Þrátt fyrir að engar framfarir hafi orðið í venjubundinni notkun í atvinnuskyni, hefur einnig verið reynt að þróa ný bóluefni í eggjum sem ekki eru HVT NDV-vectored [32-35]. Það er áskorun að nota lifandi ND bóluefni in ovo. Þó að lifandi ND bóluefni, eins og LaSota, B1, Clone 30 og Ulster, svo eitthvað sé nefnt, veiti sterka ónæmissvörun og séu almennt notuð til að bólusetja hænur allt niður í eins dags gamla, þá tengjast þau háum fósturdauða þegar gefið eftir 18 daga fósturvísa. Tilkynnt hefur verið um allt að 100 prósent dánartíðni sem notar villigerða lágveiruvírusa og 80 prósent sem notar erfðafræðilega veiklaðar lifandi veirur eftir notkun í eggi og engin lifandi ND bóluefni eru nú notuð við þessa aðferð við bólusetningargjöf [36,37] .

Nýtt raðbrigða NDV (rNDV)-vektorað tilraunabóluefni sem inniheldur andskynjun fugla interleukin 4 innlegg (IL4), sem heitir ZJ1*l-IL4R, var nýlega sýnt fram á að vera efnilegur bóluefnisframbjóðandi í eggi eftir mat á sértækum sjúkdómsvaldandi (SPF) ) embryoned chicken egg (ECE) [38]. Þessi rannsókn miðar að því að meta frekar notagildi þessa raðbrigða NDV-vectored bóluefnis og raðbrigða burðarás þess (veiklað klofningsstaður frá villigerð veiru) og raðbrigða LaSota-IL4R veiru fyrir bólusetningu í eggi hjá 18-dagsgömlum auglýsing egg með háum mótefnatítra móður. Lauslega fáanleg bóluefni LaSota og rHVT-ND voru með sem viðmið. Að auki miðaði þessi rannsókn að því að meta verndandi virkni bóluefnanna sem rannsakað var gegn snemma áskorunum með vNDV. Hér er sýnt fram á getu þessara raðbrigða bóluefna til að sigrast á ónæmi móður á skilvirkan hátt, jafnvel í litlum skömmtum, og til að framkalla sterka ónæmissvörun. Tilrauna rNDV bóluefnin sýndu 100 prósenta vernd eftir snemma áskoranir með vNDV.

2. Efni og aðferðir

2.1. Veirur

Meindýragæs/Kína/ZJ1/2000 (ZJ1, GenBank aðgangsnúmer AF431744) NDV, meðlimur undirarfgerðar VII.1.1 (fyrrum VIId), var notuð sem áskorunarveira í þessari rannsókn. Raðbrigða ZJ1 veira (veiklað útgáfa af ZJ1) með lítið meinvirkan klofningsstað (ZJ1*L) sem áður var mynduð á rannsóknarstofu okkar með öfugri erfðafræði [39] var notuð sem burðarás til að búa til raðbrigða ZJ1*L bóluefni og sem bóluefni veira. Lítið meinvirki LaSota (LS) bóluefnisstofninn var notaður sem bóluefnisstjórnun og sem burðarás til að búa til raðbrigða LS-IL4R bóluefni. Allar vírusar voru fengnar úr geymslum Southeast Poultry Research Laboratory (SEPRL) hjá National Poultry Research Center (USNPRC), landbúnaðarráðuneyti Bandaríkjanna (USDA). Að auki var rHVT-ND bóluefni (samruna gen innskot) einnig notað sem viðmið.

Raðbrigða NDV tilraunabóluefnin sem notuð voru í þessari rannsókn voru búin til með öfugri erfðafræði, eins og áður hefur verið lýst [38,39]. Í stuttu máli var kóðunarröð fugla IL4 klónuð inn í burðarás ZJ1*L og LS í öfugri stefnu (IL4R) á milli P og M genanna, sem myndaði tvær raðbrigða veiklaðar lifandi vírusar — ​​nefnilega ZJ1*L-IL4R og LS- IL4R (GenBank aðgangsnúmer MM680659 og MM680665, í sömu röð). Raðbrigða vírusunum var bjargað með því að nota breytta vaccinia veiruna Ankara sem tjáir T7 pólýmerasa (MVA/T7), í samræmi við áður birtar samskiptareglur [38-41]. Skýringarmynd af smíðunum er að finna á aukamynd S1A. Í þessari vinnu vísar hugtakið „DV bóluefni“ sem notað er hér eftir til ZJ1*L, ZJ1*L-IL4R og LS-IL4R.

Vinnubirgðir allra NDVs voru fjölgaðir í {{0}} í 11-dagsgömul SPF fósturvísuð hænsnaegg (ECE) [42]. Veirustofnar sem notaðir voru til að sáð egg í þessari rannsókn voru þynntir í heilahjartainnrennsli (BHI) seyði (BD Biosciences, MD, Bandaríkjunum), sem innihélt 200 µg/mL gentamicin, 2{{22} }00 einingar/ml penicillíns, og 4 µg/ml amfótericín B, í þrjá mismunandi marktítra, 105,5/0,1 ml, 104,5/0,1 ml og 103,5/0,1 ml fósturvísasmit (EID50), nema LS , sem var þynnt í 105,5/0,1 mL og 104,5/0,1 mL EID50. Títrar þynntra virkra stofna lifandi bóluefna voru staðfestir með baktítrunum í 9- í 11-dagsgömul SPF ECEs samkvæmt stöðluðum aðferðum, eins og vísað er til hér að ofan. rHVT-ND bóluefnið var þynnt beint með því að nota súkrósa fosfat glútamat albúmín þynningarefni fyrir rHVT bóluefni sem lýst er í USDA Center for Veterinary Biologics Test Protocol [43].

2.2. Egg

Tvöhundruð sextíu og tvö egg í sölu (ekki SPF) úr Hy-Line Rockside W-36 tegundahópnum (Mansfield, GA, Bandaríkjunum) voru vinsamlega gefin fyrir þessa tilraun. Lagahópurinn hafði verið bólusettur reglulega með LaSota bóluefninu. Flokksónæmið hefur verið prófað reglulega með ELISA og þó að þessar niðurstöður séu ekki beinlínis þýðanlegar yfir í blóðþurrkun (HI) títra, var meðalgildi and-NDV mótefna í foreldrahópnum mjög hátt (þ.e. 15.534 með mörk fyrir jákvætt sýnishorn af 1159). Uppspretta SPF ECEs (42 egg) var SEPRL SPF White Leghorn hópurinn. Öll egg voru ræktuð við 37,5 ◦C hitastig og 55–60 prósent rakastig í 18 daga.

2.3. Bólusetning

Auglýsingaeggin (n {{{{10}}}}) og SPF (n=42) eggin, eftir 18 daga fósturvísis (DOE), voru skipt í 14 hópa með 21 eggi í hverju hópur (nema BHI og Hatch samanburðarhópar, sem voru með 26 egg hvor). Með því að nota 1 ml, 24 G × 1/2 sprautur, var hvert egg sáð inn í þankabeinsholið með 0.1 ml af þynntu bóluefni eða BHI, fyrir utan Hatch samanburðarhópinn, þar sem eggin voru ekki meðhöndluð kl. allt. Það voru þrettán hópar af sáð eggjum, skipt í sjö tilraunahópa og sex samanburðarhópa. Tilraunahóparnir sjö voru sem hér segir: ZJ1*L-IL4R 104,5, ZJ1*L-IL4R 105,5, LS-IL4R 103,5, LS-IL4R 104,5, LS-IL4R 105,5, ZJ1*L 104,5, og 101. viðkomandi EID50 skammtur af sáðefni á 0,1 ml eins og tilgreint er í nafni hópsins. Að auki voru sex viðmiðunarhópar búnir til. Tveir samanburðarhópar af eggjum í sölu voru sáð eins og lýst er hér að ofan með BHI og rHVT-ND, í sömu röð. Tveir samanburðarhópar af eggjum í sölu voru sáð eins og lýst er hér að ofan með LS 104,5 og LS 105,5 EID50 skammti af sáðefni á 0,1 ml. Tveir samanburðarhópar af SPF eggjum voru sáð með ZJ1*L 103.5 og ZJ1*L-IL4R 103.5. Skýringarmynd af rannsóknarhönnuninni er að finna á aukamynd S1B, C.

Eftir sáningu voru eggin sett í Turbofan Hova-Bator útungunarvélar (GQF Manufacturing Company Inc., GA, USA) sem síðan voru sett í einangrunartæki í líföryggisstigi 2 (ABSL-2) aðstöðu fyrir dýr. Útungunarvélunum var stillt með hitastillum til að halda stöðugu hitastigi 37,5 ◦C og rakastig á milli 55 prósent og 60 prósent.

2.4. Útungun, sýnatöku, dánartíðni

Eftir útungun við 21 DOE voru ungum hýst í undirþrýstings einangrunartækjum (ABSL-2) og veittu mat og vatni að vild. Fimm kjúklingum sem ekki voru með SPF úr bæði Hatch-viðmiðunar- og BHI-hópnum var fórnað og þeim var blæðað strax eftir klak til að ákvarða grunnlínutíter móður-NDV HI-mótefna. Allir kjúklingar voru vigtaðir 1, 8 og 13 dögum eftir klak (DPH). Munnkok- og kápuþurrkur var safnað í BHI úr hverjum fugli við 2 og 4 DPH. Klínísk einkenni og dánartíðni voru skráð tvisvar á dag á tímabilinu eftir klak og blóðsýnum var safnað við 13 DPH.

2.5. Áskorun

Tólf fuglar úr hverjum hópi (nema LS 1{{10}}5.5, þar sem allir fuglar drápust með 6 DPH) voru fluttir í ABSL-3E aðstöðuna á 13 DPH. Fuglarnir voru settir í undirþrýstings einangrunartæki og látnir aðlagast í 24 klst fyrir áskorunina. Allir fuglar fengu ögrun við 14 DPH með meinvirku ZJ1 NDV við 106 EID50/0,1 ml með auga-nefleiðinni. Fylgst var með fuglum daglega með tilliti til klínískra einkenna og dánartíðni. Munnkok- og kápuþurrkur voru teknar af hverjum fugli 2 og 4 dögum eftir áskorun (DPC). Allir fuglar sem lifðu voru vigtaðir og þeim blæddi við 14 DPC og var aflífað með leghálsi eftir svæfingu með 0,2 ml ketamín/xýlasín lausn (66 mg/ml ketamín og 6,6 mg/ml xýlazín) gefið í vöðva með 25- nál.

2.6. Rauntíma RT-PCR

RNA var dregið úr öllum þurrkumiðlum með því að nota MagMAX 96 AI/ND veiru RNA einangrunarbúnaðinn (Ambion, Inc. Austin, TX, USA) með KingFisher segulmagnaðir örgjörva (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Bandaríkjunum) eftir leiðbeiningum framleiðanda. , með breytingunni á því að fjarlægja hemil sem lýst er af Das et al. [44]. Megindleg rauntíma RT-PCR (rRT-PCR) fyrir NDV greiningu sem miðar að fylkis (M) geninu var framkvæmd með því að nota AgPath-ID eins skrefs RT-PCR Kit (Ambion) og ABI 750{{31 }} Hratt rauntíma PCR kerfi (Applied Biosystems, Waltham, MA, USA) sem notar primera og rannsaka sem áður hefur verið lýst af Wise o.fl. [45]. Greiningarskilyrðin voru öfug umritun í 10 mín. við 45 ◦C; upphafsdenaturation í 10 mín. við 95 ◦C; 40 hringir af eðlisbreytingu í 10 sekúndur við 94 ◦C, grunnhitun í 30 sekúndur við 56 ◦C, og grunnlenging í 10 sekúndur við 72 ◦C. Heildarhvarfsrúmmálið 25 µL fyrir hvert sýni samanstóð af vatni af sameindagráðu — 2,5 µL; 2X biðminni—12,5 µL; áfram grunnur—0,25 µL (20pmol/µL); öfugur grunnur—0,25 µL (20 pmol/µL); rannsaka—0,50 µL (6pmol/µL); 25X ensímblanda—1,0 µL; og RNA sniðmát— 8,0 µL. Fyrir magngreiningu veirunnar var komið á staðlaðri feril fyrir hverja veiru, þar sem RNA er dregið úr sama títraða stofni veiranna sem notaðir voru til að sáð var fyrir eggin (fyrir þurrkusýnin sem safnað var eftir klak) eða ögrunarveiru (fyrir þurrkusýnin sem safnað var eftir klak). -áskorun).

Niðurstöðurnar eru tilkynntar sem EID50/ml. Reiknuð neðri greiningarmörk greininganna voru á milli 101,7 og 101,9 EID50/ml. Það er mikilvægt að hafa í huga að rRTPCR greinir veirukjarnsýrur og að áætluð gildi tákna ekki endilega smitandi veirur. EID50/mL gildin miða ekki að því að sýna smithættu og eru notuð til að veita aðferð til að bera hlutfallslegan samanburð á veirulosun milli hópa. Þrátt fyrir notkun á útdráttaraðferðum til að fjarlægja hemla kjarnsýrur, gæti mikið magn RNA sniðmáts haft áhrif á útreikninga frá stöðluðu ferlinum. Athygli vekur að sama magn af RNA sniðmáti var notað í öllum viðbrögðum og hugsanlegir leifarhemlar hefðu haft jafn áhrif á allar niðurstöður.

2.7. HI próf

Blóðmagnshömlunarprófun (HI) var notuð til að meta tilvist og títra mótefna í sermissýnunum sem safnað var í gegnum tilraunina. Eftir stöðluðum aðferðum [46] var veiran sem notuð var sem burðarás hvers bóluefnis notuð sem mótefnavaki fyrir hvern hóp sermi (ZJ1*L fyrir alla ZJ1 hópa og LS fyrir alla LS hópa). Fyrir sermissýnin sem safnað var eftir áskorun var illvíga ZJ1 veiran notuð sem mótefnavaki í HI prófinu. Títrar voru reiknaðir sem gagnkvæmir síðustu HI-jákvæðu sermisþynninguna og sýni með HI títra log2 3 og lægri voru talin neikvæð.

2.8. Tölfræðigreiningar

Prism v.7.03 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA) hugbúnaður var notaður til að greina gögnin og frávik voru auðkennd með ROUT prófinu. D'Agostino–Pearson eðlilegleikaprófið var gert til að meta hvort gildin í hverjum hópi kæmu frá Gaussdreifingu. Byggt á eðlilega dreifingunni var Kruskal–Wallis prófið sem ekki var parametrískt með Dunn's post-prófi notað fyrir margvíslegan samanburð á milli hópa. Í tölfræðilegum tilgangi fengu öll þurrkusýni, sem veirur greindust ekki úr, tölugildið 1 log undir greiningarmörkum fyrir hverja veiru. Lifunarferlar voru greindir með Log-rank (Mantel-Cox) prófinu. Tölfræðileg marktækni var sett á p-gildið < 0,05.

3. Úrslit

3.1. Útungunarhæfni, lifun eftir klak og líkamsþyngd

Lifun eftir klak fyrir alla hópa sem klakaðir eru úr eggjum í atvinnuskyni er sýnd sem lifunarferlar á mynd 1 (aðskilin á myndum 1A og B til skýrleika og til að koma í veg fyrir þrengsli í grafíkinni). Samsett línurit er fáanlegt á aukamynd S2. Hatch samanburðarhópurinn (ekki sáð) var innifalinn í hönnuninni til að tryggja að engin óeðlileg klakhæfni eða dánartíðni eftir klak væri ekki tengd við sáningu egganna.

Eins og við var að búast kom fram mjög lág (rHVT-ND) eða engin (Hatch og BHI) dánartíðni eftir klak í þremur af samanburðarhópunum. Aftur á móti höfðu LS samanburðarhóparnir 57,1 prósent og 0 prósent lifun þegar 104,5 og 105,5 skammtarnir voru notaðir, í sömu röð, sem áður hefur verið greint frá fyrir hefðbundin ND lifandi bóluefni. Tvö egg klöktust ekki í LS-IL4R 105,5 hópnum og eitt egg klöktust ekki í LS 104,5 hópnum. Breytileg dánartíðni kom fram í hinum hópunum eftir bóluefninu og sáningarskammti. ZJ1*L-IL4R 104,5 og 105,5 hóparnir voru með 90,5 prósent og 71,4 prósent lifun, í sömu röð, og lifunin skráð í ZJ1*L 104,5 og 105,5 hópunum var 80,9 prósent og 76,2 prósent, í sömu röð, en munurinn var í sömu röð (Mynd) ekki tölfræðilega marktækt. Lifun í LS-IL4R 103,5 hópnum var 95,2 prósent. Lifun sem sást í LS-IL4R 104,5 og 105,5 hópunum var 85,7 prósent og 66,7 prósent, í sömu röð (Mynd 1B).

Enginn marktækur munur var á lifun milli tilrauna ZJ1*L, ZJ1*L-IL4R og LS-IL4R bóluefnishópanna og Hatch, BHI og rHVT-ND samanburðarhópanna, en hlutfall lifun í þessum samanburðarhópum var tölulega hærra , með neikvæðri fylgni á milli skammta bóluefnis og lifun eftir klak (lifun jókst eftir því sem bóluefnisskammtur minnkaði). LS 1{{10}}5.5 samanburðarhópurinn var með marktækan mun á lifun samanborið við tilraunahópana (p gildi á milli 0.0001 og 0,02). LS 104.5 samanburðarhópurinn, þó ekki tölfræðilega ólíkur, var með verulega lægri lifunartíðni samanborið við tilraunahópana með sama skammt. LS samanburðarhóparnir tveir höfðu marktækan mun á lifun samanborið við Hatch, BHI og rHVT-ND samanburðarhópana (p gildi á milli 0,0001 og 0,04). Klínísk einkenni komu ekki fram hjá neinum hópanna eftir klak. Í hópunum þar sem dauðsföll voru til staðar eftir klak fundust fuglarnir dauðir við daglegt eftirlit.

Allir fuglar voru vigtaðir á dögum 1, 8 og 13 eftir klak (tafla 1). Við 1 DPH var meðallíkamsþyngd á fugl í flestum hópum á milli 38,5 og 42,6 grömm (g). Marktækur líkamsþyngdarmunur var aðeins á milli rHVT-ND og ZJ1*L-IL4R 104,5 hópa frá annarri hlið og ZJ1*L 104,5 og samanburðar LS 1{{4{{42} }}}4,5 frá öðrum (fuglarnir í fyrstu tveimur hópunum vógu meira en fuglarnir í samanburðarhópnum) (p gildi á milli 0.0001 og 0,017, í sömu röð). Við 8 DPH voru ZJ1*L hóparnir tveir og LS-IL4R 104.5, LS-IL4R 105.5 hópurinn og LS samanburðarhópurinn (meðalþyngd 50–63 g) með líkamsþyngd marktækt lægri samanborið við fuglana úr lúgunni, BHI, og rHVT-ND samanburðarhópar (meðalþyngd 77–82 g) (p gildi á milli 0,0001 og 0,03). Sömu hópar sem voru marktækt ólíkir viðmiðunarhópum við 8 DPH (nema LS-IL4R 104,5) höfðu marktækt lægri líkamsþyngd en Hatch, BHI og rHVT-ND hópar við 13 DPH líka (p gildi á milli 0,0001 og 0,01). Fuglarnir úr sáð SPF samanburðarhópunum voru ekki teknir með í þessum samanburði, þar sem SPF egg (og fuglarnir sem klakið hafa verið út úr þeim) eru jafnan minni og léttari en egg í sölu.

Mynd 1. Lifun kjúklinga eftir útungun eftir sáningu á eggjum í atvinnuskyni 18 daga frá fósturvísaþjóð með tilrauna NDV bóluefni í eggi. Hy-Line Rockside W-36 egg voru sáð með raðbrigðavírusum og LaSota. Þrír samanburðarhópar voru sáðir með BHI eða rHVT-ND bóluefni, eða ekki sáð (Hatch samanburðarhópur). Fylgst var með fuglum í 13 daga eftir klak. Lifunarferlar eru sýndir á tveimur myndum: (A) samanburðarhópar og ZJ1*L hópar og (B) viðmiðunarhópar og LS-IL4R hópar. Mismunandi yfirskriftarstafir gefa til kynna tölfræðilega marktækan mun á milli hópa (p-gildi < 0.05). Skammstafanir hópa: HATCH—egg ekki sáð; BHI—egg sáð með BHI; rHVT-ND—egg sáð með raðbrigða HVT bóluefni; ZJ1*L—egg sáð með raðbrigða ZJ1*L veirunni þar sem klofningsstaðurinn var breyttur til að vera af lítilli meinvirkni; ZJ1*L-IL4R—egg sáð með raðbrigða litlu meinvirku ZJ1*L með interleukin-4 geninu sett í öfuga stefnu; LS—egg sáð með LaSota stofninum; LS-IL4R—egg sáð með raðbrigða LaSota veirunni með interleukin-4 geninu sett í öfuga stefnu. Veiruskammturinn sem eggin í hverjum hópi fengu er táknaður sem tala á eftir hópnafninu í EID50/hvert egg.

Tafla 1. Meðalþyngd (og staðalfrávik) kjúklinga 1, 8 og 13 dögum eftir klak eftir sáningu á eggjum í atvinnuskyni á 18 dögum af fósturvísaþjóð með tilraunabóluefnum í eggi og 14 dögum eftir áskorun með illvígum Newcastle-sjúkdómi veira.

3.2. Losun á bóluefnisvírusum eftir bólusetningu, eins og sýnt er fram á með rRT-PCR

Við 2 DPH var enginn marktækur munur á veirulosun meðal bóluefnahópa. (Mynd 2A). Á sama hátt, við 4 DPH, var munurinn á milli hópa ekki tölfræðilega marktækur. (Mynd 2B). Engin veiruútfelling greindist hjá neinum Hatch- og BHI-viðmiðunarfuglunum.

Mynd 2. Meðaltal bóluefnislosunar eftir klak úr kjúklingum sem klakið var út úr eggjum í atvinnuskyni sem sáð var 18 daga frá fósturvísaþjóð með tilraunabóluefnum í eggi. Hver gagnapunktur táknar einn fugl og NDV títra sem greindust í munnkok (OP) og cloacal (CL) strokum á mismunandi dögum eftir klak (DPH). Losun er sýnd sérstaklega í 2 daga eftir klak (A) og 4 daga eftir klak (B). Súlur tákna staðalfrávik meðaltalsins. Allar þurrkur sem veiran greindist ekki úr fengu tölugildi 1 log undir greiningarmörkum fyrir hvern og einn veira. Greiningarmörk rRT-PCR eru sett fram sem lárétt punktalína (lægstu mörkin eru notuð). Skammstafanir hópa: HATCH—egg ekki sáð; BHI—egg sáð með BHI; rHVT-ND—egg sáð með raðbrigða HVT bóluefni; ZJ1*L—egg sáð með raðbrigða ZJ1*L veirunni þar sem klofningsstaðurinn var breyttur til að vera af lítilli meinvirkni; ZJ1*L-IL4R—egg sáð með raðbrigða litlu meinvirku ZJ1*L með interleukin-4 geninu sett í öfuga stefnu; LS—egg sáð með LaSota stofninum; LS-IL4R—egg sáð með raðbrigða LaSota veirunni með interleukin-4 geninu sett í öfuga stefnu. Veiruskammturinn sem eggin í hverjum hópi fengu er táknaður sem tala á eftir hópnafninu í EID50/hvert egg.

3.3. Húmorísk ónæmissvörun eftir klak

Greining á sermissýnum sem safnað var við 13 DPH (skárönd fylltar stangir) með HI prófi (greinir blóðkekkjumótefni gegn NDV) er sýnd á mynd 3. Til að ákvarða títra aðgerðalaust yfirfærðra HI mótefna gegn NDV móður í auglýsingum eggjum, tíu Hænum var blóðgað strax eftir klak (0 DPH). HI titrarnir við klak voru mismunandi á milli log2 5 og log2 8, með meðaltal log2 7.17 (Mynd 3, lárétt punktalína). Mótefnin við 13 DPH í Hatch, BHI og rHVT-ND hópunum (meðaltal log2 4.7) eru leifar móðurmótefna, þar sem þessir hópar voru annað hvort ekki bólusettir eða bólusettir með rHVT-ND bóluefni, sem gerir ekki framkalla HI mótefni gegn NDV. Mótefnatítrar í ZJ1*L, ZJ1*L-IL4R og LS 104.5 hópunum voru marktækt hærri samanborið við Hatch, BHI og rHVT-ND samanburðarhópana. Enginn marktækur munur kom fram á milli mismunandi skammtahópa bóluefna með sama hryggjarlið. LS-IL4R hóparnir höfðu lægri HI títra eftir bólusetningu samanborið við ZJ1*L-IL4R og ZJ1*L hópana, þó þessi munur væri ekki tölfræðilega marktækur. Athygli vekur að þótt tölulega sé aðeins hærri voru HI títrar fuglanna í öllum LS-IL4R hópum eftir bólusetningu ekki marktækt frábrugðnir títrunum sem mældir voru hjá óbólusettum samanburðarfuglum.

Mynd 3. HI mótefnatítrar fyrir og eftir áskorun (og staðalfrávik) úr kjúklingum sem klakið var út úr eggjum í atvinnuskyni sem sáð var 18 daga frá fósturvísaþjóð með tilraunabóluefnum í eggi og snemma áskorun með illvígri Newcastle-veiki veiru 14 dögum eftir klak. Skálaga röndfylltu súlurnar tákna títra fyrir áskorun 13 dögum eftir klak. Heildarfylltu súlurnar tákna títra eftir áskorun 14 dögum eftir áskorun. Tölfræðilega marktækur munur á milli mismunandi hópa er sýndur með litlum stöfum fyrir ofan hvern hóp (p-gildi<0.05). The level of maternal antibodies on the day of hatch (0 DPH) is presented as a horizontal dotted line. Group abbreviations: HATCH—eggs not inoculated; BHI—eggs inoculated with BHI; rHVT-ND—eggs inoculated with recombinant HVT vaccine; ZJ1*L—eggs inoculated with the recombinant ZJ1*L virus whose cleavage site was modified to be of low virulence; ZJ1*L-IL4R—eggs inoculated with the recombinant low virulent ZJ1*L with the interleukin-4 gene inserted in reverse orientation; LS—eggs inoculated with the LaSota strain; LS-IL4R—eggs inoculated with the recombinant LaSota virus with the interleukin-4 gene inserted in reverse orientation. The virus dose that the eggs in each group received is represented as a number after the group name in EID50/per egg.

3.4. Klínísk einkenni og lifun eftir snemma áskorun með CDV

Í samanburðarhópunum voru fyrstu klínísku einkennin sem komu fram í Hatch og BHI hópunum við 3 DPC. Þrír fuglar í Hatch hópnum og einn í BHI hópnum höfðu erfiða andardrátt. Við 4 DPC sáust úfnar fjaðrir og höfuðskjálfti í BHI og útungunarhópunum og við 5 DPC í rHVT-ND hópnum; í síðarnefnda hópnum mældust einnig ataxía og alvarleg torticollis hjá tveimur fuglum. Fuglarnir í Hatch samanburðarhópnum sýndu svefnhöfga við 5 DPC og tveir fuglar í BHI hópnum sýndu lömun. Svefn og lömun komu fram í rHVT-ND hópnum við 6 og 7 DPC. Opisthotonos, torticollis og erfið öndun sáust í Hatch og BHI samanburðarhópunum frá 9 DPC. Í rHVT-ND hópnum sást torticollis strax og 5 DPC, erfið öndun og hreyfihömlun hófst við 6 DPC og opisthotonos hófst við 13 DPC. Eftir 14 DPC dóu allir fuglar nema tveir Hatch, einn BHI og tveir rHVT-ND fuglar (83,3 prósent, 91,6 prósent og 83,3 prósent veikindi, í sömu röð) annaðhvort dáið eða þróað aðallega taugafræðileg klínísk einkenni eins og ataxia, opisthotonus, torticollis , og lamar. Fuglar sem sýndu alvarleg klínísk einkenni, hættu að borða eða drekka eða voru liggjandi voru aflífaðir og tilkynntir sem dauðir daginn eftir til að reikna út lifunartíma. Engin klínísk einkenni sáust í neinum af ZJ1*L og ZJ1*L-IL4R hópunum. Lítil klínísk einkenni opisthotonos eða torticollis sáust hjá einum fugli (8,4 prósent veikindi) í hverjum LS-IL4R hópnum og LS 104,5 hópnum við 14 DPC.

Lifun eftir áskorun með illvíga ZJ1 NDV er sýnd sem lifunarferlar á mynd 4. Þó að allir hópar sem voru sáðir með raðbrigðabóluefninu og LS sýndu 100 prósent lifun, voru fuglarnir í Hatch, BHI og rHVT-ND hópunum með 58,3 prósent, 58,3 prósent og 66,6 prósent lifun, í sömu röð. Lifun eftir áskorun í Hatch og BHI samanburðarhópunum var marktækt lægri samanborið við tilrauna bóluefnishópana. Athygli vekur að þó að líkamsþyngd fuglanna í sáðhópunum hafi sveiflast eftir klak samanborið við Hatch, BHI og rHVT-ND viðmiðunarhópana, fóru allir rNDV bólusettu fuglarnir (282–328 g) yfir líkamsþyngd þeirra óbólusettu. stjórna fuglum eftir áskorun (255–266 g) (tafla 1). Hins vegar sást enginn marktækur líkamsþyngdarmunur á milli neinna hópa sem rannsakaðir voru.

Mynd 4. Lifun hænsna eftir sáningu á eggjum í atvinnuskyni 18 daga frá fósturvísaþjóð með tilraunabóluefnum í eggi og snemma áskorun með illvígri Newcastle-veikiveiru 14 dögum eftir klak. Fylgst var með fuglum í 14 daga eftir áskorun. Mismunandi yfirskriftarstafir gefa til kynna tölfræðilega marktækan mun á milli hópa (p-gildi < 0.05). Skammstafanir hópa: HATCH—egg ekki sáð; BHI—egg sáð með BHI; rHVT-ND—egg sáð með raðbrigða HVT bóluefni; ZJ1*L—egg sáð með raðbrigða ZJ1*L veirunni þar sem klofningsstaðurinn var breyttur til að vera af lítilli meinvirkni; ZJ1*L-IL4R—egg sáð með raðbrigða litlu meinvirku ZJ1*L með interleukin-4 geninu sett í öfuga stefnu; LS—egg sáð með LaSota stofninum; LS-IL4R—egg sáð með raðbrigða LaSota veirunni með interleukin-4 geninu sett í öfuga stefnu. Veiruskammturinn sem eggin í hverjum hópi fengu er táknaður sem tala á eftir hópnafninu í EID50/hvert egg.

3.5. Losun eftir áskorun eins og sýnt er með rRT-PCR

Við 2 DPC losuðu fuglarnir í Hatch-, BHI- og rHVT-ND samanburðarhópunum háum veirutítrum (1{{20}}5,3–5,7 EID50/ml) í gegnum inntöku, en allir bóluefnishópar var með lægri en 104 EID50/mL meðaltal losunartítra (Mynd 5A). Niðurstöður fyrir veirulosun í gegnum cloaca voru undir greiningarmörkum prófunar í öllum hópum. Við 2 DPC höfðu fuglarnir í öllum ZJ1*L og ZJ1*L-IL4R hópunum og þeir í LS-IL4R 105.5 hópnum marktækt minna veiru-RNA greind með inntöku samanborið við Hatch, BHI og rHVT-ND samanburðarhópana (p gildi voru á bilinu 0,001 til 0,02). Við 4 DPC var losun í gegnum munnleiðina í Hatch, BHI og rHVT-ND hópunum mikil (106,2-6,9 EID50/mL) (Mynd 5B).

Aftur á móti sást minni losun í öllum bóluefnishópum við 4 DPC samanborið við 2 DPC, með hæsta meðaltíternum 102,9 EID50/ml í ZJ1*L 104,5 hópnum og lægsta meðaltalið 101,5 EID50/ml í ZJ1* l-IL4R 104.5 hópur (veiru-RNA fannst ekki í sumum fuglum). Allir tilraunahópar um rNDV bóluefni varpa marktækt minni veiru í gegnum inntöku samanborið við Hatch, BHI og rHVT-ND samanburðarhópa (p gildi frá<0.0001 to 0.03). No significant differences in oral shedding were observed among the experimental rNDV vaccine groups. The birds in the rNDV vaccine groups shed significantly less virus through the cloacal route compared with the Hatch, BHI, and rHVT-ND control groups (p values from <0.0001 to 0.007). The differences in the titers were not significant among the experimental rNDV vaccine groups and the LS control group.

Mynd 5. Meðaltal veirulosunar eftir áskorun frá kjúklingum eftir sáningu á eggjum í atvinnuskyni á 18 dögum frá fósturvísisþjóð með tilraunabóluefnum í eggi og snemma áskorun með illvígri Newcastle-veiki veiru 14 dögum eftir klak. Hver gagnapunktur táknar NDV títra sem greindust í munnkoki (OP) og cloacal (CL) þurrku á mismunandi dögum eftir áskorun (DPC). Losun er sýnd sérstaklega í 2 daga eftir áskorun (A) og 4 daga eftir áskorun (B). Súlur tákna staðalfrávik meðaltalsins. Öll þurrkur sem veiran greindist ekki úr fengu tölugildi 1 log undir greiningarmörkum. Greiningarmörk rRT-PCR eru sett fram sem lárétt punktalína.

Tölfræðilega marktækur munur á milli mismunandi hópa er sýndur með lágstöfum fyrir ofan hvern hóp (p-gildi < 0.05). Skammstafanir hópa: HATCH—egg ekki sáð; BHI—egg sáð með BHI; rHVT-ND—egg sáð með raðbrigða HVT bóluefni; ZJ1*L—egg sáð með raðbrigða ZJ1*L veirunni þar sem klofningsstaðurinn var breyttur til að vera af lítilli meinvirkni; ZJ1*L-IL4R—egg sáð með raðbrigða litlu meinvirku ZJ1*L með interleukin-4 geninu sett í öfuga stefnu; LS—egg sáð með LaSota stofninum; LS-IL4R—egg sáð með raðbrigða LaSota veirunni með interleukin-4 geninu sett í öfuga stefnu. Veiruskammturinn sem eggin í hverjum hópi fengu er táknaður sem tala á eftir hópnafninu í EID50/hvert egg.

3.6. Sermi eftir áskorun

Allir fuglar í Hatch-, BHI- og rHVT-ND samanburðarhópunum sýndu aukna (meira en tvöfalda) HI-mótefnatítra við 14 DPC (yfir log2 10) samanborið við títra fyrir áskorun við 13 DPH (log{ {6}}.7). Munurinn á titrum í þessum þremur hópum fyrir og eftir áskorun var marktækur (p-gildi<0.0001) (Figure 3, solid bars). In contrast, the post-challenge HI titers in all experimental rNDV vaccine groups and the LS control group did not change significantly compared with the pre-challenge titers of the same groups. In all groups, the differences between pre-and post-challenge antibody titers were within a log (except LS-ILR4 103.5, in which the difference was log2 1.8).

3.7. Sátaðir SPF stjórnhópar

Lifun í SPF samanburðarhópunum eftir klak var 66,7 prósent í hópnum sem sáð var með ZJ1*L 103,5 og 57,1 prósent í hópnum sem sáð var með ZJ1*L-IL4R 103,5 (viðbótarmynd S3A). Virkur veirulosun greindist hjá fuglunum í SPF samanburðarhópunum með báðum leiðum, með hærri títra greindust í munnkoksþurrkunarsýnum (sjá viðbótarmynd S3B). HI títrar eftir bólusetningu hjá sáð SPF samanburðarfuglum voru hærri en títrar í Hatch, BHI og rHVT-ND samanburðarhópunum og náðu meðalgildum log2 7.08 og log2 7. 58 við 13 DPH í ZJ1*L-IL4R 103.5 og ZJ1*L-IL4R 103.5 hópunum, í sömu röð (sjá viðbótarmynd S3C). Engin klínísk einkenni eða dánartíðni eftir áskorun sáust í samanburðarhópunum tveimur sem sáðu með SPF (sjá viðbótarmynd S3D fyrir lifunarferla). Fuglarnir úr sáð SPF samanburðarhópunum losa marktækt minni veiru um munn við 2 DPC og 4 DPC samanborið við samanburðarhópana (p gildi frá<0.0001 to 0.009) (see Supplementary Figure S3E). The post-challenge antibody titers in both inoculated SPF control groups did not change significantly compared with the pre-challenge titers of the same groups (see Supplementary Figure S3C).

For more information:1950477648nn@gmail.com