Taugaverndaráhrif og verkunarháttur prósýanídína in vitro og in vivo hluti 2

Vinsamlegast hafðu sambandoscar.xiao@wecistanche.comfyrir meiri upplýsingar

3. Umræður

Fjölmargar rannsóknir hafa sýnt að tölvur sýna sterka róteindaeyðandi og andoxunarvirkni ]25-27I, og að oxunarálag sem stafar af of mikilli framleiðslu á ROS og/eða skerðingu á andoxunarvarnarkerfinu gegnir mikilvægu hlutverki í taugahrörnunarsjúkdómum [ -6,28,29]. Hins vegar eru taugaverndandi áhrif og aðferðir PCs varðandi oxunarskemmdir enn óljósar. Þess vegna rannsakaði þessi rannsókn áhrif og aðferðir PC-tölva í taugavernd.

Vinsamlegast smelltu hér til að vita meira

Í þessari rannsókn bætti viðeigandi styrkur PCs magn andoxunarensíma, þar á meðal GSH-Px, CAT og SOD, en lækkaði magn ROS og MDA í líkönum af oxunarskemmdum samanborið við mælingar með H, O, eingöngu. Þessar núverandi niðurstöður voru í samræmi við fyrri rannsóknir sem bentu til þess að lítið PC viðbót með mataræði getur bætt virkni GSH-Px, CAT og SOD hjá vanvana grísum [30]. Önnur rannsókn benti einnig til þess að PC-tölvur juku marktækt CAT og SOD virkni og minnkuðu MDA innihald og bættu þannig gæði geitasæðis [31].

Cistanche getur bætt ónæmi

Nrf2/ARE leiðin er mikilvæg andoxunarferill [32-34]. Venjulega er Nrf2 í umfrymi, þar sem það er bundið hömlunarpróteininu, Keap135,36]. Við H2O2 örvun, greinist Nrf2 frá Keap1, ræsir innræna andoxunarvarnarkerfið og færist í kjölfarið yfir í kjarnann [34,37,38]. Það hefur síðan samskipti við ARE til að virkja röð frumuverndar- og andoxunargena, þar á meðal GCLC, GCLM, NOO1 og HO-139,40]. Til að bregðast við oxunarálagi, svipað og breytingar sem sjást við H-O2 örvun, losnar Nrf2 frá Keap1 í umfrymi og er síðan fluttur inn í kjarnann, bindur við ARE röðina til að virkja umritun á frostverndandi genum [41,42]. Við sáum að viðeigandi styrkur PCs auðveldaði staðsetningu Nrf2 í kjarna við H, O2-skemmdir í PC12 frumum. Þar að auki hækkaði viðeigandi styrkur PC-tölva tjáningarstig NOO1, HO-1, GCLM og GCLC, sem öll geta beint virkað til að útrýma sindurefnum og oxandi sameindum [43]. Þess vegna sýndu þessar niðurstöður að viðeigandi styrkur PCs jók magn af Nrf2/ARE leiðinni. Næst var Nfr2 genaþöggun í gegnum Nrf2 siRNA notuð til að meta frekar hlutverk Nrf2/ARE virkjunar í PC-miðlaðri taugavörn gegn H, O2-framkölluðum oxunarskemmdum. Nrf2-siRNA-umbreyttar frumur bentu til marktækrar lækkunar á Nrf2 tjáningu. Á sama tíma komumst við að því að Nrf2 útsláttur afnam PC-miðlaða vörn gegn H2O, meðhöndluðum skerðingum á lífvænleika frumna, og Nrf2 útsláttur afnam einnig andoxunaráhrif PCs. Þessar niðurstöður voru í samræmi við fyrri rannsókn sem benti til þess að bætt virkjun Nrf2/ARE ferilsins stuðlar að taugavernd [44]. Þess vegna benda þessar niðurstöður til þess að Nrf2/ARE ferillinn geti verið lyfjafræðilegt markmið PC-tölva til að koma í veg fyrir taugahrörnun.

4. Efniviður og aðferðir 4.1. Efni og hvarfefni

H2O2 var keypt frá HUSHI (HUSHI, Shanghai, Kína). CCK-8, NAC var keypt frá Beyotime (Beyotime, Shanghai, Kína). PC, 2',7/-díklórfluorescein díasetat, MDA, GSH-Px, SOD greiningarsett og CAT greiningarsett voru keypt frá Solarbio (Solarbio, Peking, Kína).RNAi Plus, PrimeScript RT hvarfefnissett með gDNA Eraser og SYBR Premix Ex Tag II var keypt frá Takara (Takara, Shiga, Japan). Nrf2-siRNA, stjórn-siRNA og lipofectamine 2000 voru fengin frá GenePharma (GenePharma, Shanghai, Kína). Eftirfarandi aðal mótefni og samsvarandi aukamótefni voru fengin frá Proteintech (Proteintech, Wuhan, Kína): Nrf2, HO-1, GCLC, GCLM, NAD(P)H: NQO1, lamin B og GAPDH.

4.2. Frumumenning

PC12 frumur voru fengnar úr National Collection of Authenticated Cell Cultures. Frumunum var haldið í DMEM miðli sem bætt var við 10 prósent nautgripafóstursermi og penicillín-streptomycini (100 U/mL; 100 ug/mL) í rakaðri hitakassa við 37 gráður með 5 prósent CO2.

4.3. Frumulífvænleikapróf

PC12 frumum var sáð í 96-brunnsplötur með þéttleikanum 1×104 frumur/brunn. Frumurnar voru útsettar fyrir mismunandi styrk PCs eða NAC (20 μM) í 24 klst, eftir það voru þær ræktaðar með 200 μM af H2O2, í 24 klst. Næst var 10 μLof CCK-8lausn bætt í hvern brunn og ræktuð í 1 klst., eftir það var gleypni mæld við 450 nm.

4.4. Viðhald fisks

Siðferðilegt samþykki fyrir notkun dýra var veitt af dýraverndunar- og notkunarnefnd tilraunadýramiðstöðvarinnar við háskólann í Zhejiang (ZJU20200125). Fullorðinn sebrafiskur (Danio rerio, AB stofn) var fenginn frá tilraunadýramiðstöð Zhejiang háskólans og honum haldið við 28±1C undir 14/10-klst ljós/myrkri hringrás [21J. Fiskunum var gefið Artemia nauplii tvisvar á dag. Til að framleiða fósturvísa voru fullorðnir sebrafiskar settir yfir nótt í ræktunarkerum í 1:1, karl:kvenkyns hlutfalli. Hrygning var sett af stað innan 2 klst. eftir að ljósin voru kveikt næsta morgun. Fósturvísar voru aldir upp í fósturvísavatni við 28 gráður [45].

4.5. ROS mælingar

Til að mæla ROS framleiðslu in vivo, voru sebrafiskalirfur (AB stofn), 3 dögum eftir frjóvgun (pdf) útsettar fyrir NAC (30 μM) eða ýmsum styrkjum PCs í fjarveru eða viðveru 300 μM af H,O, í 4 daga. Í kjölfarið, á 7 pdf, voru mismunandi meðferðarhópar fluttir yfir á 24-brunnsplötu (10 sebrafiskalirfur í hverjum hóp) meðhöndlaðir með 20 uM af 2',7'-díklórflúorescein díasetatlausn og voru ræktaðir í 60 mínútur í myrkrið við 28,5 gráður C[46]. Því næst voru lirfurnar þvegnar þrisvar sinnum með fósturvísamiðli til að fjarlægja umfram 2'7'-díklórfluorescein díasetat. Lituðu lirfurnar voru síðan skoðaðar og myndaðar undir Olympus leysiskönnun confocal smásjá. Flúrljómunarstyrkur hverrar einstakrar lirfu var magngreindur með Image] hugbúnaði.

Til að mæla ROS framleiðslu In vitro var PC12 frumum sáð í 6-brunnsplötur með þéttleikanum 2×10* frumur/brunn. Frumurnar voru útsettar fyrir mismunandi styrk PCs eða NAC (20 uM) í 24 klst og voru síðan ræktaðar með 200 uM af H2O, í 24 klst. Frumurnar voru ræktaðar með 10 μM af 2',7'-díklórfluorescein díasetatlausn í myrkri í 30 mínútur; eftir það var litarlausnin fjarlægð og frumurnar þvegnar þrisvar sinnum í fosfat-jafnaðar saltvatni. Frumurnar voru síðan skoðaðar og myndaðar undir Olympus leysiskönnun confocal smásjá. Flúrljómunarstyrkur frumanna var magngreindur með Image] hugbúnaði.

4.6. Mat á MDA, GSH-Px, SOD og CAT

Sebrafiskalirfur （AB stofn） at3 pdf voru útsettar fyrir NAC （30 μM） eða ýmsum styrkjum PCs í fjarveru eða viðveru 300 uM H2O, í 4 daga. 7 dpf sebrafiskurinn var svæfður með tetrakaíni og einsleitur eftir líknardráp á ís. MDA, GSH-Px, CAT og SOD voru greind samtímis, samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Hver tilraun innihélt 20 lirfur og hver mældur stuðull var endurtekinn í þríriti.

PC12 frumum var sáð í 6-brunnsplötur með þéttleikanum 2× 10* frumur/holu. Frumurnar voru útsettar fyrir mismunandi styrk PCs eða NAC (20 uM) í 24 klst og voru síðan ræktaðar með 200 uM af H2O í 24 klst. PC12 frumum var næst safnað og þær ræktaðar með lýsisbuffi. MDA, GSH-Px, SOD og CAT starfsemi voru mæld með samsvarandi prófunarsettum, í samræmi við samskiptareglur hvers framleiðanda. Hver mældur stuðull var endurtekinn í þrígang.

4.7. Heildar RNA útdráttur, öfug umritun og magnbundin rauntíma pólýmerasa keðjuverkun

Sebrafiskalirfur (AB-stofn) við 3 dpf voru útsettar fyrir NAC (30 μM) eða ýmsum styrkjum PCs í fjarveru eða viðveru 300 uM af H, O, í 4 daga. Eftir meðferðir var RNA dregið út með því að nota RNAiso, eftir leiðbeiningum framleiðanda. RNA var öfugt umritað með því að nota PrimeScript RT Kit með gDNA strokleðri, eftir leiðbeiningum framleiðanda (Takara, Shiga, Japan). Megindleg rauntíma PCR var framkvæmd með Applied Biosystems Vi-7 rauntíma PCR kerfi með því að nota SYBR Premix Ex TaqII -actin var notað sem viðmiðunargen og hlutfallsleg genatjáning var reiknuð með 2-AACt aðferð. Grunnraðirnar sem notaðar eru eru taldar upp í töflu 1.

4.8. Nrf2 siRNA Transfection

Nrf2-siRNA var notað til að fella Nrf2. PC12 frumur voru sáð í 6-brunn ræktunarplötur og voru síðan transsectaðar með Nrf2-siRNA (80 nM) eða viðmiðunar-siRNA með því að nota Lipofectamine 2000, samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda.

4.9.Undirbúningur heilfrumu-, frumu- og kjarnapróteina

Til útdráttar heilfrumupróteina var frumum safnað saman og þær ræktaðar með RIPA lysisbuffi sem innihélt 1 prósent PMSF og 1 prósent próteasahemla kokteil í 30 mínútur á ís. Frumulýsi voru skilin í skilvindu og flotinu var safnað og geymt. Til undirbúnings undirfrumuhlutunar voru frumusýni unnin með því að nota kjarna- og umfrymispróteinútdráttarbúnaðinn. Próteininnihaldið var mælt með því að nota BCA prófið. 4.10.Western Blotting

Próteinsýni í skammti voru leyst upp með SDS-PAGE og flutt yfir á pólývínýlíden-díflúoríð himnur. Blettirnir voru síðan ræktaðir með eftirfarandi aðal mótefnum: Nrf2, Keapl, HO-1, NQO1, GCLC, GCLM, Lamin B, eða GAPDH. Himnan var síðan þvegin með TBST í 5 mín; þetta var endurtekið 5 sinnum. Eftir það voru blettir ræktaðir í peroxidasa-tengdum aukamótefnum. Að lokum voru próteinbönd sýnd með því að nota ECL-plús Western blotting uppgötvun hvarfefni.

4.11. Hreyfihegðunarpróf

Sebrafiskalirfur （AB stofn） við 3 pdf voru útsettar fyrir NAC（30 μM） eða ýmsum styrkjum PCs í fjarveru eða viðveru 300 μM af HO, í 4 daga. Síðan, á 7 pdf, voru þessar meðhöndluðu lirfur settar í 24-brunnsplötur (einn fiskur í hverri brunn og 12 lirfur í hverjum hóp). Við notuðum Any-Maze 4.73 til að mæla hreyfihegðun sebrafiskalirfa og reiknuðum út heildarvegalengdina á 10 mínútum [47].

4.12.Tölfræðigreining

Gögn eru sýnd sem meðaltal ± staðalfrávik (SD) að minnsta kosti þriggja sjálfstæðra tilrauna. Einhliða dreifigreining (ANOVA) og Duncan's multiple range tests voru notuð til að ákvarða tölfræðilega marktekt og var munur talinn marktækur þegar p.<0.05. statistical="" analyses="" were="" performed="" via="" spss,="" version="">

5. Ályktanir

Að lokum benda þessar niðurstöður til þess að tölvur hafi taugaverndandi áhrif með því að virkja Nrf2/ARE ferilinn og afeitrunarensím hennar og andoxunarensím hennar. Samanlagt geta tölvur haft verndandi áhrif á taugahrörnunarsjúkdóma.

Framlög höfunda:Hugtakavæðing, JCandJZ.(Jiajin Zhu); aðferðafræði, JC; hugbúnaður, YC; staðfesting, YZ., JZ(Jiawen Zhao) og HY; formleg greining, JC; rannsókn, YC; auðlindir, JZ(iajin Zhu); gagnaöflun, JC; skrif — frumdrög undirbúnings, JC; skrif — yfirferð og klipping, JZ.(iajin Zhu); sjón, JC; eftirlit, DL; verkefnastjórnun, JZ(Jiajin Zhu); fjármögnunarkaup, JZ(Jiajin Zhu). Allir höfundar hafa lesið og samþykkt útgáfu handritsins.

Fjármögnun:Þessi rannsókn fékk enga utanaðkomandi styrki.

Yfirlýsing endurskoðunarnefndar stofnana:Rannsóknin var gerð í samræmi við leiðbeiningar Helsinki-yfirlýsingarinnar og samþykkt af siðanefnd dýraverndar og notkunarnefndar tilraunadýramiðstöðvarinnar við Zhejiang háskóla (ZJU20200125). Yfirlýsing um upplýst samþykki: Á ekki við.

Yfirlýsing um framboð gagna:Gögn eru í greininni. Hagsmunaárekstrar: Höfundar lýsa ekki yfir hagsmunaárekstrum.

Sýnaframboð: Sýni af efnasamböndunum eru ekki fáanleg hjá höfundum.

Þessi grein er dregin út úr Molecules 2021, 26, 2963. https://doi.org/10.3390/molecules26102963 https://www.mdpi.com/journal/molecules