Náttúruleg sýking af parvóveiru í villtum veiðiketti (Prionailurus Viverrinus) leiðir í ljós núverandi veirustaðsetningu í nýrum

edmund.chen@wecistanche.com

Ágrip

Carnivore protoparvovirus-1 (CPPV-1), veirutegund sem inniheldur kattafbrigði af panleukopenia veiru (FPV) og hunda parvóveiru (CPV), er víða dreift meðal húsdýra og villtra kjötæta sem valda almennum banvænum sjúkdómum. Villtir veiðikettir (Prionailurus viverrinus), sem er viðkvæm tegund á heimsvísu, hafa fundist dauðir. Við skoðun á skrokknum kom í ljós sár í þörmum, milta ogNýru. CPPV-1 mótefnavakaauðkenning í þessum vefjum, með því að nota pólýmerasa keðjuverkun (PCR) og ónæmisvefjaefnafræði (IHC), studdi sýkinguna af völdum veirunnar. PCR- og IHC-jákvæðni í nýrnavefleiddi í ljós óhefðbundna staðsetningu veirunnar á meðan in situ blending (ISH) og sendingar rafeindasmásjár (TEM) með pop-off tækni staðfestu fyrstu lýsinguna á veirustaðsetningu ínýru. Fullkomin greining á erfðamengi og ályktuð amínósýrugreining á CPPV sem fékkst -1 úr veiðiketti sýndu FPV sem orsakavald. FPV raðir sem fundust sýndu stökkbreytingar á amínósýrum við I566M og M569R í kapsíðprótíninu. Sýklafræðilegar og þróunarfræðilegar greiningar á fullkomnum erfðamengisröðum sem eru kóðaðar leiddu í ljós að erfðamengi fiskikettarins CPPV-1 er erfðafræðilega þyrpt í FPV erfðamengi einangraðs frá heimilisketti í Tælandi. Síðan á áttunda áratugnum hefur einnig verið sýnt fram á að þessi erfðamengi deili erfðafræðilegri þróun með kínverskum FPV stofnum. Þessi rannsókn er fyrsta vísbendingin um CPPV-1 sýkingu í veiðiketti og hún er sú fyrsta sem sýnir staðsetningu hennar ínýru. Þessar niðurstöður styðja fjölhýsilsvið þessarar parvóveiru og benda til banvænna CPPV-1 sýkinga geta leitt til annarra viðkvæmra villtra kjötæta.

Lykilorð: nýrnavefur; nýrnasjúkdómar, nýra, nýru, nýrnapíplar

Kynning

Ættkvíslin Prionailurus, fjölskylda Felidae, er flokkuð sem hópur flekkóttra, lítilla, villtra katta sem eiga uppruna sinn í Asíu [1]. Prionailurus ættkvíslin samanstendur af fjórum formlega viðurkenndum villtum kattategundum, þar á meðal hlébarðaköttinum (P. bengalensis), flathausköttinum (P. planiceps), ryðflekkóttum köttinum (P. rubiginosus) og veiðiköttinum (P. viverrinus) [2]. Veiðikötturinn lifir aðallega í grennd við mýrar og mangrove. Hann lifir eingöngu í Suður- og Suðaustur-Asíu og er algengari í Tælandi [3, 4]. Um þessar mundir er stofnum veiðikatta ógnað þar sem votlendi þar sem þeir búa hafa verið eytt á síðasta áratug. Þess vegna er þessi tegund nú talin viðkvæm og er á rauða lista Alþjóða náttúruverndarsamtakanna (IUNC) [3]. Vegna þess að búsvæði þeirra tapast hafa veiðikattabyggðir verið að flytjast til og stundum lifað á svæðum þar sem tamdýr og menn búa [5]. Þetta fyrirbæri, sameiginlegt umhverfi, getur leitt til aukinnar smitefnis milli næmra villtra dýra og húsdýra og öfugt. Tilkynnt hefur verið um banvæna uppkomu ýmist í villtum dýrum eða húsdýrum sem kunna að hafa stafað af útfalli sýkla á undanförnum áratugum [6–9]. Því ætti að kanna smitvirkni sýkla frá þessum dýrum og þarfnast frekari rannsóknar.

CISTANCHE MUN BÆTA NÝRA/NÝRAVERK

Carnivore protoparvovirus-1 (CPPV-1), veirutegund þar á meðal minkagirnisveiru (MEV), raccoon parvóveira (RPV), kattadýrafæðaveiru (FPV) og afbrigði hundaparvóveiru (CPV), hefur verið viðurkenndur sem mikilvægur sýkill sem tengist banvænum sjúkdómum í bæði villtum og innlendum Canidae og Felidae fjölskyldum [10, 11]. Gert hefur verið ráð fyrir að FPV, algengur sýkill af Felidae tegundinni, sé sameiginlegur forfaðir CPV [12-14]. CPV smitar oft dýr í Canidae fjölskyldunni og vaxandi vísbendingar eru um sýkingu í Felidae fjölskyldunni [9, 15, 16]. Áður hefur verið gert ráð fyrir að FPV og CPV séu hýsil-takmörkuð veira. Hins vegar bentu nokkrar niðurstöður í kjölfarið til þess að sum dýr í fjölskyldunni Canidae gætu gegnt hlutverki sem lón fyrir FPV eða öfugt [11, 17, 18]. Þar að auki hafa nokkrar skýrslur gefið til kynna að FPV og CPV afbrigði (CPV-2a, -2b og -2c) deili næmum hýslum. Þessir hýslar eru ekki aðeins húsdýr heldur einnig margs konar kjötætur [15, 19, 20], sem bendir til fjölhýsingarsviðs CPPV-1 [11].

Frá 1996 til 1997 greindust CPV afbrigði fyrst í hlébarðaketti og voru upphaflega tilnefndir sem hlébarðakatta parvoveira (LCPV), sem bendir til fyrstu lýsingarinnar á CPPV-1 í ættkvíslinni Prionailurus [21, 22]. Í ljós kom að sumir þessara LCPV stofna voru erfðafræðilega frábrugðnir CPV-2a og -2b sem áður hefur verið lýst vegna stökkbreytingar á G300A amínósýrunni í capsid (VP) próteininu. Þetta leiddi til breytinga á mótefnavaka eiginleika þess sem nú er notað sem einstakur stökkbreytingarpunktur til að greina CPV-2c frá öðrum CPV afbrigðum [22]. Uppgötvun nýja CPV afbrigðisins (nú þekkt sem CPV-2c) í hlébarðaketti studdi hugmyndina um samþróun CPPV-1 meðal dýrategunda. Síðar var greint frá sýkingum af FPV og CPV afbrigðum í hlébarðaketti [9]. Þetta benti til þess að aðrar tegundir í sömu ættkvísl og hlébarðakötturinn (ættkvísl Prionailurus) gætu verið næmar fyrir CPPV-1 sýkingu. Hingað til hefur næmi fyrir CPPV-1 sýkingu í öðrum tegundum af ættkvíslinni Prionailurus enn að mestu óþekkt. Að ráða hvernig CPPV-1 afbrigði eru að þróast og hvernig ný framkomin afbrigði hegða sér getur hjálpað til við að skýra hvernig eigi að koma í veg fyrir hugsanlegt faraldur nýja afbrigðisins. Jafnvel þó að nýja vírusinn nái víðari hýsilsviði, gæti banvæn uppkoma eða óhefðbundin sár í tengslum við sýkingu orðið vart hjá nýjum, næmum hýsil. Þessi rannsókn lýsir banvænni CPPV-1 sýkingu í villtum veiðiketti (Prionailurus viverrinus). Erfðafræðileg lýsing á CPPV sem fæst -1 sýnir FPV sem orsakavald. Þessi niðurstaða gefur fyrstu vísbendingar um FPV sýkingu í þessari tegund og hún afhjúpar einstaka frumu tropisma þessa vírus. Frekari útskýring á FPV sýkingu og afbrigðum hennar í þessari tegund er nauðsynleg vegna reiknings hennar fyrir alþjóðlegri sýkingu í fjölmörgum viðkvæmum tegundum.

efni og aðferðir

Dýr og hefðbundin skurðaðgerðÍ júní 2019 voru tveir villtir veiðikettir (P. viverrinus), útnefndir mál nr. 1 og 2 fundust látnir í úthverfinu í Nakhon Ratchasima héraði í Taílandi. Síðar í ágúst 2019 var annar veiðiköttur, nefndur mál nr. 3, var verið að bjarga af svæðinu þar sem fyrstu tveir veiðikettirnir fundust. Vegna alvarleika ofþornunar er mál nr. 3 létust við tilvísun á dýraspítalann. Þessir þrír veiðikettir voru sendir til skurðaðgerðar sem venjubundið ferli. Því miður voru ekki til sýnishorn af tamdýrum á lausu reiki eða villtum tegundum á sama svæði; þannig að þeir voru ekki með í þessari rannsókn. Venjuleg skurðaðgerð var gerð á öllum veiðiketti. Sértæk lífsnauðsynleg líffæri þar á meðal lungu, lifur, hjarta, milta ognýruvoru tekin sýni úr öllum veiðiketti, en þarm og mesenteric eitla var að auki safnað úr veiðikött nr.3. Allir valdir vefir voru lagðir fram til vefjafræðilegrar skoðunar og tekin var sýni fyrir frekari sameindagreiningar. Fyrir vefjafræði voru vefirnir dýfðir í 10 prósent (v/v) hlutlaust jafnað formalín í að minnsta kosti 24 klukkustundir og unnar reglulega. Síðan voru þau lituð með hematoxýlíni og eósíni

(H&E) með því að nota staðlaðar verklagsreglur fyrir rannsókn ACVP stjórnar-viðurkenndra dýrasjúkdómafræðings (TK). Fersk vefjasýni sem fengin voru úr veiðiköttunum þremur voru geymd við –80˚C til sameindarannsókna. Allar aðgerðir voru gerðar í samræmi við leiðbeiningar og reglugerðir eftir samþykki dýraumönnunar- og notkunarnefndar Chulalongkorn háskólans (nr. 1931036).

Almennar veirufræðilegar sameindagreiningarFersku vefjasýnin þar á meðal hjarta, lungu, lifur, milta ognýruaf öllum veiðiketti auk viðbótar eitlavefs í þörmum og mesenteric veiðiköttum nr. 3, voru látnir fara í veirukjarnsýruútdrátt með því að gera þær einsleitar fyrir sig með 1 prósent (v/v) fosfat-bufferuðu saltvatni (PBS). Í kjölfarið var heildarveirukjarnasýran dregin út með því að nota veirukjarnsýruútdráttarsett II í sölu (Geneaid, Taipei, Taívan) eftir tillögu framleiðanda. Útdregnu kjarnsýrurnar voru síðan hæfðar og magngreindar með A260/A280 gleypnihlutfalli þeirra með því að nota litrófsmælingaraðferðina (NanoDrop, Thermo Scientific™, Waltham, MA, Bandaríkjunum). Allar útdrættar kjarnsýrur voru gerðar frekar undir veiru sameindarannsókn með því að nota pólýmerasa keðjuverkun (PCR) greiningu með nokkrum samveirufjölskyldu PCR prófunarpanelum, þar á meðal greiningu á herpesveiru [23], paramyxoveiru [24], pneumóveiru [25], calicivirus. [26], inflúensuveira [27], bocaveira [26, 28], parvoveira [29] og kórónuveira [30, 31]. PCR samskiptareglur, hvarfefni, hringrásaraðstæður og jákvæð/neikvæð stjórntæki sem notuð eru við viðbrögðin eru lýst í S1 skránni. PCR uppgötvun sem er sértæk fyrir glýseraldehýð- 3-fosfat dehýdrógenasa (GAPDH) gen kattadýra var notuð sem innri eftirlit eins og áður hefur verið lýst [32]. Í kjölfarið voru jákvæðu PCR magnarnir sýndir með því að nota QIAxcel háræðarafmælisvettvang (Qiagen, Hilden, Þýskalandi) eins og áður hefur verið lýst [33]. Jákvæðu amplicons hvers PCR prófunar voru hreinsuð og sett í tvíátta Sanger raðgreiningu (Macrogen Inc, Seoul, Suður-Kóreu). Vegna hóflegrar sjálfrofs á vefjum var ekki hægt að gera sýklafræðilega rannsókn á þessum veiðiketti.

In situ CPPV-1 uppgötvun með því að nota ónæmisvefjaefnafræði (IHC), in situ blending (ISH) og Transmission Electron Microscopy (TEM)

Upphafleg veirufræðileg sameindaskimun leiddi í ljós jákvæða amplicons af pan-parvóveiru PCR og raðgreiningarniðurstöður sýndu einnig mögulegar DNA raðir CPPV-1. Þessar niðurstöður urðu til þess að við staðfestum enn frekar tilvist CPPV-1 og staðfærði dreifingu CPPV-1 í vefjum veiðikatta. Formalín-fastur paraffín-innfelldur (FFPE) vefur þar á meðal lungu, lifur, hjarta, milta,nýruog þörmum voru gefin fyrir CPPV-1 IHC greiningu með því að nota einstofna mótefni gegn hunda parvóveiru (ab59832, Abcam, Cambridge, Bretlandi) með piparrótarperoxidasa (HRP) greiningarkerfinu (EnVision polymer, Dako, Glostrup, Danmörku) . Í stuttu máli voru FFPE hlutar skornir í 4-μm þykkt og afparaffínaðir frekar og endurvökvaðir. Glerurnar voru síðan formeðhöndlaðar, innræn peroxíðasa læst og unnin eins og áður hefur verið lýst [11]. Hlutar úr þarmavef FPV sýkts kattar og CPV sýkts hunds voru notaðir sem jákvæðir viðmiðunarhópar, en eins hlutar ræktaðir með hreinsuðum geitmúsum og kanínu IgGs (IHC alhliða neikvætt viðmiðunarhvarfefni, kóða ADI-950-231-0025, Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, Bandaríkjunum), voru notuð sem neikvæð viðmið. Varðandinýrupípludrep til staðar á þeim svæðum þar sem CPPV-1 IHC jákvæð merki sáust,nýruhlutar af öllum veiðiketti voru settir í sérstaka litun með periodic AcidSchiff (PAS) til að sýna fram á frumubyggingunýruvefjum.

CISTANCHE mun bæta nýrna-/nýrnasjúkdóm

Ennfremur, FFPEnýruhlutar af veiðiköttum nr. 1 og 3 voru látin fara í ISH og TEM greiningu til að styðja niðurstöðu jákvæðrar CPPV-1 IHC litunar og til að sýna fram á ofurbyggingu veiruagnirnar ínýrnavef, í sömu röð. Fyrir ISH var CPPV-1 DNA rannsakað sem þekur 393 bp [34] af kapsíðgeninu CPPV-1 smíðað með PCR DIG Probe Synthesis Kit (Roche Diagnostics, Basel, Sviss), skv. tillögur framleiðanda. Varmahringsviðbrögðin og ástandið var framkvæmt eins og áður hefur verið lýst [34] með undantekningu með því að nota digoxigenin (DIG) merkt fákirni. Smíðaður blendingarnemi var sýndur og staðfestur með stærðarupplausn á 1,5 prósent (w/v) agarósa gel rafdrætti. ISH með litmyndandi DNA var gert eins og áður hefur verið lýst [26] með smávægilegum breytingum. Í stuttu máli, eftir afparaffínvæðingu, endurvökvun og í kjölfarið skolun í PBS, voru 4-μm-þykkar FFPE-gleraugu gefin fyrir próteyðandi meltingu, eftirbindingu og forblöndun. Skyggnurnar voru síðan blandaðar með 25 ng/μL ISH rannsaka við 42˚C yfir nótt. Blendingsmerkin voru sýnd með því að tengja við 100 μL af and-DIG-AP Fab brotum (Roche, Basel, Sviss) (1:200 í 1X blokkunarlausn) ásamt Liquid Permanent Red (LPR) (Dako, Glostrup, Danmörku) . Gler voru síðan mótlitaðar með hematoxýlíni. Rautt botnfall í fylgni frumuforms var talið vera jákvætt fyrir ISH. Fyrir neikvæðar viðmiðanir voru tilapia lake veiru (TiLV) rannsakanarnir [35] notaðir, í stað CPPV-1 rannsakans. TEM sýnin voru unnin í samræmi við pop-off tækni með breytingum [36-38] og voru lituð með þungmálmum eins og áður hefur verið lýst [39, 40]. Uppbyggingin var rannsökuð með því að nota TEM (HT7800; Hitachi, Tókýó, Japan) starfrækt við 80 kV

Erfðafræðileg einkenni í fullri lengd CPPV veiðiköttar-1Þar sem niðurstöður veirufræðilegrar PCR og IHC skimunar voru samhljóða og niðurstöður VP-2 erfðamengisraða að hluta sem fengust úr pan-parvoviral PCR bentu til erfðafræðilegs líkt milli tilvika nr. 1 og 2, en ekki fyrir tilvik nr.3, auðkenndum við CPPV-1 röðina í fullri lengd frá þessum veiðiketti (tilfelli nr. 1 og 3) og flokkuðum uppruna CPPV-1 með því að nota sett af hrörnuðum grunnpörum sem eru sértæk fyrir FPV og CPV sótt úr fyrri útgáfu [26]. Í stuttu máli, útdregnar kjarnsýrur sem fengnar eru úr milta ognýruaf tveimur veiðiketti auk viðbótar þarmavefs veiðiköttar nr. 3, voru magnaðir upp hver fyrir sig með því að nota GoTaq1 Hot Start Green Master Mix (Promega, Madison, WI, USA) og sérstakar primers (S1 File). PCR skilyrðum hefur verið lýst áður [26]. Markamplicons voru sýnd með því að nota 2 prósent (w/v) agarósa hlaup rafdrætti og frekar hreinsuð með Monarch DNA Gel útdráttarsetti (New England Biolab, Frankfurt, Þýskalandi) áður en Sanger raðgreining var sett í atvinnuskyni. Heildar erfðamengisraðir CPPV-1 einangranna sem fengust úr veiðiköttunum tveimur voru geymdar í GenBank (aðgangsnúmer MW145540-MW145541).

Fræðslu-, endurröðunar- og þróunargreiningar á CPPV veiðiköttum-1 Erfðamengisröð í fullri lengd CPPV-1-stofna veiðikattarins voru samræmdar útgefnum heildar CPPV-1 raðir sem fengnar voru úr ýmsum hýsiltegundum , fáanlegt í GenBank með MAFFT V. 7 (http://mafft.cbrc.jp/alignment/server/) og MEGA7 hugbúnaði (http://www.megasoftware.net). Röðröðunin var síðan látin undirgangast söfnunartrésbyggingu. Fræðslutréð var búið til með því að nota hámarkslíkur (ML) aðferðina með Hasegawa–Kishino–Yano með gammadreifingu (HKY plús G) líkaninu, sem var valið með því að nota reikniritið finna-best passa líkanið í MEGA7 samkvæmt Bayesian upplýsingaviðmiðuninni . Tréð var fest með 1,000 endurtekningum. Pörlíkindi raða meðal CPPV-1 erfðamengja var reiknuð út með því að nota hámarks samsetta líkindalíkanið og þróunarfjarlægð þeirra var greind í MEGA7. Núkleótíðauðkennin sem framleidd voru í pari voru mynduð og sýnd á Microsoft Excel sniði (S2 skrá). Úttaksröðun CPPV-1 var síðan notuð sem sniðmát fyrir erfðafræðilega endurröðunargreiningu með því að nota tvo tölfræðilega óháða hugbúnaðarpakka. Í stuttu máli greindi jöfnunin mögulega endurröðunarstofna með því að nota samþætta endurröðunarskynjunaráætlun 4 (RDP4) pakka V. Beta 4.94 hugbúnað og þetta var athugað með líkindariti og ræsiskannagreiningu í SimPlot hugbúnaðarpakkanum aldri V. 3.5.1. Stillingar forritanna og túlkun niðurstaðna voru framkvæmd eins og áður hefur verið lýst [26, 41].

FTil þróunargreiningar á veiðiköttinum CPPV{{0}} var gagnasafn með 224 heilum erfðamengisröðum sem innihalda 26 FPV-, 6 MEV- og 192 CPV raðir, allar upprunnar frá 18 löndum á árunum 1979 til 2019, sótt. úr GenBank gagnagrunninum. Þróunargreining var gerð með 2 mögulegum CPPV-1 röðum sem fengust úr veiðiketti með því að nota Bayesian Markov keðju Monte Carlo (BMCMC) líkanið útfært í BEAST V. 2.4.8 [42]. jModelTest [43] var framkvæmt til að bera kennsl á hvaða núkleótíðskiptalíkan sem hentar best fyrir margar röðunarraðir. Bestu staðgöngulíkönin undir lognormal afslöppuðum og ströngum klukkulíkönum við stöðuga íbúastærð eins og fyrri voru útfærð til að gera grein fyrir mismunandi þróunarhraða meðal ættkvísla. Upprunnandi Bayesian skyline tré fyrri tíðni og empirísk grunntíðni voru fengnar undir klukkulíkaninu sem hentaði best og keyrt fyrir 100 milljón keðjur, sýnatöku á 10.{21}} kynslóðar fresti, og fyrstu 10 prósentunum var hent sem innbrennslu. Samruni færibreytna var staðfest með því að reikna út virka úrtaksstærð með því að nota TRACER forritið V. 1.7.0 [44]. Hámarks trúverðugleikatrén voru merkt með TreeAnnotator V. 1.8.3 [42]. Fræðslutréð með áætlaðri frávik, breytilegri tímalínu, aftari líkindum og 95 prósent hæsta aftari þéttleika (HPD) var myndað og sýnt með því að nota FigTree V. 1.4.3 [45].

Afturskyggn rannsókn á CPPV-1 mótefnavaka í dýradýrumTil að kanna hlutverk CPPV-1 í tengslum við sjúkdóma og dánartíðni af óþekktum orsökum í villtum kjötætum í fjarlægri og nýlegri fortíð, voru 305 sértæk ný sýni tekin með til erfðafræðilegrar útdráttar og auðkenningarmiðunar á CPPV{{2} } kapsíð gen eins og lýst er hér að ofan. Þessi sýni hafa verið fengin síðan 2013 sem ýmist saurþurrkur eða þarmainnihald. Þeir voru fengnir úr 136 dýradýrum úr 27 mismunandi kjötætur (S1 tafla). Niðurstöður Niðurstöður eftir slátrun og staðsetning vefja á veiðiköttum CPPV-1 Allir krufðir veiðikettir voru í meðallagi rýrir með mismikla ofþornun á meðan 2 af 3 veiðiköttum (tilfelli nr. 1 og 2) sýndu miðlungsmikla sjálfrof. Áberandi er milta ognýruvoru þéttar í öllum veiðiketti. Veiðiköttur nr.3 var með stórsæjar skemmdir af garnabólgu sem innihélt vatnsbrúnt-gulleitt innihald í holrými þeirra og þrengsli í mesenteric eitla. Vefjafræðilega er lunga veiðiköttar nr. 3 leiddi í ljós alvarlega þrengsli með íferð einkjarna frumna í lungnablöðrur. Lifrin sýndi væga periportal lifrarbólgu, sem einkennist af einkjarna frumuíferð í lifrargáttarþríhyrningum. Svipuð stig miltisþéttingar með fáum fjölda eitlaeitla í milta sáust hjá öllum veiðiketti. Eitlaekkirnir voru tæmdir og þau sem eftir voru af eitilfrumuekkjum innan um hrunna miltabyggingu með auknum fjölda áberandi milta trabeculae (mynd 1A). Það voru dreifðir karyorrhectic rusl af eitilfrumum með

Mynd 1. CPPV-1 sýking í veiðiketti. Sýndarmyndir H&E (A, C) og CPPV-1 IHC (B, D) frá veiðiketti. (A) Veiðiköttur nr. 1. Dreift, stíflað milta með fáum eitilfrumum. Miðja eins af eitilfrumuekkjunum sem eftir voru innihélt eósínfíknt fibrillar efni (fíbrín) blandað dreifðum karyorrhectic rusli eitilfrumna (eitilfrumugreiningu) (innfellt). Fáir af þessum eitilfrumum innihéldu 5–7 μm basófíla innankjarna innilokunarhluta sem jaðruðu við kjarnalitninginn (ör). (B) Veiðiköttur nr. 3. Stytting villi með stöku víkkuðum dupum sem innihéldu eósínfíkn próteinkennd efni og fóðruð með verulega veiktum eða drepandi dulþekjufrumum (innfelld). Margar þekjufrumur í dulmáli voru pyknotic og karyorrhectic og sjaldgæfar frumur innihéldu svipaða basophilic innankjarna innilokunarhluta (örvar). (C) Veiðiköttur nr. 1. CPPV-1 ónæmissvörun kom oft fram í umfrymi einkjarna frumna á svæði eitilfrumu í milta. (D) Veiðiköttur nr. 3. CPPV-1 IHC merki greindust á dreifðan hátt og ónæmisvirkunarmerkin voru áberandi staðbundin í umfrymi dulmálsþekjufrumna (innfellt). Súlur gefa til kynna 25 μm fyrir (A) og 120 μm fyrir (B–D).

uppsöfnun eósínfíkla fibrillar efni í miðju slíks eggbús. Fáir af þessum eitilfrumum innihalda 5–7 μm basófíla innankjarna innilokunarhluta sem liggja að kjarnalitningi. Stytting garnavilli með hruni slímhúðarbyggingar var til staðar í þarmahluta veiðiköttar nr. 3 (Mynd 1B). Sumir graftar voru víkkaðir og þeir innihéldu eósínfíkn próteinkenndu efni og voru fóðruð með verulega veiktum eða drepandi þekjuþekjufrumum. Margar dulmálsþekjufrumur voru pyknotic og karyorrhectic og sjaldgæfar frumur innihéldu svipaða basophilic innankjarna innilokunarhluta. CPPV-1 IHC var notað til að sýna fram á tilvist veirunnar í vefjum og til að lýsa meinafræðilegu hlutverki CPPV-1 í sárum sem komu fram í hefðbundinni skoðun eftir slátrun. Einkjarna frumur sem búa í milta sýndu jákvæða mikla ónæmisvirkni CPPV-1 í öllum veiðiketti (mynd 1C). Ónæmissvörunin kom einnig fram í flestum umfrymi dulþekjufrumna og var samrýmanleg þarmaskemmdum veiðiköttar nr. 3 (Mynd 1D). Sérstaklega ýmsar gráður afnýrnapípulagaloftræsting og fjölfókalnýrublæðingar komu fram í öllum veiðiketti (mynd 2A). Sumirnýrupípulaga þekjufrumur voru ofureosinophilic með kjarna pyknosis, en sjaldgæf lofttæmdu pípulaga þekjufrumurnar sýndu blöðrulaga kjarna með jaðarkjarna chromatin (mynd 2B). Varðandinýruskemmdir, framkvæmdum við frekar PAS litun til að sýna fram á frumubyggingunýrnavefog að útiloka kerfisbundið súrefnisskort sem hugsanlega orsök þessa meinsemdar. PAS litun sýndi fram ánýrnapípulagaGrunnhimnur voru ósnortnar (mynd 2B, innfelld). Innannýruköflum, CPPV-1 ónæmismerking var sterk og sást oft í umfryminýrnapípulagaþekjufrumur (Mynd 2C) og þekjufrumur viðnýrnagrindí öllum tilfellum. Engar vísbendingar um ónæmisvaldandi viðbrögð sáust í neikvæðu viðmiðunum (S1 mynd). Óhefðbundin CPPV-1 staðsetning ínýrnavefopinberað af IHC lagði til að við ættum að gera frekari rannsóknir til að staðfesta tilvist og staðsetningu CPPV-1 ínýrunota ISH og TEM með pop-off tækni. CPPV-1 ISH-ónæmisvirknin var jákvæð hjá öllum veiðiketti og staðbundin á dreifðum stað í kjarnanýrupípulaga þekjufrumur, þar sem pípulaga skemmdirnar sáust (mynd 2D). Engin viðbrögð sáust í neikvæðu viðmiðunarhópnum (S1 mynd) Í samræmi við niðurstöður jákvæðra ónæmisfræðilegra merkja um ISH sem voru staðbundin í kjarna ínýruþekjufrumur, fjölmargar litlar rafeindaþéttar veiruagnir, áætlaðar um 19–22 nm í þvermál, sáust. Þetta var þyrpt í kjarna þessaranýrnapípulagaog þvagfærafrumur (mynd 3).

Greining á CPPV fiski köttur-1 og erfðafræðileg greiningFyrst og fremst voru sameinuð PCR-spjöld sem eru sértæk fyrir ýmsar veirur, þar á meðal herpesveiru, paramyxovirus, pneumovirus, calicivirus, inflúensuveira, bocavirus, kransæðaveiru og parvóveiru, prófuð á útdregnum veirukjarnsýrusýnum. Þetta leiddi í ljós jákvæðar niðurstöður aðeins með pan-parvoveiru PCR í þörmum, eitlum ognýrusýni af veiðiköttunum þremur. Aftur á móti voru önnur pan-PCR fyrir hinar veirugreiningarnar neikvæðar í öllum prófuðum vefjasýnum. Út frá fyrri niðurstöðum um pan-parvóveiru PCR jákvæðni í öllum veiðiketti, auðkenndum við erfðamengisröðina í tveimur veiðiköttum, sem kóðun var, með því að nota nokkur grunnpör í útdregin kjarnsýrusýni fengin úr þörmum (mál nr.1) ognýru(mál nr.3). 4.462 og 4.430 basapör af fullkomnu erfðamengi tveggja veiðikatta CPPV-1 stofna fundust og voru nefndir stofnur 19ZP004-TH/2019 (mál nr.1, aðild nr. MW145540) og 19ZP{ {12}}TH/2019 (mál nr.3, aðildarnr. MW145541), í sömu röð. Eftir erfðagreiningu sýndu heildarkóðun erfðamengi erfðafræðilega svipaðar niðurstöður meðal CPPV-1 stofna sem fengust úr veiðiketti með því að sýna að þessir CPPV veiðiköttir-1 voru FPV. Afleiddur amínósýrusamanburður á milli CPPV-1 afbrigðanna og veiðikettanna FPV er lýst í töflu 1. Athygli vekur að veiðikötturinn FPV leiddi í ljós einstakar amínósýrustökkbreytingar á I566M og M569R í byggingarprótíninu (VP1 & 2) , sem fundust ekki í fyrri CPPV-1 afbrigðum.

Mynd 2. CPPV-1 sýking í veiðiketti. Sýnandi H&E (A), PAS litun (B), CPPV-1 IHC (C) og in situ blending (ISH) (D) örmyndir afnýrufrá veiðiketti. (A, B) Veiðiköttur nr.3. (A) Fjölhreiðurnýrublæðing meðnýrnapípulagaloftræsting. Fáar pípulaga þekjufrumur voru ofureósínfílar með pyknotic kjarna (innfellt, örvar). (B)Nýrnapípulagaþekjufrumur sýndu umfrymistæmi og kjarnar sjaldgæfra þekjufrumna eru blöðrulaga með jaðarkjarnalitningi. PAS litun auðkenndi ósnortna grunnhimnu (innfellt). (C) Veiðiköttur nr. 2. CPPV-1 IHC-ónæmissvörun (dökkbrúnn litur) sást dreifður ínýrnapíplurog greinist oft í umfryminýrnapípulagaþekjuvef (innskot). (D) Veiðiköttur nr.1. CPPV-1 ISH-ónæmisvirkni (rauðbleikur litur) sást ríkulega ínýrnapíplur(stjörnur), og það staðsett í kjarna ínýrnapípulagaþekjuvef (innskot, örvar). Súlur gefa til kynna 50 μm fyrir (A, C) og 120 μm fyrir (B, D).

Fræðslu- og þróunargreiningTil að bera saman erfðafræðilega tengslin milli greindra veiðikettlinga CPPV-1 og annarra áður birtra CPPV-1 erfðamengis, var gerð mannfjölgunargreining byggð á fullkominni erfðamengisröð. ML fylgjendatréð sýndi að flestir FPV, MEV og CPV mynduðu mjög aðgreinda kladda meðal hópa (mynd 4). Tvö CPPV-1 erfðamengi frá rannsökuðu veiðikettinum (gefin til kynna með rauðum þríhyrningum) voru þyrpt saman með sömu ætterni af áður birtum FPV röðum sem fengust frá ýmsum hýslum, sem staðfestir að

Mynd 3. CPPV-1 veiruagnir í kjarna ínýrnapípulagaþekjufrumur. Sendingar rafeindasmásjár (TEM) með pop-off tækni. Ofurbyggingarsýning á þyrping rafeindaþéttra agna (örvar). Stærð icosahedral korna var 19–22 nm í þvermál staðsett í kjarna ínýrnapípulagaþekjufrumur (innskot). Skalastikur eins og sýnt er á myndinni.

CPPV fyrir veiðikött-1var FPV. Erfðamengi sem greindust voru þyrpt saman og skyldust FPV erfðamengi sem greind var í heimilisketti í Tælandi (aðgangsnr. MN127780). Til að skýra frekar þróunarferlið CPPV-1 veiðaköttsins, voru gerðar nokkrar endurröðunargreiningar og þróunargreiningar á gagnasafni með 224 CPPV-1 heilum erfðamengisröðum. Endurröðunargreiningin leiddi í ljós að engir endurröðunaratburðir fundust í CPPV-1 raðir fiskikatta. Þróunartré þessara gagna sýndi tvær helstu aðskildar aðskildar klæðar (mynd 5). Einn clade innihélt FPV og MEV og önnur clade innihélt allar CPV raðir. Heildarþróunarhraði var áætlaður 1,08 × 10-4 skipti/staður/ár (95 prósent HPD: 1,95- 2,87 × 10-4). Þróunartréð sýndi að FPV raðir veiðikatta voru þyrpaðar í sömu ætterni FPV og þær sem voru einangraðar frá Tælandi. Þeir hafa deilt erfðafræðilegri þróun með FPV erfðamengi sem greindist í heimilisketti í Kína og gætu átt sama uppruna síðan um 1970.

Umræða

Dreifing CPPV-1 afbrigða sem inniheldur CPV og FPV hefur verið auðkennd í bæði húsdýrum og villtum kjötætum. Þó banvæn sýking af CPPV-1 í húshundum og köttum sé algeng, sést þessi sýking af og til hjá villtum kjötætum [46]. Nokkrar rannsóknir hafa gefið til kynna að mörg villt kjötætur séu næm fyrir CPPV-1 sýkingu, þar á meðal villtum dýrum, minkum, otrum, skunks, þvottabjörnum, refum, úlfum, sléttuúlfum, svölum og martum [11, 19]. Sérstaklega hefur verið greint frá ættkvíslinni Prionailurus að einungis hlébarðakettir hafi verið sýktir af CPPV-1 afbrigðum [9]. Í þessari rannsókn lýsum við náttúrulegri sýkingu FPV, sem er meðlimur CPPV-1, í villtum veiðiketti (Prionailurus viverrinus). Þetta er fyrsta skýrslan með lýsingu á sérstakri veiruútbreiðslu og suðrænum hita ínýrnavefeins og staðfest er með mótefnavakagreiningu með PCR, IHC, ISH og TEM greiningu á öfgauppbyggingunni.

Smit milli tegunda CPPV-1 afbrigða milli húsdýra og villtra kjötæta hefur sést og sums staðar banvæn uppkoma CPPV-1 hefur verið talin tengjast útbreiðslu sýkla meðal búsvæða [9, 11]. Vegna núverandi taps á búsvæði villtra dýra hafa villtar nýlendur verið að flytja til og deilt búsvæðum með húsdýrum, sem hefur leitt til aukinnar smitefnis milli næmra dýra. Í þessari rannsókn komumst við að því að erfðamengi fiskiköttsins CPPV-1 hafa deilt þróunarmynstri með FPV stofnunum sem greindust í

Mynd 4. Sýklafræði sem sýnir erfðafræðilegt samband kóðunarraðanna í fullri lengd milli veiðiköttsins CPPV-1 og annarra CPPV-1 afbrigða. Fræðslutréð sýndi að raðir veiðiköttsins CPPV-1 (gefin til kynna með rauðum þríhyrningum) voru þyrpt saman við FPV erfðamengi með erfðamenginu sem er mest skylda FPV erfðamenginu sem fannst í tælenska köttinum (MN127780). GenBank aðgangsnúmer áður lýstra CPPV-1 raða sem notaðar voru í þessari greiningu voru tilgreindar.

heimilisketti í Tælandi. Þessar niðurstöður sýna svipað þróunarmynstur og FPV-stofnar frá sameiginlegum forfeðrum sem hafa verið einangraðir frá heimilisketti í Kína síðan á áttunda áratugnum. Þessi niðurstaða getur falið í sér annað hvort mögulegar vísbendingar um smit milli húskatta og veiðikatta eða samþróun CPPV-1 afbrigða. Hins vegar, vegna takmarkaðra sýna sem fengin eru úr lausu reikidýrum í sömu búsvæðum og fárra rannsakenda veiðikatta, var ekki hægt að bera kennsl á aðallón CPPV-1 í þessari rannsókn og frekari rannsókna er þörf. . Þó að nokkrar rannsóknir hafi gefið til kynna að ýmsar amínósýruleifar í kapsíðgeninu séu tengdar bæði getu til að sýkja nýja hýsil og mótefnavaka CPPV-1 [18, 47], er stökkbreytingin á einni amínósýru í stöðu 300 í Tilkynnt hefur verið um kapsíðprótein (VP2) sem lykilákvarða fyrir mörg hýsilsvið [48]. Í þessari rannsókn sýndi CPPV-1 afbrigðið sem fékkst úr veiðiketti sömu amínósýrumynstur og finnast í FPV raðir, með nærveru alaníns (A) sem lykilákvörðunarákvörðunar amínósýra í kapsíðstöðu 300. Þó að kappsíðprótein fyrir fiskikatta úr CPPV-1 sýndi asparagín (N) og alanín (A) amínósýrur staðsettar í stöðu 564 og 568, í sömu röð (sem eru taldar mikilvægar fyrir afritun FPV í kattahýsilnum), þeir höfðu 2 einstakar amínósýrustökkbreytingar í stöðunum I566M og M569R. Þessar stökkbreytingar geta greint þennan vírus frá áður lýstum CPPV-1 afbrigðum. Fyrri greining á enduruppbyggingu forfeðranna kom í ljós að FPV getur smitað mismunandi kjötætur með fáum breytingum á VP2 geninu [49]. Þannig var FPV-lík parvóveiran með semingi nefnd sem hugsanlega ný vírus sem fannst í veiðiketti og þetta gæti stutt fyrstu auðkenningu þessa vírus í þessari tegund. Hins vegar getur lítill fjöldi rannsakaðra veiðiketta samanborið við lítinn fjölda annarra raða ekki gefið endanlega túlkun. Þetta þarfnast frekari rannsókna til að hægt sé að draga ákveðnari ályktanir.

Staðsetning CPPV-1 fiskakatts sást í ýmsum vefjum, þar á meðal þekjufrumum í þörmum og eitilfrumum, þar sem algengasta vefstaðsetning CPPV-1 sýkingarinnar er að finna í öðrum tegundum [20, 26, 50, 51 ]. Athyglisvert er að þar sem frumrannsókn á erfðamengigreiningu veiru með PCR og veirustaðsetningu með IHC leiddi í ljós sérstaka veirustaðsetningu ínýrnavef, framkvæmdum við PAS litun til að sýna frumuarkitektúrnýrnavefog að útiloka altækt súrefnisskort sem hugsanlega orsök pípludreps. PAS litun leiddi í ljós að pípulaga grunnhimnur voru ósnortnar, sem bendir til þess að þessi mein megi ekki stafa af altæku súrefnisskorti [52]. Hins vegar geta aðrar orsakir eins og eiturefnadrep af völdum pípla valdið þessari meinsemd. Þannig er hlutverk FPV-eins parvóveirusýkingar sem tengistnýruskemmdir þarfnast enn frekari rannsóknar. Ennfremur reyndum við að skýra enn frekar staðsetning veirunnar ínýrnavefmeð því að nota ISH og TEM með pop-off tækninni [37] á þeim svæðum þar sem CPPV-1 IHC-ónæmissvörun greindist. Rafeindaþéttu agnirnar sáust í kjarnanum ínýrnapípulagaþekjufrumur og þvagfrumur, sem styðja jákvæða in situ ónæmisvirkni CPPV-1 ínýrnavef. FPV-sýktir kettir losa veiruna aðallega í saur, en tilvist virkra veira í þvagi hefur verið lýst [53, 54]. Nýlegar rannsóknir hafa bent til þess að parvóveirusýking hafi hlutverk ínýrnabilun[55]. Hins vegar staðsetning FPV og CPV hliðstæðu ínýrnavefhefur ekki áður verið rannsakað. Ennfremur músnýrusannað hefur verið að parvóveira (MKPV) er nýrnaveira með því að sýna sækni til að smita og staðsetja sig ínýrnapípulagaþekjufrumur, sem leiðir tilnýrnasjúkdóma [56, 57].

Byggt á þekkingu okkar, CPPV-1 staðsetning ínýruhefur ekki verið lýst áður. Þetta bendir til nýrrar lýsingar á einstakri veirustaðsetningu í þessari tegund eða jafnvel þótt hún sé að finna í FPV-sýktum köttum. Þessi niðurstaða gæti stutt fyrri rannsóknir sem fundu FPV í þvagi. Einstakar meinafræðilegar niðurstöður geta verið huglægar og geta komið fram sem sýkingar hjá einstaklingum. Þannig mun umfangsmikil rannsókn á veiðiketti CPPV-1 auðvelda endanlega túlkun. Auk þess henta sýni sem voru aðallega send af dauðum dýrum og höfðu þegar gengist undir sjálfsgreiningu eftir slátrun ekki til frekari líffærasöfnunar frá þessum dýrum. Þannig gátum við ekki ákvarðað staðsetning veiru í öðrum líffærum. Útskýring á óhefðbundinni veirustaðsetningu CPPV veiðikatta-1 væri gagnleg rannsókn.

CISTANCHE mun bæta nýrna-/nýrnasjúkdóm

CPPV-1 hefur verið greint í ýmsum villtum kjötætum og það tengist banvænum faraldri. Neikvæðar vísbendingar um afturvirka CPPV-1 uppgötvun í villtum dýrasýnum í þessari rannsókn geta annaðhvort stafað af engri náinni snertingu meðal næmra dýra eða hins vegar langvarandi geymslu sýna sem hefur áhrif á stöðugleika erfðafræðilegra efna. Hin nýja auðkenning á CPPV-1 sem tengist dauðlegri sýkingu veiðikatta í þessari rannsókn vekur áhyggjur af nýjum, hugsanlega illvígum sjúkdómi í þessu viðkvæma dýri. Þess vegna er frekari rannsókn á smiti CPPV-1 í veiðiketti nauðsynleg til að koma í veg fyrir tap á öðrum næmum dýrategundum. Til samræmis við það ætti að leggja áherslu á forvarnaraðferðir til að stjórna CPPV-1 sýkingum, ekki aðeins í þessari tegund heldur einnig í lausagangi húsdýra sem gætu þjónað sem hugsanlegur hýsil fyrir þessa veiru.