Nanómjólkurprótein-slímfléttur: Einkenni og krabbameinsáhrif Hluti 2

Fyrir frekari upplýsingar, hafðu sambandtina.xiang@wecistanche.com

Smelltu á hlekkinn til að læra hluta 1:https://www.xjcistanche.com/news/nano-milk-protein-mucilage-complexes-characte-55049142.html

3. Efni og aðferðir

3.1. Efni

Plantago ovata (undirmark) hýði og þroskandi ávöxtur Ziziphus Spina-Christi(Nabeq) voru keyptir frá Giza, Egyptalandi; mjólkurpróteinþykkni (MP, 81,3 prósent prótein) var keypt frá Fonterra fyrirtækinu (Auckland, Nýja Sjáland). Kasín- og mysupróteinin í MPC eru að mestu leyti í upprunalegu og svipuðu, micellar formi þeim sem finnast í mjólk. Öll efni sem notuð voru voru af greiningarhreinleika.

3.2.Undirbúningur Isabgol Husk mucilage (IHM) og Nabeg mucilage (NabM)

Isabgol hýðislím (IHM) og Nabeq slím (NabM) voru unnin samkvæmt aðferð sem lýst er af El-Maksoud o.fl. [5]. Í stuttu máli var sviflausn af isabgol hýði útbúin með því að leysa 1,2 g í 100 ml af eimuðu vatni og hreinsuð með asetónlausn. Gelið sem myndast var geymt í kæli (4-5 gráðu) þar til það var notað.

Fyrir NabM voru þroskuðu Nabeq ávextirnir þvegnir vandlega með kranavatni til að fjarlægja óhreinindi. Fersku ávextirnir voru aðskildir frá fræjunum og blandaðir saman við eimað vatn í hlutfallinu 1:10 (w/v) eftir að hafa verið skornir í litla bita. Blandan var blanduð með rannsóknarstofublöndunartæki (Toshiba Mixie, Japan) og látin standa í 12 klst í kæli.

Slímseyðiið var síðan skilið í skilvindu við 2000 snúninga á mínútu í 30 mínútur og síað í gegnum múslínklút. Seigfljótandi leysanlegur slímhúð sem myndast var felldur út með asetoni. Hráslím sem fékkst var geymt í kæli þar til það var notað.

Í greiningarskyni var slímið þurrkað í loftofni við 40 gráður og malað með kúlumylla MM400 (Retsch, Þýskalandi). Efnasamsetning psyllium husk mucilage dufts (PHMP) og Nabeq slímdufts (NabMP) hefur verið mæld. Innihald raka, próteina, fitu, ösku, hrátrefja og heildarkolvetnainnihalds var 8,49, 0,34,0,21,2,13,1,53 og 87,44 prósent fyrir PHMP og 9,18,4,72,2,05,2,69,1,70 og 78,26 prósent fyrir NabMP. , í sömu röð. Duftið sem fékkst var geymt við kaldur hitastig (4-5 gráðu) þar til frekari greiningu.

Smelltu til að fá frekari upplýsingar

3.3. Undirbúningur mjólkurprótein-slímfléttna (MPMC)

Mjólkurprótein (MP) fléttur með IHM og NabM voru útbúnar samkvæmt Morr et al. með nokkrum breytingum [44]. Mjólkurpróteinþykkni var blandað í eimuðu vatni (10 prósent). Mjólkurpróteinkollóíðið sem myndast var blandað saman við IHM og NabM í hlutfallinu 1:3 (o/o). pH blöndunnar var stillt á 10 og látið standa í 10 mínútur. Eftir það var pH lækkað í 3,5 með því að nota 0,1 N HCl og látið standa í aðrar 10 mínútur. pH var síðan stillt á pH 4,6 með því að nota 0,5 M NaOH til að safna MPMCby síun á síupappír: MP, sem og MPMC sem af því varð, voru þurrkuð með frostþurrkun við -45 gráðu C í 24 klst. með Novalyphe-NL500 frostþurrkara. , Savant Instruments, Holbrook, NY, Bandaríkin.

3.4. Eðlisefnafræðilegir og hagnýtir eiginleikar

3.4.1.pH Mæling

pH afurðanna sem fengust við 10 prósenta lausn var mælt með því að nota kvarðaðan pH-mæli (HANNA, HI 902 m, Þýskalandi).

3.4.2. Ákvörðun magnþéttleika (BD), Tapped Density (TD) og Carr's Index

MPMC dufti var hellt í 50 ml mælihólk allt að 25 ml, sem samsvarar ótappað rúmmáli, og síðan er ýtt á 5-10 sinnum þar til engin frekari breyting varð á rúmmáli duftsins sem samsvarar magni sem tapað var.

Magnþéttleiki, tappað þéttleiki og Carr vísitala voru ákvörðuð með því að beita eftirfarandi jöfnum [45]:

(1)BD=massi/ ónotað rúmmál

(2) TD=massi/tappað rúmmál

(3)Carr's vísitala ( prósent )= (TD-BD)/TD×100

3.4.3. Vatnsupptökuvísitala (WAI) og vatnsleysnivísitala (WSD)

Vatnsleysni og vatnsgleypnivísitölur MP og MPMC voru skoðaðar samkvæmt aðferð sem lýst er af Yagc og Gogus með nokkrum breytingum [46]. Sýnin (0,5 g) var dreift í 10 ml af eimuðu vatni við 25 gráður í skilvinduröri. Eftir að hafa staðið í 30 mínútur, með túpunni snúið við á 5 mínútna fresti, voru sýnin skilin í skilvindu við 3500 rpm í 15 mínútur. Síuvökvinn var fluttur á álplötu og þurrkaður í 3 klst við 105 gráður. Þyngd hlaupsins sem eftir var var skráð og WSI og WAI voru ákvörðuð sem hér segir:

(4)WAI(g/g)= Þyngdaraukning hlaups/þurrþyngd sýnis

(5)WSI prósent=Þyngd þurrra efna í floti ×100/þurrþyngd sýnis

3.4.4. Meltanleiki mjólkurpróteins

Meltanleiki próteina var ákvarðaður samkvæmt Abd El-Ghany o.fl. [47]. Í stuttu máli var MP og MPMC sýnum dreift í eimuðu vatni í styrkleikanum 6,38 mg/ml og pH var stillt í 8.0. Einn millilíter af nýútbúinni ensímstofnlausn (1,6 mg/ml trypsín, 3,1 mg/ml chymotrypsin og 1,3 mg/ml ER amínópeptidasa1

(ERAP1) var blandað saman við próteinsviflausn við 37 gráður. pH var skráð eftir 10 mínútur og ensímvirkni var ákvörðuð með kaseini sem viðmiðun. Eftirfarandi jafna var notuð til að reikna út próteinmeltanleika [47]:

(6) prósent meltanleiki=210.46-18.10 (pH)

3.5.Fenólbrot af PHM og NabM

Fenólsambönd úr slímsýnum með því að nota HPLC greiningu voru gerðar með samskiptareglum sem lýst er af Elsayed et al. [48]. Í stuttu máli var slímútdrátturinn greindur með því að nota Agilent 1260 röð HPLC kerfi (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, Bandaríkjunum). Aðskilnaðurinn fór fram með því að nota C18 dálkinn (100 mm×4,6 mm id,5 um). Hreyfanlegur fasi innihélt (A) vatn 0,2 prósent H3PO4, (B)metanól og (C) asetónítríl með flæðihraða 0,6 ml/mín. Gradient skolun var samkvæmt næsta skema: 0-11 mín (96 prósent A., 2 prósent B);11-13 mín (50 prósent A,25 prósent B);13-17mín (40 prósent A,30 prósent B);17-20.5 mín (50 prósent B,50 prósent C); og 20.5-30 mín (96 prósent A,2 prósent B). Bylgjulengdin (UV) skynjari, 284 nm) var stilltur á 284 nm. Inndælingarstærðin var 20 μL og súluhitastiginu haldið við 30 gráður. Efnasambönd voru þekkt með því að bera saman varðveislutíma þeirra við þá frá ekta stöðlum. Kvörðunarferlar voru notaðir til að meta magn efnasambanda.

3.6. Heildarfenól- og flavonóíðinnihald MP og MPMC

Innihald pólýfenóls var ákvarðað með Folin-Ciocalteu aðferðinni með nokkrum breytingum [5]. Í stuttu máli var 2,8 ml milli-Qwater sem innihélt 10 mg af MP eða MPMC blandað saman við 2 ml af 2 prósent natríumkarbónati og 0,1 ml af 50 prósent Folin-Ciocalteau hvarfefni. Eftir 30 mínútur af ræktun við stofuhita var gleypni hvarfblöndunnar mæld við 750 nm á móti afjónuðu vatni sem blanka með litrófsmæli (Hitachi, líkan 100-20). Gallsýra (GA) var notuð sem staðlað fenólsamband og sjö punkta staðalferill (0-200 mg/L) var smíðaður. Niðurstöðurnar voru gefnar upp sem milligrömm gallsýruígildi á hvert gramm prótein (GAE/g).

Flavonoidsinnihald var ákvarðað með álklóríðaðferðinni eins og áður var lýst af Abedelmaksoud o.fl. með nokkrum breytingum [5]. Í stuttu máli var 2,8 ml milli-Q vatni sem innihélt 10 mg MP eða MPMC blandað saman við 0,1 ml af 10 prósent álklóríðhexahýdrati og 0,1 ml af 1 M kalíumasetati. Eftir ræktun við stofuhita í 40 mínútur, var gleypni hvarfblöndunnar mæld við 415 nm á móti afjónuðu vatni sem eyðublað. Quercetin var notað sem staðall með því að nota sjö punkta staðalferil (0-50 mg/L). Heildarflavonoid innihald var gefið upp sem milligrömm quercetin ígildi (QE/g).

3.7. Andoxunarvirkni MP og MPMC

Heildargeta til að hreinsa sindurefna MP og MPMC var metin með því að nota þrjár mismunandi andoxunarprófanir: Stöð 2,2-dífenýl-1-píkrýlhýdrasýl(DPPH), asínó-bis(3-etýlbensóþíasólín{{5} }}súlfónsýru (ABTS) og Hydroxyl radical (HS) stakeindir eins og áður hefur verið lýst af El-Maksoud o.fl. [5].

3.8. Amínósýrur prófíl MP og MPMC

Próteinsýni voru vatnsrofuð með 6 N HCl samkvæmt Peksa et al. [49. Sjálfvirkur amínósýrugreiningartæki (AAA 400, INGOs Ltd.) var notaður til að ákvarða amínósýrur.

3.9. Ræfræðilegir eiginleikar

Sýni voru útbúin eins og lýst er af Barnes [50] með nokkrum breytingum. Seigja 2,5% (w/w) lausnar við pH7 var ákvörðuð við 25±1 gráðu með Brookfield seigjumæli (DV-II plus Pro, Rheocalc Software, Þýskalandi). Streita （σ） og seigja （n） voru teiknuð sem fall af skurðhraða. Samræmisvísitalan (K) og flæðihegðunarstuðullinn (n) í kraftlagslíkaninu voru reiknaðir:

Gildi n jafngildir 1 fyrir Newtons vökva og er breytilegt frá 0 til 1 fyrir vökva sem þynna skúf og stærra en 1 fyrir vökva sem þykkja klippingu [51].

3.10.Differential Scanning Calorimetry (DSC)

Hitaeiginleikar MP og MPMC voru mældir með því að nota mismunaskanna hitaeiningamæli (PerkinElmer, USA). Sýni (4-6 mg) voru sett í álplötu og innsigluð. Hver pönnu var síðan hituð í 350 gráður með flæði af þurru köfnunarefnisgasi við 20 ml mín-I við hitunarhraða 10 gráður mín.-1. Út frá innhita hámarki DSC hitaritsins var upphafshitastig afneitunar, hámarks umbreytingarhitastig og niðurbrotspunkt metið [52]. Umskiptintalpíugildið (AH) frá svæðinu undir endotherma toppnum í DSC kúrfunni var ákvarðað og tóma álpannan var notuð til viðmiðunar.

3.11. Fourier-Transform Infrared Spectroscopy (FTIR)

Innrauð litróf á milli 600 og 3500 cm-I voru mæld við 25 gráður með því að nota FTIR litrófsmæli (QFA Flex, USA) með dempuðu heildarendurkastsaðferðinni með 4 cm-I upplausn og náði 10 skannanir á sekúndu.

3.12. Sendingarrafeindasmásjá

Örbygging MP og MPMC var sýnd með því að nota rafeindasmásjá (JEOL, JEM 1400 Flash, Japan) við 80 kV. Kryo-stigið í neikvæðu litunaraðferðinni var beitt [53].

3.13.Líffræðilegar rannsóknir á MP og MPMC

3.13.1.In vitro krabbameinsvirkni

Allar frumulínur sem notaðar voru í þessari tilraun voru fengnar frá American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, Bandaríkjunum). Tvær krabbameinsfrumulínur úr mönnum voru notaðar í þessari greiningu: kirtilkrabbamein í brjósti (MCF{{0}}, ATCCHTB-22TM) og lifrarfrumukrabbamein (HepG2, ATCC4 HB-8065TM). Húðtrefjafrumur BJ-1(ATCC⑧ CRL-2522TM) og MCF-12F(ATCC CRL-10782TM) frumulínur í þekjubrjósti voru einnig prófaðar til samanburðar. Frumulínur voru ræktaðar í Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM/hár glúkósa, HyCloneTM, USA) ásamt 10 prósenta nautgripafóstursermi (FBS, Gibco, Brasilíu), 100 U/mL penicillíni, 100 ug/mL streptomycin og 25 ng/ mL amfótericín B (Sigma, Oakville, ON, Kanada) og ræktað við 37 gráður með 5 prósent CO, í rakaðri útungunarvél. Ræktunarmiðlinum var skipt út annan hvern dag með ferskum miðli. Þegar frumurnar náðu 70 prósent samruna voru þær losaðar með því að nota 0,25 prósent Trypsin-EDTA(1X) Gibco, Kanada, og fluttar í nýja ræktunarflösku. Eftir seinni yfirferðina voru frumurnar trypsínaðar og þær settar í 96-brunnsplötu í styrkleikanum 2×10* frumur/brunn. Eftir 24 klst ræktun var efnið hellt út og frumurnar þvegnar tvisvar með PBS og síðan meðhöndlaðar með 200 μL af ræktunaræti sem innihélt mismunandi styrk próteinsýna (1, 5,10 og 20 ug/mL). Doxorubicin HCl (4 ug/ml) var notað sem jákvæð viðmiðun en frumur sem voru meðhöndlaðar með óbættu miðli voru teknar sem neikvæð viðmið. Plöturnar voru ræktaðar við 37 gráður C í 24 klstgegn krabbameinivirkni sýnanna var ákvörðuð með hlutlausu rauðu upptökuprófi samkvæmt Repetto et al. [54]. Í stuttu máli, eftir ræktunartímabilið, var miðlinum skipt út fyrir 150 ul af hlutlausu rauðu litarefni (100 mg/ml) uppleyst í sermifríum miðli og frumurnar voru ræktaðar við 37 gráður C í 3 klst. Því næst voru frumurnar skolaðar með PBS og 150 μL af skolunarmiðli (EtOH/AcCOOH,50∶1) var bætt við og síðan var hrist í 10 mínútur til að tryggja algjöra upplausn. Frásog var mæld við 540nm með því að nota örtítraplötulesara (BioTek, 96 Well Plates, ELX808, Bandaríkjunum).

þar sem Ac er gleypni eftirlitsins og As er gleypni sýnisins. Hlutfall frumudauða sýndur sem frumueiturhrif( prósent ) og styrkurinn sem drepur 50 prósent frumna (IC50) var reiknaður út fyrir hvert sýni.

3.13.2. Ákvörðun p53, Bax, Caspase-3 og Bcl-2 próteinstigs

Frumumagn lykilpróteinmerkja frumudauða var ákvarðað eftir 24 klst. eftir meðferð með ICso MP og MPMC. Í stuttu máli, Hep G-2, MCF-7, Bj-1 og MCF-12F frumur voru sáð í 5× 10* frumur/holu í 6-brunn plötur. Eftir 24 klst. ræktun með sýnunum við 37 gráður, var frumum safnað og leyst og síðan skilið í skilvindu við 10,000rpm í 20 mínútur við 4 gráður. Próteinstyrkur var magngreindur í flotinu með Bradford prófun [55]. Kaspasa-3 virkni var greind með litmælingasetti (Abcam, ab39401) í samræmi við leiðbeiningar framleiðanda [56]. Í stuttu máli var 10 mg próteini bætt við 50 µL af Caspase hvarfefni og endanlegt rúmmál var stillt í 200 μL með því að nota hvarfjafnalausn við 37 gráður og blandan var ræktuð í 1 klst. í myrkri og fylgt eftir með því að mæla Caspase{{24} } styrkur við 405 nm.

Magn pro-apoptotic merkja p53, tengt X(Bax), og and-apoptotic marki B-frumu eitilæxli-2(Bcl-2) var ákvarðað í frumulýsi með því að nota Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Simple Step ELISA samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda (ab207225, ab119506, og ab199080; Abcam, USA), í sömu röð [57,58].

3.13.3.DNA skemmdir af völdum oxunarálagsvörn

DNA skaðagreining var framkvæmd eins og áður hefur verið lýst af Leba o.fl. [59] með smávægilegum breytingum. Í stuttu máli var 3 μL af ríbónúkleasahemli plasmíði RNH1（NM_203387）Human Tagged ORF klón 10 ug/μL blandað saman við Fenton's hvarfefni (5 mM af H2O2 og 0.3 mM af FeSO4 og 0,6 mM af EDTA）, og endanlegt rúmmál var stillt í 25 μL með því að nota fosfatjafna (H2POA, 8,3 mM, pH 7,4). Síðan var lausnin ræktuð í 20 mínútur við 37 gráður. Til að meta andoxunargetu MP og MPMC gegn DNA skemmdum af völdum Fentons hvarfefnis, var 5 ug/mL MP/NabM, MP/IHM og MP bætt við fyrir ræktun. RNH1 plasmíð DNA (3 μL, 10 ug/μL) var notað sem DNA verndarstýring.

3.13.4.PCR-undirstaða erfðafræðileg DNA skaðagreining

Homo sapiens metýlentetrahýdrófólat redúktasa (MTHFR) gen var magnað upp með PCR úr erfðaefni í blóði sem áður var dregið úr heilbrigðum blóðsýnum með því að nota staðlað DNA útdráttarsett [60]. DNA var ræktað í 10 mínútur með eða án Fenton's hvarfefnis sem bætt var við MP eða MPMC. 198-bp brot var magnað með því að nota fram5'-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3' og öfuga 5'-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3' frumra. Með því að nota 50 ng af meðhöndluðu DNA var PCR mögnun framkvæmd í kjölfar næsta hitahringrásar (94 gráður í 5 mínútur, fylgt eftir með 25 lotum af eðlisbreytingu, 30 sekúndur við 94 gráður; glæðing, 30 sek. við 60 gráður; og framlenging, 30 sek. við 72 gráður) fyrir 25 lotur og 1 loka framlengingarlota við 72 gráður í 5 mín. PCR hvarfsýnin voru notuð fyrir agarósa gel rafdrætti (2 prósent).

3.13.5. Genatjáningarsnið með RT-qPCR

Greining á genatjáningu lykilfor- og and-apoptótískra merkja gena voru gerðar með HepG-2, MCF-7, Bj-1 og MCF-12F frumum útsettar fyrir IC50 sem fengust gögn (tafla 3) í 72 klst. Í stuttu máli var heildar-RNA dregið út með því að nota Total RNA Purification Kit (QIAGEN., Thorold, ON, Kanada) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. cDNA

nýmyndun var framkvæmd eins og áður hefur verið lýst af Aboul-Sound o.fl. [61]. Mögnunaráætlanir og PCR amplicon sérhæfni voru framkvæmd og metin með því að nota Rotor-Gene O 5-Plex HRM varma hringrás (Qiagen, Þýskalandi) með Quanti-Tect SYBR-Green PCR Kit (Qiagen, Þýskalandi) eins og áður hefur verið skráð. eftir stöðluðum samskiptareglum [61]. Eftirfarandi grunnur voru notaðir: Hs_P53_1 SG QuantiTect Primer Assay (QT00060235); Hs_CASP3_1_SG Quan-tiTect Primer prófun (QT00023947); B-frumu eitilæxli 2 Hs_BCL2_1_SG QuantiTect Primer Assay (QT00025011);Bcl-2-eins og prótein Hs_BAX_1_SG QuantiTect Primer Assay ( QT00031192); og 18S rDNA house-keeping (HK) gen Hs_RRN18S_1_SGQuantiTect Primer Assay(QT00199367). PCR varma hringrásaráætlun og genatjáningargreining til að ákvarða fold-breytingu miðað við 18S genið voru í meginatriðum framkvæmdar eins og áður hefur verið greint frá [61].

3.14.Tölfræðigreining

Niðurstöðurnar sem fengust voru gefnar upp sem meðaltal ± staðalfrávik. Tölfræði var náð með SPSSsoftware 11.5 (SPSS, Inc.Chicago, IL, Bandaríkjunum). Duncan's multiple range test var notað til að ákvarða marktækan mun á öllum sýnum og var munurinn talinn marktækur við p<>

4. Niðurstöður

Að lokum leiddi þessi rannsókn í ljós að blanda mjólkurpróteins viðfjölsykrurmeð aðgreiningu lausnar pH er hentug tækni til fléttunar. Mjólkurprótínslímflétturnar (MPMC) sem myndast hafa marktækt hærri fenól ogflavonoidsinnihald en mjólkurpróteinið (MP). DSC niðurstöður sýndu að fléttun MP við fjölsykrur jók marktækt varmastöðugleika með breytingu á eðlisbreytingarhitastigi. FTIR greiningar voru gerðar til að bera kennsl á starfrænu hópana og flæðihegðun tilbúinna fléttna var rannsökuð. WSI og WAI mjólkurpróteins voru aukin með fléttumyndun með NabM eða IHM. TEM var notað til að sjá fyrir sér örbyggingu tilbúnu fléttanna. Á hinn bóginn er búist við að mjólkurpróteinflétturnar sem myndast með isabgol hýðislím (HM) eða Nabeq slímhúð (NabM) muni standa sig betur en innfædd mjólkurprótein í andoxunar- og krabbameinsáhrifum. Í stuttu máli, MPMC tjáði einstaka eiginleika gegn krabbameini gegn líkan af brjóstakrabbameini og lifrarkrabbameinsfrumulínum (MCF7 og HEPG2, í sömu röð) eins og sannað er með hlutlausu rauðu upptökuprófi.

MPMC bætti bæðiandoxunarefniog virkni gegn útbreiðslu. Kaspasar eru lykilprótein sem stjórna eftirlitsstofnunum sem eru fólgin í örvun frumuddjúps. Uppstjórnun caspasa 3 próteins og mRNA umrita (Mynd 9A, B) stjórnar öðrum próteinum í frumudauðaferlinu, sem einkennist af hruni hvatberahimnunnar með Bax-framkölluðum cýtókróm c losun og virkjun á caspasa 9 sem leiðir til síðari þátttöku kaspasi 3. Uppstjórnun á Casp3, p53 og Bax ásamt lækkun á Bcl-2 tjáningu leiddi í ljós að MPMC framkallaði frumufrumuvirkni, þar sem uppstjórnun á p53 mun örva tjáningu Bax, sem aftur mun örva cýtókróm c sleppa, fylgt eftir með caspase-9 og-3 virkjun. Þar að auki er vitað að Bcl-2 hindrar losun cýtókróm c. Í rannsókn okkar var sýnt fram á að MPMC-framkallað Bcl-2 lækkun auðveldaði ómótstæðilega Bax-framkallaða cýtókróm c losun og síðari frumudauða.

Krabbameinseyðandi áhrif prótein-fjölsykru fléttna veita frekari uppljómun um notagildi þessara fléttna til að nota við þróun hagkvæmrar og skilvirkrar krabbameinsmeðferðar með lágmarks aukaverkunum.