Marglitamyndataka af kalsíumbindandi próteinum í nýrnasteinum manna til að skýra áhrif próteina á kristalvöxt
Mar 21, 2022
NýraSteinsjúkdómur er algengur sjúkdómur sem hefur áhrif á 1,7–14,8 prósent íbúa að minnsta kosti einu sinni á ævinni1,2. Í allt að 50 prósent tilvika kemur þessi sjúkdómur aftur innan 5 ára frá fyrsta þætti. Þrátt fyrir mikilvægi þessa heilbrigðisvandamála er fyrirbyggjandi meðferð við steinmyndun ekki tiltæk. Að skilja meingerðnýrusteinmyndun er nauðsynleg til að draga úr tilviki og endurkomunýrusteinsjúkdómur 3. Um það bil 80 prósent afnýrusteinar eru kalsíumoxalat (CaOx) steinar4,5. CaOx steinar samanstóð af ~90 prósent af steinefnafasa, þ.e. CaOx sem er frekar flokkað í kalsíumoxalat einhýdrat [Ca(C2O4)·H2O](COM) og kalsíumoxalat tvíhýdrat [Ca(C2O4)·2H2O](COD), og tiltölulega lítið brot af lífrænum efnum, sem hefur verið talið nýrna-þvagfæradeild, Graduate School of Medical Sciences, Nagoya City University, 1‑Kawasumi, Mizuho‑cho, Mizuho‑Ku, Nagoya 467‑8601, Japan . 2Institute for Advanced Co-Creation Studies, Osaka University, 2-1, Yamadaoka, Suita 565-0871, Japan. 3Graduate School of Engineering, Osaka University, 2-1, Yamadaoka, Suita 565-0871, Japan. 4Graduate School of Life and Environmental Sciences, Kyoto Prefectural University, 1-5, Hangi-cho, Shimogamo, Sakyo-ku, Kyoto, Kyoto 606-8522, Japan. 5Department of Earth Science, Tohoku University, 6-3 Aza-Aoba, Aramaki, Aoba-ku, Sendai 980-8578, Japan. 6National Museum of Nature and Science, 4‑1‑1 Amakubo, Tsukuba 305‑0005, Japan. 7Health and Medical Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), 2217-14, Hayashi-cho, Takamatsu, Kagawa 761-0395, Japan. 8Tajiri Thin Section Laboratory, 3‑1‑11 Sannose, Higashiosaka, Osaka 577‑0849, Japan. 9Institute of Laser Engineering, Osaka University, 2-6, Yamadaoka, Suita City, Osaka 565-0871, Japan. *Netfang: maruyama@cryst.eei.eng.osaka-u.ac.jp; a-okada@med.nagoya-cu.ac.jp
Leitarorð:nýru; nýrnasteinar; nýrnasjúkdómur; nýru; lífeðlisfræði nýrna
CISTANCHE mun bæta nýrna-/nýrnabilun
sem próteinfylki6. Meingerðnýrusteinmyndun felur í sér fjölþrepa ferli sem fela í sér flókin víxlverkun milli steinefnaþátta og próteinfylkis7,8. Meira en 100 tegundir próteina hafa verið greindar ínýrusteinar 9–11. Meðal þeirra er vitað að nokkur prótein, einkum kalsíumbindandi prótein, gegna mikilvægu hlutverki í CaOx steinmyndunarferlum12–16. Sérstök áhrif þessara próteina hafa verið rannsökuð ítarlega í mörgum skrefum steinmyndunar, þar á meðal kristalkjarna, kristalvöxt, kristalsamloðun og kristalviðloðun, með fjölmörgum in vitro kristöllunarrannsóknum17–19. In vitro rannsóknir eru gagnlegar til að meta áhrif sérstakra próteina á sérstök skref í steinmyndun. Hins vegar, í raunverulegu steinmyndunarumhverfi, virkar fjöldi próteina samtímis og þvagsamsetning í styrk próteina, kalsíumjóna og oxalats sveiflast. Þessar áhyggjur hvöttu okkur til að rannsaka raunverulegt mannlegtnýrusteina til að finna raunveruleg áhrif próteina á kristalvöxt. Í flestum fyrri rannsóknum, auðkenningu próteina ínýrusteinar hafa verið gerðar með massagreiningu eftir mulning og útdrátt9–11. Þannig glatast upplýsingar um staðbundna dreifingu próteina í steininum. Í mjög takmörkuðum rannsóknum er próteinauðkenning ínýrusteinar hafa verið gerðir með sneiðum hluta af nýrnasteinum þar sem CaOx kristallar eru fjarlægðir að fullu með afkalkingu20,21. Þessi aðferð er gagnleg til að finna dreifingu próteins ínýrusteinar sem hugsanlega hjálpa til við að skilja ákveðin próteináhrif á steinmyndun. Hins vegar er mikið magn upplýsinga um steinmyndunina, skráð ínýrusteinkristallar, glatast í þessari aðferð. Mikilvægi steinefnaupplýsinga um nýrnasteina sem hægt er að fá með því að bera kennsl á kristalfasa og flokkun kristaláferðar með sneiðum og fáguðum þunnum hluta afnýrusteinar með sjónsmásjá hefur verið sýnt fram á með meira en 70 ára fyrri rannsóknum22,23.
Skortur á greiningunni til að meta próteindreifingu með óspilltum CaOx kristöllum ínýrusteinar hafa verið töluverð hindrun við að skilja steinmyndunina. Samræmt mat á dreifingu próteina og kristalfasa/formgerð getur veitt mikilvægar upplýsingar um sögu steinmyndunar. Margfeldi ónæmisflúrljómunarlitun (multi-IF litun) hefur verið notuð til að sýna dreifingu tveggja eða fleiri próteina í mörgum gerðum mjúkvefja lífsýna24. Notkun tækninnar á beinvef, sem eru samsett úr gljúpum kalsíumfosfatkristöllum, veitti einnig mikilvæga innsýn í kraftmikla stjórnun á beinsteinefnajafnvægi25. Þetta hefur hins vegar ekki verið notað til að rannsakanýrusteinar samsettir úr þéttum og hörðum kristöllum, þó að ein ónæmisflúrljómunarlitun hafi verið notuð til að sýna dreifingu tiltekins próteins í afkalkuðunýrusteinar sem geyma ekki upplýsingar um steinefni20,21. Þessi rannsókn rannsakaði aðstæður sem gera multi-IF litun ánýrusteinsýni til að varðveita upprunalegu steinefnisupplýsingarnar. Við könnuðum dreifingu þriggja mismunandi próteina, osteopontin (OPN),nýruprótrombínbrot 1 (RPTF-1), og kalgranúlín A (Cal-A), í þunnum hlutum af CaOx steinum. Þessi prótein eru algeng í flestum CaOx steinum og eru þekkt sem kalsíumbindandi prótein sem hugsanlega hafa áhrif á CaOx steinamyndun26–28. Eftir því sem við best vitum er þetta fyrsta rannsóknin þar sem mörg fylkaprótein eru sýnd saman ínýrusteini. Við túlkum enn frekar mismunandi in vivo áhrif hvers próteins á CaOx kristalvöxt út frá dreifingu þeirra, eðlisefnafræðilegum eiginleikum og flóknu eðlisfræðilegu umhverfi hvers próteins við myndun CaOx steina.
CISTANCHE MUN BÆTA NÝRA/NÝRASKILUN
Niðurstöður
Byggt á smásjá athugun ásamt FT-IR greiningu, lén afnýrusteinsýni voru flokkuð í þrjár gerðir af áferð sem eru í samræmi við það sem greint er frá í Schubert og Brien23: óregluleg áferð sem samanstendur af euhedral COD kristöllum (Type 1, vísað til sem euhedral COD aggregate; mynd 1c), mósaík áferð sem samanstendur af óreglulegri stilla COM kristallar (Type 2, vísað til sem mósaík COM; mynd 1f), og sammiðja lagskiptir COM kristallar (Type 3, vísað til sem sammiðja COM; mynd 1i). Flest af CaOx steinsýnunum sem mældust samanstóð af þessum þremur áferðum (tafla 1). Multi-IF litunaraðferð sem notuð var fyrir lífsýni var beitt við greiningu á þunnum hlutum afnýrusteinsýni unnin með dæmigerðri jarðfræðilegri aðferð. Fyrir beitingu var ætingarástand þunna hlutans fyrir litunina stillt og í ljós kom að sjónmyndin tókst aðeins þegar fáður þunnur hluti var örlítið etsaður (með pH 6.0 sítratlausn í 1 mín. ) fyrir dæmigerða litunarferlið. Multi-IF litunin gerði kleift að sjá saman þrjú prótein í mismunandi litum (OPN: Grænn, RPTF-1: Blár og, Cal-A: Rauður) í hinum þremur mismunandi steinaáferð.
Við komumst að því að hvert prótein sýndi einkennandi dreifingarmynstur eftir staðsetningu þess í COM og COD. Samanburður COD fannst í 7 sýnum af 15 sýnum (tafla 1). COD efnasamböndin voru aðallega til staðar á jaðri CaOxnýrusteinar (mynd 1a–c). Vitað er að þessir COD kristallar hafa fjórhyrnt tvípýramída lögun sem samanstendur af {101} andlitum29. Margir COD tvípýramídanna hafa einnig {110} andlit á enda beggja pýramída (mynd 2b og aukamynd S1). Fjöl-IF litunarmynd af COD kristöllum er sýnd á mynd 2a og OPN birtist reglulega á {110} flöt COD, eins og sýnt er með hvítum örvum á mynd 2c. Þetta andlit er sama andlit tvípýramídaoddsins sem kemur ekki fram í dæmigerðum COD in vitro kristalvexti29. RPTF-1 birtist sem samhliða lög meðfram {101} flötinni, með millibili á µm mælikvarða, eins og sést með gulu örinni á mynd 2d. Þetta kristalsandlit er einkennandi fyrir dæmigerðan COD-vöxt29. Cal-A var til staðar utan COD kristallanna, sem sýndi enga ívilnandi aðsog á sérstökum andlitum (mynd 2e). Sömu dreifingarmynstur sáust í öðrum steinsýnum (aukamynd S2). Mósaík COM áferðin er algengasta áferðin í CaOx steinum (mynd 1d–f). Þessi áferð kom fram í 12 sýnum af 15 (tafla 1). Multi-IF litun á mósaík COM er sýnd á mynd 3a,b. OPN og RPTF-1 voru til staðar um alla COM kristalla (mynd 3c,d). Aftur á móti var Cal-A eingöngu til staðar meðfram kornamörkum (þ.e. á yfirborði COM korna) (Mynd 3e). Við greindum frekar línustyrkleikasnið próteina, eins og sýnt er á mynd 3a, til að meta hvert próteindreifingarmynstur í smáatriðum (gul lína á mynd 4a). OPN og RPTF-1 sýndu meiri styrkleika á kristalsvæðinu, en Cal-A sýndi minni styrkleika í
kristalsvæði (mynd 4b). Mikill styrkleiki Cal-A sást eingöngu meðfram kristalsmörkunum. Þessar próteindreifingar sáust í mörgum sýnum, þótt stærðir og lögun COM korna væru mismunandi (viðbótarmynd S3). Sammiðja COM er einnig dæmigerð áferð í CaOx steinum (mynd 1g–i). Við fundum þessa áferð í 10 sýnum af 15 (tafla 1). OPN, RPTF-1 og Cal-A var dreift í sammiðja lögum (mynd 5a). OPN og RPTF-1 voru til staðar sem stöðug og regluleg lög í gegnum COM-kristallana, sem myndaði µm-kvarðabil (mynd 5b,c). Aftur á móti var Cal-A dreifingin samsett úr óreglulegum og tiltölulega breiðum lögum sem staðsett eru í ytra yfirborði steinsins (mynd 5d). SEM athugun sýndi bilalag nálægt hverju Cal-A lagi (mynd 6a,b). Báðir fletirnir sem mynduðu bilið voru uppteknir af örsmáum útfellingum sem voru greinilega aðgreindar frá helstu COM kristöllum sem mynda sammiðja COM (mynd 6c, d). Línustyrkleikasnið þessara próteina í sammiðja COM sýndu toppa í hverju próteinsniði (mynd 4c, d). Snið OPN og RPTF-1 voru svipað (þ.e. 5,58±2,70 µm/lag af OPN og 5,99±2,56 µm/lag af RPTF-1) (viðbótartafla S1). Hins vegar höfðu Cal-A lögin áberandi stórt bil (þ.e. 23,17±18,57 µm/lag) en OPN og RPTF-1. Svipuð dreifingarmynstur og millibil sáust í flestum hinum 9 sýnunum, þó að Cal-A lagið hafi ekki sést í nokkrum sýnum (aukamynd S4 og tafla S1).
Í þessari rannsókn höfðu hlutföll þriggja áferða í CaOx steinum og dreifing þriggja próteina í áferðunum þremur engin skýr tengsl við aldur og kyn steinsformans, þó að magn þeirra steina sem rannsakaðir voru hafi ekki nægt til fylgnigreiningar. . Vitað hefur verið að OPN, RPTF-1 og Cal-A séu til staðar í CaOx steinum byggt á greiningu úr útdrætti steindufts með rafgreiningu9–11. Míkróskala dreifing OPN í afkalkandi CaOx steinum með ónæmisfrumnaefnafræðilegri tækni sýndi OPN dreifingu í sammiðju lamella í CaOx steinum21,30. Núverandi aðferð sýndi ljóslega staðsetningu þriggja mismunandi próteina í áður álitnum „lífrænum lögum“ (Mynd 7a,b). Dreifingarmynstur OPN sem við sýnum í þessari rannsókn í sammiðja COM er í samræmi við fyrri athuganir. Við komumst að því að dreifingarmynstur RPTF-1 í sammiðja COM er næstum það sama og OPN, en dreifing RPTF-1 í COD kristöllum er önnur en OPN. Aftur á móti er dreifingarmynstur Cal-A gjörólíkt hinum tveimur próteinum. Skoðaðu mismunandi örkvarðadreifingu OPN, RPTF-1 og Cal-A og skráðu sögu CaOx-steinsmyndunar.
Umræða
Aðal stjórnandi þáttur próteinupptöku í kristalla.Bæði OPN og RPTF {{0}} voru til staðar í euhedral COD kristöllum, mósaík COM kornum og sammiðja COM (myndir 2a, 3a og 5a). Þessi niðurstaða staðfestir að þessi prótein eru felld inn í bæði COD og COM kristalla. Cal-A var til staðar utan á euhedral COD kristöllum og í kringum mósaík COM korn (myndir 2e og 3e). Í sammiðja COM tilvikinu bendir bilið sem er venjulega í kringum Cal-A lögin til þess að Cal-A lögin séu ekki innifalin í kristallunum heldur dreift á yfirborð kristallanna (myndir 5d og 6a–d). Þessar dreifingar gefa til kynna að OPN og RPTF-1 hafi tilhneigingu til að vera felld inn í CaOx kristalla, en Cal-A er varla felld inn. Aðsog og innlimun próteina í CaOx kristalla er fræðilega undir áhrifum af bindikrafti amínósýru hliðarkeðja þeirra og öðrum sértækum eiginleikum viðkomandi próteina eins og rafstöðueiginleikar neikvæðrar hleðslu31,32. Nettóhleðslan gefur til kynna að OPN og RPTF-1 séu neikvæðari en Cal-A, með jafnrafmagnspunktum OPN, RPTF-1 og Cal-A 3,5, 2,5–3.{{28} } og 6,5–7,0, í sömu röð 33–35. Te OPN, RPTF-1 og Cal-A eru þekkt fyrir að hafa kalsíumbindandi lén36–38. Þessi lén geta auk þess virkað sem staðbundnir bindistaðir við vaxandi kristalsyfirborð. Kalsíumbindandi lén OPN, RPTF-1 og Cal-A geta bundið 10, 7 og 2 kalsíumjónir, í sömu röð, 36–38. Þar með veldur magn og staðbundin skyldleiki þessara próteina við jákvætt hlaðna Ca á yfirborði CaOx mismunandi innlimunarvirkni þessara próteina í CaOx. Kristallvöxtur heldur áfram með því að fella vaxtareiningar í þrep og beygjustaði sem birtast á yfirborði kristals39,40 . Trjávíddarsamhæfni milli próteina og vaxandi kristalsyfirborðs myndi ráða úrslitum
CISTANCHE MUN BÆTA NÝRA/NÝRAVERKI
hversu mikið prótein er innlimað í yfirborð kristalsins. Prótein með sterka bindingargetu við vaxtarbeygjustaði og -þrep hafa tilhneigingu til að fella inn í vaxandi kristal á skilvirkari hátt41–43. Núverandi dreifing og kalsíumsækni próteinanna þriggja benda til þess að sterk sækni OPN og RPTF-1 auðveldar bindingu og innlimun í COD og COM kristalla. Aftur á móti festist Cal-A, sem hefur minni sækni, aðeins við yfirborð kristalsins en er ekki fellt inn í kristalinn. Fyrri rannsókn sem sýndi hærra hlutfall peptíðs innlimunar í COM með fleiri fosfórýleruðum peptíðum styður þessa skýringu43. Þessar umræður myndu gera okkur kleift að spá fyrir um dreifingu margra annarra próteina út frá kalsíumbindandi eiginleikum þeirra.
In vivo sértækt frásog og hamlandi áhrif OPN og RPTF-1 á CaOx kristalvöxt.Litið hefur verið á euhedral COD kristalla sem eru aðallega til staðar á jaðri CaOx steins vaxa með einkennandi lagskiptri áferð þar sem svokallað „lífræn efni“ og „steinefnalag“ skiptast á við kristalvöxt44,45. Þrátt fyrir að nákvæmar ástæðurnar sem liggja til grundvallar lagabreytingunni séu enn óljósar, eru mögulegar skýringar meðal annars umhverfisbreytingar í hýsil mannsins,nýrulífeðlisfræði og lífefnafræðilegar breytingar á þvagi, og hreyfihvarfakerfi sem mynda sveiflusvæði sem finnast í steinefnum8. Núverandi niðurstöður sýna að OPN og RPTF-1 mynda lagskipt áferð sem samsvarar {110} og {101} COD andlitanna sem innankristallað prótein, í sömu röð, en Cal-A er ekki innifalið í lagskiptu áferðinni (mynd 2c) –e). Þessi in vivo vísbending um yfirborðssértækt aðsog/innlimun próteina á/ínýrusteinkristallar gefa til kynna að dreifing próteina sé ekki eins og hið hefðbundna „lífræna efnislag“ sem sést með ljóssmásjá (Mynd 7a). In vitro vísbendingar um sértæka frásog OPN á COD kristal voru tilkynnt af Chien o.fl. (2009 og 2018)46,47. Samkvæmt þessum skýrslum binst OPN við hið dæmigerða kristallógrafíska {110} andlit COD og fellur inn í steinefnafasann, sem er í samræmi við niðurstöður okkar (Mynd 7b). Yfirborðssértæk frásog/innlimun hefur líklega stafað af kalsíumbindandi getu hvers próteins og/eða mismunandi sameindasamhæfni milli starfrænna hópa á próteinsameindunum og uppröðun grindarjóna á hverju kristalyfirborði.
Flest prótein hindra að sögn CaOx kristalvöxt við steinmyndun48,49. Litið er á hömlun á kristalvexti af peptíðum sem í gegnum þrepafestinguna og/eða kinkblokkunina41–43. Í fyrri in vitro rannsóknum er vitað að OPN og RPTF-1 eru hemlar í CaOx kristalvexti48,49. Hins vegar er umfang hömlunarinnar ínýrusteinmyndun er enn óljós.
Núverandi athugun sýnir að flestir nýrnasteins COD kristallar hafa dæmigerða kristalsvenju með {101} andlitum (mynd 2b). Kristallfletir sem hafa tiltölulega hægan vaxtarhraða eru almennt vel þróaðir40. Þessi fjármögnun gefur til kynna að vöxtur {101} andlita COD sé hægur miðað við önnur yfirborð (td {110}). Ívilnandi aðsog RPTF-1 sem hugsanlega hægði á kristalvexti með því að innlimast í COD fannst sem lagskipt uppbygging ásamt {101} flötum (mynd 2d). Á hinn bóginn fundum við {110} andlit sem OPN lagskipt mannvirki inni í COD kristalnum (Mynd 2c). {110} andlitin birtust þar sem OPN lagskipt uppbygging er þróaðari en {110} andlit OPN-fríra COD kristalla sem fengust í rannsókninni í glasi46. {110} andlit COD með ívilnandi aðsog OPN er ekki kristalsflöturinn sem birtist á COD dæmigerðrar kristalvana47. Hins vegar myndi OPN frásog á {110} hægja mjög á hlutfallslegum yfirborðsvexti og hraðaminnkunin var nógu hæg til að {110} andlitin birtust. Tilkoma {110} andlitanna, með öðrum orðum, breytir almennri kristalsvenju í mörgum sýnum af nýrnasteinum. COM kristallar birtast annað hvort sem mósaík áferð eða sammiðja áferð (myndir 3a og 5a). Bæði OPN og RPTF-1 eru einsleitar í COM-kornum í mósaíkáferð (mynd 3c,d). Hins vegar eru áhrif þessara próteina á vaxtarhraða þessarar tegundar COM ekki ljós. Í sammiðja COM, rist-eins og kristallar í geislalínu frá miðju að utan50. Kristallsfletir kristalalíka kristallanna eru ekki skýrir, en ytra yfirborð kúlulaga COM sem verður fyrir þvagi ætti að hafa sömu kristallógrafísku hliðarnar. Núverandi niðurstöður sýna greinilega að OPN og RPTF-1 eru með svipaða dreifilínusnið þar sem þau dreifast reglulega í sammiðja COM sem um það bil 4 til 6 µm mælikvarða millibilslög (myndir 4c,d, 5b,c og Viðbótartafla S1). Þetta gefur til kynna að OPN og RPTF-1 hafi óverulegan mun á aðsoginu og innlimuninni á sérstökum kristalflötum COM sem verður fyrir þvagi. Fyrri in vitro rannsóknir sýndu að OPN hefur hamlandi áhrif á COM vöxt {100}, {121} og {010} andlit 51. Þegar þessi hamlandi áhrif eru skoðuð bendir núverandi niðurstaða til þess að sammiðja COM vöxturinn hafi verið hamlaður af OPN og hugsanlega af RPTF-1 þar sem RPTF-1 hefur svipaða kalsíumbindandi getu og hefur því svipaða innlimunarvirkni og COM.
Mynd 7. Skýringarmynd af próteindreifingu í þremur helstu áferðum í CaOx. (a) Litið er á dreifingu próteins fylkis í fyrri rannsóknum (hvítur litur: steinefnafasa svartur litur: lífrænt efni). (b) Sérstök próteindreifing sem fannst í þessari rannsókn (grænt: osteopontin (OPN), blátt: nýrnaprótrombínbrot 1 (RPTF-1), og rautt: calgranulin A (Cal-A). Tegund 1 sjálfhverf COD, Type2 mósaík COM og Type3 sammiðja lagskipt COM.
In vivo hamlandi áhrif Cal-A á CaOx kristalvöxt.Cal-A aðsog á sérstökum kristalsflötum bæði COM og COD kristala sást ekki í núverandi niðurstöðu (Mynd 2a og 3a). Cal-A hefur minni kalsíumbindandi getu en OPN og RPTF-1 og var til staðar utan á euhedral COD kristalla og í kringum mósaík COM korn án lagskiptrar uppbyggingu (myndir 2a,e og 3a,e). Hins vegar er einnig vitað að Cal-A hindrar CaOx kristalvöxt in vitro rannsókn28. Svo, Cal-A gæti hafa virkað sem yfirborðsvirk efni sameind sem hefur áhrif á formgerð og kristalvaxtarhraða án innlimunar í kristal39,40,52. Við venjulegar þvagaðstæður (þ.e. án óreglulegs hás Cal-A styrks), getur Cal-A haft lægri hamlandi áhrif en OPN og RPTF-1 á kristalvöxt COM og COD frá OPN og RPTF{{17} } hindra þróun þrepa á kristalsflötum með festingu og/eða lokun með innlimun í kristalla. Þess vegna myndi kalsíumbindingargeta próteina í nýrnasteinum hjálpa til við að meta umfang hamlandi áhrifa þeirra á CaOx vöxt Í sammiðja COM sýndi Cal-A óreglubundin lög sem höfðu fjarlægð frá 20 til 50 µm (myndir 4c,d) , 5d og viðbótartafla S1). Cal-A hefur fundist í þvagi sem mynda steina28. Þannig ættu sveiflur í styrk þess í þvagi náttúrulega að eiga sér stað. Hins vegar, vegna minni sækni í kalsíumjónir, gætu litlar sveiflur í styrk Cal-A ekki verið skráðar í COM áferð. Cal-A skilst út í þvagi óreglubundið sem bólgueyðandi prótein til að bregðast við bólgu53,54. Hins vegar geta óreglubundin lög af Cal-A skráð einstaka háan styrk af Cal-A í þvagi vegna óreglulegra umhverfisbreytinga, svo sem sýkingar, meiðsla og blæðinga. Hamlandi áhrif þess á COM-vöxt myndu mjög ráðast af styrk þess í kringum vaxandi kristalla þar sem nokkur peptíð eru svo háð kalsítkristallavexti42. Cal-A getur dregið lítillega úr vexti COM með því að taka að hluta til vaxtarflötinn þegar styrkur þess í kringum kristalinn er lítill vegna þess að próteinið er ekki hætt við að vera innlimað í CaOx. Í sammiðja COM eru bilalög umkringd örsmáum útfellingum sem fundust með SEM athugun næstum eins staði og Cal-A lögin sem finnast með multi-IF myndgreiningu (mynd 6a-d). Þess vegna, þegar Cal-A lagið verður þykkt vegna óreglulega hás styrks þess vegna líffræðilegra breytinga, getur Cal-A virkað sem öflugur hemill á CaOx vexti með því að hernema víða vaxtarflötinn. Bólga, sem er kveikja að Cal-A seytingu, getur einnig haft áhrif á annað þrep í steinmynduninni vegna þess að tegund hvítra blóðkorna (þ.e. átfrumna) sem hafa stuðlað og hamlandi áhrif á myndun nýrnasteina hefur fundist í tilraunum með mús af nýrnasteini16.
Hugsanleg beiting multi-IF myndgreiningar á heildarmyndun nýrnasteina.Núverandi vinna stækkaði beitingu fjöl-IF myndgreiningar á próteinum á harðari lífefnasýni, þ.e. nýrnasteina. Kristalkjarnamyndun, kristalvöxtur, kristalsamruni og kristalviðloðun hafa verið talin mikilvæg skref í myndun nýrnasteina. Tilkynnt er um OPN, RPTF-1 og Cal-A sem hemla kjarnamyndun, vöxt og samloðun CaOx í in vitro rannsóknum48,49. Núverandi aukin notkun á fjöl-IF myndgreiningu gefur in vivo vísbendingar um hamlandi áhrif CaOx vaxtar af próteinum sem var gefið í skyn í fyrri in vitro rannsóknum. Rannsóknir á áhrifum próteina í hverju þrepi hafa verið gerðar með in vivo rannsóknum á músum sem og fjölda in vitro rannsókna14,15,26. Til dæmis hefur verið greint frá mikilvægu endurverndarhlutverki OPN sem hindri kristalmyndunar og hindrunar á kristalviðloðun á grundvelli in vivo tilrauna í músum26 en eflingu kristalviðloðun við pípulaga þekjufrumur með OPN og eflingu CaOx steins. Tilkynnt hefur verið um myndun byggt á nýlegri tilraunum í lífi með OPN-knockout músum14,15. Allt önnur kristalformgerð sem finnast í nýrnasteinum í OPN-útsláttarmús styður einnig áhrif OPN í mörgum skrefum nýrnasteinsmyndunar. Núverandi sjónmyndunaraðferð væri gagnleg við að meta próteináhrif í þessum in vitro rannsóknum á músum og jafnvel gagnleg við mat á mismunandi skrefum í myndun nýrnasteina í mönnum. Þessi nýja greining myndi gera okkur kleift að túlka þau in vivo áhrif mismunandi próteina á CaOx steinamyndun sem getur opnað leið fyrir meinafræðilega skoðun og sérsniðna lyf til að stjórna nýrnasteinssjúkdómi í mönnum.
Aðferðir
Siðferðisyfirlýsing. Rannsóknarverkefnið sem kynnt er í þessari grein var samþykkt af endurskoðunarnefnd stofnana við framhaldsnám í læknisfræði, Nagoya City háskólanum. Allar aðferðir voru framkvæmdar í samræmi við viðeigandi leiðbeiningar og reglugerðir. Skriflegt upplýst samþykki allra viðfangsefna fékkst samkvæmt verklagsreglum samþykktar af stjórn siðanefndar.
Steinsöfnun og undirbúningur steinkafla. Nýrnasteinum var safnað úr sjúklingum og voru þeir greindir í Nagoya borgarháskólanum í Japan. Fimmtán CaOx nýrnasteinssýni voru valin úr þúsundum nýrnasteinasöfnum okkar úr mönnum á grundvelli upplýsinga um innrauða litrófsgreiningu (IR) og þunnir hlutar voru útbúnir. Magn steinefnasamsetning steinsins var metin með IR greiningu. Bergfræðileg þunnskurðaraðferð, upphaflega hönnuð fyrir jarðfræðilegar rannsóknir, var beitt við þessa nýrnasteinsrannsókn55. Nýrnasteinssýni voru að öllu leyti felld inn í epoxýplastefni og skorin. Þversniðið var malað með slípiefnum (SiC og Al2O3) og síðan var slípað andlitið fest við glerrennibraut með epoxýplastefni. Annar skurður var gerður til að gera 1-mm þykkt sýni samsíða glerrennunni. Sýnið var síðan slípað niður í 20–30 µm þykkt og klárað með pússingunni með demantslausn.
Skautað smásjá og Fourier umbreyting innrauð litrófsgreining.Sjónfræðilegir eiginleikar hvers kristals sem samanstendur af nýrnasteinunum var skoðaður með skautuðum smásjá með 20–30 µm þykkum steinbrotum. Yfirborðsvísitala hvers COD plans var ákvarðaður með því að bera athugunina saman við dæmigerða COD kristalform sem reiknað er með VESTA56. Byggt á ljóseiginleikum voru kristallar flokkaðir, síðan greindir með Fourier umbreytingu innrauðum litrófsmæli (FT/IR6100, JASCO). Mælingarbylgjutalasviðið var 7800–350 cm-1. Allar mælingar voru gerðar við umhverfishita. Stærð mælingarblettsins var stillt á 20×20 µm2. Kristalfasar voru auðkenndir út frá fánu IR litrófinu með RRUFF gagnagrunninum.
Marglita ónæmisflúrljómandi litun á próteinfylki.Steinsneiðar sem notaðir voru við greiningu steinefnafasa voru einnig notaðir til að greina próteindreifingu með Multi-IF litun. Þunnu hlutarnir voru meðhöndlaðir með sítratlausn (pH 6.0) í 1 mín fyrir lágmarks ætingu. Hluturinn var þveginn með fosfat-bufferðri saltlausn (PBS), síðan lokaður í 60 mínútur í 1 prósent nautgripasermi albúmíni í fosfat-bufferðri saltlausn með Tween 20 (PBST). Eftir lokunina var hlutann ræktaður með aðal mótefnum yfir nótt við umhverfishita. Aðalmótefnin sem notuð voru voru músa einstofna and-calgranulin A (1:100 þynning, Santa Cruz Biotechnology, sc-48352), kanína fjölstofna and-osteopontin (1:100 þynning, Santa Cruz Biotechnology, sc-20631 ), og sauðfé einstofna and-manna prótrombín brot 1 (1:500 þynning, Cedarlane Ontario, Kanada, CL20111AP). Hlutinn var síðan þveginn þrisvar sinnum með PBS í 10 mínútur fyrir ræktun með flúrljómandi samtengdum aukamótefnum í 1 klst, varið gegn ljósi. Flúrljómandi samtengd aukamótefni sem notuð voru voru and-kanínu IgG (H plús L) krossaðsogað samtengd við Alexa Fluor 488, and-mús IgG (H plús L) krossaðsogað tengt við Alexa Fluor 546 og and-sauðfjár IgG (H) plús L) Cross Adsorbed samtengd við Alexa Fluor 647. Eftir víðtækan þrisvar sinnum þvott með PBS í 10 mínútur greindist flúrljómun með því að nota confocal Auto-Fluorescence Microscopy (Nikon A1R). Örvunar- og útblástursbylgjulengdir sem safnað var innihéldu 487 nm örvun (losun safnað á milli 500 og 550 nm), 561 nm örvun (losun safnað á milli 570 og 620 nm) og 639 nm (losun safnað á milli 663 og RPN TFN) { 46}}, og Cal-A, í sömu röð. Sjálfvirk flúrljómun (AF) sást frá hluta sýnanna, en merkistyrkurinn var mun lægri en próteinmerkin sem fjallað var um í þessari rannsókn. Binding mótefna sem eru ekki sértæk fyrir markpróteinin var einnig metin. Fjarvera IF merkja frá ósérhæfða mótefninu var staðfest. Neikvæð samanburðarpróf voru gerðar til að meta fjarveru fölsk-jákvæðra merkja (viðbótarmynd S5). Fyrir mótefnalitun voru samsætuviðmið notuð til að greina hvers kyns ósértæka bindingu. Sérstaklega voru aðal mótefni sem notuð voru fyrir viðmiðunarhópa kanínu (DA1E) mAb IgG XP samsætustýring (1:100 þynning frumumerki), mAb IgG1 samsætustýring (1:100 þynning frumumerki) og mAb IgG samgerð úr sauðfé (1 :100 þynningu Novus) með því að nota sömu flúrljómandi merktu aukamótefni og að ofan. Línusniðin voru smíðuð með ImageJ, sem sýnir hæsta og lægsta birtuskil sem 100 prósent og 0 prósent, í sömu röð, fyrir hvert prótein.