Multi-component Prime-boost Chlamydia Trachomatis bólusetningarkerfi framkalla mótefna- og T-frumuviðbrögð og flýta fyrir úthreinsun sýkingar í prímatlíkani sem ekki er úr mönnum Ⅱ

efni og aðferðir

Bóluefni mótefnavaka og hjálparefni

Mismunandi bóluefnismótefnavakar og hjálparefni voru notuð í þessari rannsókn: CTH522 bóluefnismótefnavaka, byggt á MOMP (11) var gefið í vöðva (IM) með CAF01 ónæmisglæði (42) eða álhýdroxíði (AlOH) ónæmisglæði, eða í nefi ( IN) án hjálparefna. Plasmíð DNA bóluefni, pcDNA3.1-MOMP, var búið til með því að klóna samhljóða MOMP inn í plasmíðferjuna pcDNA3.1 (14) og gefið með innri húð (ID) leið með rafporun (EP) í bakinu. Raðbrigða manna adenoveiru sermisgerð 5 (rHuAd5) bóluefni sem tjáir MOMP (HuAd5-MOMP) var gert með því að sameina samhljóða MOMP (AAC45154.1) í E1 og E2 eytt HuAd5 plasmíð pAL1112 ferju og gefið í vöðva (14) . Breytt vaccinia Ankara-MOMP bóluefni gert afsameinar samstöðu MOMP(AAC45154.1) í p3186 plasmíðið og veiklaða MVA ferjuna (14) og gefið í gegnumleið í vöðva.

Smelltu hér til að fá Cistanche fyrir bólgueyðandi

C. trachomatis serovar D stofn

Chlamydia trachomatis serovar D (Ct SvD; UW{{0}}/Cx, ATCC® VR-885™) var fengin frá American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) og fjölgað í HeLa{ {2}} frumur, safnaðar og hreinsaðar eins og lýst er af Caldwell et al. (43). C. trachomatis SvD stofninn var geymdur við -80 gráðu í 0,2 M súkrósa, 20 mM natríumfosfati (pH 7,4) og 5 mM glútamínsýru (SPG) og styrkur innilokunarmyndandi eininga (IFU) var ákvarðaður í HeLa-229 frumur og McCoy frumur.

Ómannlegir prímatar

Þrjátíu cynomolgus macaques (Macaca fascicularis) sem vega 3 til 5 kg voru með í rannsókninni sem var meðhöndluð í líföryggisstigi 3 (ABSL3) NHP aðstöðu IDMIT ("Smitsjúkdómalíkön og nýsköpunarmeðferðir" við CEA "Commissariat à l'Energie Atomique," Fontenay-aux-Roses, Frakklandi; faggildingarnr. #D92- 032-02). Samskiptareglurnar voru samþykktar af siðanefnd stofnana "Comité d'Ethique en Expé rimentation Animale du Commissariat à l'Energie Atomique et aux Energies Alternatives" (CEtEA #44) undir yfirlýsingu númeri A14-026. Rannsóknin var samþykkt af "Rannsókna-, nýsköpunar- og menntamálaráðuneytinu" undir skráningarnúmerinu APAFIS#720-201505281237660. Öll dýr voru prófuð neikvæð fyrir SIV, SHIV, STLV (simian Tlymphotropic veira), herpes B veiru, filovirus, SRV-1, SRV-2 fyrir rannsóknina og staðfest að þau væru seróneikandi fyrir klamydíusýkingu. Allar tilraunaaðgerðir voru gerðar samkvæmt evrópskum leiðbeiningum um umönnun dýra ("Journal Officiel de l'Union Europé enne", tilskipun 2010/63/UE, 22. september 2010).

Bólusetningarreglur

Makkanum 30 var skipt af handahófi í 6 hópa með 5 dýrum í hverjum. Mismunandi bólusetningaráætlanir fyrir 6 hópana eru sýndar í smáatriðum á mynd 1. Á meðan á öllum bólusetningum stóð voru makakar róandi með ketamínklórhýdrati (10 mg/kg líkamsþyngdar í vöðva). CTH522 (85 µg á dýr) var gefið í vöðva (IM) með annað hvort CAF{{20}}1 ónæmisglæði (625 µg/125 µg) eða AlOH hjálparefni (0.425 mg ), eins og sýnt er á mynd 1. Im bólusetningar voru framkvæmdar í 0,6 ml rúmmáli í hægra læri (M. quadriceps) dýrsins. CTH522 bólusetningar í nef (IN) (30 µg á dýr) voru framkvæmdar með Vaxinator tæki sem var tengt við 1 ml sprautu með tveimur samfelldum gjöfum af 0,25 ml, einni í hvora nös. DNA-MOMP bóluefnið var gefið í húð (ID) með rafporun (EP) í húð á bakinu. 6 endurtekið rúmmál af 0,1 ml var sprautað ID (alls 1 mg) fylgt eftir með EP með Nepagen™ kerfinu (stillingar: 6 square-ware púlsar 10 ms með 90 ms millibili við 110V, (300- 700mA)) . hAd5-MOMP bóluefnið var gefið IM með skammti af 1011 veiruagnum í 1 ml á hvert dýr. MVA-MOMP bóluefnið var gefið IM með 4*108 PFU skammti á hvert dýr í 0,5 ml rúmmáli**. Naívi hópurinn fékk enga bólusetningu og var talinn vera viðmiðunarhópurinn.

Sýnasöfnun

Við allar sýnatökuaðgerðir voru makakarnir róaðir með ketamínklórhýdrati (10 mg/kg líkamsþyngdar IM). Blóði var safnað með æð í lærlegg í viku 0, 2, 4, 6, 8, 10, 16, 18, 20, 22, 24. Leghálsvökvi til mótefnagreiningar var safnað með Weck-Cel®spears (Medtronic Ophthalmics, Jacksonville, FL , Bandaríkjunum) í viku 4, 8, 16, 18, 20, 22 og 24. Sýnum frá leghálsi til greiningar á klamydíuálagi var safnað með venjulegum flatlock strokum (Mast Diagnostic - ref.: 552C/ 10). Eftir snertingu við slímhúð legganga og legháls, var strokið sett í hettuglas sem innihélt UTM-RT miðil (Mast Diagnostic – ref.: 330C/6) og haldið á ís.

Sýking í leggöngum með 5*107 IFUs af C. trachomatis SvD

Dýrin voru svæfð með ketamínklórhýdrati (10 mg/kg IM), sett í kviðlægð með upphækkaðar mjaðmir og 1 ml af sáðefninu var sett beint á slímhúð leggöngunnar við umskipti í leggöngum og leghálsi með því að nota 1 ml sprautu. Hvert dýr var gefinn skammtur af 5*107 IFU. Dýrinu var leyft að liggja í kviðlegg með mjaðmir upphækkaðar í stuttan tíma eftir sáningu.

Ensímtengd ónæmissogandi prófun

CTH522sérstök mótefnií sermi og þurrkusýni greindust með óbeinni ELISA. Maxisorp® plötur (NUNC A/S, Hróarskeldu, Danmörku) voru húðaðar með CTH522 (0,5 µg/ml) yfir nótt við 4 gráður. Samsæturnar IgG og IgA greindust með HRP samtengdum mótefnum sem voru sértæk gegn IgG prímata sem ekki er úr mönnum (43R-IG020HRP, Fitzgerald, Acton, MA, Bandaríkjunum, 1:75.{{10 }}) og IgA (43C-CB1631, Fitzgerald, Bandaríkjunum, 1:50.000). Viðbrögðin voru sýnd með TMB PLUS hvarfefni (KemEnTec, Taastrup, Danmörku) og stöðvuð með 0,5 M brennisteinssýru. Plöturnar voru lesnar á ELISA lesara við 450 nm með leiðréttingu við 650 nm. Jákvæð viðmiðun (sermi úr fyrri rannsókn) var notuð sem innri staðall til að leiðrétta fyrir breytileika á milli plötu. Tvær holur voru keyrðar án hvarfefnis sem neikvæður samanburður á hverri plötu. Mótefnatítrar voru reiknaðir út sem gagnkvæmt af hæstu þynningu með ljósþéttni (OD) gildi hærra en viðmiðunarmörkin. Viðmiðunarmörkin voru ákvörðuð frá degi 0 sýnis meðaltal plús 2*SD.

Peptíð fylki og greining

CTH522 peptíðfylkingin var hönnuð með þríritum af óhreyfðum 15mer peptíðum sem skarast af 14 amínósýrum sem voru prentuð á virkar glerskyggnur og ræktaðar með sermisýnum af JPT Peptide Technologies, Berlín. Í stuttu máli var fylkið ræktað með sermisýnum sem safnað var í viku 24 og IgG peptíðfléttur voru sýndar með því að nota bíótínýlerað geita and-apa IgG og Alexa Fluor® 647 Streptavidin. Skyggnur voru skannaðar með háupplausnarskanni við 635 nm og gögn voru tilkynnt sem handahófskenndar flúrljómunareiningar. Meðaltal þrefaldra gilda var ákvarðað, ef breytileikastuðullinn var stærri en 0.5, voru aðeins notuð 2 næstu gildi. 10 prósent af hámarksstyrksmerkinu (65.535) var notað sem stöðvun fyrir ajákvæð viðbrögð, og meðalmerki undir þessum viðmiðunarmörkum var úthlutað gildi sem samsvarar hálfu þröskuldsgildi (3277).

In vitro hlutleysunarpróf

In vitro hlutleysunarprófið var gert til að prófa getu bóluefnisframkallaðra sermismótefna til að hlutleysa klamydíusýkingu í HaK frumum in vitro. Greiningin fylgdi aðallega samskiptareglunum sem áður var lýst (44). Fyrst voru sermisýni úr einstökum dýrum ræktuð við 56 gráður í 30 mínútur til að óvirkja komplementið. Klamydíustofn (SvD, SvE og SvF) var blandað saman og ræktað með raðþynningum af óvirkjuðu sermi úr hverju bólusettu dýranna í 30 mínútur og síðan sáð á einlag af HaK frumum í 96-vel flatbotna plötum í afrit. Eftir 30 klukkustunda ræktun voru frumur og innilokanir festar og sýndar með fjölstofna kanínu-anti-Ct043 sermi og flúrljómunarmerktu aukamótefni (Alexa Flour 488, geit-anti-kanínu IgG, A11008, Life Technologies) í þynningu 1:500 . Talning á innfellingum var framkvæmd handvirkt í 20 sjónsviðum við 40x stækkun (Olympus IX71 öfug flúrljómunarsmásjá). Hlutleysing var reiknuð út sem prósentu minnkun á meðalfjölda blindflugslyfja samanborið við safn af sermi úr samanburðarhópsdýrum (óvana).

Innanfrumu PBMC frumulitun og samfrumumæling

PBMCs voru einangruð og ({{0}} x 106 ) voru endurblönduð í 150 µl af heilum miðli sem innihélt 0,2 µg af hverju samörvandi mótefni CD28 og CD49b. Örvun var framkvæmd í 96 holum/plötum með því að nota 2 µM af hverju peptíðsafni eða SEB (sem jákvæð viðmiðun) eða miðil eitt sér (sem neikvæð viðmiðun). Brefeldin A var bætt við hvern brunn í lokastyrknum 10 µg/ml og platan var ræktuð við 37 gráður C, 5 prósent CO2 yfir nótt. Frumurnar voru síðan þvegnar, litaðar með lífvænleika litarefni (fjólublátt, flúrljómandi hvarfefni, Invitrogen), festar og gegndræpnar með BD Cytofifix/Cytoperm hvarfefninu. Gegndræp frumusýni voru síðan geymd við -80 gráðu fyrir litunarferlið. Mótefnalitun var framkvæmd í einu skrefi eftir gegndræpi. Allt notaðmótefnieru taldar upp í töflu 1. Eftir 30 mínútna ræktun á ís í myrkri voru frumur þvegnar í BD Perm/Wash buffer. Frumur voru taldar með LSR II (BD) strax eftir litunarferlið og FlowJo hugbúnaður var notaður við gagnagreiningu.

TAFLA 1 Mótefni notuð til að lita ónæmisfrumumerkja og frumufrumuefna

Greining á klamydíu DNA í leggöngum með eigindlegri PCR

Abbott RealTime CT/NG prófið (ABBOTT, Rungis, Frakkland) er in vitro pólýmerasa keðjuverkun (PCR) próf til að beina, eigindlegri greiningu á plasmíði DNA fyrir CT (C.trachomatis) og NG (N. gonorrhoeae) erfðamengi. . Kjarnsýra var dregin úr UTM (universal transport media) sýnum á M2000SP og mögnun framkvæmd á M2000SP, samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Niðurstöður voru gefnar upp sem lotuþröskuldur (Ct).

tölfræðigreining

Öll tölfræði var gerð með GraphPad Prism hugbúnaði (útgáfa 8.1.2). Gögnin sem ekki voru eðlilega dreifðu voru greind með prófum sem ekki voru breytileg; Kruskal–Wallis próf og margföld samanburðarpróf Dunns til að ákvarða mikilvægi munarins á milli hópa. Ferlar sem sýndu prósentu PCR neikvæð dýr voru bornar saman við Log-rank (Mantel-Cox) tölfræðipróf. Samanburðurinn var talinn tölfræðilega marktækur ef P gildið var < 0.05 (P < 0.05). Frekari marktæknistig er gefið til kynna með stjörnum *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.

Yfirlýsing um framboð gagna

Frumleg framlög sem kynnt eru í rannsókninni eru innifalin í greininni/viðbótarefninu. Frekari fyrirspurnum má beina til samsvarandi höfundar.

Siðferðisyfirlýsing

Dýrarannsóknin var skoðuð og samþykkt af "Comité d'Ethique en Experimentation Animale du Commissariat à l'Energie Atomique et aux Energies Alternatives" (CEtEA #44) undir yfirlýsingu númeri A14-026. Rannsóknin var samþykkt af "Rannsókna-, nýsköpunar- og menntamálaráðuneytinu" undir skráningarnúmerinu APAFIS#720-201505281237660.

Framlög höfunda

Hugsaðar og hannaðar tilraunir: JD, FF, EL, PA, RG, RS. Gerðar tilraunir: VC, DD, BD, SL, CD, CJ, ND-B, CB, BB, AT. Framleidd bóluefni og mótefnavakabyggingar: IR, PM, AO. Greindu gögnin: JD, EL, FF, IR, HJ. Samdi og ritstýrði blaðinu: JD, EL, FF. Hver og einn meðhöfunda sem skráðir eru lagði mikið af mörkum til verksins með hönnun og hugmyndum og/eða öflun, greiningu og túlkun á gögnunum. Allir höfundar lögðu sitt af mörkum við greinina og samþykktu innsenda útgáfu.

Viðurkenningar

Við þökkum Fondation Dormeur, Vaduz fyrir framlagið til Veiruþróunar- og flutningseiningarinnar fyrir rannsóknarstofutæki sem tengjast þessu verkefni.

Hagsmunaárekstrar FF, IR, PA og AWO eru meðuppfinnendur um einkaleyfisumsókn á bóluefni gegn klamydíu [WO2014146663A1]. Öll réttindi hafa verið úthlutað til Statens Serum Institut, danskrar ríkisstofnunar sem er ekki rekin í hagnaðarskyni. Höfundar sem eftir eru lýsa því yfir að rannsóknin hafi verið unnin þar sem engin viðskiptaleg eða fjárhagsleg tengsl voru til staðar sem gætu talist hugsanlegur hagsmunaárekstrar.

Athugasemd útgefanda Allar kröfur sem settar eru fram í þessari grein eru eingöngu höfundar og eru ekki endilega fulltrúar tengdra samtaka þeirra, eða útgefanda, ritstjóra og gagnrýnenda. Sérhver vara sem kann að vera metin í þessari grein, eða fullyrðingar sem kunna að vera settar fram af framleiðanda hennar, er ekki tryggð eða samþykkt af útgefanda.

Heimildir

1. Newman L, Rowley J, Vander Hoorn S, Wijesooriya NS, Unemo M, Low N, et al. Alþjóðlegt mat á algengi og tíðni fjögurra læknanlegra kynsýkinga árið 2012 byggt á kerfisbundinni endurskoðun og alþjóðlegum skýrslum. PLoS One (2015) 10(12):e0143304. doi: 10.1371/journal.pone.0143304

2. Longbottom D, Coulter LJ. Dýraklamydíósa og áhrif á dýrasjúkdóma. J Comp Pathol (2003) 128(4):217–44. doi: 10.1053/jcpa.2002.0629

3. Haggerty CL, Gottlieb SL, Taylor BD, Low N, Xu F, Ness RB. Hætta á fylgikvilla eftir chlamydia trachomatis kynfærasýkingu hjá konum. J Infect Dis (2010) 201 Suppl 2:S134–55. Doi: 10.1086/652395

4. Dodet B. Núverandi hindranir, áskoranir og tækifæri fyrir þróun árangursríkra STI bóluefna: sjónarhorn bóluefnisframleiðenda, líftæknifyrirtækja og fjármögnunarstofnana. Bóluefni (2014) 32(14):1624–9. doi: 10.1016/ j.vaccine.2013.08.032

5. Brunham RC, Kuo CC, Cles L, Holmes KK. Fylgni ónæmissvörunar hýsils við magnbundinn endurheimt Chlamydia trachomatis úr leghálsi manna. Infect Immun (1983) 39(3):1491-4. doi: 10.1128/iai.39.3.1491- 1494.1983

6. Cotter TW, Meng Q, Shen ZL, Zhang YX, Su H, Caldwell HD. Verndarvirkni meiriháttar ytri himnuprótínsértækra immúnóglóbúlína a (IgA) og IgG einstofna mótefna í músamódeli af klamydia trachomatis kynfærasýkingu. Infect Immun (1995) 63(12):4704-14. doi: 10.1128/iai.63.12.4704-4714.1995

7. Johansson M, Schon K, Ward M, Lycke N. Rannsóknir á knockout músum sýna að vörn gegn klamydíu krefst TH1 frumna sem framleiða IFN-gamma: er þetta satt fyrir menn? Scand J Immunol (1997) 46(6):546-52. doi: 10.1046/j.1365- 3083.1997.d01-167.x

8. Gondek DC, Olive AJ, Stary G, Starnbach MN. CD4 plús T frumur eru nauðsynlegar og nægar til að veita vörn gegn klamydia trachomatis sýkingu í efri kynfærum músa. J Immunol (2012) 189(5):2441–9. doi: 10.4049/ jimmunol.1103032

9. Armitage CW, O'Meara CP, Harvie MC, Timms P, Wijburg OL, Beagley KW. Mat á seytingu IgA innan og utan þekju í klamydíusýkingum. Ónæmisfræði (2014) 143(4):520–30. doi: 10.1111/imm.12317

10. Armitage CW, O'Meara CP, Harvie MC, Timms P, Blumberg RS, Beagley KW. Mismunandi niðurstöður eftir transfrumumyndun IgG sem miðar að innanfrumu og utanfrumu klamydíumótefnavaka. Immunol Cell Biol (2014) 92(5):417–26. doi: 10.1038/icb.2013.110

11. Olsen AW, Follmann F, Erneholm K, Rosenkrands I, Andersen P. Vörn gegn Chlamydia trachomatis sýkingu og sjúklegum breytingum á efri kynfærum með bóluefnisstuðlum hlutleysandi mótefnum sem beint er að VD4 aðal ytri himnupróteinsins. J Infect Dis (2015) 212(6):978–89. doi: 10.1093/infdis/jiv137

12. Nguyen N, Guleed S, Olsen AW, Follmann F, Christensen JP, Dietrich J. Th1/Th17 T frumu vefja-búsett ónæmi eykur vernd en er ekki krafist í bólusetningaráætlun gegn kynfærasýkingu með klamydia trachomatis. Front Immunol (2021) 12:790463. doi: 10.3389/fifimmu.2021.790463

Biðja um meira:

Netfang:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Sími: plús 86 15292862950

Bæta cistanche viðbót við körfu:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop