Örvun átfrumna með lágmólþunga sykrum frá Cistanche Deserticola

Tengiliður: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Netfang:audrey.hu@wecistanche.com

［Abstsvindla］

Til að kanna ónæmisvirkjunaráhrif og gangverk sykrna með lágan mólþunga fráCistanche deserticola(LMSC) á kviðfrumum músa, RAW264. 7 frumur. RAW264. 7 frumum var skipt í venjulega samanburðarhóp, LPS jákvæðan samanburðarhóp og LMSC meðferðarhópa. RAW264. 7 frumur voru meðhöndlaðar með ýmsum styrkjum af LMSC frá 3,91 til 62. 5 g·L - 1. Hlutlausa rauða prófið var notað til að greina átfrumuvirkni átfrumna. NO losun greindist með því að nota NO sett og átfrumuvirkjun tengd prótein tjáningarstig (TNF- , IL-6, IKK , p-IKK , IκB , p-IκB , NF-κB og p-NF-κB) greindust með Western blot. Niðurstöður sýndu að LMSC hafði virkjunaráhrif á átfrumur; það getur verulega aukið losun NO í RAW264. 7 frumur og stuðla að tjáningu cýtókína TNF- og IL-6. Þar að auki jók LMSC verulega fosfórun á IKK, IκB og NF-κB p65. Ennfremur jók mannitól eitt af aðal innihaldsefnum LMSC verulega átfrumuvirkni átfrumna. Þessar niðurstöður sýndu að LMSC gæti virkjað átfrumur með því að uppstilla NF-κB boðferilinn og mannitól gæti verið einn af helstu virku innihaldsefnum LMSC.

［Lykilorð］ Sykur með lágmólþunga; Cistanche deserticola; ónæmisvirkjun; átfrumur; bólguþáttur; NF-kB

Cistanche deserticola YC Maer planta sem tilheyrir ættkvíslinniCistanche deserticolaYC Ma. Hægt er að nota holdugan stilkinn sem lyf. Það hefur það hlutverk að næra nýra yang, næra kjarna og blóð og raka þarma. Það er þekkt sem "eyðimerkur ginseng". Efnafræðilegir þættir Cistanche innihalda fenýletanóíð glýkósíð, iridoid glýkósíð, sykur, lignans og margar aðrar gerðir. Nútíma lyfjafræðilegar rannsóknir hafa komist að því að Cistanche hefur marga líffræðilega virkni eins og taugavörn, æxlisvörn, ónæmisstjórnun, bólgueyðandi og andoxunarefni [1]. Rannsóknir hafa sýnt að decoction af Cistanche og fjölsykrum getur verulega bætt átfrumugetu og seytingarvirkni átfrumna [2-3]. Hins vegar er engin skýrsla um virknirannsóknir á kolvetnum með lág sameindaþyngd. Þess vegna notaði þessi rannsókn in vitro ræktunarkerfið RAW264. 7 kviðfrumur músa átfrumna til að kanna ónæmisbælandi virkni og skylda aðferðir Cistanche lágmólþunga kolvetna. Þessi rannsókn getur veitt fleiri tilraunavísbendingar fyrir alhliða skilning áÓnæmisbælandi áhrif Cistancheí framtíðinni, til að leiðbeina frekar klínískri notkun þess.

Cistanche deserticola hefur mörg áhrif, smelltu hér til að vita meira

1. Efni

RAW264. 7 frumur voru keyptar frá frumumiðstöð Kínversku læknavísindaakademíunnar; fósturnautasermi (FBS) var keypt frá PAN Biotech, Þýskalandi; sýklalyf og DMEM miðill voru keyptir frá Zhongke Machen Technology Co., Ltd. Lipopolysaccharide frá Escherichia coli O55:B5 (LPS) var keypt frá Sigma Company, Bandaríkjunum. Nituroxíð (NO) sett var keypt frá Nanjing Jiancheng Institute of Bioengineering. ECL efnaljómunarsett var keypt frá Thermo Fisher, Bandaríkjunum; mótefni var keypt frá Cell Signaling Technology, Bandaríkjunum; Cistanche cistanche heildarglýkósíð, cistanche lágmólþunga sykur og cistanche fjölsykrur voru sjálfgerðar af rannsóknarhópnum okkar. Massahlutfall cistanche heildarglýkósíða var 78,76 prósent. Massahlutfall sykra með lágmólþunga afCistanche deserticolaer 58. 00 prósent og massahlutfall afCistanche deserticolafjölsykrur eru 65,24 prósent. Tanon-5200Multi gel myndgreiningarkerfi var keypt frá Shanghai Tianneng Technology Co., Ltd.; Sunrise-Basic örplötulesari var keyptur frá TECAN fyrirtækinu.

2. Aðferð

2. 1 Hlutlaus rauð aðferð til að mæla átfrumuvirkni átfrumna

Taktu kviðfrumur músa í logaritmískum vaxtarfasa, eftir trypsínvæðingu, teldu frumurnar, stilltu fjölda frumna í 5 × 104 frumur/mL og sáðu þær í 96-brunn frumuræktarplötu, 100 μL/brunn. , við 37 gráður Ræktað við 5 prósent CO2 aðstæður, eftir að frumurnar festast við vegginn, fargaðu ræktunarfljótandi vökvanum, bætið við DMEM miðli (10 prósent FBS auk 1 prósent P /S), LPS (1 mg·L - 1) og Cistanche cistanche hver um sig Heildar glýkósíð,Cistancheheildarfjölsykrur og Cistanche cistanche sykur með lágmólþunga (3,91 ~ 62,5 g·L -1, hver um sig, síuð með síuhimnu fyrir gjöf) voru ræktaðar. Eftir ræktun í 48 klukkustundir, bætið 100 μL af 0,075 prósent hlutlausri rauðri lífeðlisfræðilegri saltvatnslausn í hvern brunn, haltu áfram að rækta í 4 klukkustundir, sogðu ofan af vökvanum, þvoðu 3 sinnum með PBS, bættu við frumulýsi (ísediksýra) -etanól 1:1) 100 μL, settu það við 4 gráður í 2 klst og mældu gleypni (A540 nm) eftir að frumurnar hafa verið leystar.

2. 2 Greining á magni NO losunar í frumufrumvökva

Sprautaðu RAW264. 7 frumur í 48-brunnsplötu (1 × 105 frumur/ml, 500 μL/brunn), sogið út frumuræktunarefnið eftir ræktun yfir nótt, bætið við DMEM miðli (10 prósent FBS plús 1 prósent P /S), 500 μL hvor af LPS (1 mg·L -1) og Cistanche cistanche heildarglýkósíð, heildarfjölsykrur og sykur með lágmólþunga (3,91 ~ 62,5 g·L -1, í sömu röð). Eftir 24 klukkustunda örvunarræktun var flotinu safnað. Ákvarðu styrk NO í frumufljótandi vökva hvers hóps með NO settinu, fylgdu leiðbeiningunum og greindu að lokum gleypni (A570 nm) með örplötulesara

2. 3. Vesturblettur

Sprautaðu RAW264. 7 frumur í 6-brunnsplötu, sogðu út frumuræktunarmiðlinum eftir ræktun yfir nótt, bættu við DMEM miðli (10 prósent FBS plús 1 prósent P /S), LPS (1 mg·L － 1), ogCistancheheildarfjölsykrur og sykur með lágmólþunga (3,91 ~ 62,5 g·L -1) voru hvor um sig 2 ml, og flotinu var hent eftir 24 klukkustunda örvunarræktun. Frumurnar voru þvegnar tvisvar með PBS og þeim hent. Eftir trypsínvæðingu eru frumurnar pípettaðar niður. Miðflótta, fjarlægja ofanvatnið, bæta við 100 μL NP40 Lysis Buffer og lýsa á ís í 40 mín. Eftir skilvindu var flotið tekið og próteinstyrkurinn ákvarðaður með BCA aðferðinni og próteinstyrkur hvers históns var stilltur jafnt. Taktu sama magn af próteinsýnum og aðskilið þau á 12 prósent SDS-PAGE undir stöðugum þrýstingi. Notaðu síðan Bio-Rad flutningsrafdrættistankinn til að flytja himnuna með stöðugum straumi 350 mA í 1 klukkustund og flytja próteinið yfir á PVDF himnuna (formeðferð á PVDF himnunni: bleytið í metanóli og komið í jafnvægi við flutningsbuffið). Eftir blokkun með 5 prósenta undanrennu (stillt með TBST sem inniheldur 0,1 prósent Tween-20) í 1 klst við stofuhita, var himnan þvegin þrisvar sinnum með TBST og himnan var ræktuð í frummótefnaþynningarefni próteins við 4 gráðu yfir nótt. Himnan var þvegin þrisvar sinnum með TBST annan hvern dag og samsvarandi þynningarefni var bætt við til að rækta í 1 klst. Himnan var þvegin þrisvar sinnum með TBST og ræmurnar voru þróaðar með ECL efnaljómandi framkallaefni.

2. 4 gagnagreining

Gögnin eru gefin upp sem x ± s og þýðing mismunarins er prófuð með því að nota GraphPad Prism 6 tölfræðihugbúnað fyrir einhliða dreifnigreiningu. Taktu P<0.01 as="" a="" very="" significant="" difference,="" and=""><0.05 as="" a="" significant="">

3. Úrslit

3. 1. Áhrif Cistanche cistanche sykra með lágmólþunga, heildarglýkósíða og heildarfjölsykrum á átfrumuvirkni RAW264. 7 frumur

Rannsóknir á efnaþáttum Cistanche sýna þaðCistancheinniheldur aðallegafenýletanóíð glýkósíð, iridoid glýkósíð og kolvetni. Í þessari tilraun er heildarglýkósíð af cistanche (þar með talið fenetýlalkóhólglýkósíð og iridoid glýkósíð), lágsameindasykur og sykrur valdir. Þrír virku staðir heildarfjölsykra voru rannsakaðir með tilliti til áhrifa þeirra á virkjun RAW264. 7 frumur. Bæði Cistanche cistanche fjölsykra og cistanche lágmólþunga sykur geta verulega aukið átfrumuvirkni RAW264. 7 frumur, en átfrumuvirkni heildarglýkósíðgjafahópsins breytist ekki marktækt. Að auki bætti jákvæða samanburðarlyfið LPS einnig verulega átfrumuvirkni RAW264. 7 frumur, eins og sýnt er á mynd 1. Niðurstöðurnar hér að ofan benda til þess að sykur og fjölsykrur með lágmólþunga í Cistanche geti haft þau áhrif að virkja RAW264. 7 frumur.

3. 2. Áhrif Cistanche heildarglýkósíða, lág sameindasykur og heildarfjölsykrur á innihald nituroxíðs (NO) í frumu ofanvatni

Til að kanna frekar virkjunaráhrif þriggja virku staða Cistanche á RAW264. 7 frumur, var innihald NO í frumufrumvökvanum örvuðum af mismunandi lyfjum ákvarðað. Niðurstöðurnar sýndu að losun NO í LPS hópnum var marktækt meiri en í blanka samanburðarhópnum (P<0.01); the="" release="" of="" no="" in="" the="" 5="" doses="" of="" low="" molecular="" sugar="" and="" polysaccharides="" in="" the="" cistanche="" cistanche="" group="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" control="" group="" (p=""><0.01) ),="" and="" was="" dose-dependent;="" the="" total="" glycosides="" of="">Cistanchehafði engin marktæk áhrif. Ofangreindar niðurstöður benda til þess að bæði fjölsykrurnar og sykur með lágmólþunga í Cistanche geti stuðlað að losun NO frá RAW264. 7 frumur. Meðal þeirra eru áhrif lágmólþunga sykurs af Cistanche sérstaklega mikilvæg, eins og sýnt er á mynd 2.

3. 3. Áhrif Cistanche cistanche lágmólþunga sykurs á tjáningu TNF- og IL-6 próteins í RAW264. 7 frumur

TNF- er mikilvægur bólgumiðill sem kemur fram í virkjunarferli RAW264. 7 frumur, sem geta stuðlað að myndun og losun annarra frumuefna (eins og IL-6). Niðurstöðurnar sýndu að tjáning TNF- og IL-6 jókst marktækt eftir að lágmólþungi sykur Cistanche cistanche var örvaður, sem bendir til þess að lágmólþungi sykur Cistanche gæti stuðlað að tjáningu TNF - og IL-6 í RAW264. 7 frumur og virkja þar með frumuónæmi Átfrumubólgu, sjá mynd 3.

3. 4. Stjórnunaráhrif Cistanche cistanche lágmólþunga sykurs á IKK/IκB/NF-κB boðleið

Til þess að kanna hugsanlegan gang Cistanche cistanche sykra með lágmólþunga við að virkja RAW264. 7 frumur rannsökuðu höfundarnir stjórnunaráhrif þess á IKK /IκB /NF-κB klassíska boðleiðina. Cistanche cistanche sykur með lágmólþunga getur verulega aukið fosfórun NF-KB og fosfórun á andstreymis lykilmerkapróteinum IKK og IκB og dregið úr tjáningu heildar IκB próteins, sem gefur til kynna að það hafi virkjandi áhrif á IKK / IκB /NF-κB merkjaleið. Jákvæða samanburðarlyfið LPS hefur einnig svipuð stjórnunaráhrif. Í stuttu máli geta lágmólþunga sykrurnar í Cistanche virkjað IKK /IκB /NF-κB boðferilinn og þar með valdið nýmyndun og losun cýtókína eins og TNF- og IL-6 og að lokum valdið ónæmiskerfi. virkjun RAW264. 7 frumur, sjá mynd 4.

3. 5. Skimun á virkum innihaldsefnum með átfrumuvirkjandi áhrifum í Cistanche sykri með lágmólþunga

Rannsóknarstofa okkar hefur greint lágsameindasykur sem er að finna íCistancheá frumstigi og komst að því að það inniheldur aðallega mannitól (16,53 prósent), súkrósa (8,34 prósent), frúktósa (25,38 prósent) og glúkósa (7, 75 prósent) og önnur innihaldsefni. Þannig að höfundurinn notaði hlutlausa rauða aðferðina til að skima virkjunaráhrif ofangreindra íhluta á átfrumur. Mannitól getur aukið átfrumuvirkni átfrumna verulega á skammtaháðan hátt á meðan áhrif annarra innihaldsefna eru ekki marktæk. Þetta bendir til þess að mannitól geti verið einn af virku lykilþáttunum í lágmólþunga sykrum Cistanche cistanche til að virkja átfrumur, eins og sýnt er á mynd 5.

4. Umræður

Tilkynnt hefur verið um að Cistanche cistanche, sníkjudýr af Lydanaceae fjölskyldunni, hafi ónæmisbælandi áhrif, þannig að hún ætti að innihalda ónæmisbælandi efni. Í þessari tilraun skimaði höfundur átfrumuvirkni kviðfrumna átfrumna músa á mismunandi hreinsuðum hlutumCistancheog komst að því að sykur og fjölsykrur með lágmólþunga í Cistanche hafa áhrif á virkjun átfrumna, en heildarglýkósíð í Cistanche eru ekki augljós. Á sama tíma komst höfundur að því að sykur með lágmólþunga getur virkjað átfrumur í lægri styrk, svo höfundarnir völduCistanchesykur með lágmólþunga sem þungamiðja síðari rannsókna.

Með því að skoða áhrif lágmólþunga cistanche sykurs á tjáningu cýtókína TNF- og IL-6 komust höfundar að því að lágmólþunga cistanche sykur jók marktækt tjáningu TNF- og IL-6, sem sannaði enn frekar að lágmólþunga cistanche sykur hefur áhrif á mýs. Átfrumur í kviðarholi hafa virkjandi áhrif. Þannig að höfundurinn kannaði frekar hugsanlegan verkunarmáta þess. Hafa rannsóknir

Sýnt hefur verið fram á að bakteríulípópólýsykra (LPS) getur framkallað virkjun músa átfrumna og músa glial frumur í gegnum merkjaleiðir eins og JAK2/STAT3, NF-KB, p38/ERK og MAPK [4-8]. NF-KB leiðin er viðurkennd sem klassísk leið, þannig að merkjapróteinin á þessari leið voru prófuð í þessari tilraun. Niðurstöðurnar sýndu að sykur með lágmólþunga í Cistanche geta verulega aukið fosfórun á NF-kB og fosfórun á helstu andstreymismerkjapróteinum IKK og IκB , sem bendir til þess að sykur með lágmólþunga afCistanchegetur virkjað kviðhimnu risa músa í gegnum IKK /IκB /NF-κB merkjaleiðina. Fagufrumur gefa út bólgusýtókín og gegna síðan hlutverki við að virkja frumuónæmi.

Á fyrstu stigum rannsóknarstofu, efnasamsetning sykurþykkni með lágmólþunga afCistanche deserticolavar kerfisbundið greint. Í ljós kemur að sykur með lág sameindaþyngd innihalda aðallega einliða eins og mannitól, súkrósa, frúktósa og glúkósa. Frekari rannsóknir komust að því að mannitól getur verulega bætt átfrumuvirkni átfrumna. Þess vegna er getgátur um að mannitól geti verið lykilþáttur í sykri með lágmólþunga sem virkjar frumuónæmisstarfsemi.

Í stuttu máli, þessi rannsókn notaði átfrumuna í Vitro ræktunarkerfinu og komst að því að sykur með lágmólþungaCistanchehafa umtalsverð virkjunaráhrif á átfrumur og geta virkjað kviðfrumur músa í gegnum NF-KB boðleiðina og þá gegnt hlutverki. Mannitól í sykri með lágmólþunga getur gegnt mikilvægu hlutverki við að virkja átfrumuvirkni átfrumna.

Heimildir

[1] Tu Pengfei, Guo Yuhai. Ræktunartækni eyðimerkur Cistanche og gestgjafa hennar Tamarix [M]. Peking: Science Press, 2015:31.

[2] Gao Xiaoxia, Chen Jun, Peng Yanli. Rannsóknaryfirlit um lyfjafræðileg áhrifCistanche deserticolafjölsykra [J]. Matur og fíkniefni, 2015, 17(2):136.

[3] Wang Xiangyan, Qi Yun, Cai Ruslan, o.fl. Macrophage virkjun Cistanche Polysaccharide [J]. Chinese Pharmacological Bulletin, 2009, 25(6):787.

[4] Liu Zhongyuan, Li Yanping. Líffræðileg virkni og virkni bakteríulípópólýsykru [J]. Medical Science Review, 2010, 16(2):166.

[5] Fu Zhihui, Xu Ling, Huang Jiao, o.fl. LPS í gegnum p38 /MAPK ferilinn og NF-κB virkjun framkallar tjáningu HIF-1 í RAW264. 7 frumur [J]. Chongqing Medical University Journal, 2016, 41(10): 1033.

[6] Hao Yutong, Chen Chunhai, Yang Xuesen, o.fl. JAK2/STAT3 merkjaleiðin tekur þátt í lípo fjöl Sykurörvun örvunar á microglia［J］. Journal of the Third Military Medical University, 2009, 31(12):1119.

[7] Song Xiaomin, Liao Lixi, Dong Xin, o.fl. Mulbascum glýkósíð hamla bólgu af völdum lípópólýsykra í BV-2 míkróglium og virkni þess [J]. Chinese Journal of Traditional Chinese Medicine, 2016, 41(13): 2506.