Langtíma ónæmissnið sýnir ríkjandi epitopur sem miðla langtíma húmorsónæmi hjá COVID--19-bata einstaklingum
Sep 12, 2023
Bakgrunnur: Alvarlegt bráða öndunarfæraheilkenni coronavirus 2 (SARS-CoV-2) er mjög sjúkdómsvaldandi og smitandi kórónavírus sem olli heimsfaraldri með 5,2 milljón dauðsföllum til þessa. Spurningar varðandi sermisfræðilega eiginleika langtímaónæmis, sérstaklega ríkjandi epitopes sem miðla varanleg mótefnasvörun eftir SARS-CoV-2 sýkingu, á eftir að skýra.
Hlutlæg: Við stefndum að því að kryfja hreyfihvörf og langlífi ónæmissvörunar hjá sjúklingum með kransæðaveirusjúkdóm 2019 (COVID-19), sem og myndefnin sem bera ábyrgð á viðvarandi langtíma ónæmi gegn SARS-CoV-2.
Aðferðir: Við metum SARS-CoV-2 ónæmisvirkni allt að 180 til 220 dögum eftir sjúkdómsbyrjun hjá 31 einstaklingi sem upplifði aðallega miðlungsmikil einkenni COVID-19, og gerðum síðan prótein-vítt snið á ríkjandi epitopum sem bera ábyrgð á viðvarandi humoral ónæmissvörun.
Niðurstöður: Lengdargreining leiddi í ljós viðvarandi SARS-CoV-2 topppróteinsértæk mótefni og hlutleysandi mótefni hjá COVID-19 sjúklingum, ásamt virkjun cýtókínframleiðslu á fyrstu stigum eftir SARS-CoV-2 sýkingu. Sýnt var fram á að mjög hvarfgjarnar epitopur sem voru færar um að miðla langtíma mótefnasvörun voru staðsettar á toppnum og ORF1ab próteinum. Lykilmyndir SARS-CoV-2 gaddapróteins voru kortlagðar á N-enda lén S1 undireiningarinnar og S2 undireiningarinnar, með mismikilli raðsamlíkingu meðal landlægra kransæðaveiru manna og mikillar raðauðkenni milli snemma SARS- CoV-2 (Wuhan-Hu- 1) og núverandi afbrigði í dreifingu.
Kostir cistanche viðbót - hvernig á að styrkja ónæmiskerfið
Niðurstaða: SARS-CoV-2 sýking framkallar viðvarandi húmorsónæmi hjá einstaklingum á batastigi COVID-19 með því að miða á ríkjandi epitopur sem staðsettar eru við toppinn og ORF1ab prótein sem miðla langtíma ónæmissvörun. Niðurstöður okkar veita leið til að aðstoða við skynsamlega bóluefnahönnun og greiningu. (J Allergy Clin Immunol 2022;149:1225-41.)
Leitarorð:
SARS-CoV-2, COVID-19, langtíma ónæmissvörun, húmorsónæmi, próteinbreiður peptíð örfylki, ríkjandi epitope
Alvarlegt brátt öndunarfæraheilkenni kransæðaveiru 2 (SARS-CoV- 2), orsakavaldur heimsfaraldurs kransæðaveirusjúkdómsins 2019 (COVID-19), sem er í gangi, tilheyrir Betacoronavirus ættkvíslinni, sem felur í sér 2 aðrar þekktar mjög sjúkdómsvaldandi menn kransæðaveiru: alvarlegt bráða öndunarfæraheilkenni (SARS) og öndunarfæraheilkenni í Mið-Austurlöndum (MERS) kransæðaveirum.1 Frá því fyrsta skráða tilvikið hófst seint í desember 2019 hefur SARS-CoV-2 sýking valdið meira en 263 milljónum staðfest tilfelli og 5,2 milljónir dauðsfalla um allan heim frá og með nóvember 2021, sem hafa áhrif á 220 lönd og svæði í 5 heimsálfum.2 Eftir sýkingu eru klínískar útfærslur á sviðum víða, þar á meðal einkennalausar sýkingar, væg eða í meðallagi alvarleg einkenni, eða jafnvel lífshættuleg alvarleg lungnabólga.3 Þrátt fyrir Mörg lönd eru enn í erfiðleikum með að innihalda nýjar bylgjur sýkinga, þar sem vírusafbrigði eru að koma fram sem virðast sýna aukið smithæfni og ónæmi gegn veirueyðandi ónæmissvörun. Áhrifaríkt húmorískt ónæmissvörun miðlað af hlutleysandi mótefnum ætti að búa yfir öflugu og ómissandi aðlögunarónæmi til að hindra sýkingu og útrýma veirusýkingum. Eftir SARS-CoV-2 sýkingu sást hátt hlutfall (yfir 90%) af öflugri sermisbreytingu meðal sýktra einstaklinga 7 til 14 dögum eftir upphaf sjúkdómsins.4-6 Framleiðsla mótefnavaka sértæks IgA, IgG, og IgM sem þekkti toppprótein (S) og núkleókapsíðprótein (N) í SARS-CoV-2 var greinanlegt á bráðastigi sjúkdómsins og snemma batastigs.4,5,7 Umfang hlutleysandi mótefna virtist vera tengst aldri, sýkingum með einkennum og alvarleika sjúkdómsins. Aldraðir sjúklingar og einstaklingar sem sýna alvarleg COVID-19 einkenni hafa tilhneigingu til að mynda hærra magn hlutleysandi mótefna.4,8-10 Nokkrar rannsóknir sem varða langlífi mótefnasvörunar hafa leitt í ljós að þrátt fyrir að sermi/plasma hvarfgirni við veiru tapi mótefnavaka og lækkandi hlutleysandi mótefnatítur með tímanum í sumum einkennabundnum COVID-19 tilfellum sást viðvarandi heildar langtíma húmorónæmi í allt að 8 til 12 mánuði eftir sýkingu í COVID-19 einstaklingum sem höfðu náð bata .10-13 Ennfremur hélst fjöldi SARS-CoV-2 mótefnavaka-sértækra minni B-frumna stöðugur í að minnsta kosti 6 til 12 mánuði,12,13 ásamt áframhaldandi vali og uppsöfnun B-frumuklóna sem tjá hlutleysandi mótefni,12,14 sem gefur til kynna að viðhalda viðvarandi húmorsónæmi eftir SARSCoV-2 sýkingu.
cistanche viðbót kostir-auka friðhelgi
Hlutleysandi mótefni gegna grundvallarhlutverki í vörnum hýsils gegn veirusýkingu. Greint hefur verið frá hópi mjög öflugra einstofna mótefna gegn SARS-CoV-2, 15-17 sem fyrst og fremst miða á epitopur sem staðsettar eru á viðtakabindingarsvæði S próteins sem safnast saman í trimera á yfirborði veirunnar og auðveldar innkomu veirunnar og samruna á tengingu við angíótensínbreytandi ensím 2 viðtakann.18 Önnur svæði S próteins, þar á meðal N-endasvæði (NTD) S1 undireiningarinnar og S2 undireiningarinnar, innihalda einnig ónæmisvaldandi epitopur sem geta framkallað hlutleysandi mótefni.16 ,19,20 Fyrir utan hlutleysingu geta mótefni gegn SARS-CoV-2 veitt vernd in vivo í gegnum Fc-miðlaða áhrifavirkni, svo sem mótefnaháða átfrumnaafgangur af völdum náttúrulegra drápsfrumna og mótefnaháð frumueiturhrif af mónófrumum eða átfrumum. 21,22 Auk þess að berjast gegn veirusýkingum geta mótefni sem myndast við náttúrulega sýkingu eða bólusetningu auðveldað veirusýkingu, annað hvort með aukinni bólguvirkjun eða aukinni veirusýkingu með myndun mótefnavaka/mótefna ónæmisfléttu eða með Fc-háðum aðgerðum,23-25 þó að aukin veirusýking hafi ekki sést í samhengi við SARS-CoV-2 in vivo. Þessi ólíku hlutverk mótefnasvörunar krefjast kerfisbundinnar einkennisgreiningar á SARSCoV-2 myndefni, sem og eiginleika langvarandi mótefna sem miða að hlutleysandi eða óhlutleysandi epitópum. Þrátt fyrir nýlegar framfarir varðandi hreyfihvörf og tímalengd mótefnasvörunar eftir SARS-CoV-2 sýkingu, er lengdargreining á áberandi epitopum sem viðhalda langtíma húmorónæmissvörun enn takmörkuð. Fyrri rannsóknir hafa lýst myndlíkingum mótefnasvörunar hjá COVID-19-sýktum einstaklingum, aðallega með því að nota ELISA-undirstaða greiningar, 26,27 aðferða- eða bakteríubirtingar,28-31 og tækni sem byggir á örfylki.30,{{ 38}} Nokkrar ónæmisráðandi einkenni SARS-CoV-2 S próteins hafa verið greind; þau svæði sem oftast greindust voru kortlögð nálægt eða spanna samrunapeptíð (FP) S2 undireiningarinnar, önnur heptad endurtekin innan S2 undireiningarinnar og á C-enda léni S1 undireiningarinnar.26,28-30, 32,33 Þar að auki leiddi sermisskimun í ljós efri hlutar sem staðsettar eru við önnur prótein þvert yfir SARS-CoV-2 próteinið, þar á meðal N prótein, himnu (M) prótein og ORF1ab, ORF3a og ORF7a.28-30, 34,35 Þrátt fyrir að fyrri rannsóknir hafi veitt mikilvæga innsýn í mótefnavakaeitrun, hafa þessar rannsóknir að mestu einbeitt sér að frumeðlissniði COVID-19 sjúklinga í upphafi batastigs. Það á eftir að skýra nákvæmar epitopur sem miðla varanlegum SARS-CoV-2-sértæk mótefnasvörun sem og gangverki epitope-þekkingar. Hér, til að öðlast dýpri skilning á hreyfihvörfum og endingu húmors ónæmissvörunar hjá COVID-19 sjúklingum, sérstaklega epitopum sem bera ábyrgð á viðvarandi langtíma ónæmi gegn SARS-CoV-2, gerðum við yfirgripsmikla lengdargreiningu ónæmisprófunar hjá 31 COVID-19 sjúklingi allt að 180 til 220 dögum eftir upphaf einkenna. Byggt á mati á mótefnavakabindandi og hlutleysandi mótefnum sem og þéttni cýtókína í sermi, auðkenndum við enn frekar hóp epitópa sem staðsettir eru á ORF1ab, S og N próteinum SARSCoV-2 sem miðlar viðvarandi húmors ónæmissvörun með því að nota peptíð örfylki sem nær yfir allt prótein SARS-CoV-2. Niðurstöður okkar varpa ljósi á eiginleika langtímaónæmis til að sigrast á veirusýkingu og munu hjálpa til við að upplýsa skynsamlega bóluefnahönnun og þróun endurbættra sermisfræðilegra greiningartækja.
AÐFERÐIR
Þátttakendur í rannsóknum og sýnasöfnun
Til að meta lengdarhvörf SARS-CoV-2-stýrð ónæmissvörun, var 101 sermissýnum safnað úr 31 SARS-CoV-2-sýktum einstaklingum sem voru lagðir inn á Nantong þriðja sjúkrahúsið sem tengist Nantong háskólanum (Nantong) , Kína) á tímabilinu janúar til mars 2020. Allir sjúklingar greindust með staðfesta SARS-CoV-2 sýkingu með megindlegri PCR prófun á öfugri umritun; Alvarleiki sjúkdómsins var skilgreindur sem vægur til miðlungsmikill (ekki alvarlegur) eða alvarlegur COVID-19 samkvæmt útgáfu 7 af greiningar- og meðferðarbókuninni fyrir nýja lungnabólgu vegna kórónavírus sem gefin var út af heilbrigðisnefnd Alþýðulýðveldisins Kína.36 Fylgst var með sjúklingum. upp á lengd í 4 til 8 mánuði eftir bata eftir bráða sýkingu. Blóðsýnum var safnað á lengdarhátt frá 4 til 219 dögum eftir að einkenni komu fram hjá 20 sjúklingum meðal 31 þátttakanda í rannsókninni (miðgildi 4,5 sýni á einstakling, á bilinu 2 til 8), en sýnistaka var tekin í eitt skipti fyrir hvern aðrir 11 einstaklingar sem voru seint á batastigi (dagar 122 til 214 eftir upphaf sjúkdóms). Samkvæmt því voru sermi (n 5 20) frá heilbrigðum gjöfum sem passa við aldur og kyn einnig teknir með sem viðmiðunarhópur. Enginn þátttakandi í rannsókninni var með skjalfesta fyrri sýkingu af SARS eða MERS.
Rannsóknin var samþykkt af siðanefnd Nantong Third Hospital sem tengist Nantong University (samþykki EL2020006). Skriflegt upplýst samþykki var fengið frá hverjum og einum þátttakenda í rannsókninni. Sermi var aðskilið frá útlægu blóði í hlauprörum í sermi með skilvindu, myndað í skammta og geymt við 2808C fyrir notkun.
Frumulínur
HEK293T og Huh7 frumur voru ræktaðar í Dulbecco-breyttum Eagle miðli (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Waltham, Mass) bætt við 10% hitaóvirkjuð nautgripasermi (Gibco), 100 U/ml penicillín (Gibco) og 100 mg/ mL streptomycin (Gibco) við 378C með 5% CO2.
cistanche ávinningur fyrir karla styrkir ónæmiskerfið
Smelltu hér til að skoða Cistanche Enhance Immunity vörur
【Biðja um meira】 Netfang:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Greining á IgG mótefni með ELISA
Magn mótefnavakabindandi IgG mótefna í sermissýnum úr mönnum var ákvarðað með ELISA. Níutíu og sex brunna ELISA plötur (Corning, Corning, NY) voru forhúðaðar með SARS-CoV-2 núkleókapsíðpróteini (Sino Biological, Peking, Kína, vörulistanr. 40588-V08B , 50 ng í hverri holu) eða toppprótein (Sino Biological, 40589-V08B1, 100 ng í hverri holu), SARS-CoV toppprótein (Sino Biological, 40634-V08B, 100 ng á vel), eða MERS-CoV toppprótein (Sino Biological, 40069-V08B, 50 ng í hverri holu) yfir nótt við 48C. Eftir blokkun með 5% fitulausri mjólk í fosfat-bufferðri saltlausn (PBS) sem inniheldur 0,05% Tween 20 (PBS-T) í 2 klukkustundir við 378C, 3-faldaðu raðþynnt hitaóvirkjuð sermissýni við upphafsþynningu 1 :200 var bætt í forhúðaðar plötur í 2 klukkustundir við 378C. Brunnar voru þvegnar þrisvar sinnum á milli hvers þrepa með PBS-T. Viðbrögð voru sýnd með ræktun með piparrótarperoxidasa-tengdu and-manna IgG mótefni (Abcam, Cambridge, Bretlandi, 1:100,000 þynning) í 1 klukkustund við 378C, fylgt eftir með því að bæta við tetrametýlbenzidín hvarfefni (Life Technologies, Carlsbad) , Kaliforníu). Þróunarhvörfin voru stöðvuð með 2 mól H2SO4 og gleypni var mæld við 450 nm með leiðréttingarbylgjulengdinni stillt á 630 nm (OD450 2 OD630). Til að reikna út endapunktstítra bindandi mótefna voru gögn línulögð með því að plotta log10 sermisþynningar á móti leiðréttum ljósþéttni (OD) gildi (OD450 2 OD630) innan línulega hluta ferilsins (y 5 kx 1 b , r2 > 0,99), og sermisþynningu þar sem leiðrétt OD gildi (OD450 2 OD630) 5 0 var reiknað út til að gefa endapunktstítra. Mótefnavaka-sértæk IgG mótefni í peptíð-ónæmdum músum voru metin með peptíð-undirstaða ELISA. Í stuttu máli, 96-brunn ELISA plötur (Thermo Fisher Scientific) voru húðaðar með 1 mg í hverri brunn af 4 blönduðum peptíðum (peptíð 318, 356, 510 og 530) í karbónatbuffi (pH 9,6) yfir nótt við 48C. Eftir blokkun með PBS-T sem innihélt 5% fitulausa mjólk, voru holur ræktaðar með sermisýnum þynnt við 1:40 í 1 klukkustund við 378C. Í kjölfarið voru plöturnar þvegnar og ræktaðar með piparrótarperoxídasa-tengdu and-músa IgG mótefni (Abcam). Viðbrögð voru sýnd með tetrametýlbensidín hvarfefni (Life Technologies), og gleypni við 450 nm var mæld eftir að hvarf með 2 mól H2SO4 var hætt.
Gerviveiruframleiðsla og títrun
Kóða-bjartsýni gen sem kóðar SARS-CoV-2 (NC_045512) eða SARS-CoV (AY291315.1) toppprótein með C-enda 19 aa eyðingu, eða MERS-CoV (JX{{10) }}) toppprótein sem var stytt með C-enda 16 aa var klónað inn í pcDNA3.1(1) vektor, í sömu röð. HEK 293T frumur ræktaðar í 100 mm vefjaræktunarskál voru samsmitaðar með 1 mg af plasmíði sem kóðar toppprótein og 15 mg af env-skorti, lúsiferasa-tjáandi burðarás (pNL4-3.luc.RE) með því að nota pólýetýlenimín (Polysciences) , Warrington, Pa). Frumuræktunarfrumvökva sem innihélt gerviveiru var safnað 48 tímum eftir transfæðingu, síað og geymt við 2808C í deilum. Til að ákvarða vírustítra (50% sýkingarskammtur í vefjarækt) var raðþynningum af gerviveirum bætt við 1 3 104 Huh7 frumur sem voru forsáðar í 96-brunnsplötur. Eftir 12 klst sýkingu var vírusinnihaldandi miðli skipt út fyrir ferskan vaxtarmiðil og frumur voru ræktaðar í 48 klst til viðbótar. Lúsiferasavirkni frumugreiningar var mæld með Steady-Glo Luciferase prófunarkerfi (Promega, Madison, Wisc) með því að nota örplötulesara (BioTek Instruments, Winooski, Vt), og holur sem mynduðu hlutfallslegar birtueiningar sem voru hærri en 10 sinnum meðal bakgrunnsgildi voru teknar til greina. jákvæð.
Gervirus hlutleysingarprófun
Hitaóvirkjuð sermissýni frá COVID-19 sjúklingum eða heilbrigðum gjöfum voru 2-falt raðþynnt og ræktuð með 200 gerviveirum við 50% vefjaræktarsmitsskammt í 1 klukkustund við 378C. Blöndurnar voru síðan settar á til að sýkja Huh7 frumur sem voru forsáðar í 96-brunnsplötum í tvíriti. Brunnar voru endurnýjaðar með fersku vaxtaræti 12 klukkustundum eftir sýkingu og lúsiferasavirkni frumna var ákvörðuð 48 klukkustundum síðar. 50% hlutleysingartítrar (NT50) gegn SARS-CoV-2 og SARS-CoV gerviveirum voru reiknaðir út með ólínulegri aðhvarf með því að nota GraphPad Prism 8.0 hugbúnað (GraphPad Software, La Jolla, Calif); og NT50 MERS-CoV gerviveiru var skilgreint sem hæsta þynning sermis sem leiddi til 50% minnkunar á hlutfallslegum birtueiningum samanborið við veirueftirlitið án þess að nota sermissýni.
Cýtókíngreining sem byggir á próteinum örfylki
Magnmæling margra frumuefna (IL-1a, IL-1b, IL- 4, IL-6, IL-8, IL-10 , IL-13, MCP-1, IFN-g og TNF-a) í sermissýnum voru gerðar með því að nota multiplex ELISA fylki (RayBiotech, Peachtree Corners, Ga) samkvæmt samskiptareglum framleiðanda. Í stuttu máli, glerskyggnur, sem voru forhúðaðar með frumu-sértækum mótefnum, voru læstar með sýnisþynningarefni við stofuhita í 30 mínútur, fylgt eftir með því að bæta við 60 ml 2-falt þynntum sermisýnum eða cýtókínstaðalþynningum. Eftir ræktun yfir nótt við 48C voru skyggnur þvegnar 5 sinnum og litaðar með 80 mL bíótínýleruðum mótefnakokteil og síðan Cy3 jafngildi litarefnis-tengdu streptavidíni við stofuhita í 1 klukkustund. Flúrljómunarstyrkurinn var greindur með InnoScan 300 örfylkisskanna (Innopsys, Chicago, Ill) við 532 nm og gögn voru greind með Q-Analyzer hugbúnaði (RayBiotech).
Peptíðmyndun og samtenging við albúmín í sermi nautgripa
Alls 515 peptíð (15 aa að lengd, skarast um 11 aa) sem þekja SARS-CoV-2 próteinið voru mynduð af GL Biochem (Shanghai, Kína) á grundvelli amínósýruröð SARS-CoV -2 stofn Wuhan-Hu-1. Peptíð voru samtengd við serum albúmín úr nautgripum (BSA) með því að nota krossbindarann Sulfo-SMCC (Thermo Fisher Scientific) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Í stuttu máli var Sulfo-SMCC bætt við í 30-földu mólumfjölda við BSA, fylgt eftir með skilun í PBS. Í kjölfarið var peptíðinu sem innihélt cystein bætt við í hlutfallinu 1:1 (wt/wt) ræktað í 2 klukkustundir, og frekar skilað með PBS til að útrýma frjálsum peptíðum.
Peptíð örfylki tilbúningur
Til að undirbúa peptíð örfylkinguna, peptíð af SARS-CoV-2, sem og neikvæða viðmiðunarhópnum (BSA) og jákvæðu viðmiðunum (and-manna IgG og and-manna IgM mótefni; Sigma-Aldrich, St Louis, Mo) , voru kyrrsettar á PATH undirlagsglas (Grace Bio-Labs, Bend, Ore) í þríriti með því að nota Super Marathon prentara (Arrayjet, Edinborg, Skotlandi, Bretlandi). Síðan voru peptíð örfylki varðveitt við 2808C til frekari notkunar.
cistanche tubulosa-bæta ónæmiskerfið
Microarray-undirstaða epitope kortlagning
Sermisgreining á örfylkingu var framkvæmd eins og Li et al,37 með smávægilegum breytingum. Til þess að búa til einstök hólf fyrir eins undirfylki var 14-hólfsgúmmíþétting sett á hverja peptíð örfylkisglas. Skyggnuflokkarnir voru hitaðir að stofuhita fyrir notkun, síðan lokaðir með 3% BSA í PBS-T í 3 klukkustundir. Sermissýnin frá COVID-19 sjúklingum eða safnað sermi frá 20 heilbrigðum gjöfum (viðmiðunarhópur) voru þynnt við 1:200 í PBS-T fyrir flest sýni og síðan ræktuð með hverjum undirflokki í 2 klukkustundir kl. 48C. Fylkin voru þvegin með PBS-T og ræktuð með Cy3-conjugered geit and-man-man IgG og Alexa Fluor 647- conjugated asna and-human IgM (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, Pa) í 1:1000 þynningu hver í 1 klukkustund við stofuhita. Eftir ræktun voru fylkin þvegin með PBS-T og síðan þurrkuð að fullu með skilvindu við stofuhita. Í kjölfarið voru fylkin skannaðar með LuxScan 10K-A örfylkisskanni (CapitalBio, Peking, Kína) og FL flúrljómunarstyrkleikagögn voru fengin og greind með GenePix Pro 6.0 hugbúnaði (Molecular Devices, Sunnyvale, Kalifornía).
MYND 1. Lengdarvirkni mótefnasvörunar hjá COVID-19 sjúklingum. Skýringarmynd af hönnun náms. Alls voru 31 SARS-CoV-2-sýktir einstaklingar og 20 heilbrigðir gjafar skráðir í rannsóknina. Söfnun sermissýna var framkvæmd langsum á mörgum tímapunktum fyrir 20 sjúklinga meðal 31 SARS-CoV-2-sýktra einstaklinga, en sýnatöku á einum tímapunkti var gerð fyrir hina 11 sjúklingana. Fjöldi þátttakenda og sermissýni sem notuð eru í ýmsum mælingum eru skráð. B og C, Alls voru 101 sermissýni frá 31 COVID-19 sjúklingi prófuð með ELISA fyrir SARS-CoV-2 N prótein (B) og S prótein (C) bindandi IgG mótefni á mismunandi tímapunktum eftir að einkenni koma fram (dagar 1-30, n 5 37; dagar 31-61, n 5 18; dagar 100-150, n 5 21; dagar {{21 }}, n 5 25). Sermissýni frá 20 heilbrigðum gjöfum voru tekin með sem viðmiðunarhópur. D, NT50 gegn SARS-CoV-2 gerviveirum með tímanum var reiknað með ólínulegri aðhvarf. E, Dreifing á hlutleysandi virkni í sermi hjá COVID-19 sjúklingum á tilgreindum tímapunktum eftir að sjúkdómurinn byrjar. Sýni með NT50 títra undir 20 voru skilgreind sem engin hlutleysandi
Peptíð örfylkisgagnagreining
IgG og IgM gögnin voru greind hvort um sig. Merkisstyrkur hvers bletts var skilgreindur sem forgrunnur að frádregnum bakgrunni og meðaltal þrefaldra bletta fyrir hvert peptíð. Viðmiðunargildi fyrir jákvæða peptíðsvörun COVID-19 sýna var stillt sem tvöfalt merkjastyrkur heilbrigðs gjafastýringar. Peptíð með jákvætt hlutfall yfir 80% meðal sýna sem voru prófuð á öllum 3 sýnatökutímum (dögum 10-60, 100-150 og 180-220 eftir upphaf sjúkdóms) voru skilgreind sem ríkjandi og viðvarandi peptíð og peptíð með jákvæð svörunartíðni yfir 60% á öllum 3-tímapunktum var talin lægri og viðvarandi. Reiknaður var út meðalmerkisstyrkur hvers peptíðs í 3 sýnatökutímahópum; Peptíð sem sýndu háan merkistyrk (yfir meðaltal 1 SD af merkistyrk allra prófaðra sýna) voru einnig valin. Gagnavinnsla og greining var framkvæmd með R v3.6.3 hugbúnaði (https://www.r-project.org/) og marktækar breytingar á merkistyrkleika meðal mismunandi sýnatökutímahópa voru metnar út frá Limma. Munur með P <.05 var talinn tölfræðilega marktækur.
Músabólusetning
Kvenkyns BALB/c mýs á aldrinum 6 til 8 vikna voru keyptar frá Beijing Vitalstar Biotechnology (Beijing, Kína). Allar mýs voru geymdar í sérstökum sjúkdómsvaldandi aðstöðu og dýrarannsóknin var samþykkt af dýraumönnunar- og notkunarnefnd Tianjin læknaháskólans (Tianjin, Kína). Til ónæmisaðgerða var hópum af músum (n 5 5) sprautað í vöðva með 25 mg í hverjum skammti af hverju peptíði (peptíð 318, 356, 510 og 530 í sömu röð) blandað með 50 mg alum (InvivoGen, San Diego, Kaliforníu) og 10 mg CpG ónæmisglæði, og aukið tvisvar með 50 mg í hverjum skammti af peptíðum í nærveru ónæmisglæða með 2-viku millibili. Bólusetning með hjálparefnum einum og sér þjónaði sem neikvæða viðmiðunin. Serum var safnað úr bólusettum músum á degi 10 eða degi 14 eftir aðra og þriðju bólusetningu.
Tölfræði- og byggingargreiningar
Öll línurit voru teiknuð af GraphPad Prism. Tölfræðilegur samanburður á milli hópa á myndum 1, 2 og 4 var gerður með 1-leið ANOVA með Tukey margfeldissamanburði. Fylgni sýnd á mynd 1 Mynd E9 og mynd E10 í netgeymslunni sem er aðgengileg á www.jacionline.org voru ákvörðuð með Pearson fylgnigreiningu. Munur með P <.05 var talinn tölfræðilega marktækur. Uppbygging SARS-CoV-2 toppprótíns (Protein Data Bank [PDB; http://www.wwpdb.org/] ID: 6VXX og PDB ID: 6ZGI) og dimerization lén SARS-CoV{{ 13}} nucleocapsid prótein (PDB ID: 6YUN) var notað til að kryfja byggingarupplýsingar auðkenndra epitopes sem staðsettar eru á spike próteininu og dimerization léni nucleocapsíð próteins. Raðaðlögun og samheitagreining meðal ýmissa kransæðaveiru manna var framkvæmd með Clustal W reikniritinu í MEGA v10.1.6 hugbúnaði.
NIÐURSTÖÐUR
SARS-CoV-2 sýking veldur viðvarandi mótefnavaka-sértæk bindingu og hlutleysandi mótefni
Til að meta langvarandi mótefnasvörun eftir SARS-CoV-2 sýkingu var 101 sermissýni safnað frá 31 einstaklingi með PCR-staðfesta SARS-CoV-2 sýkingu (mynd 1, A). Þátttakendur í rannsókninni voru 26 sjúklingar með miðlungsmikið COVID-19, 1 með einkennalausa framsetningu, 2 með væga sjúkdóma og 2 með alvarleg einkenni (sjá töflu E1 í netgeymslunni sem er að finna á www.jacionline.org). Sjúklingar sem tóku þátt í þessari rannsókn voru á aldrinum 17 til 66 ára (miðgildi aldurs, 45 ár), með um það bil jafnri dreifingu karla (51,6%) og kvenna (48,4%). Algengustu einkennin meðal þátttakenda í rannsókninni voru hiti (83,9%), hósti (67,7%), vöðvaverkir (22,6%) og kuldahrollur (22,6%), með meðallengd veikinda í 15 daga. Alls var 90 sermissýnum úr 20 COVID-19 sjúklingum safnað við sjúkrahúsinnlögn og útskrift eftir bata á mörgum tímapunktum allt að 219 dögum eftir upphaf einkenna (mynd 1, A, og sjá töflu E2 í netgeymslunni). Sýnataka úr hinum 11 þátttakendunum var gerð á einum tímapunkti á síðbúnum bata (dagar 122 til 214 eftir að einkenni komu fram). Að auki voru sýni frá 20 heilbrigðum gjöfum með samsvarandi aldur og kyndreifingu tekin með sem viðmiðunarhópur (tafla E1). Mótefnavakasértæk IgG mótefni í sermissýnum voru magngreind með ELISA forhúðuð með SARS-CoV-2 N próteini eða S próteini. Í samanburði við heilbrigða gjafa, mynduðust bæði and-N og anti-S IgG mótefni hjá COVID-19 sjúklingum innan 30 daga frá upphafi einkenna, með rúmfræðilega meðalendapunktatítra upp á 4,10 (log10 and-N IgG) og 4.20 (log10 and-S IgG) (mynd 1, B og C; og sjá töflu E3 í netgeymslunni á www.jacionline.org; mynd E1, A og B; og mynd E2), í samræmi við fyrri athuganir um að sermisbreytingar á sér stað 1 til 2 vikum eftir SARS-CoV-2 sýkingu.5,38 Síðan lækkuðu mótefnavakabindandi mótefnatítrar í mismiklum mæli með tímanum. Hröð og verulega lækkandi magn and-N IgG mótefna sást hjá COVID-19 sjúklingum, en hærra magn and-S IgG títra hélst allt að 180 til 220 dögum eftir upphaf sjúkdómsins samanborið við heilbrigða gjafa (mynd 1, B) og C). Fylgnigreining leiddi í ljós marktæka fylgni milli log10 and-N IgG titra og and-S IgG titra (r 5 0.50 og P <.001; mynd 1, F). Auk þess að magngreina bindandi mótefni var gangverki virkra hlutleysandi mótefna hjá einstaklingum með COVID-19 ákvarðað frekar með því að nota gervigerð SARS-CoV-2. Yfir 95% af sermissýnum sjúklinga (35/37) sem safnað var á milli 4 og 30 dögum eftir að einkenni komu fram höfðu öfluga hlutleysandi virkni gegn SARS-CoV-2 og stór hluti sýna sýndi miðlungsmikil (NT50 80-320 ) til sterkrar (NT50 > 320) hlutleysandi virkni (mynd 1, D og E). Athygli vekur að 2 sýnum með engum eða lágum hlutleysandi titrum (NT50 við lágmarksþynningu í sermi 1:20) var safnað snemma eftir veirusýkingu (á 4. degi og degi 11 eftir að einkenni komu fram) áður en framkallað var öflug hlutleysandi mótefni (mynd 1, D og mynd E1, C). Þrátt fyrir lækkandi magn SARS-CoV-2 hlutleysandi mótefna hjá COVID-19 sjúklingum með tímanum, voru flest sermissýni sjúklinga (24/25) sem fengust á 180 til 220 dögum eftir að einkenni komu fram viðvarandi jákvæðni fyrir hlutleysingu gegn SARS- CoV-2, með 2.8-faldri lækkun á rúmfræðilegu meðaltali NT50 títra (mynd 1, D og E; tafla E3; mynd E3). Eins og búist var við, samanborið við and-N IgG mótefni, greindist sterkari fylgni milli SARS-CoV-2 S bindandi IgG titra og hlutleysandi mótefnatítra (r 5 0.61 og P <.001; mynd 1 , G og H), í samræmi við niðurstöður um að SARS-CoV-2 S prótein sé aðalmarkmið hlutleysandi mótefna. S prótein SARS-CoV-2 deilir mikilli raðlíkingu með mjög meinvirku SARS-CoV (76% raðauðkenni) og sýnir litla raðsamstæðu við MERS-CoV (34% raðauðkenni). Greint hefur verið frá sermisfræðilegri víxlvirkni meðal kransæðavírusa; 8,10,28,29 eru hins vegar takmörkuð gögn um langvarandi eftirfylgnimat á krossviðbrögðum mótefna gegn SARS-CoV-2 gagnvart öðrum kransæðaveirum. Við ákváðum krossbindandi og krosshlutleysandi mótefni í lengdarsermi frá SARS-CoV-2-sýktum einstaklingum. Niðurstöður sýndu að meira en 80% af sermissýnum sjúklinga bundust S próteinum af SARS-CoV og/eða MERS-CoV innan 1 mánaðar eftir að einkenni komu fram, þar sem 27% sýna sýndu tvöfalda krossviðbrögð (mynd 1, I). Hvarfgirni við SARS-CoV S prótein var með stærra hlutfall (73%) en MERS-CoV (35%) meðal sýna sem voru prófuð snemma (1-30 dögum eftir upphaf sjúkdóms) (mynd 1, I). Tvöföld krossbindingu og SARS-CoV krossbindandi mótefnin sýndu smám saman hnignun með tímanum, með aðeins 8% tvöfaldri krossbindingu og 20% SARS-CoV stökum krossbindandi sýnum 180 til 220 dögum eftir upphaf sjúkdóms (Mynd 1 , I; í netgeymslunni sem er að finna á www.jacionline.org, sjá mynd E4, A; mynd E5, A; og mynd E6 í netgeymslu þessarar greinar á www.jacionline.org). Það er forvitnilegt að jákvæðni MERS-CoV S próteinviðbragða mótefna hélst tiltölulega stöðug með tímanum (mynd 1, I). Ólíkt mikilli krossbindingargetu, krosshlutleysaði aðeins lítill fjöldi sjúklinga í sermi SARS-CoV og/eða MERS-CoV gerviveirur (mynd 1, I; mynd E4, B; mynd E5, B; og sjá mynd E7 í Geymsla á netinu). Um það bil 27% sýna sem safnað var 1 til 30 dögum eftir að einkenni komu fram sýndu krosshlutleysandi virkni og þessi tala fór niður í 20% eftir 180 til 220 daga, með gríðarlegri breytingum á SARS-CoV krosshlutleysandi virkni (Mynd 1, I. ). Hærra hlutfall sýna krosshlutleysaði SARSCoV en MERS-CoV innan 30 daga eftir upphaf sjúkdómsins. Rétt er að taka fram að þrátt fyrir svipað hlutfall sýna sem sýndu SARS-CoV og MERS-CoV krosshlutleysingu, voru NT50 gildin fyrir MERS-CoV mun lægri en SARSCoV meðal sermissýna sem voru jákvæð fyrir krosshlutleysingu (Mynd E4, B; mynd E5, B; mynd E7).
cistanche plöntuaukning ónæmiskerfi
SARS-CoV-2 sýking leiðir til virkjunar á frumumyndun
Til að lýsa ítarlega ónæmisfræðilegu breytingarnar eftir SARS-CoV-2 sýkingu, metum við frekar breytingar á gangverki í cýtókíngildum í sermi COVID-19 sjúklinga. Fimmtíu og fimm lengdarsermissýni sem safnað var á fyrstu 2 mánuðum eftir að einkenni komu fram voru notuð til að greina frumumyndun cýtókína með próteini-undirstaða örfylki. Aukin þéttni margra cýtókína í sermi sást á fyrsta mánuði veikinda, þar á meðal IL-1a (bólgueyðandi), IL-6 (bólgueyðandi) og IL-10 (bólgueyðandi). ), sem hafa verið tengd cýtókínlosunarheilkenni í alvarlegum COVID-19 tilfellum,39,40 sem og IFN-g (TH1 gerð) og IL-4 (TH2 gerð) (Mynd 2, A, og mynd E8 í netgeymslunni sem er að finna á www.jacionline.org). Sérstaklega jókst styrkur IL-6, IL-10 og IFN-g í sermi innan 15 daga frá upphafi einkenna hjá sjúklingum og minnkaði á síðari stigum, en losun IL-1 Sýnt var fram á að a og IL-4 hækkuðu ótrúlega mikið á 16 til 30 dögum frá upphafi sjúkdómsins og féllu hratt í eðlilegt horf eftir það (mynd 2, A). Fylgnigreining gaf til kynna veik eða engin línuleg tengsl milli mótefnavaka-sértækra mótefnasvörunar og frumuefnamyndunar eftir SARS-CoV-2 sýkingu, þó að tölfræðileg marktekt hafi sést á milli styrks IL-10 og SARS-CoV{{ 34}} N próteinbindandi mótefni (r 5 0.321 og P < .05), á milli IL-1b framleiðslu og S próteinbindandi mótefni (r 5 20.335 og P<.05), and between TNF-a and S protein binding antibody levels (r 5 20.335 and P <.05; see Fig E9 in the Online Repository). To allow direct visualization and comparison among patient samples across multiple cytokine responses over time, we constructed a heat map showing fold changes in cytokine release relative to the healthy donor control group (Fig 2, B). Consistent with our findings presented above, elevated serum cytokine levels after SARS-CoV-2 infection were predominantly observed during the acute phase and an early period of convalescence (within 30 days after disease onset) (Fig 2, A and B). Among cytokines tested, proinflammatory IL-6 exhibited the most robust response, with a 4.9-fold increase and a 2.9-fold increase on average for samples collected during 1 to 15 days and 16 to 30 after onset of symptoms, respectively (Fig 2, B). Of note, 1 serum sample (sample Pt-S22, collected on day 18 after disease onset) obtained from a COVID–19–infected individual with moderate disease, exhibited a marked increase in the production of multiple proinflammatory cytokines, including IL-1a, IL-1b, IL-6, and TNF-a (Fig 2, B). Additionally, hyperproduction of cytokines including IL- 1a, IL-4, IL-6, IL-10, IL-13, and IFN-g was also detected in 1 sample (sample Pt-S11, collected at day 15 after disease onset) collected from a severe case of COVID-19; presumably, these are associated with disease severity and outcome (Fig 2, B). These results indicate broad inflammatory activation and changes over time involving the concomitant release of proinflammatory and anti-inflammatory cytokines as well as TH1-type and TH2-type cytokines in COVID-19 patients.
Kortlagning próteóma-breiðs eðlis greinir ríkjandi epitopur sem miðla viðvarandi humoral ónæmissvörun hjá COVID-19 sjúklingum
Til að auðkenna betur einkenni húmorsónæmis gegn SARS-CoV-2 með tímanum, beittum við kortlagningu próteóma-breittrar epitóps með því að nota peptíð-undirstaða örfylki. Peptíðsafn sem þekur SARS-CoV-2 próteinið var myndað og sett á skyggnur, þar sem hvert peptíð var 15 aa að lengd með 11 aa skörun. Alls 51 lengdarsermissýni frá 19 sjúklingum með annað hvort einkennalaus (n 5 1) eða væg (n 5 2) til miðlungsmikil (n 5 15) eða alvarleg (n 5 1 ) SARS-CoV-2 sýkingar voru prófaðar (tafla I). Til að ná tiltölulega jafnvægi á fjölda sýnatöku, millibili og tímapunktum var sýnum safnað í röð á 2 eða 3 tímapunktum frá hverjum COVID{18}} þátttakanda á bilinu 16 til 219 dögum eftir að einkenni komu fram. Meirihluti sjúklinga (18/19) myndaði hlutleysandi mótefni eftir veirusýkingu, nema einstaklingurinn með einkennalausa sýkingu (tafla I). Samkvæmt mismunandi tímapunktum sýnatöku var sýnum skipt í 3 hópa: dagar 10-60 (n 5 18), dagar 100-150 (n 5 18) og dagar {{28 }} (n 5 15). Langtímamat á víruseitópsprófílum hjá COVID-19 sjúklingum var framkvæmt fyrir bæði IgG og IgM mótefni í sermi, með sameinuðu sermi frá 20 heilbrigðum gjöfum notað sem neikvæð viðmið. Með því að nota SARS-CoV-2 prótein örfylki, voru hreyfihvörf peptíðbindandi mótefnasvörunar ákvörðuð og greind með tilliti til (1) bindismerkjastyrks og (2) hlutfalls jákvæðra viðbragða (jákvætt hlutfall) fyrir hvert peptíð. . Byggt á skerðingargildi fyrir jákvætt peptíðbindandi svar, sem var stillt sem tvöfalt merkjastyrk neikvæða samanburðarins, greindum við samtals 460 jákvæð peptíð fyrir IgG og 479 jákvæð peptíð fyrir IgM sem voru hvarfgjörn með að minnsta kosti 1 sjúklingi sermisýni. Jákvæð peptíðfjöldi og dreifing svörunar yfir mismunandi opna lestrarramma (ORF) SARS-CoV-2 voru tiltölulega stöðugar meðal mismunandi sýnatökuhópa, með tilhneigingu til lítilsháttar lækkunar á jákvæðum peptíðtölum með tímanum (Mynd 3, A). Mest hvarfgirni var auðkennd í fjölpróteininu ORF1ab, sem er stærsta ORF, sem nær yfir meira en tvo þriðju hluta alls erfðamengisins (mynd 3, A). Athyglisvert var að við sáum miðlungs til sterka fylgni milli jákvæðra peptíðbindandi svörunar og sermisþéttni cýtókína snemma eftir SARS-CoV-2 sýkingu (dögum 10-60 eftir að sjúkdómurinn hófst; sjá mynd E10 í netgeymslunni á www.jacionline.org). Sýnt var fram á að fjöldi jákvæðra bindandi peptíða fyrir IgM tengist sermisþéttni IL-6 og IL-10; sömuleiðis sýndi meðaltalsmerkjastyrkur heildar hvarfgefna peptíða og ORF1ab bindandi peptíða fyrir IgM jákvæð tengsl við IL-6 og IFN-g framleiðslu í sermissýnum. Þessar upplýsingar benda til þess að breytingar á cýtókínmagni eftir SARS-CoV-2 sýkingu geti haft áhrif á stærð og breidd epitópa sem þekkjast af mótefnavaka-sértækum húmorsvörunum. Byggt á því að bera kennsl á jákvæðar myndefni, völdum við enn frekar algengustu myndefnin sem héldust stöðugt hvarfgjörn í meira en 80% COVID-19 sýnanna úr hverjum af 3 sýnatökuhópunum (kallaðir ríkjandi og viðvarandi myndefni). Niðurstöður leiddu í ljós að þessar mjög ríkjandi epitopur sem geta miðlað langtíma humoral ónæmissvörun voru staðsettar við SARS-CoV-2 ORF1ab fjölprótein og S prótein, með fleiri epitopur sem þekkjast af IgM mótefnum (n 5 33) en IgG mótefni (n 5 10) (mynd 3, B og tafla II; sjá mynd E11 og mynd E12 í netgeymslunni á www.jacionline.org). ORF1ab fjölpróteinið bjó yfir hámarksfjölda ríkjandi epitópa sem miðla langtímasvörun, og epitopur dreifðust víða um svæði óbyggingarpróteina (nbsp) 2-5, nbsp 8-10, nbsp 12-14, og nbsp 16 (tafla II). Athyglisvert var að við greindum eina ónæmisráðandi epitope, 2073 (ORF1ab, aa 5801-5815), sem hægt væri að þekkja með IgG og IgM mótefnum frá 100% COVID-19 sjúklinganna, óháð tímapunktum fyrir sýnatöku í sermi (mynd 3, B og töflu II; sjá mynd E13 og mynd E14 í netgeymslunni). Þetta mjög hvarfgjarna peptíð er staðsett innan helicase (nsp 13) svæði ORF1ab fjölpróteins, sem er nauðsynlegt til að vinda ofan af tvíþátta RNA sniðmátum við SARS-CoV-2 afritun.41 Meðal valinna peptíða af ORF1ab, 2 ónæmisráðandi peptíð með hæsta meðaltalsmerkjastyrk sem IgG mótefni þekkja, númer 1985 (ORF1ab, aa 5449-5463) og númer 2073 (ORF1ab, aa 5801-5815), eru báðar staðsettar á nsp 13. Fyrir IgM svörun, peptíð 685 (ORF1ab, aa 249-263) á nsp 2 og peptíð 1985 (ORF1ab, aa 5449-5463) á nsp 13 sýndu sterkustu bindingarstyrkinn (mynd 3, B). Að teknu tilliti til breytileika í grunnlínumerkjum (sameinað sermi frá heilbrigðum gjöfum) fyrir mismunandi peptíð (mynd 3, B), reiknuðum við frekar falt breytingar á merki styrkleika varðandi hvert lykilpeptíð, miðað við heilbrigða samanburðarhópinn. Niðurstöður sýndu að peptíð 2073 (IgG binding) og peptíð 1985 (IgM binding) staðsett á nsp 13 svæðinu héldu uppi efstu peptíðbindingarstyrk (faltbreytingu) meðal sermi sjúklinga sem safnað var í allt að 180 til 220 daga (mynd E13 og mynd E14).
MYND 2. Hreyfifræði cýtókínframleiðslu hjá COVID-19 sjúklingum. A, Cýtókínframleiðslumagn í 55 sermissýnum sem safnað var frá 16 COVID-19 sjúklingum á bráðastiginu og snemma batastigs greindust með próteinörvum sem byggir á ELISA (dagar 1-15, n. 5 11; dagar 16-30, n 5 26; dagar 31-61, n 5 18; heilbrigðir gjafar, n 5 20). Hver punktur táknar einstakt sermissýni; punktalínur tákna greiningarmörk. Tölfræðileg marktækni var ákvörðuð með 1-leið ANOVA með Tukey margfeldissamanburði. *P <.05, **P <.01, og ****P <.0001. B, Föld breyting á hverju frumuefnaframleiðslustigi hjá COVID-19 sjúklingum sýnd í (A) samanborið við meðalgildi 20 sýna frá heilbrigðum gjöfum. Hver dálkur gefur til kynna sérstakt sermissýni sem safnað var frá tilgreindum tímapunktum eftir upphaf einkenna; hver röð táknar 1 einstaklingsprófað cýtókín.
Tafla I. Einkenni COVID-19 sjúklinga og úrtakshópa í kortlagningu
MYND 3. IgM- og IgG-þekking á ríkjandi epitopum sem stuðla að langtíma mótefnasvörun í SARS-CoV-2-sýktum einstaklingum. Lengdargreining á sermigreiningu á epitópum í 19 einstaklingum með COVID-19 með því að nota peptíð örfylki sem nær yfir prótein SARS-CoV-2. Viðmiðunargildi fyrir jákvæða svörun peptíðbindingar í sýnum sjúklinga (n 5 51) var stillt sem tvöfalt merkisstyrkur samsafnaðs sermis frá 20 heilbrigðum gjöfum. A, Peptíðfjöldi og dreifing jákvæðra bindipeptíða sem voru greinanleg í 1 eða fleiri sýnum sem safnað var á 10-60 dögum (n 5 18), 100-150 dögum (n 5 18), og 180- 220 dögum (n 5 15) eftir að sjúkdómurinn hófst. Tölur gefa til kynna heildar auðkenndar IgG og IgM epitopur frá hverjum ORF. B, Merkjastyrkur ríkjandi og viðvarandi IgG og IgM epitopa (x-ás) sem voru viðvarandi viðbrögð í meira en 80% sýna innan allra þriggja sýnatökutíma. Hver punktur gefur til kynna safnað sermi frá heilbrigðum gjöfum (efst) eða sérstakt sermissýni sjúklings sem safnað var frá tilgreindum tímapunktum eftir að einkenni komu fram. E, Envelope prótein.
TABLE II. Epitopes with >80% jákvætt hlutfall á öllum 3 sýnatökutímum
Ríkjandi og viðvarandi einkenni SARS-CoV-2 S próteins eru staðsettar í NTD og S2 undireiningum
Alls greindust 4 ríkjandi og viðvarandi epitopur úr SARSCoV-2 S próteini: peptíð 318 (S, aa 45-59) og peptíð 356 (S, aa 197-211), sem eru staðsett innan NTD svæðinu; peptíð 510 (S, aa 813-827), sem nær yfir S2' klofningsstaðinn og hluta af FP S2 undireiningarinnar, og peptíð 530 (S, aa 893-907), sem er staðsett á tengisvæðinu milli FP og fyrsta heptad endurtekningarsvæðis S2 undireiningarinnar (mynd 3, B og tafla II). Meðal þessara lykilpeptíða af S próteini sem við völdum var peptíð 318, staðsett við NTD S próteinsins, með sterkasta bindingarstyrkinn (föld breyting miðað við viðmiðunina; mynd E13 og mynd E14). Byggingargreiningar leiddu í ljós að þessar epitopur eru að fullu útsettar á yfirborði einliða S próteins; þó eru sumar leifar af epitópum fyrir peptíð 318, 356 og 530 faldar undir yfirborði þrímera S próteinsins (mynd 4, A og B), sem bendir til þess að bæði S einliða og þrímera uppbyggingu séu þekkt á skilvirkan hátt af ónæmiskerfi hýsilsins samkvæmt vissum aðstæður. Til að vera sérstakur eru 2 lykkjuhlutar af peptíð 318 (aa 45-46 og aa 56-59) afhjúpaðir á trimeric S próteininu, með miðlæga b-strenginn grafinn inni; og flestar leifar peptíðs 356 eru aðgengilegar á yfirborðinu, þar á meðal kjarna b-strengur (aa 203-209) og lykkjuhluta (aa 210-211). Peptíð 510 inniheldur S2' klofningsstað og miðlæga helix FP, sem báðir koma að fullu fram á yfirborði S próteins; leifar af peptíði 530 eru að mestu dulrænar, þar sem aðeins lítið brot af lykkjunni (aa 893-895) er afhjúpað á trimeric S próteininu (mynd 4, C). Greining á samsvörun raðar meðal 7 algengra kórónuveirra manna leiddi í ljós að 2 epitopes staðsettar í S2 undireiningunni (peptíð 510 og 530) deila mikilli raðeinkenni með öðrum kórónuveirum, sem bendir til serfræðilegrar krossviðbragðs sem miðar að þessum epitopum meðal kórónuveiru manna (mynd 4, D). Röð peptíðs 318 sýndi mikla líkingu við SARSCoV, á meðan lágt stig raðsamstæður fyrir peptíð 356 var sýnt meðal kransæðaveiru, sem bendir til SARS-CoV -2-sértæk mótefnasvörun sem miðar að þessu svæði (mynd 4, D). Með hliðsjón af nýjum SARS-CoV-2 afbrigðum sem eru að koma fram og í dreifingu á heimsvísu, gerðum við enn frekar röðun raða með tilliti til lykileinhverfa S próteins milli snemma SARS-CoV-2 stofnsins (Wuhan-Hu{{52} }) og 5 afbrigði sem vekja áhyggjur (Alfa, Beta, Gamma, Delta og Omicron), auk 2 afbrigði af áhuga (Lambda og Mu), samkvæmt flokkun Alþjóðaheilbrigðismálastofnunarinnar á afbrigðum vírusa (uppfært 30. nóvember 2021) ). Niðurstöður sýndu að raðir þessara ríkjandi og viðvarandi epitópa eru næstum eins meðal afbrigða sem voru greind, nema fyrir staka N211I stökkbreytingu sem greind var í nýja Omicron afbrigðinu (mynd 4, E). Þessi gögn benda til þess að mótefni sem myndast af snemma SARS-CoV-2 stofnum kunni stöðugt að þekkja núverandi afbrigði í blóðrásinni og að þessar ríkjandi epitopur gætu verið færar um að miðla viðvarandi langtíma mótefnasvörun við sýkingu af SARS-CoV-2 afbrigði. Til að ákvarða frekar ónæmisfræðilega eiginleika auðkenndra epitópa á S próteininu, og til að kanna frekar hugsanlegt gildi þessara S-próteina epitopa sem peptíðbóluefnisframbjóðenda, gerðum við músabólusetningarrannsókn með því að nota valin peptíð. BALB/c mýs voru sáð þrisvar sinnum með hverju peptíði í viðurvist alums og CpG hjálparefna (mynd 4, F). Meðal 4 peptíðanna sem valin voru, framkallaði bólusetning með peptíði 356 mótefnavaka-sértæk mótefni eftir annan og þriðja skammtinn (mynd 4, G). Niðurstöður hlutleysunarprófsins í sermi leiddu í ljós að ónæmisaðgerð með línulegum peptíðum myndaði ekki marktækt magn hlutleysandi mótefna gegn SARS-CoV -2 (mynd 4, H), sem bendir til þess að þessi línulegu peptíð skili illa árangri í að framkalla öflug hlutleysandi mótefnasvörun.
N prótein af SARS-CoV-2 skortir flestar hvarfgjarnar epitopes sem miðla varanleg mótefnasvörun eftir veirusýkingu
Fjöldi rannsókna hefur leitt í ljós öfluga mótefnavaka SARS-CoV-2 N próteins.4,11,12 Hins vegar tókst okkur ekki að bera kennsl á ríkjandi og viðvarandi epitopur sem staðsettar eru við N próteinið á grundvelli núverandi valviðmiðana (yfir 80% jákvætt hlutfall á öllum 3 sýnatökutímum). Til að meta lengdarsnið á frumusniði N-próteins hjá einstaklingum með COVID-19, framkvæmdum við aðra lotu af epitopeskimun sem byggðist á gögnum sem fengust úr peptíð örfylkingunni fyrir val á undirríkjandi epitopum sem héldu stöðugt jákvæðri hvarfgirni. í meira en 60% COVID-19 sýnanna fyrir hvern af 3 sýnatökutímapunktum (kallaðir undirríkis- og viðvarandi einkenni). Alls greindust 4 undirráðandi og þrávirkar epitopes SARS-CoV-2 N próteins, þar á meðal peptíð 2455 (N, aa 213-227) sýndi hvarfgirni fyrir bæði IgG og IgM mótefni í COVID{{16 }} sjúklingar, með tiltölulega hærra merki styrkleika (mynd 5, A og B, og sjá töflu E4 í netgeymslunni á www.jacionline.org). Peptíðin tvö sem skarast, peptíð 2455 (N, aa 213-227) og peptíð 2456 (N, aa 217-231), eru staðsett á Ser/Arg-ríku tengisvæðinu milli N-enda RNA bindisvæðisins og C-terminal dimerization domain N próteinsins. Peptíð 2482 (N, aa 321-335) og peptíð 2491 (N, aa 357-371) eru að fullu eða að hluta staðsett innan dímerunarsvæðis N próteins (tafla E4). Vegna skorts á 3-D uppbyggingu varðandi ósnortna sköpulag N próteins, gerðum við aðeins burðargreiningar á 2 auðkenndum epitópum á tvískiptu uppbyggingu C-enda dimerization lénsins. Leifar af peptíð 2482 mynda 2 b þræði sem er raðað á andhliðstæðan hátt í dímerunarskilum, en aa 357-364 af peptíð 2491 myndar helix-undirstaða uppbyggingu sem eru staðsett á gagnstæðum endum dimersins (mynd 5, C) . Raðaðlögun milli snemma SARS-CoV-2 (stofns Wuhan-Hu-1) og 7 nýrra afbrigða leiddi ennfremur í ljós að raðir þessara undirráðandi og viðvarandi epitopa í N próteini eru nánast eins meðal núverandi afbrigða í blóðrás, með stök G215C skipting á peptíð 2455 sem kemur fram í Delta afbrigðinu og einni G214C stökkbreyting á peptíð 2455 sem auðkennd er í Lambda afbrigðinu, sem bendir til þess að mótefni sem miða á þessi peptíð þekkja mögulega mótefnavaka SARS-CoV-2 afbrigða sem koma fram (mynd 5, D ).
MYND 4. Ríkjandi einkenni SARS-CoV-2 topppróteins hvað varðar miðlun varanlegrar húmors ónæmissvörunar. A og B, Staðsetningar ríkjandi og viðvarandi epitopa á 3-D byggingu einliða (A) og þrímeraðs (B) S próteins (PDB ID: 6VXX). Þættir eru auðkenndir með grænu (peptíð 356, aa 197-211), rauðum (peptíð 318, aa 45-59), bláu (peptíð 510, aa 813-827) og fjólubláu (peptíð 530, aa 893-907), í sömu röð. S einliðurnar þrjár í lokuðu sniði eru sýndar í gráu, bleiku og bláleitu, í sömu röð. C, Ítarleg uppbyggingu greining á ríkjandi epitopum í SARS-CoV-2 S próteini á lokuðu ástandi S trimersins (PDB ID: 6VXX). D, Röð röðun auðkenndra epitópa meðal algengra kransæðaveiru manna. Eðlisleifar sem varðveitast á milli SARS-CoV-2 og annarra kransæðaveiru manna eru gráum skyggingum. E, Eðlisverndargreining á snemma SARS-CoV-2 (stofn Wuhan-Hu-1) og 7 afbrigði sem eru að koma upp. Svartir punktar tákna eins leifar á milli Wuhan-Hu-1 stofnsins og tilgreinds.
MYND 5. Undirríkjandi epitopes staðsett við SARS-CoV-2 núkleókapsíð próteinið geta miðlað viðvarandi mótefnasvörun. A-, IgG- og IgM-þekkingartíðni lægri peptíða (varanlega hvarfgjörn í meira en 60% sýnum) meðal sermissýna sjúklinga sem safnað var á mörgum tímapunktum eftir upphaf sjúkdóms. B, Hreyfifræði merkjastyrks auðkenndra undirríkjandi epitópa með tímanum. Hver punktur táknar sérstakt sýni úr sjúklingssermi sem er fengið frá COVID-19 sjúklingum á tilgreindum tímapunktum eftir að einkenni koma fram. Láréttar punktaðar línur gefa til kynna afmörkunargildi jákvæðrar svörunar fyrir hvert peptíð. C, Ítarleg uppbyggingu greining á epitopes á C-enda dimerization léni N próteinsins (PDB ID: 6YUN). Þættir eru merktir með bláu (peptíð 2482, aa 321-335) og brúnt (peptíð 2491, aa 357-364). Einliðabyggingarnar tvær eru sýndar í gráu og bláleitu, í sömu röð. D, raðgreiningargreiningu á auðkenndum N-próteinseðlum milli snemma SARS-CoV-2 (stofns Wuhan-Hu-1) og 7 afbrigða sem koma fram. Svartir punktar tákna sömu raðir á milli Wuhan-Hu-1 stofnsins og tilgreinds afbrigðis. Breytingar á amínósýruröð eru auðkenndar með rauðu.
MYND 6. Liner epitopes með miklum bindistyrk og minnkandi viðbragðstíðni með tímanum, þekkt af SARS-CoV-2-sýktum einstaklingum. A og B, Lengdargreining og dreifing auðkenndra peptíða sem sýna háan bindimerkjastyrk (yfir meðaltal 1 SD af merkjastyrk allra prófaðra sýna) en minnkandi jákvætt hlutfall með tímanum. Þekkingartíðni (A) og merkjastyrkur (B) efriðarmynda voru teiknuð með 3 sýnatökutímapunktum eftir upphaf einkenna. Hver punktur í (B) stendur fyrir sérstakt sermissýni sjúklings sem safnað var á tilgreindum tímapunktum eftir að einkenni koma fram; láréttar punktalínur gefa til kynna afmörkunargildi jákvæðni fyrir hvert peptíð. Tölfræðileg marktektargreining var gerð út frá Limma of R v3.6.3 hugbúnaðinum. *P <.05 og **P <.01. C, staðsetningar- og raðsamanburður á 2 aðliggjandi epitopum, peptíð 510 (ríkjandi og viðvarandi) og peptíð 511 (mikill merkistyrkur og minnkandi jákvæðni með tímanum), á SARS-CoV-2 S próteinbyggingu (PDB ID: 6ZGI) . Svæðin sem skarast á milli 2 epitópanna eru auðkennd með grænu; einstakar raðir eru merktar með rauðu og bláu.
Lengd sermisgreining auðkennir epitopur með háan merkistyrk en minnkandi hvarfvirkni með tímanum
Til viðbótar við valda mjög hvarfgjarna epitopes sem eru ábyrgir fyrir viðvarandi humoral ónæmissvörun sem nefnd eru hér að ofan, auðkenndum við og einkenndum hóp af 9 jákvæðum peptíðum sem sýndu sterkan bindistyrk (yfir meðaltal 1 SD af merkjastyrk allra prófaðra sýna) með tilhneiging til minnkandi viðbragða (jákvæðar breytingar á hlutfalli yfir 20%) meðal sermissýna frá COVID-19 sjúklingum með tímanum, í samræmi við almenna tilhneigingu til að minnka ónæmissvörun í húmor. Þessar epitopur eru staðsettar innan 3 ráðandi mótefnavaka: ORF1ab, S og N prótein (mynd 6, A; og sjá töflu E5 í netgeymslunni á www.jacionline.org). Að auki sást marktæk minnkun á merkjastyrk 4 peptíða frá ORF1ab (peptíð 784-IgG, 1617-IgM og 1986-IgM) og N (peptíð 2457-IgG) próteinum á milli sýna frá upphafi sýnatökutíma (dögum 10-60 eftir upphaf sjúkdóms) og síðari áfanga sýnatökutímapunkta (dögum 100-150 eða dögum 180-220 eftir upphaf einkenna) (mynd 6 , B). Athyglisvert er að þrátt fyrir að þau skarast að mestu hvort við annað, sýndu 2 peptíð af S prótein peptíðinu 510 (ríkjandi og viðvarandi; mynd 3, B) og peptíð 511 (mikill merkistyrkur og minnkandi jákvæður hlutfall með tímanum; mynd 6, A) mismunandi mynstur af hvarfgirni meðal sermissýna sjúklinga með tímanum. Raða- og staðsetningargreining benti til þess að peptíð 510 inniheldur S2' klofningsstað og viðbótar amínósýrur af 813-SKRS-816, en peptíð 511 er algjörlega innan FP með útbreiddan 828-LADA{{29 }} leifar sem eru að fullu útsettar á yfirborði trimeric S próteins (mynd 6, C). Þessar niðurstöður leiddu í ljós nýja eiginleika epitópa sem geta að lokum stuðlað að langvarandi og sterkara húmorsónæmi gegn SARS-CoV-2.
UMRÆÐA
Kerfisbundin lýsing á langtíma ónæmissvörun við SARS-CoV-2 sýkingu er mikilvæg fyrir þróun betri greiningar, árangursríkra meðferðaraðgerða og bóluefna. Í núverandi rannsókn gerðum við yfirgripsmikla lengdargreiningu á COVID-19 sjúklingum yfir 180 til 220 daga eftirfylgni, sem sýndi viðvarandi ónæmissvörun í húmor og virkjaða frumumyndun eftir veirusýkingu.
Mikilvægt er að með því að nýta sér peptíð-undirstaða örfylki sem spannar prótein SARS-CoV-2, afhjúpuðum við enn frekar hreyfihvörf myndefnisþekkingar og auðkenndum hóp ríkjandi epitópa sem geta miðlað langtíma húmorónæmi. Niðurstöðurnar sem við greinum frá hér varðandi langlífi ónæmissvörunar í húmor eftir SARS-CoV-2 sýkingu staðfesta nokkur áður birt gögn5,10,12,13,42 en lengja þau með því að framkvæma djúpa sermisgreiningu og frumuskimun með því að nota lengdarsermissýni frá einstaklingum með COVID-19 í gegnum prótein-breitt örfylkisaðferð. Í þessari rannsókn greindum við 4 ríkjandi epitopur (peptíð 318, 356, 510 og 530) innan SARS-CoV-2 S próteinsins sem var fær um að bregðast viðvarandi við meira en 80% COVID-19 sjúklinga sýni prófuð, allt að 180 til 220 dögum eftir upphaf einkenna. Peptíð 510 (S, aa 813-827), sem samanstendur af S2 klofningsstaðnum og FP S2 undireiningarinnar, hefur almennt verið auðkennt í fyrri rannsóknum á öðrum hópum.26,28,32-34 Virknigreiningar bentu til mótefna að miða á þetta svæði gæti sýnt takmarkaða hlutleysandi virkni gegn SARS-CoV-226,33 þrátt fyrir að vera mjög útsett á yfirborði S próteins (mynd 4, AC). Þegar um er að ræða peptíð 530 (S, aa 893-907), sem er staðsett á milli FP og fyrsta heptad endurtekningarsvæðis S2 undireiningarinnar, eru leifar yfirleitt grafnar inni í þrímera uppbyggingu S próteins, sem gerir það að verkum að erfitt að nálgast með öflugum hlutleysandi mótefnum gegn SARS-CoV-2 (mynd 4, AC). Að auki voru 2 S1-NTD-stýrð peptíð sem gætu miðlað langtíma mótefnasvörun SARS-CoV-2 einnig valin. Greining varðandi peptíðaröðina og staðsetningu gaf til kynna að leifar þessara 2 peptíða — peptíðs 318 (S, aa 45-59) og peptíðs 356 (S, aa 197-211) — eru í nálægð við greindar epitopur. með sýkingabætandi mótefnum23,25 en fyrir utan lykilstað mjög öflugra hlutleysandi mótefna sem miða á NTD í S1 undireiningunni, 16,19,43 sem bendir til möguleika á epitópaþekkingu með óhlutleysandi mótefnum gegn þessum 2 auðkenndu peptíðum. Til viðbótar við smáatriðin sem nefnd eru hér að ofan, benti músabólusetning með völdum peptíðum ennfremur á litla virkni þessara línulegu peptíða sem ekki eru viðtakabindandi lén til að framkalla öflug hlutleysandi mótefnasvörun (mynd 4, G). Samanlagt benda þessar upplýsingar til þess að ríkjandi línulegar epitopur sem miðla langtíma húmorísk ónæmissvörun við SARS-CoV-2 sýkingu valdi líklega mótefnum með enga eða takmarkaða hlutleysandi virkni. Meiri skilningur á myndefnislandslagi SARS-CoV-2 mótefna, sérstaklega S-próteinstýrðum epitópum, veitir nýja innsýn í starfræna krufningu mótefna, sem auðveldar enn frekar nýstárlega og skynsamlega hönnun bóluefna. Hlutleysandi mótefni veita vernd til að útrýma veirusýkingum, en óhlutleysandi mótefni geta gegnt gagnlegu, hlutlausu eða jafnvel skaðlegu hlutverki við úthreinsun veirunnar. Óhlutleysandi mótefni veita aukna vernd in vivo með ýmsum Fc-miðluðum verkunaraðgerðum í tengslum við mótefnaháða átfrumna og mótefnaháð frumueitrun. Aftur á móti hafa sumar rannsóknir lagt til möguleika á sjúkdómsvaldandi hlutverki óhlutleysandi mótefna í kransæðaveirusýkingu. Fyrri rannsóknir þar sem notaðar voru margar tegundir af bóluefnisframbjóðendum fyrir SARS-CoV og MERS-CoV sýndu aukna ónæmissjúkdómafræði í bólusettum smádýrum og ómannlegum prímötum eftir veiruáskorunina.24,44-50 Nýlega hafa rannsóknir á tveimur hópum greint frá því að óhlutleysandi mótefni sem miða að NTD af SARS-CoV-2 S próteini gátu aukið veirusýkingu in vitro með Fcg viðtaka-óháðum aðferðum,23,25 þó sýnt hafi verið fram á að óvirk gefin sýkingabætandi mótefni í dýralíkönum vernda gegn SARS -CoV-2 sýking in vivo. Með hliðsjón af umdeildu hlutverki mótefna við kransæðaveirusýkingu, er þörf á frekari rannsóknum til að sannreyna hugsanlegt hlutverk mótefna við að þekkja þessar ríkjandi og viðvarandi epitopur í baráttunni gegn veirusýkingu in vivo. Næsta stig skynsamlegrar bóluefnahönnunar fyrir SARS-CoV-2 gæti verið hugsað með því að kalla fram mjög öflug hlutleysandi mótefni og verndandi óhlutleysandi mótefni, ásamt því að draga úr kynningu á sýkingabætandi epitópum eða ónæmisráðandi epitopum sem hafa engin jákvæð áhrif. Þrátt fyrir að fjöldi fyrri rannsókna hafi eingöngu beinst að S próteini SARS-CoV-2 með það að markmiði að skilgreina mótefnavirkni varðandi hlutleysingu, gerðum við yfirgripsmikla kortlagningu próteóma-breitts epitópa og auðkenndum hóp af epitópum innan ORF1ab fjölpróteinsins sem var stöðugt viðurkennt af háu hlutfalli sermissýna sjúklinga með tímanum. Þrátt fyrir að þessi ORF1ab-stýrðu peptíð, sem dreift er á mörg prótein sem ekki eru uppbyggjandi, framkalli ef til vill virk mótefni sem miða á SARS-CoV-2 veiruna, gætu þau verið notuð sem greiningartæki til að hjálpa að greina náttúrulega sýkingu frá bólusetningu. Með auknum fjölda bóluefnaþega um allan heim standa núverandi sermipróf byggð á S próteini og N próteini frammi fyrir áskorunum sem skilvirk aðferð til að aðstoða sameindaprófanir til að greina SARS-CoV-2 sýkingu, og einnig fyrir ákvörðun ónæmisstöðu eftir veirusýkingu. Með því að nýta sér algengustu og viðvarandi hvarfgjörnu peptíðin innan ORF1ab meðal COVID-19-sýktra einstaklinga, verður sermisgreining á náttúrulegri sýkingu framkvæmd án þess að taka tillit til bólusetningarstöðu sem felur í sér S-prótein sem byggir á viðtakabindandi léni – byggt og óvirkjað veiru-undirstaða bóluefnisaðferðir. Framtíðarrannsóknir eru nauðsynlegar til að meta hvarfgirni, næmi og sérhæfni auðkenndra ORF1ab peptíða í stærri hópum sem samanstanda af bæði SARSCoV-2-sýktum einstaklingum og bóluefnisþegum. Að auki þarf frekara mat á uppgötvun skilvirkni með mörgum peptíð samsetningu aðferðum til að sigrast á lægra næmi peptíða samanborið við prótein í fullri lengd og mögulega krossviðbrögð meðal algengra kransæðaveiru manna. Helstu takmarkanir rannsóknarinnar okkar eru tiltölulega fá sýni úr litlum hópi sjúklinga og meirihluti þátttakenda upplifði óalvarlega COVID{106}} sjúkdóma. Þetta getur takmarkað sumar niðurstöður okkar með tilliti til jákvæðrar svörunartíðni og umfangs ónæmissvörunar, sem geta verið mismunandi eftir alvarleika sjúkdómsins. Engu að síður veita gögnin sem kynnt eru í þessari rannsókn dýrmæta innsýn í hreyfihvörf ónæmissvörunar með tímanum eftir SARS-CoV-2 sýkingu og eiginleika ríkjandi epitópa sem geta miðlað viðvarandi húmorsónæmi hjá einstaklingum með COVID-19. Saman veita þessar niðurstöður dýpri skilning á langlífi náttúrulegs ónæmis af völdum veirusýkingar og hafa víðtæk áhrif á nýstárlegar bólusetningaraðferðir og bættar greiningaraðferðir.
HEIMILDIR
1. Lu R, Zhao X, Li J, Niu P, Yang B, Wu H, o.fl. Erfðafræðileg einkenni og faraldsfræði 2019 nýrrar kransæðaveiru: áhrif á uppruna vírusa og viðtakabindingu. Lancet 2020;395:565-74.
2. Alþjóðaheilbrigðismálastofnunin (WHO). Mælaborð WHO coronavirus (COVID-19), 2021. Aðgengilegt á: https://COVID19.who.int/. Skoðað 30. nóvember 2021.
3. Wu Z, McGoogan JM. Einkenni og mikilvægur lærdómur af kransæðaveirusjúkdómnum 2019 (COVID-19) braust í Kína: samantekt á skýrslu um 72314 tilfelli frá kínversku miðstöðinni fyrir eftirlit og forvarnir gegn sjúkdómum. JAMA 2020;323:1239-42.
4. Rydyznski Moderbacher C, Ramirez SI, Dan JM, Grifoni A, Hastie KM, Weiskopf D, o.fl. Mótefnavakasértækt aðlögunarónæmi gegn SARS-CoV-2 í bráðri COVID-19 og tengslum við aldur og alvarleika sjúkdómsins. Cell 2020;183:996-1012.e19.
5. Wu J, Liang B, Chen C, Wang H, Fang Y, Shen S, et al. SARS-CoV-2 sýking veldur viðvarandi ónæmissvörun í húmor hjá sjúklingum á batavegi eftir COVID-19 með einkennum. Nat Commun 2021;12:1813.
6. Long QX, Liu BZ, Deng HJ, Wu GC, Deng K, Chen YK, o.fl. Mótefnasvörun við SARS-CoV-2 hjá sjúklingum með COVID-19. Nat Med 2020;26:845-8.
7. Sterlin D, Mathian A, Miyara M, Mohr A, Anna F, Claer L, o.fl. IgA ræður ríkjum í snemmtækri hlutleysandi mótefnasvörun við SARS-CoV-2. Sci Transl Med 2021;13: eabd2223.
8. Zhang J, Wu Q, Liu Z, Wang Q, Wu J, Hu Y, o.fl. Gaddasértæk T-ekkjuhjálparfruma í blóðrás og krosshlutleysandi mótefnasvörun hjá COVID-19- einstaklingum á batavegi. Nat Microbiol 2021;6:51-8.
9. Wang P, Liu L, Nair MS, Yin MT, Luo Y, Wang Q, o.fl. SARS-CoV-2 hlutleysandi mótefnasvörun er öflugri hjá sjúklingum með alvarlegan sjúkdóm. Emerg Microbes Infect 2020;9:2091-3.
10. Vanshylla K, Di Cristanziano V, Kleipass F, Dewald F, Schommers P, Gieselmann L, et al. Hreyfifræði og fylgni hlutleysandi mótefnasvörunar við SARSCoV-2 sýkingu í mönnum. Cell Host Microbe 2021;29:917-29.e4.
11. Xiang T, Liang B, Fang Y, Lu S, Li S, Wang H, o.fl. Minnkandi magn hlutleysandi mótefna gegn SARS-CoV-2 hjá COVID-19 sjúklingum á batavegi einu ári eftir að einkenni komu fram. Front Immunol 2021;12:708523.
12. Wang Z, Muecksch F, Schaefer-Babajew D, Finkin S, Viant C, Gaebler C, et al. Náttúrulega aukin hlutleysandi breidd gegn SARS-CoV-2 einu ári eftir sýkingu. Nature 2021;595:426-31.
13. Dan JM, Mateus J, Kato Y, Hastie KM, Yu ED, Faliti CE, o.fl. Ónæmisfræðilegt minni fyrir SARS-CoV-2 metið í allt að 8 mánuði eftir sýkingu. Vísindi 2021;371:eabf4063.
14. Sokal A, Chappert P, Barba-Spaeth G, Roeser A, Fourati S, Azzaoui I, et al. Þroska og viðvarandi and-SARS-CoV-2 minni B frumu svörun. Cell 2021; 184:1201-13.e14. 15. Ju B, Zhang Q, Ge J, Wang R, Sun J, Ge X, o.fl. Hlutleysandi mótefni úr mönnum framkölluð af SARS-CoV-2 sýkingu. Nature 2020;584:115-9.
16. Liu L, Wang P, Nair MS, Yu J, Rapp M, Wang Q, o.fl. Öflug hlutleysandi mótefni gegn mörgum epitopum á SARS-CoV-2 toppi. Nature 2020;584:450-6.
17. Zost SJ, Gilchuk P, Case JB, Binshtein E, Chen RE, Nkolola JP, et al. Virkilega hlutleysandi og verndandi mannamótefni gegn SARS-CoV-2. Náttúran 2020; 584:443-9.
18. Xu C, Wang Y, Liu C, Zhang C, Han W, Hong X, o.fl. Byggingarvirkni SARS-CoV-2 trimeric spike glýkópróteins í flóknu með ACE2 viðtaka sem kemur í ljós með cryo-EM. Sci Adv 2021;7:eabe5575.
19. McCallum M, De Marco A, Lempp FA, Tortorici MA, Pinto D, Walls AC, o.fl. Mótefnavakakortlagning á N-enda léni leiðir í ljós varnarsvæði fyrir SARSCoV-2. Cell 2021;184:2332-47.e16.
20. Sauer MM, Tortorici MA, Park YJ, Walls AC, Homad L, Acton OJ, o.fl. Uppbyggingargrundvöllur fyrir víðtæka hlutleysingu kransæðaveiru. Nat Struct Mol Biol 2021;28:478-86.
21. Tortorici MA, Beltramello M, Lempp FA, Pinto D, Dang HV, Rosen LE, o.fl. Ofursterk mannamótefni vernda gegn SARS-CoV-2 áskorun með mörgum aðferðum. Vísindi 2020;370:950-7.
22. Pinto D, Park YJ, Beltramello M, Walls AC, Tortorici MA, Bianchi S, et al. Krosshlutleysing SARS-CoV-2 með einstofna SARS-CoV mótefni úr mönnum. Nature 2020;583:290-5.
23. Liu Y, Soh WT, Kishikawa JI, Hirose M, Nakayama EE, Li S, o.fl. Sýkingabætandi síða á SARS-CoV-2 topppróteininu sem mótefni miðar á. Cell 2021; 184:3452-66.e18.
24. Liu L, Wei Q, Lin Q, Fang J, Wang H, Kwok H, et al. Anti-spike IgG veldur alvarlegum bráðum lungnaskaða með því að skekkja átfrumnaviðbrögð við bráða SARS-CoV sýkingu. JCI Insight 2019;4:e123158.
25. Li D, Edwards RJ, Manne K, Martinez DR, Sch€afer A, Alam SM, o.fl. In vitro og in vivo virkni SARS-CoV-2 sýkingar-aukandi og hlutleysandi mótefna. Cell 2021;184:4203-19.e32. 26. Poh CM, Carissimo G, Wang B, Amrun SN, Lee CY, Chee RS, o.fl. Tvær línulegar útlitsmyndir á SARS-CoV-2 topppróteininu kalla fram hlutleysandi mótefni hjá COVID-19 sjúklingum. Nat Commun 2020;11:2806.
27. Zhang BZ, Hu YF, Chen LL, Yau T, Tong YG, Hu JC, o.fl. Námuefni á topppróteini SARS-CoV-2 frá COVID-19 sjúklingum. Cell Res 2020;30:702-4.
28. Stoddard CI, Galloway J, Chu HY, Shipley MM, Sung K, Itell HL, o.fl. Epitope profiling sýnir bindandi einkenni SARS-CoV-2 ónæmissvörunar við náttúrulega sýkingu og krosshvarf við landlægum CoVs úr mönnum. Cell Rep 2021;35: 109164.
29. Shrock E, Fujimura E, Kula T, Timms RT, Lee IH, Leng Y, o.fl. Veirueiginleikaprófanir COVID-19 sjúklinga sýna víxlviðbrögð og fylgni um alvarleika. Vísindi 2020;370:eabd4250.
30. Zamecnik CR, Rajan JV, Yamauchi KA, Mann SA, Loudermilk RP, Sowa GM, o.fl. ReScan, margfeldisgreiningarleiðsla, sér um sermi úr mönnum fyrir SARS-CoV-2- 2 mótefnavaka. Cell Rep Med 2020;1:100123.
31. Haynes WA, Kamath K, Bozekowski J, Baum-Jones E, Campbell M, Casanovas Massana A, et al. Kortlagning á myndefni í háum upplausn og lýsing á SARS-CoV-2 mótefnum í stórum hópum einstaklinga með COVID-19. Commun Biol 2021;4:1317.
32. Li Y, Lai DY, Lei Q, Xu ZW, Wang F, Hou H, o.fl. Kerfisbundið mat á IgG svörun við SARS-CoV-2 toppprótínafleiddum peptíðum til að fylgjast með COVID-19 sjúklingum. Cell Mol Immunol 2021;18:621-31.
33. Li Y, Ma ML, Lei Q, Wang F, Hong W, Lai DY, o.fl. Línulegt samþættingarlandslag SARS-CoV-2 gaddapróteinsins smíðað úr 1.051 COVID-19 sjúklingi. Cell Rep 2021;34:108915.
34. Wang H, Wu X, Zhang X, Hou X, Liang T, Wang D, o.fl. SARS-CoV-2 Proteome örfylki til að kortleggja COVID-19 mótefnasamskipti við amínósýruupplausn. ACS Cent Sci 2020;6:2238-49.
35. Yi Z, Ling Y, Zhang X, Chen J, Hu K, Wang Y, o.fl. Virk kortlagning á línulegum B-frumumyndum SARS-CoV-2 í COVID-19 batahópi. Emerg Microbes Infect 2020;9:1988-96.
36. National Health Commission & National Administration of Traditional Chinese Medicine. Greining og meðferðarbókun fyrir nýrri lungnabólgu vegna kórónavírus (prufuútgáfa 7). Chin Med J (Engl) 2020;133:1087-95; https://doi.org/10.1097/ CM9.0000000000000819.
37. Li Y, Li CQ, Guo SJ, Guo W, Jiang HW, Li HC, o.fl. Lengdargreining sjálfsmótefna í sermi greinir lífmerki tengd skurðaðgerð í kirtilkrabbameini í lungum. EBioMedicine 2020;53:102674.
38. Zhao J, Yuan Q, Wang H, Liu W, Liao X, Su Y, o.fl. Mótefnasvörun við SARSCoV-2 hjá sjúklingum með nýjan kransæðasjúkdóm 2019. Clin Infect Dis 2020;71: 2027-34.
39. Lucas C, Wong P, Klein J, Castro TBR, Silva J, Sundaram M, et al. Lengdargreiningar sýna ónæmisfræðilega misskilning í alvarlegu COVID-19. Nature 2020;584: 463-9.
40. Moore JB, júní CH. Cytokine losunarheilkenni í alvarlegu COVID-19. Vísindi 2020;368:473-4.
41. Chen J, Malone B, Llewellyn E, Grasso M, Shelton PMM, Olinares PDB, et al. Byggingargrundvöllur fyrir Helicase-Polymerasa tengingu í SARS-CoV-2 afritunar-umritunarsamstæðunni. Cell 2020;182:1560-73.e13.
42. Wajnberg A, Amanat F, Firpo A, Altman DR, Bailey MJ, Mansour M, et al. Öflug hlutleysandi mótefni gegn SARS-CoV-2 sýkingu eru viðvarandi í marga mánuði. Vísindi 2020; 370:1227-30.
43. Chi X, Yan R, Zhang J, Zhang G, Zhang Y, Hao M, o.fl. Hlutleysandi mótefni úr mönnum binst N-enda léninu á topppróteini SARS-CoV-2. Vísindi 2020;369:650-5.
44. Tseng CT, Sbrana E, Iwata-Yoshikawa N, Newman PC, Garron T, Atmar RL, o.fl. Bólusetning með SARS kransæðavírusbóluefni leiðir til ónæmissjúkdóma í lungum við áskorun með SARS veirunni. PLoS One 2012;7:e35421.
45. Bolles M, Deming D, Long K, Agnihothram S, Whitmore A, Ferris M, et al. Tvöfalt óvirkjað kórónavírusbóluefni fyrir alvarlega bráða öndunarfæraheilkenni veitir ófullkomna vörn í músum og veldur aukinni eósínfíkn bólgueyðandi lungnasvörun við ögrun. J Virol 2011;85:12201-15.
46. Weingartl H, Czub M, Czub S, Neufeld J, Marszal P, Gren J, et al. Bólusetning með breyttri vaccinia veiru Ankara-undirstaða raðbrigða bóluefni gegn alvarlegu bráðu öndunarfæraheilkenni tengist aukinni lifrarbólgu í frettum. J Virol 2004;78:12672-6.
47. Yasui F, Kai C, Kitabatake M, Inoue S, Yoneda M, Yokochi S, o.fl. Fyrri bólusetning með alvarlegu bráðu öndunarfæraheilkenni (SARS) tengdu kórónaveirunni (SARS-CoV) núkleókapsíðpróteini veldur alvarlegri lungnabólgu í músum sem eru sýktar af SARS-CoV. J Immunol 2008;181:6337-48.
48. Deming D, Sheahan T, Heise M, Yount B, Davis N, Sims A, o.fl. Virkni bóluefnis hjá öldruðum músum sem þjást af raðbrigða SARS-CoV-berandi faraldri og afbrigðum af völdum dýrasjúkdóma. PLoS Med 2006;3:e525.
49. Wang Q, Zhang L, Kuwahara K, Li L, Liu Z, Li T, o.fl. Ónæmisráðandi SARS kransæðaveirur í mönnum vöktu bæði auka og hlutleysandi áhrif á sýkingu hjá prímötum sem ekki eru menn. ACS Infect Dis 2016;2: 361-76.
50. Agrawal AS, Tao X, Algaissi A, Garron T, Narayanan K, Peng BH, o.fl. Bólusetning með óvirkjuð öndunarfæraheilkenni kransæðabóluefni í Mið-Austurlöndum leiðir til ónæmissjúkdóma í lungum við áskorun með lifandi vírus. Hum Vaccin Immunother 2016;12:2351-6.