Kolmónoxíð (CO) dregur úr sykursýki nýrnakvilla (DN) á áhrifaríkan hátt
Mar 16, 2022
fyrir frekari upplýsingar:ali.ma@wecistanche.com
Hluti Ⅰ: Kolmónoxíð dregur úr öldrun í nýrnakvilla með sykursýki með því að bæta sjálfsát
Guibin Meil; Chunjie Jiang; Xueer Cheng; & á al.V
KYNNING
Sykursýki nýrnakvilli (DN) er einn algengasti og alvarlegasti örvandi sykursýkissjúkdómurinn. Tölfræðilega séð, 20 prósent -40 prósent sjúklinga með DN (Sykursýki nýrnakvilli) mun þróast yfir í lokastigs nýrnasjúkdóm (ESRD) með hraða sem er 14 sinnum hraðar en aðrir nýrnasjúkdómar. Að auki, aukin hætta á hjarta- og æðasjúkdómum af DN (Sykursýki nýrnakvilli)sjúklingar stuðla mjög að háum dánartíðni.2Flókin meingerð DN (Sykursýki nýrnakvilli)er enn óljóst með takmörkuðu meðferðaraðferð sem er í boði. Þess vegna er brýnt að bera kennsl á meingerð og meðferðarefni til að koma í veg fyrir versnandi tap á nýrnastarfsemi DN (Sykursýki nýrnakvilli).
Öldrunarfrumur, sem einkennast af varanlegu frumuhringsstoppi, hafa vakið mikla athygli sem „uppvakningafrumur“. Vegna ónæmis gegn frumudauða og áframhaldandi framleiðslu á senescence-associated secretory phenotype (SASP), eru öldrunarfrumur í auknum mæli viðurkenndar sem afgerandi orsök aldurstengdra sjúkdóma. Algengt hefur verið að sjá öldrunartengda nýrnastarfsemi í DN (Sykursýki nýrnakvilli)sjúklinga og tilraunalíkön, eins og STZ framkallaðar (sykursýki af tegund 1 (T1D)) og db/db (sykursýki af tegund 2 (T2D)) mýs. Mikilvægt er að úthreinsun p16-jákvæðra frumna úr öldruðum músum bætti gauklakölkun. Ennfremur létti p21 eða p27 út í T1D músum próteinmigu og gauklavíkkun. Þessar niðurstöður bentu til þess að öldrun gegni mikilvægu hlutverki í meingerð DN (Sykursýki nýrnakvilli). Hins vegar reglugerð um öldrun í DN (Sykursýki nýrnakvilli)er enn óljós.
Nýjar vísbendingar sýndu að sjálfsát, aðferð við niðurbrot innanfrumuinnihalds, er gildur öldrunarstillir." Þó að greint hafi verið frá því að sjálfsát stuðli að öflun öldrunarsvipgerðar, eru and-öldrunaráhrif sjálfsáts almennt viðurkennd. Tilkynnt var um sjálfsát sem lengdi lífaldur aldraðra músa og eldra flugna.10 Frekari rannsóknir sýndu að það að slá út Atg7 versnaði öldrun stofnfrumna.11 Það sem meira er um vert, eyðing Atg5 jók próteinmigu og bandvefssjúkdóm sem aðalárangur afnýruöldrun.12.13 Þannig geta lyf sem miða á sjálfsát til að draga úr öldrun verið ein vænlegasta aðferðin fyrir DN (Sykursýki nýrnakvilli)forvarnir og meðferð.
Kolmónoxíð (CO) sem myndast fyrir tilstilli niðurbrots á hemi með hemoxygenasasímum er innræn loftkennd sameind. Fjöldi rita leiddi í ljós bólgueyðandi, apoptotic og aðra verndandi eiginleika CO (Kolmónoxíð) þegar það er notað í litlum skömmtum.14 Þó CO (Kolmónoxíð)hefur verið vel rannsakað til að veita endurvörn gegn blóðþurrð-endurflæði eðanýruígræðslumýs,15 áhrif og verkunarháttur CO (Kolmónoxíð)á DN (Sykursýki nýrnakvilli)eru óljósar. Nýlega sýndu bókmenntir að CO (Kolmónoxíð)veitti frumuverndandi hlutverki sem sjálfsátsvirkjun í eyjum sem þjást af súrefnisskorti, 16 blóðsýkingarmúsum7 og öldruðum rottum með hjartastopp.18 Þar að auki er gjöf CO (Kolmónoxíð)dregur úr öldrun æðaþelsfrumna af völdum eiturverkana lyfja.1Þessar niðurstöður virðast ýta undir mögulega miðlun sjálfsáts sem CO2 miðar að. (Kolmónoxíð)til að bæta öldrun.
Þess vegna gerðum við tilgátu um að uppsöfnun öldrunarfrumna ínýruaf DN (Sykursýki nýrnakvilli)mýs gætu snúist við með CO (Kolmónoxíð)með virkjun sjálfsáts, sem bætir í kjölfarið skerta nýrnastarfsemi. Til að prófa tilgátu okkar og kanna undirliggjandi kerfi, beittum við meðferð á kolmónoxíðlosandi sameind -2 (CORM-2) in vivo (tilrauna DN (Sykursýki nýrnakvilli)músum) og in vitro (mesangial frumur úr rottum, pípulaga þekjufrumur úr mönnum og fræfrumur úr mönnum).
Nýrnastarfsemi: hvernig hefur kolmónoxíð (CO) áhrifSykursýki nýrnakvilli (DN)
Smelltu á Cistanches og Cistanche vörur fyrir nýrnasjúkdóma
EFNI OG AÐFERÐIR
2.1|Hönnun dýratilrauna
Átta vikna gamlar karlkyns C57BL/6J mýs (Charles River) voru hafðar í hefðbundinni ljós/myrkri hringrás (12:12 klst.) með venjulegu mataræði (ND) eða fituríku mataræði (HFD) (60 prósent orku frá fitu ) í 16 vikur.20 Í 17. viku rannsóknarinnar fengu mýs sem fengu HFD sprautur í kviðarholi af STZ (50 mg/kg) í 7 daga, en músum með ND var sprautað með burðarefni (sítratbuffi, pH=4 .5). Viku eftir inndælinguna var blóðsykursgildi skottstöng mæld tvisvar með 24 klukkustunda millibili. Næst, DN (Sykursýki nýrnakvilli)músum með glúkósagildi 16,9 mmól/L eða meira var skipt í þrjá hópa af handahófi, með 15 dýrum í hverjum hópi (DN (Sykursýki nýrnakvilli), DN (Sykursýki nýrnakvilli)plús CO og DN (Sykursýki nýrnakvilli)plús iCO): hópur kallaður DN-viðmiðunarhópur og aðrir hópar meðhöndlaðir með inndælingum í kviðarhol (tvisvar í viku í 16 vikur) af CORM-2 (3 mg/kg) eða ógildum CORM-2 sem var framleitt með losun CO (Kolmónoxíð)frá CORM-2 við stofuhita. Í lok tilraunatímabilsins voru mýs svæfðar, blóðsýnum var safnað með því að kljúfa augnkúlur og nýru safnað til greiningar. Öll dýr voru meðhöndluð í samræmi við leiðbeiningar um umhirðu og notkun tilraunadýra sem gefin voru út af bandarísku heilbrigðisstofnuninni og allar dýraaðferðir voru samþykktar af Tongji Medical College Council on Animals Care Committee.
2.2|Plasma lífefnafræðileg og vefjafræðileg greining
Safnað heilblóð og sermi voru geymd í -80 gráðu til greiningar. Blóðþvagefni köfnunarefni (BUN) var mælt með prófunarsettum sem fáanlegir eru í verslun (Jiancheng Bioengineering Institute, Kína). Eftir að nýru voru fjarlægð og yfirborðið þvegið með saltvatni. Nýrnavefurinn var litaður með hematoxylin-eosin og Masson's tri-chrome lit og að lokum skoðaður með smásjá.
2.3|Rafeindasmásjá
Litlir bitar af nýrnaberki voru festir í glútaraldehýði (2,5 prósent) og felldir inn í Araldite. Vefurinn var fjölliðaður skorinn í ofurþunna hluta (80-100 nm) með því að nota ultramicrotome (Leica EM UC7). Þunnu sneiðarnar á koparnetinu voru litaðar og skoðaðar undir rafeindasmásjá (Tecnai G220 TWIN).
2.4|Skurbylgjuteygjanleiki
Í lok tilraunatímabilsins voru mýsnar svæfðar og sendar á ultrasonic rannsóknarstofuna (Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan, Kína) fyrir klippibylgjuteygju með því að nota fljótlega umfang (Supersonic Imagine). Meðalstuðull Young (Eman) var notaður til að mæla stífleika í nýrum.
2,5|SA- -gal litun
Frosinnnýruhlutar og frumur sem sáð var í 6-brunnplötu voru notaðar til að greina SA- -gal virkni með viðskiptasetti (Beyotime Biotechnology) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Litið var á bláa blettinn sem uppsöfnunarsvæði öldrunarfrumna.
2.6|Rauntíma magn PCR fyrir mRNA tjáningu
Samkvæmt leiðbeiningunum (TaKaRa BIO INC) var RNA í nýrnavef dregið út með því að nota TRlzol hvarfefnið. Tjáning mRNA var magngreind með TB grænum gRT-PCR setti og sérstökum primers (tafla 1). Hver genatjáning var metin með eigin stöðluðu ferli og mRNA stig Gapdh var magnmælt sem innræn stjórn.
2.7|Western blotting og ónæmisútfelling
Nýrnavefur eða fruma var gerð einsleit og greind, síðan magngreind með BCA próteinprófunarbúnaði (Beyotime líftækni). Próteinið var aðskilið og síðan flutt yfir á PVDF himnurnar (Millipore). Eftir að hafa verið stíflað voru himnurnar ræktaðar yfir nótt með frummótefnum (tafla 2). Eftir þvott voru himnurnar ræktaðar með samsvarandi aukamótefni. Þéttleiki hvers marksviðs var magnmældur með Image Pro-Plus 6.0 hugbúnaði og staðlað í GAPDH sem optískan þéttleika. Allar sýnastærðir dýra eða frumna voru stærri en eða jöfn 3.
Lýsat nýrnavefs var skilið í skilvindu (14 000 g við 4 gráður C í 30 mínútur), og flotið var forhreinsað með 20 μL prótein A/G agarósa perlum í 2 klukkustundir og ræktað yfir nótt með Bcl{{6} } eða mús lgG mótefni. Ónæmisútfellingar voru þvegnar, aftur sviflausnar, soðnar og greindar með Western blot með því að nota anti-Beclin-1 (Cell Signaling Technology) og and-Bcl-2 (Proteintech) eins og lýst er áðan. .21
Tafla 1 Rauntíma megindlegar PCR grunnraðir
2.8|Ónæmisflúrljómun
Nýrnavefurinn sem var felldur inn í OCT miðil var skorinn í 6-8 μm þykka frosna hluta. Eftir blokkun með 10 prósent venjulegu geitasermi voru hlutar ræktaðir yfir nótt með frummótefnum. Daginn eftir var vefurinn merktur með auka mótefnum. Eftir að hafa verið skolað með PBS voru skyggnurnar ræktaðar með DAPI og í kjölfarið ljósmyndaðar undir flúrljómandi smásjá (Olympus).
2.9|Frumuræktun
HBZY-1 var viðhaldið í DMEM(Gibco) og HK-2 var haldið í DMEM/F12 (Gibco) ásamt 10 prósentum nautgripasermi, 100 U mL-1 penicillín/streptomycin (Gibco) ) við 37 gráður í rakaðri andrúmslofti sem inniheldur 95 prósent loft og 5 prósent CO (Kolmónoxíð). HPC veitt af prófessor Chun Zhang frá Huazhong University of Science and Technology var viðhaldið í RPMI 1640 (Gibco). HPC var fyrst fjölgað við 33 gráður og síðan flutt yfir í 37 gráður til aðgreiningar áður en hægt er að nota það í tilraunum eins og áður var lýst.22
2.10|ELIS próf
Eftir að HPC var meðhöndlað á annan hátt og ræktað í 5 daga, var helmingur flotans tekinn út til greiningar (losað VEGF). Frumurnar voru brotnar með því að nota ultrasonic cell crusher (SONICS), sem gerir próteinunum kleift að losa algjörlega út í ofanvatnið sem eftir er (heildar VEGF). Síðan var styrkur VEGF mældur með því að nota ELISA sett í sölu (MEIMIAN). Hlutfall losaðs VEGF af heildar VEGF var VEGF lekahraðinn.
2.11|Gen þöggun
Niðurlæging á Atg7 í HK-2 frumum var náð með því að nota öfuga siRNA transfection aðferð sem framkvæmd var í sex brunna plötum. Þegar þær höfðu vaxið upp í 70 prósent samruna, voru frumur umbreyttar með siRNA eða spæna siRNA(RiboBio) með því að nota Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) samkvæmt samskiptareglum framleiðanda. Eftir 48 klst. transfection, var transfection skilvirkni staðfest með Western blot til að sannreyna röðina (ACTCGAGTCTTTCAAGACT).
TAFLA 2 Allir mótefnalistar
2.12|Fylgstu með sjálfsskaðaflæðinu
Plasmíðin sem innihalda lentiveiruferjuna RFP-GFP-LC3(Genecopoeia) voru smíðuð og síðan pakkað í HEK293T frumur samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda (GeneCopoeia). Veirufrumvökvanum var safnað til að smita HK-2 og HBZY-1 frumur til að fylgjast með flæði sjálfsáts. Þessi rannsakandi gæti greint sjálfsátfrumna (GFP*/RFPt, gula punkta) og sjálfslitsóma (GFP-/RFPt, rauða punkta).
2.13|Gagnagreining
Gögnin voru greind með Graph Pad Prism8 og sýnd sem meðaltal ± SEM. Mismunur á milli hópanna var ákvarðaður með einhliða dreifigreiningu. Mikilvægi var sett sem P<>
NIÐURSTÖÐUR
3.1|CO (Kolmónoxíð)veiklað nýrnabilun á DN (Sykursýki nýrnakvilli)mýs
Til að kanna endurverndun CO (Kolmónoxíð), DN (Sykursýki nýrnakvilli)líkanið var framkallað af HFD og STZ (Mynd 1A). Eftir 34 vikna tilraunafóður, blóðsykur, þyngd,nýru-líkamshlutfall, kreatínín og BUN voru mæld. Í DN (Sykursýki nýrnakvilli)hópur,nýru-líkamshlutfall, kreatínín og BUN voru aukin, en meðferð á CO (Kolmónoxíð)snúið frávik (tafla 3). Í samræmi við nýrnaformgerð DN (Sykursýki nýrnakvilli)mýs voru afar truflaðar með þekjufrumum afþekju, hrörnun í lofttæmi, gaukla Bowman rúm stækkun og mesangial stækkun (Mynd 1B). Ennfremur sýndi öfgabygging glomerulus þykknun grunnhimnu og útrýmingu á fótfrumnafótum (Mynd 1B). Þvert á móti, CO (Kolmónoxíð)meðferð staðlað umfram neikvæðar formfræðilegar breytingar (Mynd 1B). Að auki jukust fibrillar kollagen í nýrnaberki (Mynd 1C) og nýrnahörku, mæld með skurðbylgjuteygju, bæði í DN (Sykursýki nýrnakvilli)mýs (Mynd 1D). Eins og búist var við, CO (Kolmónoxíð)verulega bætt nýrnabilun á DN (Sykursýki nýrnakvilli)þar á meðal bandvefssjúkdómur.
MYND 1 CO (Kolmónoxíð)veiklað nýrnabilun á DN (Sykursýki nýrnakvilli)mýs framkallaðar af HFD og STZ.
Skema um tilraunahönnun. B, Fulltrúar myndir afnýruvefur litaður með H&E (kvarðastöng: 50 μm), PAS (kvarðaslá: 10 μm) og útgerðarbreytingar á gauklaformgerð metnar með rafeindasmásjá (kvarðastika: 1 μm).
Og tölfræðileg gögn um hlutfall PAS-jákvæðra við gauklasvæði, GBM þykkt, breidd fótferils og fjölda fótferla á mm af GBM (n=3).
C, dæmigerðar myndir af nýrnavef sem litaður er með Masson's trichrome og tölfræðilegum upplýsingum um jákvætt svæði (n=3). Mælikvarðarstöng: 25 μm.
D, Shear wave elastography greint með sono umfangi og magngreiningu á stuðli Young sem gráðu nýrnatrefjunar (n=7). *P <.05, **p=""><.01, ***p=""><>
Tafla 3 Umbrotsgögn músa í öllum hópum
3.2|CO (Kolmónoxíð)létta öldrun í DN (Sykursýki nýrnakvilli)mýs og nýrnafrumur sem þjást af háum glúkósa
Öldrunarárátta er í auknum mæli talin helsta orsök bandvefsmyndunar í nýrum, einkenni öldrunar.23 Að kanna öldrunaráhrif CO (Kolmónoxíð), við gerðum SA- -gal litun á nýru. Auknar SA- -gal* og p16* frumur söfnuðust upp um nýrnaberki í DN (Sykursýki nýrnakvilli)hópur, en stjórn og CO (Kolmónoxíð)-meðferðarnýru sýndu einstaka jákvæðni (Mynd 2A, B). Frá líffærafræðilegri stöðu nýrna greindist jákvæð tjáning p16 í mesangial frumum (gul ör), nýrnapípulaga þekjufrumum (rauð ör) og fræfrumum (svört ör). Öldrunaráráttur sem varð í DN (Sykursýki nýrnakvilli)mýs var frekar studd af augljósri uppstjórnun á klassískum öldrunartengdum próteinum, þar á meðal p53, p21 og p16 (mynd 2C). Aftur á móti er gjöf CO (Kolmónoxíð)létti á ofangreindum öldruðum frammistöðu.
Tilkynnt var um öldrunartengd seytingarsvipgerð, sérstakt seyti öldrunarfrumna, trufla örumhverfið og auðvelda framgang sjúkdómsins.2 Þess vegna voru mRNA-gildi sumra dæmigerðra SASP mælt, þar á meðal I-1, Il-6 , Tgf- , Tnf-a, Vegf, Icam-1 og Vcam-1. Niðurstöður sýndu að óeðlilegri aukningu þessa SASP var afstýrt af CO (Kolmónoxíð)inngrip (Mynd 2D).
Í ljósi bælandi öldrunar CO (Kolmónoxíð)in vivo, könnum við frekar and-öldrunaráhrif þess in vitro líkan af 3 tegundum nýrnafrumna, þar á meðal rottufrumur (HBZY-1), pípulaga þekjufrumum úr mönnum (HK-2) og fræfrumum úr mönnum (HPC). Eftir útsetningu fyrir háum glúkósa (HG,35 mmól/L), sýndu 3 tegundir frumna aukningu á SA- -gal með stærri formgerð á degi 7 (Mynd 2E), degi 5 og degi 14 (Mynd 2l) , í sömu röð. Athyglisvert er að aukning á LDH lekahraða HBZY-1 benti til þess að HG framkallaði öldrun og skemmdir á frumum (Mynd 2F). Til að kanna viðeigandi skammt af CO (Kolmónoxíð), HBZY-1 var meðhöndlað með mismunandi styrk CORM-2. Með því að mæla lekahraða LDH (Mynd 2F), EdU-jákvæðra frumna (Mynd 2G) og SA- -gal (Mynd 2H), komumst við að því að styrkur 1 μmól/L hafði betri inngripsáhrif. Í samræmi, CO (Kolmónoxíð)(1μmól/L) minnkaði einnig jákvæða tjáningu SA- -gal í HK-2 og HPC (Mynd 2). Samanlagt leiddu þessar niðurstöður í ljós að CO (Kolmónoxíð)gegnt ótrúlegu hlutverki gegn öldrun bæði in vivo og in vitro.
MYND 2 CO (Kolmónoxíð)létta öldrun í DN (Sykursýki nýrnakvilli)mýs og nýrnafrumur ögraðar af HG.
A, Fulltrúi mynd afnýruvefur litaður með SA- -gal og tölfræðileg gögn um jákvætt svæði (n=3). Gaukurinn var auðkenndur með rauðum punktahring. Mælikvarðarstöng: 25 μm.
B, Jákvæð tjáning p16 ínýruvar sýnt með ónæmisvefjafræði (n=3). Gulu örvarnar gáfu til kynna mesangial frumur, rauðar gáfu til kynna nýrnapípulaga þekjufrumur og svartar örvar gáfu til kynna fræfrumur. Mælikvarðarstöng: 25 μm.
C, Próteinmagn öldrunarmerkja ákvarðað með ónæmisblettum og þéttleikagreiningu á p53, p21 og p16 (n=3).
D, falt breytingar á tjáningarstigum SASP mRNA (Il-1, Il-6, Tgf-, Tnf-, Vegf, Icam-1 og Vcam-1) (n Stærra en eða jafnt og 4).
E, HBZY{{0}} útsett fyrir NG (5 mmól/L) eða HG (35 mmól/L) var litað með SA- -gal frá degi 0 til 7. dags og tölfræðilegum gögnum um SA - -gal-jákvæðar frumur við 5 og 7 d (n=3). Mælikvarðarstöng: 50 μm.
F, LDH losunarhraði HBZY{{0}} meðhöndluð með mismunandi styrk CORM-2 (0,1, 1, 10 og 100 μmól/L) (n=6).
G, Hlutfall EdU-jákvæðra HBZY-1 sem er meðhöndlað með mismunandi styrk CORM-2 (n=3).
H, SA- -gal litun í HBZY-1 meðhöndluð með mismunandi styrk CORM-2 (n=3). Mælikvarðarstöng: 50 μm.
I, fulltrúamyndir af SA- -gal af HPC (dagur 5) og HK-2 (dagur 14) með gjöf CORM-2 (1μmól/L) og tölfræðilegum gögnum (n { {6}}). Mælikvarðarstöng: 50 μm. *P <.05, **p=""><.01, ***p=""><>
3.3|CO (Kolmónoxíð)virkjað sjálfsát og bætt sjálfsátflæði in vivo og in vitro
Vaxandi hópur rannsókna leiddi í ljós neikvæða stjórnun sjálfsáts til öldrunar og CO (Kolmónoxíð)hefur verið litið á sem sjálfvirka virkja. Til að kanna áhrif COon autophagy í DN (Sykursýki nýrnakvilli), röð af sjálfsátatengdum próteinum var mæld. Samanborið við sykursýkismýs, CO (Kolmónoxíð)meðferð jók marktækt tjáningu á sjálfsát upphaf próteins Beclin -1(Mynd 3A) og minnkaði sjálfsát hvarfefni p62 (Mynd 3B), en minnkaði hlutfall LC3Il á móti LC3l, merki sjálfsáts (Mynd 3C). Fyrri vísbendingar bentu til þess að þessi mótsögn gæti stafað af stífluðu sjálfsátflæði af völdum truflunar á lýsósóminu.25Niðurstöður sýndu að lýsósómtengd prótein Cathepsin B og LAMP2 voru aukin í DN (Sykursýki nýrnakvilli)plús COgroup miðað við DN (Sykursýki nýrnakvilli)hópur (mynd 3D). Þar að auki studdi samstaðsetningargreining LC3 puncta og LAMP2 að CO (Kolmónoxíð)dró verulega úr uppsöfnun autophagosomes og jók fjölda autolysosomes (Mynd 3E).
Í samræmi við það fannst truflun á sjálfsát og lýsósóm in vitro, eins og sýnt er af próteinimagni og lýsósómrannsóknum (Mynd 3F, G). Ennfremur voru HK-2 og HBZY-1 færðar með lentivirus RFP-GFP-LC3 til að fylgjast með flæði sjálfsáts. Við ástand HG jókst punktur sjálfsfagósóma og sjálfslitsfrumum fækkaði í HBZY-1 og HK-2, sem var ekki breytt frekar með klórókín (CQ) meðferð. CO (Kolmónoxíð)fjölgaði sjálfsfrumum og fækkaði sjálfsátfrumum, sem var hamlað með því að bæta við CQ (Mynd 3H, I). Í stuttu máli sýndu þessar niðurstöður að CO (Kolmónoxíð)virkjað sjálfsát og bætt sjálfsátflæði in vivo og in vitro.
3.4|CO (Kolmónoxíð)létt á öldrun með því að bæta sjálfsát in vitro
Til að kanna frekar hlutverk sjálfsáfalls í and-öldrunarkerfi CO (Kolmónoxíð), var samsetning CORM-2 og sjálfsátshemla notuð í nýrnafrumum sem verða fyrir HG. Tvær gerðir af hemlum, wortmannin(WORT) til að hindra upphaf sjálfsátsáts og CQ til að þvinga aftur sjálfsátflæði, sneru í raun við lækkun SA- -gal af CO (Kolmónoxíð)í 3 tegundum nýrnafrumna (Mynd 4A). Í samræmi, CO (Kolmónoxíð)jók verulega hlutfall EdU frumna, sem var hamlað af tveimur hemlum í HBZY-1(Mynd 4B) og HK-2(Mynd 4C). Í HBZY-1, áhrifin sem draga úr öldrun af CO (Kolmónoxíð), sýnd með minni tjáningu p53, p21 og p16, var fjarverandi eftir að sjálfsátshemlum var bætt við (Mynd 4D). Á sama hátt sýndi ónæmisflúrljómunargreining að sjálfsátshemlar hindra fækkun p53- og p16-jákvæðra frumna með CO (Kolmónoxíð)í HK-2 (Mynd 4印) og HPC (Mynd 4F). Ennfremur hindraði þögn Atg7 (Mynd 4G) verndandi áhrif CO (Kolmónoxíð), sýnd með auknum SA- -galtfrumum og minnkaðri EdU*frumum í HK-2(Mynd 4H). Fyrrnefndar niðurstöður bentu til þess að CO (Kolmónoxíð)bæla öldrun með því að bæta sjálfsát.
3,5|Virkjað sjálfsát getur dregið úr SASP í DN (Sykursýki nýrnakvilli)mýs
Við könnuðum frekar hið sérstaka samband milli sjálfsáfalls og öldrunar. Rannsóknir sýndu að sjálfsát dregur úr öldrun með því að sértækt niðurbrot GATA4, sem stjórnaði NF-KB á jákvæðan hátt til að losa SASP.26Í samræmi við þetta var mikið magn af SASP þróað í DN (Sykursýki nýrnakvilli)hóp (Mynd 2D), og tjáning og kjarnaflutningur á p65 var aukin (Mynd 5A). Hins vegar hélst próteinmagn GATA4 óbreytt, sem bendir til þess að GATA4 kunni ekki að miðla myndun SASP í háu glúkósaástandi (Mynd 5B). Auk þess leiddu rannsóknir í ljós að TOR-autophagy spatial coupling compartment (TASCC) sem myndast við samsetningu mTOR, seint autophagosome og lysosome flýtti fyrir öldrun með því að auka seytingu SASP.27Niðurstöður ónæmisflúrljómunar sýndu hins vegar að það var engin þrefaldur sambyggður mTOR, LC3 , og LAMP2, sem gefur til kynna misheppnaða myndun TASCC í nýrum (Mynd 5C).
Eins og við vitum, virkar autophagy í niðurbroti frumuefnaþátta, sem er aðallega framkvæmt af sjálfsfrumum sem myndast við samruna sjálfsfrumna og lýsósóms. Tilkynnt hefur verið um að sjálfsáhrif dragi úr seytingu IL-1 með því að brjóta niður pro-IL-1 í LPS-örvuðum átfrumum.28 Athyglisvert er að við komumst að því að IL-1 (grænt) var samstaðsett með LC3 puncta (rautt) og LAMP2 (bleikt) í CON og DN (Sykursýki nýrnakvilli)auk CO (Kolmónoxíð)hópa (Mynd 5D, rauða örin), sem gefur til kynna gatnamótin milli SASP og niðurbrots sjálfsáts. Á sama hátt, í samanburði við DN (Sykursýki nýrnakvilli)hópur, önnur frumufrumur SASP, þar á meðal IL-6, TGF- og VEGF, höfðu einnig hóflega en augljósa samstaðsetningu með LC3 puncta og LAMP2 í CON og DN plús CO (Kolmónoxíð)hópa (Mynd 5E-G, rauða örin), þar á meðal VEGF sam-staðsetur með sjálflýsósum augljóslegast (Mynd 5G). Hins vegar skarast gulur litun í DN (Sykursýki nýrnakvilli)hópurinn sýndi að SASP var aðeins staðsett samhliða LC3 puncta (Mynd 5D-G, hvíta örin). Ennfremur var próteinmagn VEGF mælt í HPC eftir að hafa bætt við sjálfsátörvum (ABT737 og rapamycin) eða CORM-2. Þrátt fyrir að enginn marktækur munur hafi verið á heildarpróteinmagni VEGF (Mynd 5H), er tilvist bæði sjálfsátsörva og CO (Kolmónoxíð)dró verulega úr losun VEGF í HPC framkallað af HG (Mynd 5I, J). Samanlagt bentu þessar niðurstöður til þess að sumt SASP sé brotið niður með sjálfsát.
MYND 4 CO (Kolmónoxíð)létt á öldrun með því að bæta sjálfsát in vitro. HBZY-1, HPC og HK-2 voru meðhöndlaðir með HG, CORM-2 og sjálfsátshemlum (WORT: 200nM og CQ: 5 μmól/L).
A, Litunar og jákvæðar frumur SA- -gal í 3 tegundum nýrnafrumna (n=3). Mælikvarðarstöng: 25 μm.
B, C, frumufjölgun metin með EdU litun í HBZY-1 og HK-2 og magngreining á hlutfalli jákvæðra frumna (n=3). Mælikvarðarstöng: 50 μm.
D, Tjáning öldrunartengds próteins (p53, p16 og p21) í HBZY-1 (n=5).
E, F, dæmigerðar ónæmisflúrljómunarmyndir af p53 og p16 og magngreining á hlutfalli jákvæðra frumna í HK-2 og HPC (n=3). Mælikvarðarstöng: 50 μm.
G, Prótein tjáningarstig Atg7 í HK-2 þaggað niður með siRNA (þrjár raðir).
H, táknrænar myndir af SA- -gal (Kvarðarstiku: 50 μm) og EdU litun (Mvarðarstika: 25 μm), og magngreining á hlutfalli jákvæðra frumna í HK-2 (n {{4 }}). *P <.05, **p=""><.01, ***p=""><>
3.6|CO (Kolmónoxíð)virkjaði sjálfsáhrif að hluta til með því að sundra Beclin-1-Bcl-2 flókið
Tilkynnt hefur verið um sundrun Beclin-1-Bcl-2 flókins til að bæta sjálfsát og koma í veg fyrir ótímabæra öldrun, þar með talið aldurstengdar nýrnabreytingar.21 Að auki, CO (Kolmónoxíð)virkjuð sjálfsát í gegnum Beclin-1 í blóðsýkingarmúsunum.1/Þess vegna könnuðum við hvort sundrun á flóknu miðlaði virkjun sjálfsáfalls með CO (Kolmónoxíð). Niðurstöður samónæmisútfellingar sýndu að CO (Kolmónoxíð)minnkað Beclin-1-Bcl-2 binding í DN (Sykursýki nýrnakvilli) mýs (Mynd 6A). Ennfremur, samanborið við meðferð HG og CO (Kolmónoxíð), sameinuð notkun HG, CO (Kolmónoxíð), og Beclin-1-Bcl-2 flókið sundrunarefni ABT737 virkjaði frekar sjálfsáhrif HBZY-1, eins og sést af óbreyttu LAMP2, lækkaði p62 og jók LC3ll/LC3l hlutfallið (mynd 6B). Þar að auki sýndu niðurstöðurnar að samsett notkun CO (Kolmónoxíð)og ABT737 lækkuðu tjáningu p53,p21 og p16 enn frekar í HBZY-1 (Mynd 6C) og minnkuðu SA- -galtfrumu í HBZY-1, HK{{9} } og HPC (Mynd 6D), sem gefur til kynna að ABT737 hafi aukið öldrunaráhrif CO (Kolmónoxíð). Þessar athuganir bentu til þess að CO (Kolmónoxíð)gæti virkjað sjálfsáhrif með því að sundra Beclin-1-Bcl-2 flókið til að draga úr öldrun.
