JAK hemill hindrar COVID-19-cýtókín-framkallað JAK-STAT-APOL1 boð í gauklafrumum og frumukvilla í nýrum manna Ⅱ

Niðurstöður okkar breyta núverandi hugmyndafræði af völdum interferónsAPOL1-nýrnakvilli. Nokkur dæmi íhvaða hátt interferón ástand olli fallandi gauklakvilla hjá burðarfólki með áhættuAPOL1arfgerðleiddi til hugmyndafræði þar sem forréttindi interferóna sem helstu kveikjur APOL1-miðluðuglomerulopathy (31, 36, 37). Þessi hugmyndafræði styrktist enn frekar af þeirri staðreynd að interferón alfa, beta,og gamma framkallaðAPOL1tjáning í ræktuðum fræfrumu- og æðaþelsfrumulínum (22). Hins vegar,þessari erkigerð er mótmælt af þeirri athugun að interferón eru ekki alltaf hækkuð í sermisjúklingar meðCOVID-19 sýkingog COVAN, en önnur frumuefni þar á meðal IL-6, IL-1 , og IL-18eru aukin (4, 17, 18). Í núverandi rannsókn sýndum við fram á að jafnvel án interferóna,þessi cýtókín sem ekki eru interferón ollu, hver fyrir sig og sameiginlega, sterkAPOL1tjáning í mönnumpodocytes og GECs en undirstrika einnig áður ómetin samvirkni. Með því að sýna fram áað JAK-STAT merkjasendingar séu aðalmiðlari þessara samsettu cýtókínáhrifa, sýna niðurstöður okkartrúverðug skýring á því hvernig COVID-19 frumustormurinn knýr áframAPOL1svipbrigði og hið háatíðni hrynjandi glomerulopathy hjá sjúklingum með áhættuafbrigðiAPOL1ogCOVID-19sýkingu. Þessar niðurstöður geta haft áhrif á annaðAPOL1-miðlaði nýrnakvilla. 

Fyrir frekari upplýsingar vinsamlegast hafðu samband við okkur á:

Netfang:wallence.suen@wecistanche.com

Sími/Whatsapp: +86 15292862950

Þó að niðurstöður okkar sýni þaðCOVID-19-örvaði frumuefninægir til að framkallaAPOL1tjáninguog valda tapi ánýrna örlífrænar fræfrumur, útiloka þau ekki þann möguleika að SAR-CoV-2 getur einnig sýkt nýrnafrumur beint eins og nýlega var greint frá (38, 39). Hins vegar, SARs-CoV-2í nýrnavef manna hefur aðeins verið sýnt fram á krufningarsýni þar sem ruglingurinnEkki var hægt að útiloka framlag sjálfgreiningar vefja (3, 4, 15, 16). Flestar skýrslur um nýrnasýniaf sjúklingum með COVAN hefur ekki tekist að greina SARs-CoV-2 vírusinn þrátt fyrir að nota viðkvæmar aðferðir (3, 4),þar á meðal tvö af níu tilfellum í núverandi rannsókn sem voru prófuð með ónæmisvefjaefnafræði og ísitu blending.

Með því að sýna fram á frumufrumukvilla af völdum frumufrumuefna, vék nýrna örlíffæralíkanið okkar fránýlega birtnýra lífrænt efnilíkan af APOL1-miðluðum nýrnasjúkdómi eftir Liu o.flmynduðu nýralífræn efni úr CRISPR-ritstýrðum iPSCs frá gjafa sem ekki er afrískur þar sem G0APOL1samsætum var breytt í G1 samsætur en á G0 erfðafræðilegum bakgrunni. Meðan interferón gamma-örvað erAPOL1tjáningu í líffærum þeirra, olli það ekki frumueiturhrifum (40). Skortur á frumueitrun í þeirranýra lífrænt efnilíkan gæti útskýrt minna eitraðan erfðafræðilegan bakgrunn sem G1 stökkbreytingar eru ávoru lagðar ofan á. Það er vitað að frumueiturhrif afAPOL1haplotype hefur áhrif á erfðafræði hennarbakgrunnur (41). Thenýra örlífræn efnií þessari rannsókn var búið til úr óbreyttum iPSCsaf Afríku-Ameríkubera af G1G2 arfgerðinni. Varðveisla innfæddrar erfðafræðilegrar haplotype geturhafa stuðlað að APOL1-tengdum frumueitrun sem sést í okkarörlífræn frumur í nýrum. 

Ennfremur, öfugt við uppstýrða APOL1 prótein tjáningu sem við greinum frá hér, nýleg rannsóknfann engan mun áAPOL1mRNA gildi í nýrnasýni eins sjúklings með COVAN miðað viðheilbrigt viðmið (26). Þessi ágreiningur í niðurstöðum okkar kann að skýrast af tímabundnu eðliAPOL1mRNA miðað við prótein, sérstaklega þegar vefjasýni voru tekin nokkrum vikum eftir upphafgreining á COVID-19 sýkingu þegar bráðaáhrif COVID-19-ollu frumuvakastormi ogsamsvarandi mRNA tjáningarsnið gæti hafa dreifst. Það má hugsa sér að því lengra sem maður erfrá cýtókínstormnum-19-völdum COVID, því veikari eru bráðafasa hvarfefnin neðan viðcýtókínviðtaka verða, þar á meðal fosfórýleruð STAT prótein ogAPOL1mRNA. Niðurstöður okkarbenda til þess að framkallað APOL1 prótein haldist lengurAPOL1mRNA og fosfórýleruð STAT.

Þessi rannsókn hefur þrjár megin klínískar afleiðingar. Einn, þeir undirstrika nauðsyn þess að arfgerð Black eðaRómönsku einstaklingar reyndust vera með hrunheklakvilla í tengslum við virkan eða nýlegan COVID-19sýkingu. Hins vegar, efnýrna vefjasýnier ekki framkvæmanlegt eða mögulegt,APOL1arfgerð svarts eðaRómönsku COVID-19-sýktir einstaklingar með nýja eða versnandi próteinmigu og AKI eru einnig líklegarhár ávöxtun. Í öðru lagi, vegna þess að mörg COVID-19-örvuð frumuvaka virkja JAK-STAT óþarfaleið til að framkallaAPOL1tjáningu, lækningaaðferð sem byggir á sértækri fjarlægingu eðaÓlíklegt er að hömlun á einhverju frumtókíni skili árangri við að koma í veg fyrir eða meðhöndla COVAN. Eins og er,baricitinib er aðeins leyft til notkunar samkvæmt neyðarleyfi til að meðhöndla COVID-19þarfnast viðbótar súrefnis. Þess vegna þarf alvarlega möguleika þess sem meðferð við COVANtillitssemi, sérstaklega fyrir svarta og rómönsku flutningsaðila með mikla áhættuAPOL1arfgerðir sem hafaCOVID-19 sýking. Að lokum, byggt á sönnunargögnum um að interferónskortur tengist alvarlegumCOVID-19 sýkingu var lagt til að interferón yrði gefið sem meðferð við COVID-19. Hjáþegar þetta er skrifað, samkvæmt ClinicalTrials.gov, þrjátíu og sex klínískar rannsóknir á interferoni sem meðferð íCOVID-19 eru annað hvort í gangi eða lokið. Öfugt við rökin á bak við þessar klínísku rannsóknir, okkarleiðir til varúðar gegn gjöf interferóna sem meðferð við COVID-19 sýkingu hjá burðarberummikil áhættaAPOL1arfgerð vegna þess að interferón gætu aukið tjáningu sjúkdómsvaldandiAPOL1innthenýru og botnfall COVAN. 

Rannsóknin okkar hefur nokkrar takmarkanir. COVAN tilvikaröðin okkar með níu vefjasýni sem hafa sannað hrunglomerulopathy tilfelli er tiltölulega lítið úrtak og gæti hafa vanmetið tengsliná milli áhættuarfgerðar og COVAN eða verið háð sýnatökuhlutdrægni. Logistic áskorunin afað fá nýrnasýni úr sjúklingum með virka COVID-19 sýkingu í bráðaþjónustu takmarkartíðni ánýrnasýnií þessum íbúafjölda. Sami þáttur er líklega ábyrgur fyrir þvíflestar vefjasýnin í þessari rannsókn voru gerðar nokkrum vikum til mánuðum eftir fyrstu greiningu áCOVID-19 sýking. Greining á nýrnasýnum sem náðst hafa nær smitandi kveikju getur veittfrekari innsýn í frumu svipgerðir. Þar að auki greinir núverandi rannsókn ekki hverog hvenær á að meðhöndla COVAN með JAK hemlum. Svör við þessum spurningum og ákvörðun umvirkni JAK hömlunar sem meðferð við COVAN verður í brennidepli í framtíðarrannsóknum.Þessi vinna undirstrikar tengsl áhættuhópaAPOL1arfgerð og hlutverk JAK-STAT-APOL1merki í þróun COVAN. Eftir því sem skilningur okkar á COVID-19 heimsfaraldri þróast,brýn þörf er á að auka vitund lækna og lýðheilsu um nýrnavandamálinaf COVID-19. Það er líka brýn þörf fyrir COVAN meðferð. Rannsókn okkar býður upp á ný gögn um JAKhemlar sem sterkir meðferðarframbjóðendur fyrir APOL1-tengd COVAN.

Aðferðir

Mótefni og hvarfefni.

Notuð voru aðal mótefni gegn eftirfarandi próteinum: APOL1 kanínamannfjandsamleg [Genentech, 3.1C1&3.7D6; Western blot [WB] 1:5000 (lokastyrkur 0,05 ug/mL);Genentech, 5.17D12 [IHC] 1:4000 (lokastyrkur 0,95 ug/mL) samkvæmt nýlegri skýrslu (42)];APOL1 mús gegn mönnum [Genentech, 4.17A5; Ónæmisflúrljómun [IF] 1:2000 (lokastyrkur2,13 ug/mL); GAPDH mús gegn mönnum (Santa Cruz Biotechnology, sc47724; WB 1:200); Vinkúlínmúsaandstæðingur (Sigma-Aldrich, V9131; WB 1:200); NEPH1 mús gegn mönnum (Santa CruzLíftækni, sc373787; WB 1:300); WT1 kanína gegn mönnum (Abcam, ab89901; WB 1:1000); STAT1mús gegn mönnum (Cell Signaling Technology [CST], 9176s; WB 1:1000); STAT2 kanína gegn mönnum(CST, 72604: WB 1:1000); STAT3 mús gegn mönnum (CST, 9139; WB 1:1000); FosfórýleraðSTAT1 (Y701) kanína gegn mönnum (CST, 9167; WB 1:1000); Fosfórýlerað-STAT2 (Y690) kanínumótefnimanna (CST, 88410; WB 1:1000); Fosfórýleruð-STAT3 (Y705) kanína gegn mönnum (CST, 9145; WB1:2000); PODXL geit gegn mönnum (R&D, AF1658; IF 1:500), E-Cadherin kanína gegn mönnum (frumaMerki, 3195S; EF 1:200), NEPH1 músarandstæðingur (Santa Cruz, sc-373787; EF 1:100). Secondarymótefni innihéldu geit-and-kanínu IgG, HRP-tengd mótefni (CST, 7074s; WB 1:1000); hestur andstæðingurmúsa IgG, HRP-tengt mótefni (CST, 7076s; WB 1:1000); Alexa Fluor 488 samtengd asnavörnmús (Jackson ImmunoResearch, 715-546-150; IF 1:1000), Alexa Fluor 594 conjugated donkey antigeit (Jackson ImmunoResearch, 705-585-147; IF 1:1000), og Alexa Fluor 405 samtengdur asniand-kanínu (Thermo Scientific, A48258; 1:000). Fyrir qRT-PCR, TaqMan genatjáningarprófinnifalið APOL1 (Hs01066280_m1), GAPDH (Hs03929097_g1) og PECAM-1 (Hs00169777_m1).Nýra ónæmisvefjaefnalitun fyrir APOL1, synaptopodin og CD31. Byrjar með formalíni fastparaffín innfelldar nýrnavefjasýni, mótefnavaka endurheimt var framkvæmd með (EDTA lausn við pH 8.0)í 56 mínútur við 100 gráður. Aðalmótefni gegn APOL1 (5.17D12, Genentech), synaptopodin (ProgenBiotechnik, 61094) og CD31 (Cell Signaling, 3528s) voru beitt við 1:4000 (endastyrkur 0,95)ug/mL), 1:100 og 1:1600, í sömu röð í 60 mínútur við 36 gráður. Tilbúið til notkunar HQ-tengdaukaefni gegn kanínum (760-4815) voru ræktaðar í 12 mínútur við 36 gráður. Þessu var fylgt eftirmeð því að bæta við and-HQ HRP í 12 mín. DAB (760-159) var ræktað í 5 mínútur í herbergihitastig. Vefjahlutinn var mótlitaður með hematoxýlíni (760-2021) í 4 mínútur við stofuhita.Bláandi hvarfefni (760-2037) var bætt við í 4 mínútur við stofuhita.

Cytókínmeðferð á ræktuðum frumum.

Aðal gauklaæðaþelsfrumur úr mönnum, frumfrumurundirræktuð úr gjafanýrum úr mönnum, og frumur úr lífrænum frumum voru meðhöndlaðar með 50ng/ml,20ng/ml, eða 10ng/ml styrkur eftirfarandi frumuefna: Raðbrigða manna CXCL9(Biolegend, 578102); Raðbrigða manna CXCL10 (Biolegend, 573502); Raðbrigða mannaCXCL13 (Biolegend, 573502); IL-1 (PeproTech, 200-01B); IL-15 (PeproTech, 200-15); IL-18(Biolegend, 592102); IL-8 (Biolegend, 574202); Interferón (IFN) alfa 1 (Sigma-Aldrich, SRP4596); IFNbeta (Peprotech, 300-02BC); IFN gamma (Sigma-Aldrich, I17001); IL-6 (Peprotech, 200-06); TNF-alfa(Peprotech, 300-01A); MCP-1 (CCL2) (Peprotech, 300-04); MIP-1alfa (CCL3) (Peprotech, 300-08);IL-10 (Peprotech, 200-10); IL-7 (Peprotech, 200-07); IL-2 (Peprotech, 200-02); G-CSF (Peprotech, 300-23). Stöðlaður cýtókínstyrkur 50ng/ml var fyrirfram ákveðinn á grundvelli fordæmis fráfrumumeðferðir í mönnum sem meta frumulostsheilkenni í COVID-19 sýkingu (17). Fylgja eftirtilraunir notuðu styrkleika 20ng/ml og 10ng/ml. Síðari meðferðir, þar á meðal lífræn efniog frumufrumutilraunir úr lífrænum frumum, voru gerðar með 10ng/ml. JAK 1/2 hemill,baricitinib (INCB028050) (Selleckchem, S2851), var notað í 10uM lokastyrk í öllumtilraunir.

Aðal ræktun gauklaæðaþelsfrumna úr mönnum. Frosinnstofn af áhættulítilli (G0G0) frummönnumgauklaæðaþelsfrumur voru keyptar frá Celprogen (36066-05), þíðaðar og ræktaðar í mönnumgauklaæðaþels frumfrumuræktun heill miðill með sermi, sýklalyfjalaus (Celprogen,M36066-05SA) á plötum sem eru húðaðar með eigin utanfrumu fylki (Celprogen, E36066-05-PD10 ogE36066-05-12Jæja) í raka umhverfinu við 37 gráður og 5% CO2. Frumur voru yfirfarnar með því að nota 1XTrypsin EDTA (Celprogen, T1509-014). Frumur voru notaðar til tilrauna á milli leiða 2 til 4.Frumur voru staðfestar með qRT-PCR sem sýndi auðgun í PECAM1 genatjáningu (æðaþelsfrumurmerki, einnig þekkt sem CD31).

Glomerular einangrun frá gjafa manna nýrum og podocyte subculture.Manngjafi nýra varkeypt í gegnum National Disease Research Interchange (NDRI). APOL1 arfgerð gjafans varG0G1. Glomerular einangrun var framkvæmd með sigtiaðferðinni sem var aðlöguð frá fyrri útgáfu (43,44). Í stuttu máli, þegar unnið var á ís í dauðhreinsuðu hettu, var nýrað fyrst tekið af hylkinu og skorið í tvennt í miðjum sagittally. Mergurinn var krufinn í burtu og barkurinn var eftir. Barkurinn var síðan hakkaðurog farið í gegnum sigti úr ryðfríu stáli möskva (stærðir 425 µm, 250 µm) og safnað áefst á þriðja sigti (150 µm) á meðan þvegið er oft með forkældu fosfatbúðuðu saltvatni (PBS)með 1% BSA (án kalsíums og magnesíums) (Endecotts, Sieves 100SIW.150, 100SIW.250,100SIW.425). Glomeruli var safnað, skilið í skilvindu og endurleyst í 5mL PBS. 10µL af sýninuvoru lituð með NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342) (Thermo Fisher Scientific,R37605) og sýnd með ljóssmásjá. Glomeruli voru síðan ræktuð í meltingarjafna[DMEM/F12, 1mg/ml hvor af (kollagenasa I, IV og V), DNAse I (50 U/mL eða 50 µg/ml)] við 37 gráður fyrir1 klst til að fá einfrumu sviflausn (Thermo Fisher Scientific, 10565018; StemCell Technologies,07415m 07426, 07430; Sigma-Aldrich, 11284932001). DMEM/F12 með 10% FBS (R&D Systems,S10350H) var bætt við til að stöðva meltingu og sýnið skilið í skilvindu við 450 g mínútur við 4 gráður.Einangraðar fræfrumur voru undirræktaðar í Advanced RPMI (Fischer Scientific, MT10040CV) með 10% FBSog 1% penicillin-streptomycin (Thermo Fisher Scientific, 15070063) á vitronectin húðuðum plötum(StemCell Technologies, 07004) við 37 gráður og 5% CO2. Undirræktaðar frumur voru sýnilegar eftir ~5 daga ogvoru meðhöndlaðir eftir 2 vikur í ræktun.

Próteinútdráttur og Western blotting.Öllum ræktunarplötum og sýnum var haldið við 4 gráður. Einlagaaf frumum var leyst og safnað með frumulýsubuffer (Cell Signaling, 9803) með heilllítill próteasa hemill og fosfatasa hemill (Sigma-Aldrich, 04693159001, 04906837001).

Sýnin voru hljóðbeitt á stigi 4 í 10 sekúndur hvert, skilið í skilvindu við 12000 snúninga á mínútu x5 mín, flotiðvar safnað í nýtt Eppendorf túpu og próteinstyrkur var ákvarðaður með BCA próteingreiningu(Pierce, 23225). Próteinlýsöt voru þynnt með 4x LaemmLi sýnisbuffi 2-merkaptóetanóli(BioRad, 1610747; Thermo Fisher, 21985023) og hitað við 95-100 gráðu í 5 mínútur. Próteinlýsötvoru síðan aðskilin með Criterion TGX litlausum hlaupum (4-20%) og flutt með Bio-Rad TransBlot Turbo flutningskerfi. Yfirfærðar himnur voru lokaðar í 1 klst í 3% fitulausri mjólk í Tris-bufferðrisaltlausn og ræktuð með sérstökum frummótefnum yfir nótt við 4 gráður. Næsta dagur eftirstaðlaðan þvott, himnur voru ræktaðar með piparrótarperoxídasa-tengdu aukaefnimótefni í að minnsta kosti 1 klst. við stofuhita fyrir myndatöku með Bio-Rad ChemiDoc MP myndgreiningarkerfisamkvæmt leiðbeiningum framleiðanda.

RNA útdráttur og qRT-PCR.RNA var einangrað úr frumu einlagi með því að nota RLT lýsisbuffa ogQiagen RNEasy Mini Kit (74106) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. RNA var umritað í cDNA með því að notaInvitrogen SuperScript IV öfug umskriftarhvarfefni og samskiptareglur (Thermo Fisher, 18091050).qRT-PCR viðbrögð voru framkvæmd með Applied Biosystems TaqMan Fast Advanced Master Mix(Fischer Scientific, 44-445-57) og genatjáningargreiningar með QuantStudio 6 Flex System(Thermo Fisher Scientific) með ∆∆Ct aðferð með GAPDH sem viðmiðunargeni.

Arfgerð.DNA var dregið úr FFPE vefjablokkum með því að nota QIAamp DNA FFPE vefjasettið(Qiagen, 56404) samkvæmt samskiptareglum framleiðanda. Arfgerð var framkvæmd með Applied BiosystemsTaqman samsætugreiningarpróf fyrir G1 SNP (p.Ser342Gly) og G2 fjölbreytni(p.Asn388_Tyr389del) með QuantStudio 6 Flex System. Þessi prófun hefur 100% greiningarsérhæfni oggreiningarnæmi (greiningarmörk) upp á 1,0ng DNA til að greinaAPOL1áhættuafbrigði í DNAdregin úr útlægum blóðfrumum. Prófanir voru áður staðfestar með því að bera saman niðurstöður viðbein raðgreining (Sanger raðgreining). Arfgerð gæðaeftirlitsráðstafana innihélt notkun átæknilegar endurtekningar, 100% samsvörun jákvæðra viðmiða af hverri arfgerð og neikvæðra viðmiða.

Afleiðing af G1G2 sjúklingi iPSC nýra örlífrænum.Nýra ör-lífræn efni voru unnin samkvæmtbirt bókun (27), með nokkrum breytingum. Í stuttu máli, framkallaðar fjölhæfar stofnfrumur úr mönnum (iPSC)voru sundraðar í stakar frumur með TrypLE Select og sáð á vitronectin húðaðar plötur íStemFlex miðlar (Thermo Fisher Scientific, A3349401) með 10uM Rho kínasa hemli (TocrisLífvísindi, 1254) með þéttleika 11,000-14,000 frumur/cm2 og ræktað í rakaðri umhverfi kl37 gráður og 5% CO2. Frumum var síðan skipt yfir í TeSR-E6 miðil (Stemcell Technologies, 05946) með8 µM CHIR99021 (Tocris Bioscience, 4423) í 4 daga. Frá degi 5 til 7. dags voru frumur meðhöndlaðar með200 ng/ml FGF9, 1 µg/ml heparín og 1 µM CHIR99021. Á 7. degi voru frumur þvegnar með PBS ogsundrað TrypLE. Aðgreindar frumur voru síðan þvegnar með látlausu DMEM og skilið í skilvindu kl300xg í 5 mínútur. Frumukúla var endurleyst í Stage1 miðli [TeSR-E6 sem innihélt 200 ng/mlFGF9, 1 µg/mL heparín, 1 µM CHIR99021, 0,1% PVA, 10 µM Rho kínasa hemill (Tocris Bioscience)]og flutt á 24-brunn AggreWell 400 plötu (Stemcell, 34411) á um það bil 1,2 milljónirfrumur/brunnur. Platan var síðan skilin í skilvindu við 100xg í 3 mínútur og ræktuð í 48 klukkustundir við 37 gráður og5% CO2 í stöðluðum frumuræktarútungunarvél. Eftir 48 klukkustundir (dag7+2) voru lífræn efni frá AggreWellflutt yfir á 6-vel lágan festingarplötu með Stage2 miðli [TeSR-E6 sem inniheldur 200 ng/ml FGF9, 1µg/mL heparín, 1 µM CHIR99021, 0,1% PVA] á hringhristara inni í frumuútungunarvél fyrir aðra 72klukkustundir. Frá og með degi 7+5 voru öll lífræn efni endurnýjuð með 3. stigs miðli [TeSR-E6 sem inniheldur0,1% PVA] á öðrum dögum þar til það er notað í tilraunir.

Podocyte einangrun frá örlífrænum.Einangrun glomeruli frá lífrænum nýrum var aðlöguð frá aáður lýst samskiptareglur (45). Í stuttu máli, hópar af iPSC-afleiddum nýrnalífrænum frumum með upphafsstafupphafshólfsnúmer 1,2x106 iPSCs voru sundruð með ræktun með TrypLE select (ThermoFisher) í 5 mínútur við 37 gráður. Varlega blandað með 1 ml pípettu var beitt á 2-3 mín fresti til að hjálpasundrungu. Í hverjum hópi var stak 70 µm frumusía (PluriSelect) sett á 50 ml rör (Falcon)og möskvan var vökvuð með PBS. Frumulausninni var bætt við með því að nota 1 ml pípettu, sem leyfði flæði í gegnumlausnarinnar með þyngdaraflinu. Notaðu stimpilinn úr 1 ml sæfðri sprautu, fruman sem eftir erlausninni sem var fangað á síunni var þrýst varlega í gegnum möskvann. Síið var þvegið meðPBS og fargað, heldur frumunni í gegn. Frumflæðinu var síðan pípettað á forvökvaða40 µm frumu sigti (Pluriselect) og sett á ferskt 50 ml rör (Falcon) sem gerir stakar frumur kleiftað flæða í gegnum með þyngdarafl og þvo sigtið mikið með PBS til að fjarlægja allt sem eftir erfrumur. Stærstu glomeruli var síðan safnað úr 40 µm frumu sigti með því að hvolfa sigtinu áferskt 50 ml túpa og þvegið með PBS til að skola út fanguðum glomeruli. Þetta ferli varendurtekið með gegnumstreymi frá 40 µm ferli með því að nota loka 30 µm frumu síuna (PluriSelect) tilsafna smærri glomeruli. Einangraðir glomeruli frá IPSC-afleiddum nýrnalífrænum lífrænum frumum voru ræktaðir ávitronectinhúðaðar plötur með háþróaðri RPMI 1640 sem innihalda 10% FBS í venjulegri frumurækthitakassa við 37 gráður auk 5% CO2. Fjölmiðlar voru endurnærðir annan hvern dag þar til frumur voru notaðar fyrirtilraunir.

Ónæmisflúrljómunarlitun, örlífræn.Nýra örlífræn efni voru þvegin með PBS ogfastur í 4% PFA í PBS í 30-45 mín á ís. Föst lífræn efni voru síðan þvegin þrisvar sinnum með PBS,og ræktað í 30% súkrósa í PBS yfir nótt við 4 gráður. Lífræn efni voru innbyggð í OCT og10 µm frystiskurður með Laica Cryostat. Lífrænar frostskurðir voru þvegnir þrírsinnum með PBS og síðan lokað með blokkandi biðminni 1 (1% fiskgelatín, 2% asnasermi, 0.3% TritonX-100 í PBS) í eina klukkustund við stofuhita. Því næst voru frystiskurðir ræktaðir með aðalmótefni í blokkandi biðminni 1 yfir nótt við 4 gráður. Krydóskurðir voru þvegnir þrisvar sinnum með PBS. Eftirþvott, frystiskurðir voru ræktaðir með aukamótefnum í blokkandi biðminni 1 í 2 klukkustundir í herbergihitastig. Eftir fimm þvott með PBS voru frystihlutarnir settir upp með Prolong Glass antifadeuppsetningarlausn (Thermo Scientific, P36980). Flúrljósmyndir voru búnar til með ECHOsmásjá.

Ónæmisflúrljómun litun, podocyte.Podocyte ræktun var þvegin með PBS og fest í 4%PFA í PBS í 10-15 mín. við stofuhita. Eftir festingu voru frumur þvegnar þrisvar sinnum með PBSog læst í blokkandi biðminni 2 (1% fisher gelatín, 2% asnasermi, 0.1% sapónín í PBS) fyrir 30-60mín. Frumur voru ræktaðar með frummótefnum í blokkandi biðminni 2 í 2 klukkustundir við stofuhita(eða yfir nótt við 4 gráður). Frumur voru þvegnar þrisvar sinnum með blokkandi biðminni 2 og ræktaðar meðaukamótefni í blokkandi biðminni 2 í 1 klukkustund við stofuhita. Eftir þrjá þvotta meðblokkandi biðminni 2 og einn lokaþvott með PBS, frumurnar voru settar upp með Drop-n-Stain EverBritefestingarmiðill (Biotium, 23008). Flúrljómandi myndir voru teknar með ECHO smásjá.

Lífvænleikaprófun. Fyrir frumulífvænleika og ATP mælingar voru frumur fengnar úr lífrænum frumum húðaðará vitronectin-húðaða 96-brunnplötu í 100uL miðli (StemCell Technologies, 07004; Corning,CLS3603) og ræktað í Advanced RPMI+10%FBS+1%PS (Fischer Scientific, MT10040CV; ThermoFisher Scientific, 15070063) í rakaðri umhverfi við 37 gráður og 5% CO2. Lífrænt ættaðfræfrumur voru samtímis plötuðar á 6-brunnplötu til að nota til RNA útdráttar fyrir qPCR ogá 24-brunnsplötu til að nota til ónæmisvefjaefnafræði (IHC). Frumur voru meðhöndlaðar við ~80% samrennslimeð sex skilyrðum [viðmiðun, IFNG (10ng/mL), IFNG (10ng/mL) + baricitinib (endastyrkur 10uM),Öll cýtókín (10ng/mL), og öll cýtókín (10ng/mL) + baricitinib (endastyrkur 10uM)]. Fjölmiðlarvar breytt á Q48klst og frumur voru metnar á 96klst. 96-brunnplata var unnin með Promegalífvænleika frumna og ATP próf eins og nánar er getið hér að neðan; 6-brunnsplatan var unnin fyrir RNAútdráttur, cDNA nýmyndun og qRT-PCR; og 24-brunnsplata var fest í 4% PFA fyrir IHC. CellTiterFlúorTMCell Viability Assay (Promega, G6080) og CellTiter-Glo® 2.0 Greining (Promega, G9241) voruframkvæmt með því að nota staðlaðar samskiptaleiðbeiningar frá framleiðanda. Mælingarnar voru margfaldaðará bókun. Flúrljómun (non-lytic proteasa próf) og luminescence (lýtísk ATP próf) vorumælt með SpectramaxM3 flúormæli. Munurinn á mælikvörðum var ákvarðaður af nemendaóparað t-próf.

Tölfræði.Öll gögn eru sýnd sem meðaltal ± SD. GraphPad Prism 8.3.1 hugbúnaður var notaður fyrir gögnanalysis. Cytokine conditions inducing >1,5 sinnumAPOL1afrit samanborið við viðmiðunarmiðlunvoru greindar með tilliti til marktækni með því að nota óparað t-próf ​​með Holm-Sidak leiðréttingu fyrir margasamanburði. P-gildin sem tilkynnt eru um eru leiðrétt p-gildin. Merking var sett á bls<0.05.

Námssamþykki. Þessi rannsókn var samþykkt af Institutional Review Board (IRB) Duke háskólans,Norður Karólína. Upplýst samþykki sjúklings var ekki krafist af IRB vegna þess að málið hluti af þessurannsóknin var afturskyggn endurskoðun á klínísku og geymdu meinafræðilegu efni eingöngu. Mannsnýra fyrirgauklaeinangrun og undirræktun fræfrumna var aflað í gegnum National Disease Researchskipti (NDRI); Þessi vefjarannsókn á mönnum var einnig fyrirfram samþykkt í gegnum Duke's IRB. NDRIkrefst þess að allir vefjauppsprettusvæði fái upplýst samþykki frá vefjagjafa eða staðgöngumanni.

Framlög höfundaSEN, GL, SD, KS og DS gerðu tilraunir og ritstýrðu handritum. AW og DT fluttu ogtúlkaði vefjameinafræði, og IHC, og ritstýrði handritinu. GH lagði til nauðsynleg hvarfefni og ritstýrðihandriti. SEN og OAO hönnuðu rannsóknina, greindu og túlkuðu gögn, hönnuðu tölur ogskrifaði og ritstýrði handritinu.

ViðurkenningarÞetta verk var stutt af 1DP2DK124891-01, 1R01MD016401-01 og Whitehead Scholar Award(OAO); SEN var studd af Duke Nephrology T32 Training Grant (5T32DK007731-24). Við þökkumSuzie Scales (Genentech) fyrir rausnarlega gjöf APOL1-sértækra mótefna. Við þökkum RannsókninniVefjafræðistofa hjá Duke BRPC og Steven R. Colon hjá PhotoPath, Duke Department of Pathology.

Heimildir

1. Chan L, Chaudhary K, Saha A, Chauhan K, Vaid A, Zhao S, o.fl. AKI hjá sjúklingum á sjúkrahúsi með COVID-19. J Am Soc Nephrol.2021;32(1):151-60.

2. Hirsch JS, Ng JH, Ross DW, Sharma P, Shah HH, Barnett RL, o.fl. Bráður nýrnaskaði hjá sjúklingumá sjúkrahúsi með COVID-19.Nýra Int.2020;98(1):209-18. 

3. May RM, Cassol C, Hannoudi A, Larsen CP, Lerma EV, Haun RS, o.fl. Fjölsetra yfirsýn árgangurrannsókn skilgreinir litróf nýrnasjúkdóma í Coronavirus 2019 sjúkdómnum (COVID-19).Nýra Int.2021.

4. Wu H, Larsen CP, Hernandez-Arroyo CF, Mohamed MMB, Caza T, Sharshir M, et al. AKI og HrunGlomerulopathy tengt COVID-19 og APOL 1 áhættuarfgerð.J Am Soc Nephrol.2020;31(8):1688-95. 

5. Genovese G, Friedman DJ, Ross MD, Lecordier L, Uzureau P, Freedman BI, o.fl. Samtök umtrypanolytic ApoL1 afbrigði með nýrnasjúkdóm í Afríku-Ameríkumönnum.Vísindi.2010;329(5993):841-5.

6. Friedman DJ og Pollak MR. APOL1 nýrnakvilli: Frá erfðafræði til klínískra nota.Clin J Am SocNephrol.2020. 

7. Friedman DJ og Pollak MR. APOL1 og nýrnasjúkdómur: Frá erfðafræði til líffræði.Annu Rev Physiol.2020;82:323-42. 8. Tzur S, Rosset S, Shemer R, Yudkovsky G, Selig S, Tarekegn A, et al. Missense stökkbreytingar í APOL1gen eru mjög tengd við lokastig nýrnasjúkdómsáhættu sem áður var rakin til MYH9 gensins.Humm Genet.2010;128(3):345-50. 

Stuðningsþjónusta Wecistanche - Stærsti útflytjandi cistanche í Kína:

Netfang:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Sími:+86 15292862950

Verslaðu fyrir frekari upplýsingar:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

FÁÐU NÁTTÚRLEGT LÍFFRÆNT CISTANCHE ÚTDRÆT MEÐ 25% ECHINACOSIDE OG 9% ACTEOSIDE VEGNA NÝRASÝKINGAR