Einangrun og magngreining Ginsenoside Rh23, nýtt and-melanógenandi efnasamband úr laufum Panax Ginsengs
Mar 21, 2023
Ágrip:
Nýtt ginsenosíð, nefnt ginsenosíð Rh23 (1), og 20-O- -D-glúkópyranósýl-3 ,6 , 12 ,20 ,25-pentahýdroxýdammar-23-en (2) voru einangruð úr laufum vatnsræktunar Panax ginsengs. Efnasambönd voru einangruð með mismunandi súluskiljun og uppbygging þeirra ákvörðuð út frá litrófsfræðilegum aðferðum, þar með talið háupplausnarfjórpól/flugtíma massagreiningu (HR-QTOF/MS), kjarnasegulómun (NMR) litrófsgreiningu og innrauðri (IR) litrófsgreiningu. . Til að ákvarða and-melanogenic virkni var breytingin á melaníninnihaldi í Melan-a frumum sem voru meðhöndlaðar með auðkenndum efnasamböndum prófuð.
Að auki rannsökuðum við melanín hamlandi áhrif ginsenosíð Rh23 á litarefni í sebrafiski in vivo líkani. Efnasamband 1 hindraði öfluga sortumyndun í melan-a frumum með 37,0 prósenta sortumyndunarhömlun við 80 µM og sýndi einnig hömlun á litarefni líkamans í sebrafiskalíkaninu. Þrátt fyrir að efnasamband 2 sýndi aðeins minni hamlandi virkni en efnasamband 1, sýndi það einnig marktækt minnkaða sortumyndun í Melan-a frumum og sebrafiskalíkaninu. Þessar niðurstöður gáfu til kynna að hægt væri að nota efnasambönd einangruð úr hydroponic P. ginseng sem ný húðhvítandi efnasambönd í gegnum in vitro og in vivo kerfin. Ennfremur sýndi þessi rannsókn fram á notagildi MS-undirstaða efnasambands 1 fyrir megindlega greiningu. Ginsenoside Rh23 (1) fannst í magni 0,31 mg/g í laufum af vatnsræktuðu P. ginsengi.
Fyrir melanín komumst við að því að Cistanche getur dregið verulega úr virkni tyrosinasa, sem er aðalhraðatakmarkandi ensímið í nýmyndun melaníns í húð og er samsett úr kopar og próteini. Það getur hýdroxýlerað týrósín, aðalhráefnið til melanínframleiðslu í líkamanum, til að framleiða L-dópa og síðan oxað dópa í dópakínón. Dópakínón gengur í gegnum röð efnaskiptaferla, endurraðar og fjölliðar og sameinast að lokum við Prótein sameinast til að framleiða röð melanín litarefna sem valda brúnni. Melanín er mikilvægasti þátturinn í að ákvarða húðlit mannslíkamans. Of mikil nýmyndun getur valdið myndun litarefna húðsjúkdóma eins og freknur, chloasma, aldursblettir og sortuæxli. Þess vegna, með rannsóknum á hömlun á virkni tyrosinasa, er hægt að skima út áhrifarík innihaldsefni til að hindra litarefni húðarinnar, þannig að hægt sé að sjá að heildarglýkósíð í Cistanche deserticola hafa þau áhrif að hindra litarefni húðarinnar og hvítna fegurð.
Leitarorð:
ginsenosíð Rh23; Panax ginseng; NMR; UPLC-QTOF/MS; sebrafiskur; magngreiningu.
1. Inngangur
Panax ginseng CA Meyer er mjög fræg hefðbundin lækningajurt í Asíulöndum. Panax er upprunnið úr "panacea", sem þýðir lækning við sjúkdómum. P. ginseng er ævarandi jurtaplanta sem tilheyrir Araliaceae fjölskyldunni [1]. Fjögurra til sex ára gamlar rætur P. ginsengs eru aðallega notaðar í lækningaskyni. Blóm blómstra í júní og blöðin hafa gómform. P. ginseng hefur aðallega verið ræktað í Austur-Asíu, þar á meðal Kóreu, Kína og Japan [2]. Hingað til hefur verið greint frá mörgum rannsóknum um efnafræðilega innihaldsefni ginsengróta, laufblaða og berja; meira en 100 tegundir ginsenósíða hafa verið einangraðar. Greint var frá ýmsum lífvirkni P. ginsengs, svo sem aukning á ónæmisbælandi virkni, næringarstyrkingu, bættri lifrarstarfsemi, sykursýki, krabbameini, apoptotic og andoxunarvirkni [3-10].
Eins og er eykst áhugi á vellíðan tengdum landbúnaðarvörum af háum gæðum smám saman, sem leiðir til vatnsræktunar á ginsengi. Vatnsræktun hefur þá kosti einfalt ræktunarferli og styttri vaxtartíma en jarðvegsræktun. Vatnsræktað ginseng þarf aðeins 2-4 mánuði í kerfi sem stjórnar hitastigi, er laust við skordýraeitur, rakt, létt, hefur lífræn innihaldsefni o.s.frv. [11]. Lauf jarðvegsræktunarginsengs eru ekki notuð til lækninga og hagnýtrar grænmetis, á meðan hægt er að nota lauf vatnsræktaðs ginsengs.
In a previous study, the contents and composition of ginsenosides in different parts, such as leaves, roots, and fruits of ginseng, were investigated after a short-term hydroponic system [12]. The total ginsenoside content of the ginseng leaves was found to be significantly higher at 15.30%, while the content of the ginseng roots was at 1.27%. Additionally, the contents of the major ginsenosides components produced in the ginseng leave cultured in the hydroponic system were observed in the order of Rg1 > Rd > Re > Rc > Rb2 > Rg2 >Rb1 > Rh1 > Rf [11]. Niðurstaðan er sú að vatnsræktaraðstæður leiddu til mikils ginsenosíðs og heildarinnihald ginsenosíðs í laufum var marktækt hærra en í rótum, sem bendir til þess að ginsenglauf gætu verið góð uppspretta hagnýtra grænmetis og lækningajurta.
Nokkrir þekktir hvítandi efnasambönd, eins og arbútín og kojínsýra, hafa verið rannsökuð fyrir virkni þeirra við að draga úr sortumyndun [13]. Því miður er nauðsynlegt að finna öruggari og skilvirkari húðhvítandi efni, vegna krabbameinsvaldandi möguleika kojínsýru og bæði öryggis og aukaverkana arbútíns [14]. Þar með hefur stöðugt mikil athygli verið rannsökuð þróun nýrra náttúruvara í snyrtivöruiðnaðinum [15,16]. Nokkrar rannsóknir hafa greint frá hömlun á melanínmyndun frá P. ginseng ræktað í jarðvegi [17-20].
Hins vegar var greint frá þessum rannsóknum með vel þekktum efnasamböndum, eins og kanilsýru og fenólsamböndum, og hvítunarvirkni hefur ekki verið tilkynnt frá laufum vatnsræktunar P. ginsengs (HPGL). Áframhaldandi vinna okkar leiddi til einangrunar á minniháttar ginsenósíðum frá HPGL. Venjulega er ekki hægt að greina ginsenósíð í litlu magni eða snefilmagni með HPLC. Annars er greiningartíminn mjög langur, sem er ekki hentugt til að hæfa ginsenósíðurnar í ginsengkryddi [21,22]. Til að mæla ný efnasambönd hratt ætti að koma á hraðri og viðkvæmri aðferð, sem getur greint snefilmagn nýrra efnasambanda rækilega. Í þessari rannsókn var næm vökvaskiljun með ofurafkastamikilli afköst ásamt fjórpól/flugtíma massagreiningu (UPLC-QTOF-MS) aðferð komið á til að magngreina nýja efnasambandið.
Byggt á ofangreindri lýsingu, í þessari vinnu, var einangrun og auðkenning á nýju efnasambandi, þ.mt eðliseiginleikar og magngreining, leitt í ljós með litrófsfræðilegum aðferðum og and-melanogenic virkni þeirra var rannsökuð í gegnum in vitro og in vivo kerfi.
2. Niðurstöður og umræður
Blöð af vatnsræktuðu Panax ginsengi (HPGL) voru dregin út með vatnskenndu MeOH og skipt í etýlasetat (EtOAc), n-bútanól (n-BuOH) og H2O hluta, í sömu röð. Endurteknar SiO2 og ODS súluskiljanir á n-BuOH hlutanum gáfu eitt nýtt ginsenosíð (1) og eitt sjaldgæft ginsenosíð (2) var einangrað úr EtOAc brotinu af HPGL.
Efnasamband 1, hvítt duft (metanól), sýndi fjólubláan lit á TLC, með því að úða 10 prósent H2SO4 og hita. Sameindaformúlan var ákvörðuð til að vera C37H64O10 frá hálfsameindajónatoppnum m/z 713,44723 [M plús COOH]- í neikvæðu QTOF/MS. IR litróf benti til þess að hýdroxýlhópur (3377 cm−1) og tvítengi (1647 cm−1) væri til staðar. 1H-NMR litrófið (tafla 1 og viðbótarefni) sýndu tvö olefín metín róteindamerki (δH 6,02, 5,64), þrjú súrefnisrík metínróteindamerki (δH 4,38, 4,03, 3,49), eitt metoxýróteindamerki (δH 3) og átta. stakmetýl róteindamerki (δH 1,94, 1,55, 1,43, 1,33, 1,31, 1,14, 1,04, 0,92), sem gefur til kynna að efnasamband 1 hafi tetrasýklískan tríterpenhluta sem inniheldur eitt tvítengi með umbreytingu og þrjá hýdroxýlhópa.
Að auki er staðfest að efnasamband 1 sé prótópanaxatríól (PPT) gerð frá efnabreytingu metýlróteindamerkis við δH 1,94 (H-28). Efnabreyting H-28 í prótópanaxadíól (PPD) gerð sést venjulega við ca δH 1,30 [23]. Ennfremur sáust hemiacetal róteindamerki (δH 5,15) og nokkur súrefnisríkt metín og metýlenróteindamerki við δH 4,45–3,95 sem merki um sykurhluta. Frá tengingarfasta anómer róteindamerkisins (J=7.6 Hz), voru bæði himiacetal róteind og H-2 sykurhlutans í áslegu fyrirkomulagi. Samsetning ofangreindra gagna komst að þeirri niðurstöðu að efnasamband 1 væri prótópanaxatríól amínóglýkósíð. 13C-NMR litrófið sýndi 37 kolefnismerki vegna triterpenes, metoxý og hexósa hluta. Tvö olefín metínkolefni (δC 138,5 (C-24), 126,8 (C-23)), eitt súrefnisríkt fjórðungskolefni (δC 74,9 (C-25)), þrjú súrefnisrík metínkolefni (δC) 78,5 (C-3), 7{{90}},3 (C-12), 67,7 (C-6)), eitt metoxý kolefni (δC 50,2 ( 25-OCH3)), og átta metýlkolefni (δC 31,9 (C-28), 26,3 (C-27), 26,1 (C-26), 23,0 (C{{ 57}}), 17,6 (C-18), 17,4 (C-19), 17,3 (C-30), 16,4 (C-29)) merki sáust fyrir aglycon hluti. NMR gögn efnasambands 1 voru svipuð og efnasambands 2, nema efnabreytingin fyrir súrefnisríkt fjórðungskolefni, þ.e. C-25. Að auki var sykurinn auðkenndur sem -glúkópýranósi frá kolefnismerkjunum hemiacetal (δC 98,3, (C-10)), fjórum súrefnisríku metíni (δC 78,9 (C-30), 78,2 (C{{82) }}), 75,2 (C-20), 71,6 (C-40)), og eitt súrefnisríkt metýlen (δC 63,0 (C-60)). Í gHMBC litrófinu gHMBC (gradient heteroclear multiple bonde fylgni) sást langdræg fylgni á milli anómerískra róteindamerkja (δH 5.15 (H-10)) og súrefnisríks fjórðungs kolefnismerkis aglýkonsins (δC 83.0 (C) -20)), sem gefur til kynna að -glúkópýranósinn hafi verið tengdur hýdroxýli C-20 (Mynd 1).
Að auki benti fylgnin á milli metoxýróteindamerkisins (δH 3.18 (25-OCH3)) og súrefnisríka fjórðungs kolefnismerksins (δc 74.9 (C-25)) til þess að metoxýið væri tengt C{{ 7}} (Mynd 1). Byggt á ofangreindum gögnum var efnafræðileg uppbygging 1 ákvörðuð sem 20-O- -D-glúkópyranósýl-3 ,6 ,12,20 -tetrahýdroxý-25- methoxydammar-23-en, og nefnt ginsenosíð Rh23. Efnasamband 2 var auðkennt sem 20-O- -D-glúkópyranósýl-3 ,6 ,12 ,20,25- pentahýdroxýdammar-23-en úr samanburði á NMR og MS gögn með þeim sem greint er frá í bókmenntum [23,24] (Mynd 1). Efnasambönd 1 og 2 voru í fyrsta skipti einangruð úr HPGL.
Hreinleiki ginsenosíð Rh23 var ákvarðaður vera meira en 99 prósent með því að staðla toppsvæðin sem greindust með UPLC greiningu. Þar sem sannað hefur verið að UPLC-OTOF/MS sé hentugur búnaður til að bera kennsl á ginsenoside Rh23, var aðskilnaður innihaldsefna í HPGL útdrætti framkvæmdur með UPLC-OTOF/MS í neikvæðum jónaham. Mynd 2 sýnir dæmigerð heildarjónaskiljun (TIC) af ginsenoside Rh23 og útdrætti með massagreiningu.
Línuleg kvörðunarferill fékkst fyrir ginsenosíð Rh23 við mismunandi styrkleikastig. Eiginleikar kvörðunarreitanna eru teknir saman í töflu 2. Eins og sést í töflunni sýnir ginsenoside Rh23 framúrskarandi fylgnistuðla. Fjöldi skynjara (hlutfallslegt toppsvæði) var línulega háð sýnisstyrknum á bilinu 0.02–0,8 µg/mL fyrir ginsenosíð Rh23. LOD fyrir ginsenoside Rh23 var 0.002 ppm. LOQs fyrir ginsenoside Rh23 voru ákvörðuð vera 0,005 ppm með UPLC-QTOF/MS í neikvæðri jónaham. Magn ginsenosíðs Rh23 í HPGL sem fékkst með staðfestingaraðferðum (tafla 2) var 0,319 mg/g.
Til að ákvarða and-melanogenic virkni var breytingin á melaníninnihaldi í melan-a frumum sem voru meðhöndlaðar með hreinsuðum og auðkenndum efnasamböndum rannsökuð. Melan-a frumur voru meðhöndlaðar í 72 klst með efnasamböndum 1 og 2 í styrk á bilinu 0 til 80 µM, og lífvænleiki frumna var metinn með CCK-8 frumulífvænleikaprófunarsetti. Frumulífvænleiki efnasambanda 1 og 2 við 80 µM styrk fyrir melan-a frumu var yfir 98,1 prósent og 97,8 prósent í sömu röð (gögn ekki sýnd). Þessar niðurstöður bentu til þess að efnasambönd 1 og 2 hafi ekki frumueitrun. Áhrif mótefnavaka efnasambanda eru sýnd á mynd 3. Hömlun á melanínmyndun efnasambands 1 við 20, 40 og 80 µM var 8,4 prósent, 15,6 prósent og 37,0 prósent samanborið við samanburðarhópinn. Efnasamband 2 sýndi aðeins minni hamlandi virkni en efnasamband 1 við 7,6 prósent, 12,8 prósent og 17,8 prósent við 20, 40 og 80 µM, í sömu röð. Bæði efnasamböndin hamluðu myndun melaníns á skammtaháðan hátt.
Athyglisvert er að efnasamband 1 sýndi mestu melanín hamlandi virkni, 37,0 prósent við 80 µM styrk. Að sögn sýndi útdrátturinn af radix ginseng við 0-1000 µg/mL enga marktæka hömlun á melaníni [19] og kanillsýra, hvítunarefni sem aðallega er að finna í P. ginseng, sýndi 29 prósenta hömlun á myndun melaníns við 675 µM [20]. Samanborið við útdrætti úr radix ginsengi og kanilsýru sýndi efnasamband 1 öfluga hamlandi virkni melanínmyndunar og sýndi jafnvel 1.2-falt meiri hamlandi virkni melanínmyndunar við áttafalt lægri styrk samanborið við kúmarsýru [ 17,20].
Sebrafiskurinn er mjög hagstæð hryggdýralíkan lífvera vegna svipaðra líffærakerfa og genaraða og manneskjur [25]. Ennfremur fær notkun sebrafiskafósturvísa vaxandi athygli þar sem þeir eru taldir koma í staðinn fyrir dýratilraunir [26]. Sebrafiskar eru með melanín litarefni á yfirborðinu, sem gerir kleift að skoða litarefnisferlið á einfaldan hátt án flókinna tilraunaaðgerða [27].
Þannig könnuðum við melanín-hamlandi áhrif efnasambands 1 á litarefni sebrafiska. Við notuðum PTU (N-phenylthiourea; brennisteins-innihaldandi tyrosinasa-hemli) sem jákvæða viðmiðun (Mynd 4B), sem er mikið notað í sebrafiskarannsóknum [28,29]. Eins og sýnt er á mynd 4C, D, 40 og 80 µM meðferð með efnasambandi 1 framkallaði ótrúlega hömlun á litarefni sebrafiska líkamans, sem dró verulega úr heildar melaníninnihaldi samanborið við samanburðarburðarefnið (Mynd 4A).
Í þessari rannsókn einangruðum við nýtt ginsenoside Rh23 (1) úr vatnsræktuðum P. ginseng laufum. Þannig hefur verið greint frá mun meira en 100 ginsenósíðum úr ginsengtegundum. Hins vegar koma 25-hýdroxýlgínsenósíð sjaldan fyrir í náttúrunni, þar með talið í ginsengplöntum. Að auki hafði ekki verið tilkynnt um hvítunarvirkni. Hindrandi virkni ginsenosíðs Rh23 sýndi 37 prósent við 80 óstyrk án frumueiturhrifa í melan-a frumum, en engin hömlun á in vitro sveppa tyrosinasa virkni sást af ginsenosíð Rh23 (gögn ekki sýnd). Nýlega hefur verið sýnt fram á að útdrættir eða hreinsað ginsenósíð úr ginsengrótum og laufum búa yfir andoxunareiginleikum (30,31), á meðan vatn eða lífrænt ginsengseyði hefur sýnt hreinsandi virkni gagnvart DPPH, súperoxíðanjóni og hýdroxýlrótarefni (32). Þess vegna getur hið nýja ginsenoside Rh23 okkar, einangrað úr laufum vatnsræktunar P. ginsengs, haft niðurstýrt tyrosinasa vegna andoxunareiginleika þess. Hins vegar hefur sortumyndunarhlutverk þess ekki verið rannsakað ennþá. Þess vegna, í frekari rannsóknum, er nauðsynlegt að ákvarða nákvæma verkun ginsenosíð Rh23 á stjórnun melanínmyndunar.
3. Tilraunaverkefni
3.1. Almennt
Kieselgel 60 og LiChroprep RP-18 kvoða voru notuð við súluskiljun (Merck, Darmstadt, Þýskalandi). Kieselgel 60 F254 (Merck) og RP-18 F254S (Merck) voru notuð sem fastir fasar fyrir TLC tilraun. Greining á blettum á TLC plötunni var framkvæmd með athugun undir UV lampa (Spectroline, gerð ENF-240 C/F, Spectronics Corp., New York, NY, Bandaríkjunum) eða með því að úða 10 prósent vatnskenndu H2SO4 á þróaða plötu og síðan hitun. Ljóssnúningur var mældur með JASCO P-1010 stafrænum skautamæli (Tókýó, Japan). Bræðslumark voru fengin með því að nota Fisher-Johns Melting Point Apparatus (Fisher scientific company, Pittsburgh, PA, USA) með smásjá. Útfjólublá litróf voru mæld á Shimadzu líkan UV-1601 litrófsmæli (Shimadzu Corp., Kyoto, Japan). IR litróf voru fengin úr Perkin Elmer Spectrum One FT-IR litrófsmæli (Buckinghamshire, Bretlandi). NMR litróf voru skráð á Varian Inova AS 400 litrófsmæli (400 MHz, Varian, Palo Alto, CA, Bandaríkjunum). UPLC-QTOF/MS greining var framkvæmd með Waters Xevo G2-S röð (Waters Corp., Milford, MA, Bandaríkjunum) sem starfaði í neikvæðri jónaham.
3.2. Plöntuefni
Hydroponic Panax ginseng var ræktað í gróðurhúsi Department of Herbal Crop Research sem staðsett er í Eumseong, Chungbuk héraði í samræmi við siðareglur "ginseng GAP staðlaðar ræktunarleiðbeiningar" [11,33] þróaðar af Rural Development Administration, Lýðveldinu Kóreu. Eins árs gamlar ginseng plönturætur sem vógu 0,8 til 1 g voru keyptar frá jurtarannsóknadeild, National Institute of Horticultural and Herbal Science (NIHHS), Rural Development Administration (RDA) og geymdar í hólf við lágan hita (1–2 ◦C) fyrir notkun. Ginseng ungplönturæturnar voru ígræddar í næringarböð og ræktaðar í vatnsræktunarkerfinu. Eftir þriggja mánaða ræktun var vatnsræktað ginseng dregið út til uppskeru. Uppskeru vatnsræktuðu ginsengplönturnar voru þvegnar hreinar af ryki með vatni og flokkaðar í lauf og rætur, sem síðan voru þurrkaðar í 72 klst í frostþurrkara (FD8512, Ilshin Biobase Co., Yangju, Kóreu). Skírteinissýni (NIHHS14-03) var afhent á grasstofu jurtarannsóknadeildar, NIHHS, RDA, Eumseong, Lýðveldinu Kóreu.
3.3. Útdráttur og einangrun
Þurrkuð og duftformuð lauf af vatnsræktuðu P. ginsengi (HPGL, 6 kg) voru dregin út með 80 prósent MeOH (30 L × 3) við stofuhita í 24 klst. Útdrættirnir voru síaðir í gegnum síupappír og látnir gufa upp við lækkaðan þrýsting við 45 ◦C til að gefa 1,4 kg af útdrætti. Útdrættinum var hellt í H2O (3L) og dregið út með EtOAc (3 L × 3) og n-BuOH (2,6 L × 3), í röð. Hvert lag var þétt við lækkaðan þrýsting til að fá EtOAc (75 g), n-BuOH (470 g) og H2O (855 g) hluta.
n-BuOH brotið (HPGLB, 130 g) var sett á kísilgelsúluna (φ 13 × 17 cm) og skolað með CHCl3–MeOH–H2O (8:3:1, 9{{42} } L → 6:4:1, 110 L) til að gefa 20 brot (HPGLB1 til HPGLB20). Hlutar HPGLB3 og HPGLB4 voru sameinuð (18,9 g, Ve/Vt=0.05–0.12), og skipt frekar yfir kísilgelsúluna (φ 8 × 15 cm, CHCl3–MeOH–H2O=12:3:1, 14 L) til að gefa 14 brot (HPGLB3-1 til HPGLB3-14). Hlutir HPGLB3-4 og HPGLB3-5 voru sameinuð (1,27 g, Ve/Vt {{40}}.09–0.16), og skipt frekar yfir ODS dálkinn (φ 4 × 7 cm, MeOH–H2O=2:1, 2,6 L) til að gefa níu brot (HPGLB3-4-1 til HPGLB3-4-9). Hluti HPGLB3-4-3 (119,4 mg, Ve/Vt=0.14–0.26) var skipt frekar yfir ODS dálkinn (φ 2,5 × 7 cm, MeOH–H2O=1:1, 1 L) til að gefa níu brot (HPGLB3-4-3-1 til HPGLB3-4-3-9) þar á meðal efnasamband 1 (HPGLB3-4-3-7, 10,5 mg, Ve/Vt=0.42–0.55, TLC Rf=0.40 (RP-18 F254S, MeOH–H2O=2:1), Rf=0.50 (Kieselgel 60 F254, CHCl3–MeOH–H2O {{90} }:3:1)). Hlutir HPGLB5 til HPGLB7 voru sameinaðir (24,0 g, Ve/Vt=0.12–0,22), og skipt frekar yfir kísilgelsúluna (φ 7 × 12 cm, CHCl3–MeOH–H2O=10: 3:1, 10 L → 6:4:1, 9 L) til að gefa 16 brot (HPGLB5-1 til HPGLB5-16). Hluti HPGLB5-6 (323,1 mg, Ve/Vt=0.28–0.31) var skipt frekar yfir ODS dálkinn (φ 3 × 14 cm, MeOH–H2O=3:2, 1,2 L → 3:1, 1,5 L) til að gefa tíu brot (HPGLB5-6-1 til HPGLB5-6-10) þar á meðal efnasamband 2 (HPGLB5-6-5, 10,1 mg, Ve/Vt=0 .21–0.23, TLC Rf=0.50 (RP-18 F254S, MeOH–H2O=2:1), Rf=0.45 (Kieselgel 60 F254, CHCl3– MeOH–H2O=7:3:1)).
3.4. Litrófsgögn
Efnasamband 1. Hvítt duft, bm: 138–140 ◦C; [ ] 25 D plús 17,4◦ (c=0.39, MeOH); IR (CaF2 gluggi): 3377, 2932, 1382 cm−1; neikvæð QTOF/MS m/z 713,44723 [M plús COOH]- (reiknað fyrir C37H64O10, 668,4499); 1H- og 13C-NMR gögn, sjá töflu 1.
Efnasamband 2. Hvítt duft, bm: 133–136 ◦C; [ ] 25 D plús 20,2◦ (c=0.50, MeOH); IR (CaF2 gluggi): 3359, 2929, 1384 cm−1; neikvæð QTOF/MS m/z 699,48311 [M plús COOH]- (reiknað fyrir C36H62O10, 654,4323);1H- og 13C-NMR gögn, sjá töflu 1.
3.5. Magngreining á nýju efnasambandi 1 með UPLC-QTOF/MS
Stöðluð stofnlausn af efnasambandi 1 var útbúin með því að leysa upp 1,00 mg hver í 1 ml af metanóli til að gefa styrkleikann 1,00 mg/ml og var haldið við 4 ◦C. Staðlaða stofnlausnin (1) var þynnt með metanóli til að fá kvörðunarlausnir á bilinu 0.{{10}}2–0,8 µg/mL, í sömu röð. Eitt gramm af HPGL útdrætti var vegið nákvæmlega og leyst upp í föstu rúmmáli (10 ml) af metanóli, síað í gegnum 0.20 mm síupappír og geymt í kæli við 4 ◦C . UPLC var framkvæmt með því að nota Waters ACQUITY H-Class UPLC (Waters Corp., Milford, MA, Bandaríkjunum) með ACQUITY BEH C18 súlu (2,1 × 100 mm, 1,7 µm). Færanlegu fasarnir samanstóð af vatni (A) með 0,1 prósent maurasýru (v/v) og asetónítríl (B) með 0,1 prósent maurasýru (v/v). Skolunarstiglinn var sem hér segir: 0–4 mín, B 10–30 prósent; 4–15 mín, B 30–60 prósent; 15–16 mín., B 60–100 prósent; 16–19 mín, B 100–10 prósent . Rennslishraði var 0,45 ml/mín og inndælingarrúmmál var 2 µL fyrir hverja keyrslu.
Næst var HR-MS greining gerð með Waters Xevo G2-S QTOF MS (Waters Corp., Milford, MA, Bandaríkjunum) sem starfaði í neikvæðri jónaham. Massamælarnir framkvæmdu til skiptis há- og lágorkuskannanir sem kallast MSE-upptökuhamur. Nákvæmar massamælingar voru fengnar með því að nota sjálfvirkt kvörðunarkerfi sem innihélt Leucine enkephalin, m/z 554.262 (ESI neg. háttur) sem innri viðmiðun. Bestu rekstrarfæribreytur voru stilltar eins og sýnt er í töflu 3.
3.6. Frumumenning
Melan-a sortufrumur eru mjög litarefni, ódauðleg, venjuleg músa sortufrumufrumulína unnin úr C57BL/6 músum. Melan-a frumurnar sem notaðar voru í þessari rannsókn voru fengnar frá Dr. Dorothy Bennett (St. George's Hospital, London, Bretlandi). Frumur voru ræktaðar við 37 ◦C í andrúmslofti 95% lofts, 10% CO2 í RPMI 1640 miðli bætt við lokastyrk með 10% hitaóvirkjuð sermi frá nautgripum, 1% penicillín/streptomycin og 200 nM PMA. Lífvænleiki frumna var ákvarðaður með CCK-8 frumutalningarbúnaði-8 (Dojindo Lab., Kumamoto, Japan).
3.7. Melanín próf
Melan-a frumur voru meðhöndlaðar með efnasamböndum í 72 klst og síðan voru frumurnar leystar upp í 1 N NaOH við 60 ◦C í 30 mín. Síðan voru lýsötin mæld við 450 nm með litrófsmæli. Gögnin voru stöðluð í samræmi við próteininnihald frumulýsanna. Frumulýsin voru síðan unnin til að ákvarða próteinstyrkinn með því að nota BCA próteinprófunarsett (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL, Bandaríkjunum).
3.8. Uppruni og viðhald foreldrafiska
Fullorðnir sebrafiskar voru fengnir frá söluaðilum og 10–15 fiskar voru geymdir í 5 L akrýltanki með eftirfarandi skilyrðum: 28,5 ◦C, með 14/10 klst ljós/myrkri hringrás. Sebrafiskar voru fóðraðir þrisvar á dag, sex daga vikunnar, með TetraMin flögufóðri ásamt lifandi saltvatnsrækjum (Artemia salina). Fósturvísar voru fengnir úr náttúrulegri hrygningu sem var framkölluð að morgni með því að kveikja á ljósinu. Söfnun fósturvísa var lokið innan 30 mín. Allar tilraunareglur og verklagsreglur voru samþykktar og framkvæmdar samkvæmt samþykktum leiðbeiningum og reglugerðum dýrasiðanefndar Chungnam National University (CNU-00866).
3.9. Meðferð við efnasambönd og mat á svipgerðum
Samstilltum fósturvísum var safnað og raðað með pípettum (7–9 fósturvísar í hverri brunn í 24-brunnsplötum sem innihéldu 1 ml af fósturvísamiðli). Prófefnasambönd voru leyst upp í 0,1 prósent DMSO og síðan bætt við fósturvísamiðilinn frá níu til 72 klst. eftir frjóvgun (hpf) (63 klst. af útsetningu). Áhrifin á litarefni sebrafiska sáust undir stereómíkrósjá. Hrært var af og til, auk þess að skipta um miðil, daglega til að tryggja jafna dreifingu efnasambandanna. Í öllum tilraunum var 0.2 mM 1-fenýl-2-þíúrea (PTU) notað til að búa til gagnsæja sebrafiska án þess að trufla þróunarferlið [33] og var talið staðlað jákvæð viðmiðun. Svipgerðarmat á litarefni líkamans var svæfð með töngum, svæfð í tricaine metansúlfónatlausn (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Bandaríkjunum), sett í 3 prósent metýlsellulósa á 35 mm fat (SPL Lifesciences, Pocheon, Kóreu), og mynduð undir stereómíkrósjánni MZ16 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Þýskalandi).
4. Niðurstöður
Í þessari rannsókn var ginsenoside Rh23 (1) einangrað úr vatnshljóðum Panax ginseng laufum ásamt 20-O- -D-glúkópyranósýl-3 ,6 ,12 ,20 ,25- pentahýdroxýdammar-23-en (2). Okkur hefur almennt gengið vel í tilraunum okkar til að ná fram litarefnaáhrifum efnasambanda úr vatnsræktuðu P. ginsengi. Ginsenosíð Rh23 og 20-O- -D-glúkópyranósýl-3,6 ,12,20,25-pentahýdroxýdammar23-en hafa hamlandi virkni á nýmyndun melaníns án frumudrepandi áhrifa í melan-a frumu. Að auki jók ginsenoside Rh23 litarefnahreinsun sebrafisksins sem annað dýralíkan. Minnkun á melaníninnihaldi og litarefni í líkamanum getur haft möguleika á hvítandi virkni og frumudrepandi áhrifin eru hagstæðari punkturinn vegna þess að öryggi er aðalatriði fyrir hvítunarefni í snyrtivörum.
Þannig, miðað við núverandi niðurstöður okkar, er mikilvægt að hægt sé að nota ný vatnshljóð P. ginseng efnasambönd sem hugsanlegt áhrifaríkt efni til að lýsa húðinni. Frekari rannsóknir munu skýra nákvæma verkun ginsenosíð Rh23 á stjórnun melanínmyndunar og sambandið milli byggingareiginleika ginsenosíðs Rh23 og sortumyndunar, til að ganga úr skugga um hvort það sé hugsanlegt hvítunarefni fyrir snyrtivöruiðnaðinn. Kostir blendings Q-TOF massagreininga eru ekki aðeins gæðagreiningargeta og næmi, heldur einnig nákvæmar mælingar, sem gerir burðarvirki auðveldari. Það er hægt að nota til eigindlegrar og megindlegrar ákvörðunar á minniháttar eða nýjum efnasamböndum, sem hjálpar til við að bæta gæðaeftirlit með ginseng kryddi.
Viðbótarefni:
1H-NMR og 13C-NMR litróf 1 eru fáanleg í viðbótarefninu.
Viðurkenningar:
Þessi vinna var unnin með stuðningi „Samstarfsrannsóknaráætlunarinnar um landbúnaðarvísindi og tækniþróun“ (PJ01136203), byggðaþróunarstofnun, Lýðveldinu Kóreu. Við þökkum Cheol-Hee Kim (Chungnam National University) fyrir að deila sebrafiskaaðstöðunni.
Framlög höfunda:
DYL og N.-IB hugsuðu og hönnuðu tilraunirnar; H.-GK og Y.-GL einangruðu efnasamböndin; DYL skýrði mannvirkin; I.-BJ lagði sitt af mörkum við undirbúning plöntuefna; JHK framkvæmdi líffræðilega greiningu og aðstoðaði við gerð handritsins; JWL og B.-RC framkvæmdu NMR og UPLC-QTOF/MS sýnanna; G.-SK aðstoðaði við endurskoðun handritsins; og DYL skrifaði blaðið og stýrði rannsóknarverkefninu. Allir höfundar lásu og samþykktu lokahandritið.
Hagsmunaárekstrar:
Höfundar lýsa engum hagsmunaárekstrum. Stofnendurnir höfðu ekkert hlutverk í hönnun rannsóknarinnar; söfnun, greiningu eða túlkun gagna; ritun handritsins; eða ákvörðun um að birta niðurstöðurnar.
Heimildir
1. Ben, EW; Michael, W. Lyfjaplöntur heimsins. Í Shinilbooks; Timber Press Inc.: Portland, OR, Bandaríkin, 2007.
2. Park, JD; Rhee, DK; Lee, YH Líffræðileg starfsemi og efnafræði sapónína frá Panax ginseng CA Meyer. Phytochemistry 2005, 4, 159–175. [Krossvísun]
3. Kwon, SJ; Chung, DK Ónæmisbætandi áhrif ginsengs fjallakjóla, fjallaræktaðs ginsengs og Panax ginsengs. J. Orient. Taugageðlækningar 2004, 15, 89–101.
4. Gillis, CN Panax ginseng lyfjafræði: Nituroxíð hlekkur? Biochem. Pharmacol. 1997, 54, 1–8. [Krossvísun]
5. Kang, KS; Yamabe, N.; Kim, HY; Yokozawa, T. Áhrif sól ginseng metanóls útdráttar á lifrarskaða af völdum lípópólýsykru hjá rottum. Phytomedicine 2007, 14, 840–845. [CrossRef] [PubMed]
6. Jiang, S.; Ren, D.; Li, J.; Yuan, G.; Li, H.; Xu, G.; Han, X.; Du, P.; An, L. Áhrif efnasambands K á blóðsykurshækkun og insúlínviðnám hjá rottum með sykursýki af tegund 2. Fioterapia 2014, 95, 58–64. [CrossRef] [PubMed]
7. Kim, HS; Lee, EH; Ko, SR; Choi, KJ; Park, JH; Im, DS Áhrif ginsenoside Rg3 og Rh2 á útbreiðslu krabbameinsfrumna í blöðruhálskirtli. Arch. Pharm. Res. 2004, 27, 429–435. [CrossRef] [PubMed]
8. Nocerino, E.; Amato, M.; Izzo, AA Ástardrykkur og aðlögunarfræðilegir eiginleikar ginsengs. Fitoterapia 2000, 71, S1–S5. [Krossvísun]
9. Keum, YS; Park, KK; Lee, JM; Chun, KS; Park, JH; Lee, SK; Kwon, HJ; Surh, YJ Andoxunarefni og æxlishvetjandi virkni metanólútdráttar úr hitaunnnu ginsengi. Krabbamein Lett. 2000, 150, 41–48. [Krossvísun]
10. Kim, GS; Lee, SE; Nei, HJ; Kwon, H.; Lee, SW; Kim, SY; Kim, YB Áhrif náttúrulegra lífvirkra vara á vöxt og ginsenosíðinnihald Panax ginsengs sem er ræktað í loftþrýstingskerfi. J. Ginseng Res. 2012, 36, 430–441. [CrossRef] [PubMed]
11. Choi, SY; Cho, CW; Lee, YM; Kim, SS; Lee, SH; Kim, KT Samanburður á innihaldi ginsenosíðs og fenóls innihaldsefna í vatnsræktuðum ginsenglaufum, ávöxtum og rótum. J. Ginseng Res. 2012, 36, 425–429. [CrossRef] [PubMed]
12. Matsuda, H.; Nakamura, S.; Kubo, M. Rannsóknir á naglaböndum úr náttúrulegum uppruna. II. Hamlandi áhrif Prunus plantna á nýmyndun melaníns. Biol. Pharm. Naut. 1994, 17, 1417–1420. [CrossRef] [PubMed]
13. Duncan, CL; Foster, EM Áhrif natríumnítríts, natríumklóríðs og natríumnítrats á spírun og útvöxt loftfirrtra gróa. Appl. Örverur. 1968, 16, 406–411. [PubMed]
14. Shimizu, K.; Yasutake, S.; Kondo, R. Nýtt stilben með týrósínasahamlandi virkni frá Chlorophora skarar fram úr. Chem. Pharm. Naut. 2003, 51, 318–319. [CrossRef] [PubMed]
15. Park, SH; Kim, DS; Kim, WG; Ryoo, IJ; Lee, DH; Ha, CH; Youn, SW; Jú, auðkenni; Park, KC Terrin: Nýr sortumyndunarhemill og vélbúnaður hans. Cell. Mol. Lífið 2004, 61, 2878–2885. [CrossRef] [PubMed]
16. Kong, YH; Jo, YO; Cho, CW; Sonur, DW; Park, SJ; Rho, JH; Choi, SY Hindrandi áhrif kanilsýru á nýmyndun melaníns í húðinni. Biol. Pharm. Naut. 2008, 31, 946–948. [CrossRef] [PubMed]
17. Hwang, EY; Choi, SY Magngreining á fenólsamböndum í mismunandi hlutum Panax ginseng CA Meyer og hamlandi áhrif þess á nýmyndun melaníns. Kóreumaður J. Med. Uppskera Sci. 2006, 14, 148–152.
18. Im, SJ; Kim, KN; Yun, YG; Lee, JC; Mun, YJ; Kim, JH; Woo, WH Áhrif radix ginsengs og radix trichosanthis á sortumyndun. Biol. Pharm. Naut. 2003, 26, 849–853. [CrossRef] [PubMed]
19. Hwang, EY; Kong, YH; Lee, YC; Kim, YC; Jú, KM; Jo, YO Samanburður á innihaldi fenólefnasambanda milli hvíts og rauðs ginsengs og hamlandi áhrif þeirra á nýmyndun melaníns. J. Ginseng Res. 2006, 30, 82–87.
20. Zhang, YC; Pí, ZF; Liu, CM; Söngur, FR; Liu, ZQ; Liu, SY Greining á lágskautuðum ginsenósíðum í gufusoðnu Panax ginsengi við háan hita með HPLC-ESI-MS/MS. Chem. Res. Haka. Univ. 2012, 28, 31–36.
21. Xie, YY; Luo, D.; Cheng, YJ; Ma, JF; Wang, YM; Liang, QL; Luo, GA Efnabreytingar af völdum gufu og heildrænt gæðamat á rauðu ginsengi úr Panax ginsengi með því að nota HPLC-ESI-MS/MSn byggt fjölþátta magnfingrafara. J. Agric. Food Chem. 2012, 60, 8213–8224. [CrossRef] [PubMed]
22. Liu, GY; Li, XW; Wang, NB; Zhou, HY; Wei, W.; Gui, MÍN; Yang, B.; Jin, YR Þrjú ný dammarane-gerð triterpene saponín úr laufum Panax ginseng CA Meyer. J. Asian Nat. Framl. Res. 2010, 12, 865–873. [CrossRef] [PubMed]
23. Xing, Q.; Liang, T.; Shen, G.; Wang, X.; Jin, Y.; Liang, X. Alhliða HILIC x RPLC með massagreiningu til greiningar á sapónínum í Panax notoginseng. Sérfræðingur 2012, 137, 2239–2249. [CrossRef] [PubMed]
24. Ást, DR; Pichler, FB; Dodd, A.; Copp, BR; Greenwood, DR Tækni fyrir skjá með miklum afköstum: Nútíð og framtíð með sebrafiski. Curr. Opin. Líftækni. 2004, 15, 564–571. [CrossRef] [PubMed]
25. Uwe, S.; Stefán, S.; Pobert, G.; Petra, G.; Henner, H.; Sepand, R.; Axel, S.; Ingrid, S.; Carsten, W.; Hilda, W.; o.fl. Fósturvísar sebrafiska sem valkostur við dýratilraunir - Umsögn um skilgreiningu á upphaf verndaðs lífsstigs í reglugerðum um velferð dýra. Reprod. Toxicol. 2012, 33, 128–132.
26. Chio, TY; Kim, JH; Ko, DH; Kim, CH; Hwang, JS; Ahn, S.; Kim, SY; Kim, geisladiskur; Lee, JH; Yoo, TJ Zebrafish sem nýtt líkan fyrir skimun sem byggir á svipgerðum á sortuvaldandi eftirlitssamböndum. Pigment Cell Res. 2007, 20, 120–127. [CrossRef] [PubMed]
27. Elsalini, OA; Rohr, KB Phenylthiourea truflar starfsemi skjaldkirtils við þróun sebrafiska. Dev. Gen Evol. 2003, 212, 593–598. [PubMed]
28. Lee, DY; Cha, BJ; Lee, YS; Kim, GS; Nei, HJ; Kim, SY; Kang, HC; Kim, JH; Baek, NI Möguleikinn á minniháttar ginsenósíðum einangruðum úr laufum Panax ginsengs sem hemlar sortumyndunar. Alþj. J. Mol. Sci. 2015, 16, 1677–1690. [CrossRef] [PubMed]
29. Li, J.; Huang, M.; Teoh, H.; Maður, RY Panax quinquefolium saponín verndar lágþéttni lípóprótein gegn oxun. Lífvísindi. 1999, 64, 53–62. [Krossvísun]
30. Li, TSC; Mazza, G.; Cottrell, AC; Gao, L. Ginsenósíður í rótum og laufum amerísks ginsengs. J. Agric. Food Chem. 1996, 44, 717–720. [Krossvísun]
31. Jung, CH; Seog, HM; Choi, IW; Park, MW; Cho, HY Andoxunareiginleikar ýmissa leysiseyðis úr villtum ginsenglaufum. LWT 2006, 39, 266–274. [Krossvísun]
32. National Institute of Crop Science. Ginseng GAP Standard ræktunarleiðbeiningar; National Institute of Crop Science, Rural Development Administration: Suwon, Kóreu, 2009.
33. Karlsson, J.; Von Hofsten, J.; Olsson, PE Að búa til gagnsæjan sebrafisk: Fáguð aðferð til að bæta greiningu á tjáningu gena við fósturþroska. Mar. Líftækni. 2001, 3, 522–527. [CrossRef] [PubMed]
Dæmi um framboð:
Sýnishorn af efnasamböndum 1 og 2 eru fáanleg hjá höfundum.
Dae Young Lee 1 ID , Hyoung-Geun Kim 2 , Yeong-Geun Lee 2 , Jin Hee Kim 3 , Jae Won Lee 1 ID , Bo-Ram Choi 1 , In-Bae Jang 1 , Geum-Soog Kim 1 og Nam-In Baek 2,*
1 Department of Herbal Crop Research, National Institute of Horticultural and Herbal Science, RDA, Eumseong 27709, Kóreu; dylee0809@gmail.com (DYL); jaewon3@gmail.com (JWL); bmcbr@korea.kr (B.-RC); ikanet@korea.kr (I.-BJ); kimgs0725@korea.kr (G.-SK)
2 Department of Oriental Medicine Biotechnology, Kyung Hee University, Yongin 17104, Kóreu; zwang05@naver.com (H.-GK); lyg629@nate.com (Y.-GL)
3 College of Herbal Bio-industry, Daegu Haany University, Gyeongsan 38610, Korea; gonogo1@nate.com
Móttekið: 28. nóvember 2017; Samþykkt: 26. janúar 2018; Birt: 29. janúar 2018
For more information:1950477648nn@gmail.com
