In vitro mat á P-gp-miðluðum lyfja- og lyfjamilliverkunum með því að nota RPTEC/TERT1 manna nýrnafrumulíkanið
Mar 01, 2022
Kynning In vitro mat á hömlunarmöguleikum P-glýkópróteina (P-gp) er mikilvægt atriði í lyfjaþróunarferlinu, þar sem það gerir kleift að spá fyrir um klínískt mikilvægar lyfjamilliverkanir (DDI) [1-3]. P-gp tilheyrir ATP-bindandi snælda (ABC) yfirfjölskyldunni og er kóðað af fjöllyfjaónæmisgeninu MDR1 (einnig þekkt sem ABCB1). Vitað er að þessi himnuflutningsefni er oftjáður í æxlisfrumum og veldur ónæmi fyrir mörgum krabbameinslyfjum [4]. Staðsett innan allra lífeðlisfræðilegra hindrana, þar á meðal þarma, lifur ognýru, P-gp verndar gegn útlendingalyfjum með því að takmarka frásog þessara hvarfefna úr meltingarveginum og auðvelda útflæði þeirra í gall og þvag. Þannig gegnir P-gp áberandi hlutverki í lyfjahvörfum ýmissa lækningaflokka [5-7]. Vitað er að fjöldi lyfja eins og krabbameinslyf, sveppalyf og hjarta- og æðalyf eru P-gp hvarfefni og/eða hemlar og mörg þeirra taka þátt í klínískt mikilvægum milliverkunum [8-10]. Þess vegna skipar Matvæla- og lyfjaeftirlit Bandaríkjanna (FDA) að meta þurfi möguleika á að hamla P-gp á fyrstu stigum lyfjaþróunar. In vitro prófanir sem gerðar eru í þessu skyni eru almennt byggðar á lyfjaflutningsrannsóknum með því að nota P-gp-tjáandi frumulínur. Nánar tiltekið mæla leiðbeiningar FDA með því að ákvarða in vitro gildum hálfhámarks hamlandi styrks (IC50) til að meta hættuna á klínískum DDI sem stafar af P-gp hömlun. Í þessu skyni hafa margar tilraunagreiningar verið gerðar og flestar þeirra hafa beinst að lyfjamilliverkunum sem tengjast frásogi í þörmum með því að nota Caco-2 eða MDCK-MDR1 líkanin [11–13]
CISTANCHE mun bæta nýrna-/nýrnasjúkdóm
Síðannýrubrotthvarf er einnig algeng brotthvarfsleið fyrir ýmsa flokka lyfja, virk pípluseyting í gegnum ABC flutningstæki getur einnig gegnt lykilhlutverki í þessum milliverkunum [14]. Hins vegar in vitro gögn umnýruDDI sem miðlað er af P-gp eru takmörkuð. Þetta er að hluta til vegna skorts á þróun og lýsingu á in vitro líkönum til að spá fyrir umnýrufíkniefnaflutningar. Meðal ýmissa manna frumulína virðist RPTEC/TERT1 líkanið sýna loforð um mat ánýrulyfjamilliverkanir. Þessi frumulína er fengin frá heilbrigðum gjöfum úr mönnum og hefur verið mynduð úr ódauðlegum nærpíplufrumum. Ennfremur hefur verið sýnt fram á tjáningu og virkni P-gp með því að nota þetta líkan, sem staðfestir þannig getu þess til að spá fyrir umnýrulyfjaáhrif [15, 16]. Í þessu samhengi var þessi rannsókn hönnuð til að kanna P-gp hemlunarmöguleika með því að nota RPTEC/TERT1 líkanið. Fyrst var rhodamine 123 (R123) uppsöfnunarskimunarpróf gerð til að fá hömlunarpróf fyrir hvert prófað lyf. Á grundvelli þessarar skimunar voru fjögur lyf síðan valin til að meta þéttniháð áhrif þeirra á innanfrumuuppsöfnun tveggja P-gp hvarfefnislyfja: apixaban og rivaroxaban
Leitarorð:nýrnafruma, nýrnalíkan, nýrnalyf, brotthvarf um nýru, nýru.
Efni og aðferðir
HvarfefniApixaban, [2H71 3C] - api xa ban, riva r oxa ban,[13C6]-rivaroxaban, nilotinib, crizotinib, erlotinib, axitinib, idelalisib, warfarin og dabigatran etexilat voru keypt frá Alsachim, Illkirch (Illkirch) Frakkland). Verapamil, ketoconazol, simvastatin, amiodarone, rhodamine 123, Hank's balanced salt solution (HBSS) og HEPES lausn voru keypt frá Sigma-Aldrich (Saint-Quentin-Fallavier, Frakklandi).
Frumumenning RPTEC/TERT1 frumur voru fengnar frá American Type Culture Collection (ATCC, Molsheim, Frakklandi) og ræktaðar í hormónavörðum, sermifríum miðli sem samanstóð af Dulbecco's Modifed Eagle's Medium F12 (ATCC) ásamt vaxtarþáttasetti (ATCC) og a 1 prósent sýklalyfja/sveppalyfjablöndu (penicillín–streptomycin, amfótericín B) við 37 gráður og 5 prósent CO 2. Fyrir allar tilraunirnar var frumum sáð í 96-brunnsplötur með þéttleikanum 50,000 frumur í hverri brunn og voru notaðar til að vaxa eftir 14 daga ræktun. Miðillinn var endurnýjaður á tveggja daga fresti og frumur voru notaðar frá göngu 27 til göngu 34. Caco-2 frumur voru einnig keyptar frá ATCC. Frumunum var haldið í ræktunarmiðli sem samanstóð af Eagle's Minimal Essential Medium (Sigma–Aldrich, Missouri, Bandaríkjunum) bætt við 10 prósent FBS, 1 prósent ónauðsynlegar amínósýrur og 1 prósent sýklalyfja/sveppalyfjablöndu (penicillín-streptomycin, amfótericín B). ) við 37 gráður og 5 prósent CO2. Caco-2 frumum var sáð í 96-brunnsplötur með þéttleikanum 5 × 10 3 frumur í hverri brunn og voru notaðar til að vaxa eftir 14 daga ræktun. Pípulaga þekjufrumur úr mönnum (HPTEC) voru fengnar frá BIOPREDIC (Rennes, Frakklandi) og ræktaðar í DMEM/F12 ásamt hýdrókortisóni, EGF, insúlíni, transferríni og natríumseleníti. Frumum var sáð í 96-brunn kollagenhúðaðar ræktunarplötur með þéttleikanum 6600 frumur í hverri brunn og voru notaðar til að vaxa eftir 11 daga ræktun.
Rhodamine 123 uppsöfnunarskimunarpróf Hömlunarmöguleiki P-gp var ákvarðaður með því að mæla innanfrumuuppsöfnun rhodamine 123 í RPTEC/TERT1 frumum í nærveru og fjarveru ýmissa lyfjaflokka. Meðal 14 lyfja sem prófuð voru voru cyclosporin A (10 µM), ketókónazól (50 µM), verapamíl (100 µM) og amíódarón (50 µM) notuð sem P-gp hemlar. Apixaban, rivaroxaban og dabigatran etexílat — þrjú bein segavarnarlyf til inntöku (DOAC) — voru notuð sem P-gp hvarfefni (10 µM). Warfarín (50 µM) var notað sem ekki hemill og fimm krabbameinslyf, þar á meðal nilotinib, crizotinib, erlotinib og idelalisib, voru notuð án þess að vita um hömlunarprófanir þeirra í styrkleikanum 10 µM. Nokkrar aðstæður voru afritaðar með Caco-2 frumunum, sem eru samþykktar af FDA fyrir lyfjaflutningsrannsóknir. Á þennan hátt var innanfrumu varðveisla rhodamine 123 ákvarðað í Caco-2 frumum í nærveru og fjarveru verapamíls (100 µM), cyclosporin A (10 µM), nilotinib (10 µM) og DOACs (10 µM) ). Í stuttu máli, eftir 14 daga ræktun í 96-brunnplötum, voru frumurnar forræktaðar í 10 mínútur við 37 gráður með hverju lyfi leyst upp í HBSS með 10 mM HEPES (v/v). Síðan voru frumurnar ræktaðar með 10 µM rhodamine 123 í 45 mínútur við 37 gráður. Að lokum, eftir þrjá þvotta í köldu HBSS/HEPES lausn, voru frumurnar leystar við stofuhita í 45 mínútur í lausn af natríumdódecýlsúlfati (SDS) sem innihélt 1 prósent natríumbórat. Magnið af intracellularrhodamine 123 var magnmælt með því að nota Infnite M nanólitrófsmæli (Life Sciences, TECAN, Sviss) og stillti bylgjulengdirnar á 485/535 nm. Gögnin voru gefin upp sem prósentur af rhodamine 123 uppsöfnuninni í samanburðarfrumum sem ekki hafa verið útsettar fyrir neinum hugsanlegum P-gp hemlum og geðþótta stillt á 100 prósent uppsöfnun.
DOAC innanfrumuuppsöfnunarpróf og IC50 ákvörðun Úr fyrri rhodamine 123 skimunarprófinu voru fjögur lyf valin til að rannsaka styrkleikaháð áhrif þeirra á innanfrumu uppsöfnun apixabans og rivaroxabans (10 µM) í RPTEC/TERT1 frumum. Ketoconazol, crizotinib og nilotinib voru valin sem P-gp hemlar og warfarin var valið sem ekki hemill. Cyclosporin A (10 µM) var notað sem breiðvirkur hemill á flutningsefni. Rannsóknir á milliverkunum milli DOAC og nilotinibs til að ákvarða IC50 gildi voru endurgerðar í Caco-2 frumum til að bera saman frumulíkönin tvö. Öll efnasamböndin voru þynnt annaðhvort eitt sér eða með tilheyrandi hemli í HBSS flutningsþjöppu sem bætt var við 1 prósent HEPES (v/v) og 1 prósent DMSO (v/v). Fyrir ræktun voru allar lausnir hitaðar í 37 gráður og pH var stillt í 7,4. Fyrir krabbameinslyfin crizotinib og nilotinib, vegna lélegrar leysni þeirra og frumudrepandi möguleika, var styrkur á bilinu 0,1 til 25 µM. Fyrir ketókónazól og warfarín var styrkurinn á bilinu 0,1 til 100 µM. Í stuttu máli, eftir 14 daga ræktun, voru öll lyf leyst upp í HBSS með 1 prósent HEPES (v/v) forræktuð í 10 mínútur við 37 gráður. Síðan voru frumur ræktaðar með 10 µM af apixaban eða rivaroxaban í 60 mínútur við 37 gráður. Að lokum, eftir þrjá þvott í köldu HBSS/HEPES lausn, voru frumur ljósaðar við stofuhita í 45 mínútur í 0,2 prósent lausn af Triton X -100. Magn innanfrumu DOAC var síðan magnmælt með vökvaskiljun-massagreiningu (LC-MS). Gögnin voru gefin upp sem prósentuhækkanir á DOAC uppsöfnun og DOAC innanfrumuuppsöfnun var geðþótta stillt á 100 prósent í samanburðarfrumum. IC50 gildin fyrir hömlun á P-gp virkni, sem samsvara helmingi hámarks áhrifastyrk (EC50) gildum til að auka DOAC uppsöfnun, voru ákvörðuð út frá óveginni ólínulegri minnstu ferninga aðhvarfslíkönum af aukinni uppsöfnun með 'nls()' fallinu í R hugbúnaður, samkvæmt eftirfarandi jöfnu (jöfnu 1):
Vökvaskiljun–massalitrófsgreiningMagngreining á apixabani (m/z 460.19793) og rivaroxaban (m/z 436.07285) var framkvæmd með Ultimate U300{{18 }} vökvaskiljunarkerfi (Dionex, Sunnyvale, CA, Bandaríkjunum) ásamt Q-Exactive Plus massagreiningarmæli (ThermoFisher, Bremen, Þýskalandi). LC aðskilnaður náðist með því að nota Hypersil Gold C18 (3 µm, 50 × 2,1 mm) greiningarsúlu (ThermoFisher Scientifc, Waltham, MA, Bandaríkjunum) og flæðihraða 0,6 ml/mín. . Hreyfanlegur fasi A var vatn með 0,1 prósent maurasýru (FA) og hreyfanlegur fasi B var asetónítríl með 0,1 prósent FA. Fyrir rivaroxaban var hallinn: 0–0,3 mín, 10 prósent B; 0,3–1 mín, línuleg frá 10 prósentum í 70 prósent B; 1–1,5 mín., 70 prósent B; 1,51 mín, farið aftur í upphafsskilyrði þar til 3 mín. Fyrir apixaban var hallinn: 0–0,3 mín, 10 prósent B; 0,3–0,7 mín., línuleg frá 10 til 90 prósent B; 0,7–1,5, 90 prósent B; 1,51 mín, farið aftur í upphafsskilyrði þar til 3 mín. Greining var framkvæmd í rafúða-jákvæðum samhliða viðbragðsvöktun (PRM) ham við upplausnina 35,000 (við m/z 200). Innri staðlar (IS) voru [13C,2H7]-apixaban (m/z 468.2452) fyrir apixaban og [13C6]-rivaroxaban (m/z 442.09297) fyrir rivaroxaban. Fyrir hvert lyf og viðkomandi IS var fylgst með markjóni (til magngreiningar) og staðfestingarjón. Fyrir rivaroxaban og IS þess var markjónin m/z 144,95125 og staðfestingarjónirnar m/z 231,11280 og m/z 237,13298, í sömu röð. Fyrir apixaban og IS þess var markjónin m/z 199,08656 og staðfestingarjónirnar m/z 282,12387 og m/z 241,06062, í sömu röð.
Niðurstöður
Rhodamine 123 uppsöfnunarskimunarprófRhodamine 123 uppsöfnunarskimunargreiningin var framkvæmd í RPTEC/TERT1 frumum með 14 lyfjum með mismunandi hömlunarpróf (mynd 1). Eins og búist var við var innanfrumuuppsöfnun rhodamine 123 í viðurvist cýklósporíns A, breiðvirks hemils, með því hæsta, með aukningu á uppsöfnun um 75 prósent samanborið við samanburðarfrumurnar. Tilvist verapamíls, sem er sérstakur P-gp hemill, leiddi til aukningar á uppsöfnun rhodamine 123 um 57 prósent, sem sýnir þátttöku P-gp. Á sama hátt leiddi ketókónazól, sem lýst er sem sterkum P-gp hemli, til meiri aukningar (66 prósent) á innanfrumuuppsöfnun rhodamine 123 samanborið við verapamíl, sem staðfestir hömlunarpróf þess. Aftur á móti olli viðbót amíódaróns, sem einkenndist sem miðlungsmikill P-gp hemill, aukningu á uppsöfnun um 59 prósent, sem er svipað því sem stafar af verapamíl. Mismunandi hömlunarpróf komu fram fyrir krabbameinslyfin nilotinib, axitinib, crizotinib, erlotinib og idelalisib. Viðbót á nilotinibi olli mikilli aukningu á uppsöfnun rhodamine 123 (71 prósent), sem bendir til umtalsverðs hamlandi möguleika, síðan axitinib, sem olli aukningu á varðveislu um 57 prósent. Á hinn bóginn sýndu crizotinib og erlotinib miðlungs til litla hemlunarmöguleika, með aukningu á rhodamine 123 uppsöfnun um 23 prósent og 16 prósent, í sömu röð. Idelalisib hafði ekki áhrif á uppsöfnun rhodamine 123; sama gilti um warfarín, sem var
valinn sem óhemjandi. Meðal þriggja DOACs olli apixaban og rivaroxaban lítilsháttar aukningu á varðveislu rhodamine 123: 33 prósent og 12 prósent, í sömu röð. Athyglisvert er að dabigatran etexílat, forlyf dabigatrans og þekkt hvarfefni P-gp, olli aukningu á varðveislu rhodamine 123 um 50 prósent, þó að því sé ekki lýst sem hugsanlegum P-gp hemli. Að lokum olli viðbót simvastatíns aðeins lítilsháttar aukningu á uppsöfnun eldfljótandi undirlagsins (32 prósent). Á grundvelli þessarar skimunar voru fjögur lyf valin til að meta styrkleikaháð áhrif þeirra á innanfrumuuppsöfnun apixabans og rivaroxabans innan RPTEC/TERT1 líkansins. Ketókónazól var valið sem jákvætt viðmiðunarskilyrði fyrir P-gp hömlun og warfarín var valið sem ekki hemill P-gp fyrir neikvæða samanburðarástandið. Nilotinib og crizotinib voru valin sem sterkir og miðlungsmiklir P-gp hemlar, í sömu röð. Nokkrar aðstæður voru afritaðar með viðmiðunarlíkaninu, Caco-2. Innanfrumuuppsöfnun R123 í frumum var ákvörðuð eftir samsetningu (eða ekki) með apixaban og rivaroxaban (10 µM), nilotinib (10 µM) og með cyclosporin A (10 µM) og verapamíl (100 µM) fyrir viðmiðunarskilyrði fyrir hömlun (Mynd 2A). Eins og búist var við, ollu verapamíl og cyclosporin A mikilli aukningu á R123 varðveislu um 297 prósent og 275 prósent, í sömu röð. Á sama hátt olli nilotinib mikilli aukningu á innanfrumuuppsöfnun R123 (229 prósent), sem staðfestir hindrandi möguleika þess. Sameining R123 og DOAC leiddi til minniháttar aukningar á uppsöfnun R123 (40–44 prósent) samanborið við önnur lyf. Þar að auki, innanfrumu uppsöfnun rhodamine 123 í fjarveru og nærveru cyclosporin A ínýrufrumfrumur úr mönnum voru einnig rannsakaðar í þessari rannsókn til að athuga áreiðanleika niðurstaðna sem fengust með RPTEC/TERT1 frumum (mynd 2B). Þessar greiningar sýndu að tilvist cýklósporíns A jók R123 varðveisluna um 71 prósent. Þetta gildi var nálægt því sem fæst við sömu aðstæður með RPTEC/TERT1 frumum (hækkun um 75 prósent með cyclosporin A). Þess vegna var virkni P-glýkópróteins svipuð í RPTEC/TERT1 líkaninu og frumum úr mönnum.
DOACs innanfrumuuppsöfnunarpróf: IC50 og I1/IC50 hlutfallsákvörðun Innanfrumuuppsöfnunarrannsóknir voru gerðar til að meta P-gp-miðlaðan flutning apixabans og rivaroxabans við stöðugan styrk 10 µM í RPTEC/TERT1 frumum in vitro og í viðurvist aukins styrks nilotinibs, crizotinibs, ketókónazóls. , og warfarín (myndir 2, 3). Líkanagerð á aukinni varðveislu apixabans og rivaroxabans var metin til að ákvarða IC50 gildi. Sameining DOACs og nilotinibs leiddi til lægstu IC50-gildanna: 0,85 µM og 1,37 µM fyrir rivaroxaban og apixaban, í sömu röð (myndir 4, 5). Samsetning með crizotinibi gaf IC50 gildi upp á 10,1 µM og 12,2 µM fyrir rivaroxaban og apixaban, í sömu röð. Það kemur á óvart að sameining DOACs og ketókónazóls gaf ekki lægstu IC50 gildin (16,5 µM og 16,9 µM fyrir rivaroxaban og apixaban, í sömu röð). Að lokum, eins og búist var við, samsetning með warfaríni, sem var
valinn sem ekki hemill, hafði ekki áhrif á innanfrumuhald DOACs tveggja. Innanfrumuuppsöfnun bæði apixabans og rivaroxabans í Caco-2 frumum í viðurvist aukins styrks nilotinibs var því rannsökuð til samanburðar við frumulíkönin. Athyglisvert er að eins og sést með RPTEC/TERT1 líkaninu var IC50 gildi fyrir rivaroxaban (4,16 µM) lægra en það sem fæst fyrir apixaban (9,35 µM). Það er líka athyglisvert að IC50 gildin sem sáust í Caco-2 frumum voru hærri en þau sem fengust í RPTEC/TERT1 frumum fyrir sama hemil. Hægt er að spá fyrir um klíníska þýðingu DDI lyfja út frá in vitro gögnum. Samkvæmt leiðbeiningum FDA voru [I1]/IC50 hlutföll reiknuð út fyrir hverja samsetningu lyfja. Þetta hlutfall gerir kleift að bera saman styrkleika in vivo við þá sem vitað er að valda viðeigandi áhrifum in vitro. Fyrir apixaban í RPTEC/TERT1 frumum voru hlutföllin 3,1, 0,06 og 17,4 með nilotinib, crizotinibi og ketókónazól, í sömu röð (tafla 1). Í Caco-2 frumum var [I1]/IC50 hlutfallið 0,46 fyrir milliverkun apixabans og nilotinibs (tafla 1). Fyrir rivaroxaban voru hlutföllin aðeins hærri en þau sem fengust fyrir apixaban í RPTEC/TERT1 frumum: 5,1, 0,08 og 17,7, í sömu röð, fyrir nilotinib, crizotinib og ketoconazol (tafla 2). Á sama hátt var [I1]/IC50 hlutfallið sem sást fyrir milliverkun rivaroxabans og nilotinibs í Caco-2 frumum 1,03, sem var hærra en það sem fæst fyrir apixaban (tafla 2).
Umræða
Fjölmargar rannsóknir sem gerðar hafa verið á undanförnum áratugum hafa greint frá áberandi hlutverki P-gp í lyfjahvörfum lyfja [17-19]. Með hliðsjón af auknum eftirlitsáhuga á milliverkunum lyfja sem miðlað er af P-gp, eru in vitro prófanir til að kanna hindrandi möguleika lyfja mikilvægur þáttur í lyfjaþróun og klínískri framkvæmd. Í þessu skyni hafa margar in vitro prófanir verið gerðar og flest tilheyrandi gögn um spáð frásog í þörmum hafa verið framleidd úr Caco-2 og MDCK-MDR1 frumulínum [20-22]. Hins vegar eru fáar upplýsingar tiltækar um virka pípluseytingu lyfja, sem einnig gegnir lykilhlutverki í lyfjaúthlutun og er háð tilvist ABC flutningsefna. Þessi athugun er greinilega tengd við skort á einkennandinýrufrumulínur til að spá fyrir um lyfnýruefux. Þetta markmið krefst in vitronýrulíkan sem líkir náið eftir lífeðlisfræðilegu hindruninni. Mannfrumulínan RPTEC/TERT1, sem tjáir nokkra ABC flutningsefni (sérstaklega P-gp), virðist vera góður valkostur, eins og sýnt var í fyrri rannsókn [16]. Í þessu samhengi rannsakaði þessi vinna beitingu RPTEC/TERT1 líkansins til að meta möguleika á P-gp hemlun. Eftir því sem við best vitum er þessi vinna sú fyrsta til að veita gögn úr P-gp hömlunarrannsóknum með mönnumnýrufrumur.
In vitro mælingar til að ákvarða P-gp hemlunarmöguleika eru almennt byggðar á notkun sérstakrar viðmiðunar P-gp hvarfefnis, eins og digoxín eða rhodamine 123 [23-25]. Vegna auðveldrar notkunar eru eldskynjarar hagkvæmir fyrir mælingar með háum afköstum. Þar að auki hefur rhodamine 123 verið mikið notað til að greina P-gp virkni í fjölmörgum rannsóknum [26-28]. Á þennan hátt voru gerðar mælingar á rhodamine 123 uppsöfnun í RPTEC/TERT1 frumum í þessari rannsókn til að bera kennsl á hömlunarpróf 14 lyfja. Meðal þessara lyfja voru cyclosporin A, ketókónazól og verapamíl valin sem sterkir P-gp hemlar. Þessir hemlar hafa verið taldir umtalsvert fyrir marktæka P-gp hemlunarmöguleika þeirra, sem leiðir til mótunar á bæði digoxíni og rhodamine 123 flutningi [27, 29, 30]. Eins og búist var við ollu þessi lyf hæstu rhodamine 123 varðveislu í RPTEC/TERT1 frumum. Aftur á móti sást engin aukning á varðveislu R123 með warfaríni, sem var notað sem neikvæð viðmiðun, sem staðfestir áreiðanleika RPTEC/TERT1 líkansins. Athyglisvert er að meðal allra prófaðra lyfja ollu DOACs - þar á meðal dabigatran etexílat, apixaban og rivaroxaban - áberandi aukningu á varðveislu R123, jafnvel þó að þau hafi ekki áður verið einkennd sem hemlar, aðeins P-gp hvarfefni [31, 32]. Þessi athugun gæti stafað af tilvist svokallaðrar „samkeppnis“ hömlunar, þar sem lyfin geta haft samskipti við sömu bindistaði á P-gp. Vel einkennandi staðirnir fyrir P-gp eru H-staðurinn (til að binda Hoechst 33342) og R-staðurinn (til að binda rhodamine 123). Hins vegar gætu mörg önnur óþekkt lyfjabindingarsvæði gegnt hlutverki í þessum milliverkunum, sem gæti útskýrt mismunandi áhrif DOACs á uppsöfnun R123 [33, 34]. P-gp hömlun sem sést fyrir tiltekið lyf er því háð hvarfefninu sem notað er í in vitro rannsóknum [28, 35]. Því ætti að íhuga notkun mismunandi P-gp hvarfefna sem hafa samskipti við mismunandi lyfjabindistaði til að lýsa nákvæmlega hugsanlegum P-gp hamlandi virkni lyfja. Það er líka áhugavert að hafa í huga að nokkrar aðstæður frá rhodamine 123 skimun voru einnig gerðar í Caco-2 frumum til að bera RPTEC/TERT1 frumurnar saman við viðmiðunarlíkan í lyfjaflutningsrannsóknum. Eins og búist var við ollu cyclosporin A, verapamil og nilotinib mestu aukningu á rhodamine varðveislu. Sömu hömlunarprófanir sáust með bæði Caco-2 og RPTEC/TERT1 frumum. Hins vegar var aukningin á rhodamine 123 varðveislu sem myndaðist af milliverkunum í Caco-2 líkaninu meiri en þær sem sáust í RPTEC/TERT1 frumum, sem bendir til hugsanlegs munar á tjáningu P-glýkópróteins milli líkana. Þess vegna, í núverandi rannsókn var önnur aðferð notuð til að meta og staðfesta hugsanlega hömlun lyfja á P-gp.
CISTANCHE MUN BÆTA NÝRA/NÝRASKILUN
Byggt á rhodamine 123 uppsöfnunarprófinu voru fjögur lyf valin til að ákvarða styrkleikaháð áhrif þeirra á innanfrumu uppsöfnun apixabans og rivaroxabans. Sýnt hefur verið fram á að P-gp gegnir aðalhlutverki í efuxi apixabans og rivaroxabans [32, 36]. IC50 gildi nilotinibs, crizotinibs og ketókónazóls voru því metin, þar sem DOAC voru valin sem „fórnarlamb“ lyfin. Eftir því sem við best vitum er þessi rannsókn sú fyrsta til að framkvæma innanfrumuuppsöfnunarrannsóknir með DOAC í mönnumnýrufrumur. IC50 gildin sem fengust fyrir nilotinib og crizotinib voru í samræmi við hömlunarprófanir þeirra sem fengust með rhodamine 123 uppsöfnunarprófinu. Nilotinib, sem olli mikilli aukningu á varðveislu R123, sýndi lægsta IC50 gildið fyrir DOAC tvö, sem staðfestir mikla hömlunarmöguleika þess. Þessi niðurstaða er einnig í samræmi við fyrri rannsókn sem sýndi þéttniháða aukningu á innanfrumuuppsöfnun [3H]-paclitaxels í MDR1-umgefnum frumum, sem bendir til þess að það hafi hemlapróf [37]. Fyrir crizotinib sýndi R123 prófið í meðallagi hömlunarmöguleika, með minni aukningu á R123 varðveislu en af völdum nilotinibs. Þessi athugun er studd af fyrri rannsókn þar sem crizotinib jók innanfrumuuppsöfnun R123 og doxórúbicíns í MDR1-smituðum frumum [38]. Þessi niðurstaða er einnig í samræmi við IC50 gildin ákvörðuð með DOAC, sem voru hærri en samsvarandi gildi fyrir nilotinib, sem staðfestir miðlungs hömlunarpróf þess. Hins vegar er áhugavert að hafa í huga að styrkur upp á 10 µM af annaðhvort nilotinibi eða crizotinibi olli ekki sömu aukningu á varðveislu rhodamine 123 og DOACs. Í rhodamine skimun jók nilotinib varðveislu hvarfefnisins um 71 prósent, en það var um 40 prósent fyrir DOACs. Aftur á móti olli crizotinib lítilli aukningu á varðveislu rhodamins (23 prósent) en meiri aukningu á varðveislu DOACs (um 50 prósent) við sama styrk. Eins og áður hefur verið fjallað um gæti þessi athugun verið útskýrð með mismun á bindistöðum á P-gp. Það er vitað að mörg lyf hafa samskipti og keppa við H-bindingarstaðinn frekar en R-bindingarstaðinn (sem er þar sem rhodamine 123 binst) og öfugt [39]. Athyglisvert er að ketókónazól, sem vitað er að er sterkur P-gp hemill, olli aðeins minni aukningu á varðveislu rhodamine 123 en nilotinib gerði (66 prósent á móti 71 prósent, í sömu röð). Engu að síður kom svipað gildi fyrir Caco-2 frumur, þar sem nærvera ketókónazóls olli 60 prósenta aukningu á uppsöfnun R123 [40]. Innanfrumuuppsöfnun DOACs til að ákvarða IC50 gildi sýndi einnig hærri gildi samanborið við nilotinib og crizotinib. Athyglisvert er að flest IC50 gildin sem fundust í LLC-PK1 eða Caco-2 líkönunum sem notuðu digoxín sem P-gp hvarfefni voru á milli 3 og 4 µM fyrir ketókónazól [41, 42]. Þessi gildi eru nokkuð frábrugðin þeim sem fundust í þessari rannsókn (16,5 µM og 16,9 µM með apixaban og rivaroxaban, í sömu röð). Þessi athugun staðfestir að val á hvarfefninu og líkaninu sem notað er eru afgerandi áhrif þegar ákvarðað er P-gp hemlunarmöguleika. Að auki greindi nýleg rannsókn frá því að tjáningarmagn ABC flutningsefna í in vitro frumulíkönum hafi áhrif á lyfjaflutningspróf og þar af leiðandi á mat á DDI sem tengjast P-gp [43]. Reyndar leiddi ákvörðun IC50 gildi fyrir verapamil með því að nota rivaroxaban sem P-gp hvarfefni í ljós misleitni milli MDCKMDR1 og Caco-2 frumulíkana, með IC50 gildi upp á 6,94 µM og 21,2 µM, í sömu röð [43]. Ennfremur voru þéttniháð áhrif nilotinibs á innanfrumuuppsöfnun apixabans og rivaroxabans einnig rannsökuð í Caco-2 frumum í þessari rannsókn. Athyglisvert er að IC50 gildi fyrir nilotinib voru umtalsvert hærri í Caco-2 frumum en í RPTEC/TERT1 frumum. Þessa athugun má skýra með muninum á P-gp tjáningu milli þessara líkana. Að auki er vitað að P-gp dreifingin fer eftir vefnum sem til greina kemur. Fallon o.fl. sýndi fram á að magn P-gp væri hærra ínýruen í lifrarvef hjá mönnum [45]. Aftur á móti virðist tjáningarstig P-gp vera hærra í þörmum en ínýruvefur [46]. Notkun mannafrumna eins og RPTEC/TERT1 líkansins, sem ekki oftjáir flutningsefni, gæti því veitt viðbótargögn. Hægt væri að nota þessi gögn og reikna út í lífeðlisfræðilega byggðri lyfjahvarfalíkönum (PBPK) með því að samþætta nokkrar breytur, svo sem magn P-gp í vefja- eða in vitro líkani eða IC50 gildi.
Þrátt fyrir að IC50 gildin sem fundust fyrir ketókónazól í RPTEC/TERT1 líkaninu hafi verið hærri en þau sem komu fram í fræðiritum, sýndi [I1]/IC50 hlutfallið – sem var fullgilt sem spá fyrir hugsanlega klínískt mikilvæga DDI lyf til inntöku – há gildi sem voru yfir viðmiðunarmörkum 0,1 sem FDA skilgreinir. Þessi niðurstaða er í samræmi við klíníska rannsókn sem sýndi tvöfalda aukningu á útsetningu fyrir apixabani við samhliða gjöf ketókónazóls [44]. Samanlagt sýna allar þessar niðurstöður að RPTEC/TERT1 líkanið er efnilegt tæki til að meta möguleika á P-gp hemlun.
CISTANCHE MUN BÆTA NÝRA/NÝRAVERKI
Niðurstaða
Rannsókn okkar sýndi fram á að notkun RPTEC/TERT1 líkansins er hentug til að meta P-gp hemlunarmöguleika ýmissa lyfjaflokka. Rhodamine 123 uppsöfnunarpróf gerðu kleift að framkvæma fyrstu lyfjaskimun. Hins vegar verður einnig að rannsaka P-gp hemlunarmöguleika lyfja sem hafa ekki samskipti við R-stað P-gp með því að nota viðbótar hvarfefni til að staðfesta spárnar. IC50 gildin, ákvörðuð út frá innanfrumu uppsöfnun apixabans og rivaroxabans, eru í samræmi við hömlunarprófanir sem mælst hafa með rhodamine 123. Þar að auki staðfesti notkun ketókónazóls og warfaríns sem sterks hemils og ekki hemils P-gp, í sömu röð. áreiðanleika RPTEC/TER1 líkansins þegar það er notað til að afla in vitro gagna um hindrandi möguleika lyfja á P-gp. Að lokum sýndi samanburður á niðurstöðum sem fengust með því að nota RPTEC/TERT1 líkanið við þær sem fengust með Caco-2 frumum mikilvægi þess að framkvæma in vitro rannsóknir í mismunandi frumumódelum til að staðfesta hamlandi prófílinn fyrir tiltekið lyf.