Í kísilgreiningu á Drosophila sníkjudýri eitri peptíð sýnir algengi katjón-skauta-katjóna klemmumótífs í Knottin próteinum Part 1

Ágrip:

Sem almennir sníkjugeitungar er Leptopilina heteroatom mjög vel heppnað á mörgum tegundum ávaxtaflugna af ættkvíslinni Drosophila. Sníkjudýrin framleiða sérhæfða fjölstefnu utanfrumublöðru (EV)-líkar byggingar í eitri þeirra. Próteomic greining benti á nokkur ónæmistengd prótein, þar á meðal knottin peptíðið, LhKNOT, sem inniheldur burðarvirkan cysteine ​​knot (ICK) fold, sem er til staðar í próteinum úr ýmsum flokkum. Skipulags- og tengingargreining okkar á 36-leifarkjarna knottin fold LhKNOT leiddi í ljós að til viðbótar við knottin mótífið sjálft er það einnig með Cation–Polar–Cation (CPC) klemmu.

Inhibitor cysteine ​​er náttúrulegt efni sem notað er til að koma í veg fyrir oxunarskemmdir og stuðla að frumuvexti. Fyrir ónæmi endurspeglast hlutverk cysteins aðallega í því að bæta ónæmi líkamans og koma í veg fyrir bólgu og sýkingu.

Á undanförnum árum hafa fleiri og fleiri rannsóknir sýnt að cystein getur gegnt mikilvægu hlutverki í ónæmiskerfinu. Það getur stuðlað að útbreiðslu ónæmisfrumna, aukið viðnám líkamans gegn sýkla og dregið úr hættu á sýkingu. Að auki getur cystein einnig dregið úr framleiðslu sindurefna og bætt almenna heilsu ónæmiskerfisins og þar með aukið ónæmi líkamans.

Þrátt fyrir að áhrif cysteins á ónæmi séu mjög mikilvæg, ætti að nota það með varúð þegar cystein hemill er notaður. Vegna þess að hemillinn cystein er venjulega notaður til að meðhöndla ákveðna sjúkdóma, eins og hjarta- og æðasjúkdóma, liðagigt o.s.frv., ef hann er misnotaður, mun hann hafa áhrif á ónæmi og valda því að ónæmiskerfi líkamans veikist og eykur þar með hættu á sýkingu.

Niðurstaðan er sú að það er órjúfanlegt samband á milli hemilsins cysteins og ónæmis. Þrátt fyrir að hemlar cysteins geti stuðlað að heilbrigði líkamans þarf einnig að nota þá undir leiðsögn læknis og huga skal að því að viðhalda hæfilegum skammti til að viðhalda heilsu líkamans. Það má sjá að við þurfum að bæta friðhelgi. Cistanche getur verulega bætt friðhelgi, vegna þess að kjötaska inniheldur margs konar líffræðilega virk efni, svo sem fjölsykrur, tveir sveppir, Huang Li, osfrv. Þessi innihaldsefni geta örvað ýmis ónæmiskerfi. frumulíkar frumur, auka ónæmisvirkni þeirra.

Smelltu á heilsuávinning af cistanche

Talið er að CPC klemmumótífið auðveldi örverueyðandi virkni í heparínbindandi próteinum. Það kemur á óvart að meirihluti ICKs sem prófaðir eru hafa einnig CPC klemmumótífið, þar á meðal 75 knottinprótein úr plöntum og liðdýrum í góðri trú sem deila mikilli röð og/eða uppbyggingu líkt með LhKNOT. Eins og LhKNOT og þessi önnur 75 knottin prótein, inniheldur meira að segja Drosophila Drosomycin sveppalyfið peptíð, kanónískt markgen í TollNF-kappa B ónæmisferli flugunnar, þetta CPC clip mótíf. Saman benda niðurstöður okkar til hugsanlegrar varnaraðgerðar fyrir sníkjudýrið LhKNOT.

Algengi CPC klemmumótífsins, sem er eðlislægt cysteine ​​hnútnum innan knottin próteinanna sem skoðuð eru hér, bendir til þess að þrívíddaruppbyggingin sem myndast sé mikilvæg fyrir lífefnafræðilega virkni þeirra. CPC klemman er líklega mjög varðveitt byggingarmótíf sem finnast í mörgum fjölbreyttum próteinum með heparín bindingargetu, þar á meðal amyloid prótein. Knottis eru markmið fyrir þróun lyfja til lækninga og innsýn í sambönd þeirra á milli uppbyggingu og virkni mun stuðla að nýrri lyfjahönnun.

Leitarorð:

Gestgjafi–sníkjudýr; Drosophila; Leptopilina; cysteine ​​hnútur; knottin fold; Cation–Polar–Cation klemmur; örverueyðandi peptíð; heparínbindandi mótíf; smá prótein.

1. Inngangur

Í samskiptum hýsils og sníkjudýrs verður sníkjudýrið að veita móðgandi þrýsting á sama tíma og halda hýsilnum á lífi til að viðhalda lífvænlegum afkvæmum [1,2]. Slík andstæð markmið hafa leitt til þróunar meinvirkniþátta með fjölbreyttum sameindaaðferðum en viðhalda mikilli sérhæfni hýsils. Sníkjudýr (hymenoptera) samanstendur af meira en milljón tegunda, eru alls staðar á jörðinni og sníkja ýmsa liðdýra, aðallega skordýr [3].

Geitungar sem ráðast á skordýrahýsil hafa þróað úrval af hegðunar- og lífefnafræðilegum aðferðum til að ná árangri og eru áfram undir stöðugum samþróunarþrýstingi með hýslum sínum [4-7].

Leptopilina/Drosophila kerfið er vaxandi líkan til að skilja sameindagrundvöll viðbragða gegn geitungum og meinvirkni aðferða við geitunga [8]. Til að bæla ónæmi hýsils innleiða Leptopilina kvendýr eiturþætti í lirfuhýsils sínum meðan á egglos stendur [4,9,10]. Vel skilgreindir meðfæddir ónæmiskerfi í Drosophila [11-13] veita dýrmætt samhengi til að rannsaka áhrif þessara geitungaeiturþátta.

Sýking frá sérfræðingnum L. boulardi virkjar húmor og frumuónæmisarma sem stjórnað er af varðveittum Toll-NF-κB boðleið flugunnar. Tjáning örverueyðandi peptíð (AMP) gena eins og drosomycin er virkjuð eftir L. boulardi sýkingu [14]. Toll-NF-KB merkjagjöf stjórnar einnig skiptingu og þroska blóðfrumna [15,16], skref sem stjórna hjúpun og dauða geitungaeggja [17,18].

Aftur á móti bælir sýking af almennu L. heteróatóminu báðar ónæmisbrautirnar [9,14] og næstum allar blóðfrumur lirfa eyðileggjast af þáttum í geitungaeitrinu [19,20].

Í þessari rannsókn greinum við fræðilega uppbyggingu L. heteroatom peptíðs, sem kallast LhKNOT, sem er auðkennt innan líffæralíkra seytinga í L. heteroatom eitri en ekki í L. boulardi eitri [21]. Þessar ónæmisbælandi frumulíffæri innihalda meira en 350 prótein og búa yfir próteinprófíl heilkjörnunga örblöðru og ofgnótt af ónæmistengdum próteinum [21-23].

LhKNOT tileinkar sér mótífið „Bemlandi cysteine ​​Knot“ (knottin) [24]. Hnútamótífið er í stórum dráttum varðveitt í ýmsum flokkum, allt frá plöntum [25,26] til snigla [27]. Þessi litlu peptíð (<60 residues) are functionally diverse. Knottins are used offensively, in spider toxins [28] and cone snail venom [27], as well as defensively, e.g., in wound healing activities of cacti [26], and antimicrobial host defense in plants [25,26,29] and invertebrates [30].

Hið víðtæka svið virkni knottins er rakið til heildarbyggingar fellingar þess, sem byggir eingöngu á varðveittu mótífi sex cysteinleifa sem nýtir sér einstaka hæfileika cysteinanna til að mynda tvísúlfíðbrýr. Knottin mótífið kemur fram þegar cystein leifar sjást í C1-C2-C3-C4-C5-C6 mynstri (þar sem "-" táknar nokkur mjög breytilegar leifar).

Dísúlfíðbrýr myndast síðan á svipaðan hátt (C1-C4, C2-C5 og C3-C6), sem leiðir til C1-C4 og C{{ 8}}C5 myndar stórhring, en C3-C6 á sér stað innan þessa stórhring, sem leiðir til „hnútaðs“ svæðisfræði. Þar sem þessi hnýtta svæðisfræði byggist að miklu leyti á varðveislu cysteinleifanna sex, gerir knottin mótífið veruleg breytileika í heildarröðinni [30]. Samsetning smæðar þeirra, mikils þols fyrir raðbreytileika og stöðugleika í uppbyggingu hefur gert knottin að vinsælum vinnupalli fyrir lyfjahönnun [30], hugsanlega jafnvel fyrir krabbameinsmeðferð [31].

Ýmsar vísbendingar um tilraunir sýna fram á eða benda til sýklalyfjagetu fyrir mismunandi knottin [25,26,29,30,32,33] eða hliðaðar jónagöngsvíxlverkanir [28,34], þó að sameindaaðferðirnar sem þessar aðgerðir eru framkvæmdar séu ekki vel skilið. Ennfremur er ekki vitað hvort þessi sýklalyfjavirkni deili sameiginlegum verkunarmáta.

Miðað við uppgötvun þess úr ónæmisbælandi ögnum úr flugnasníkjudýrum, voru markmið okkar að (a) bera kennsl á LhKNOT tengdar raðir úr fjölbreyttum lífverum, þar á meðal L. heteroatom, L. boulardi og Ganaspis parasitoids, sem ráðast á Drosophila og (b) bera kennsl á hvers kyns ný byggingarmyndefni sem eru til staðar í þekktum eða nýjum LhKNOT homologum með von um að spá um slíkt varðveitt mótíf gæti gefið til kynna mögulegar aðgerðir fyrir LhKNOT og leiðbeina framtíðar tilraunarannsóknum.

Við sýnum að fræðilegt líkan af LhKNOT býr yfir einkennum knottinfoldarinnar með þremur andhliðstæða betablöðum, bundin af tvísúlfíðbrýr. LhKNOT líkanið inniheldur CPC klemmu, sem getur haft samskipti við heparín, neikvætt hlaðið glýkósamínóglýkan (GAG) með verulegt læknisfræðilegt gildi. LhKNOT hefur einnig möguleika á að hafa samskipti við önnur GAG, eins og keratansúlfat (GAG sem er mjög súlfatað, svipað og heparín) og hýalúrónsýra (einn GAG fulltrúi sem krefst ekki súlferunar) [35].

Ennfremur hafa byggingarsamstæður LhKNOT (þ.e. bona fide knottin mótífprótein) einnig CPC klemmumótífið sem getur fest sig við heparín. Það kemur á óvart, eins og LhKNOT og þessi önnur góð knottin prótein, jafnvel Drosophila Drosomycin sveppaeyðandi peptíð deilir þessu CPC klemmumótíf í uppbyggingu sinni. Þetta mótíf var einnig auðkennt í 41 af 46 viðbótar LhKNOT homologum frá L. heteroatom, L. boulardi og Ganaspis spp. geitungar tókst á D. melanogaster.

Þetta í kísil-undirstaða athuganir benda til þess að CPC clip mótíf, sem felst í mörgum knottins, getur verið byggingargrundvöllur til að breyta ónæmis- eða meinvirkni. Við veltum fyrir okkur hugsanlegri sýklalyfja- eða meinvirknitengdri virkni fyrir geitunginn LhKNOT. Gnægð knottinfellingarinnar og samsvörun hans við CPC klemmumótífið í flestum nýgreindum knottinpeptíðum úr þremur Drosophila sníkjudýrum bendir til mikilvægs hlutverks sem enn á eftir að ákvarða fyrir þau í lífeðlisfræði sníkjudýra og/eða í hýsilssníkjudýrinu. samskipti.

2. Úrslit
2.1. LhKNOT röðin sýnir líkindi við skordýra- og plöntusýklalyfjapeptíð

BLASTp leit í nr og TSA gagnagrunnunum með LhKNOT röðinni í fullri lengd (60 amínósýrur) sýndi takmarkaðan fjölda marktækra smella, fyrst og fremst merkt sem "sýklalyfjapeptíð", frá plöntum og skordýrum. Einnig fundust nokkrar svepparaðir. Allar niðurstöður sýndu minna en 60 prósent amínósýrueinkenni LhKNOT. Efsta samsvörun fyrir LhKNOT í nr gagnagrunninum var örverueyðandi peptíð frá algengu bjöllunni, Callosobruchus maculates, en efsta höggið í TSA gagnagrunninum var sýklalyfjapeptíð úr hveitikrullamítlinum Aceria Coachella.

Varðveislan var mest áberandi á svæði eina raðmyndarinnar sem tengist LhKNOT, cysteinhnýttu 'sveppapeptíðinu' undirskriftinni (pfam11410 lén, E=2.8 × 10−3 ). Eftir að hafa keyrt PSI-BLAST til að greina fjarlægar samsvörun, komu fleiri raðir í ljós. PSI-BLAST sýndi svipaðar niðurstöður með algengri ísplöntu, Mesembryanthemum crystallinum; rauðmaur, Dinothrombium tinctorium; sníkjugeitungur, Trichogramma pretiosum; smellur bjalla, Ignelater lýsandi; sníkjugeitungur, Trichogramma brassicae; algeng frjóbjalla, Brassicogethes aeneus; öskubor, Agrilus planipennis; og sagfluga, Neodiprion lecontei.

Með því að nota Hidden Markov Models-drifinn HMMER vefþjóninn sem aðra aðferð til að greina fjarlægar samsvörun, greindum við fimm sveppahits frá Akanthomyces lecanii, Cordyceps javanica, Cordyceps confragosa, Rosellinia necatrix og Beauveria bassiana.

Leit í PDB að svipuðum raðir náði aðeins tveimur marktækum niðurstöðum, annarri fyrir knottin-gerð sveppaeyðandi peptíðs Alo-3 frá skordýrinu Acrocinus longimanus og sú seinni úr dísúlfíð-þvinguðu sárgræðandi peptíðinu pB1 frá Pereskia bleo. Upplýsingar um allar nálægar og fjarlægar samsvörun sem auðkennd eru með því að nota mismunandi raðlíkingaraðferðir eru teknar saman í viðbótartöflu S1.

Jöfnun LhKNOT við þekkta uppbyggingu dæmigerðra knottins sem og auðkennd homologa sýndi varðveislu sex cysteinanna sem mynda þrísúlfíðbrýrnar í LhKNOT (Mynd 1A). Á N-enda sínum inniheldur LhKNOT langan, helical hluta sem spáð er að virki sem merkaröð; innra með sér, inniheldur það þrjú beta-blöð, eins og búist er við af efri uppbyggingu knottin peptíða (Mynd 1B).

Að auki, mat á röð líkt LhKNOT miðað við fyrirliggjandi L. heteroatom og L. boulardi afrit og frá öðrum Drosophila sníkjudýr, Ganaspis spp. (sjá Aðferðir), leiddi í ljós gnægð skyldra raða. Fyrir L. heterotoma (Lh14), greindum við 16 viðbótar Lh14 knottin prótein (viðbótartafla S2).
Fyrir L. boulardi greindum við 22 knottin prótein (viðbótartafla S3). Sex LhKNOT homologar voru á sama hátt auðkenndar úr Ganaspis hookeri (G1) og tveir LhKNOT homologar fundust í próteinspám sem gerðar voru úr G. brasiliensis (VA) erfðamengi (viðbótartafla S4). Mynd 2 sýnir varðveislu þessara sníkjudýra knottin raða með LhKNOT. Þannig virðast að minnsta kosti fáir Drosophila sníkjudýr sem tekin voru sýni í þessari rannsókn umrita mörg knottin prótein. Fleiri slík knottin peptíð geta verið kóðuð af þessum geitungum og kerfisbundnar próteómískar/lífupplýsingaaðferðir eru nauðsynlegar til að fá yfirgripsmikinn lista. Virkni þessara meintu knottins í lífeðlisfræði sníkjudýra er enn óþekkt.

Mynd 1. (A) Margfaldar röð röðun LhKNOT (efst) og homologa í knottin fjölskyldunni (frá-til-botn): Mesembryanthemum crystallinum (planta; sýklalyf; NCBI auðkenni: AAC19399), Aceria tosichella (mítill; sýklalyf; NCBI auðkenni :MDE48292.1), Callosobruchus maculatus (bjalla; óþekkt; NCBI auðkenni:VEN35376.1), Dinothrombium tinctorium (mítil; óþekkt; NCBI auðkenni:RWS16713.1), Trichogramma pretiosum (Alo{{10}} eins og; sníkjugeitungur; sýklalyf; NCBI auðkenni: XP_014233229.1), Ignelater luminosus (bjalla; óþekkt; NCBI auðkenni: KAF2884324.1), Trichogramma brassicae (sníkjugeitungur; óþekkt; NCBI auðkenni: CAB{{27 }}{{30}}31014.1), Brassicogethes aeneus (bjalla; óþekkt; NCBI auðkenni: CAH0563829.1), Agrilus planipennis (öskuborari; sýklalyf; NCBI auðkenni : XP_018321119.1), Neodiprion lecontei (sögfluga; óþekkt; NCBI auðkenni: XP_015517007.2), Akanthomyces lecanii (sveppur; sveppalyf; Uniprot auðkenni: A0A168C5L6), Cordyceps javanica (sveppur; sveppalyf ; Uniprot auðkenni: A0A545VVU1), Cordyceps confragosa (sveppur; óþekkt; Uniprot auðkenni: A0A179IJT7), Rosellinia necatrix (sveppur; Óþekktur; Uniprot auðkenni: A0A1S8A723), Beauveria bassiana (sveppur; óþekkt; Uniprot auðkenni: A0A0A2VUF6), Acrocinus longimanus (Alo-3; bjalla; sveppalyf; PDB auðkenni: 1Q3J) og Pereskia bleo (pB1; auðkenni: kaktus; 5XBD). Sams konar leifar eru auðkenndar með rauðu, en efnafræðilega svipaðar leifar eru auðkenndar með gulu. Svartar örvar tákna varðveitt cystein leifar sem bera ábyrgð á knottin byggingarfellingunni og tvísúlfíðbrúartengingar þriggja tvísúlfíðbrúa eru merktar með neongrænum tölum.

X og XX tákna breytilegan fjölda leifa við N- og C-enda, í sömu röð. Aukabyggingarþættir fyrirmyndaða LhKNOT eru sýndir efst. og T tákna -streng, og -beygja, í sömu röð. (B) Spá um efri uppbyggingu fyrir LhKNOT, sem sýnir langan helical hluta (bleikur strokka; merkjapeptíð) fylgt eftir af þremur beta þráðum (gular örvar). Þessi aukabygging fylgir hinni kanónísku Knottin undirskrift [36]. (C) Frumgerð af burðarbroti knottin úr KNOTTIN gagnagrunninum [36] (leyfi til að endurskapa þessa mynd gefið af Dr. Jean-Christophe Gelly, INSERM, október 2019). Tvær tvísúlfíðbrýrnar (grænar) mynda stórhringrás, en sú þriðja (bláa) togar í gegnum miðjuna og gefur próteininu hnýttan staðfræði nafna þess. (D) Spáð háskólabygging LhKNOT, sem sýnir hnýttan staðfræði og varðveitt cystein mótíf, cystein leifar mynda tvísúlfíð brýr í varðveittu mynstrinu sem sést í gegnum knottin fjölskylduna (C1 -C4 og C2 -C5 form stórhringurinn, C3 -C6 dregur í gegnum miðjuna).

Mynd 2. (A) Margföld röð röðun LhKNOT (efst) og homologa í Lh14. (B) Margföld röð röðun LhKNOT (efst) og homologa í L. boulardi. X merkt í græna reitnum samsvarar eftirfarandi innsetningum í tveimur Lb17 röðum: Lb: GISX01151661.1 X=SQAPPPTPEPFHPPGTPP; Lb: GISX01151653.1 X=SQLTSPRSTFPPTGSTIPSIITT. (C) Margfeldi röðun LhKNOT (efst) og homologa í Ganaspis spp. Sams konar leifar eru auðkenndar með rauðu, en efnafræðilega svipaðar leifar eru auðkenndar með gulu.

Svartar örvar tákna varðveitt cystein leifar sem bera ábyrgð á knottin byggingarfellingunni og tvísúlfíðbrúartengingar þriggja tvísúlfíðbrúa eru merktar með neongrænum tölum. Aukabyggingarþættir fyrirmyndaða LhKNOT eru sýndir efst. og T tákna -streng, og -beygja, í sömu röð. Gráum stjörnum er bætt við efst á blokkum af röðum, leifar hér að ofan tákna leifar sem eru gerðar eftir líkönum með mismunandi sköpum.

2.2. Þrívídd uppbygging LhKNOT

Dæmigert byggingarbrot knottinpeptíðs er skilgreint af sex cysteinum sem taka þátt í þremur tvísúlfíðtengjum til að mynda cystein-hnýtt þriggja þráða andhliðstæða beta-blað [25]. Mikilvægur eiginleiki þessa fellingar er tenging sýsteinleifanna til að mynda dísúlfíð brýr og dísúlfíðbrú sýsteina 3 og 6 sem fara í gegnum dísúlfíð 1–4 og 2–5 til að búa til sérstakan dísúlfíð í gegnum dísúlfíðhnút (Mynd 1A, C ).

Þetta tvísúlfíð, í gegnum tvísúlfíðhnútaeiginleika, aðgreinir knottinfellinguna frá öðrum cysteinhnútapróteinum. Annað en varðveittu cysteinin, getur restin af amínósýruröðinni verið nokkuð breytileg og því er aðeins takmarkaður fjöldi knottins auðkenndur með raðlíkingaraðferðum fyrir LhKNOT (sjá fyrri kafla og viðbótartöflu S1).

Fold-þekkingaralgrím og sniðmátsbundnar líkanaaðferðir náðu aftur á móti nokkrum fjölbreyttum hnútum sem hentugum umsækjendum til að móta LhKNOT. Meðal hinna ýmsu LhKNOT líkana sem mynduð voru, var besta líkanið fjölsniðna byggt líkan af LhKNOT sem var búið til með því að nota forritið HHpred [37] með burðarvirkjum fengnum úr þremur efstu sniðmátunum, Alo-3 (PDB: 1Q3J) [ 30], omega-agatoxín-IVA (PDB: 1IVA) [28] og PAFP-S (PDB: 1DKC) [25]. Þekkingartengd orkusnið sem reiknuð voru út með ProSA-vef [38] fyrir þetta valda líkan sýndu lága orku og z-stig upp á -4,53, sem er sambærilegt við leyst mannvirki.

Verify3D [39] mat þetta líkan sem byggir á mörgum sniðmátum með staðhæfingu (100.00 prósent af leifum í líkaninu hafa að meðaltali þrívídd-1 D skor hærra en eða jafnt og 0,2). VoroMQA [40] stigið 0,325 er líklega endurspeglun á smæð peptíðsins og stig sniðmátanna voru á sama bili (viðbótarmynd S1).

Þetta líkan sem byggir á mörgum sniðmátum er dæmigert fyrir hnútafellinguna með þremur andhliðstæða beta-þráðum, bundin af tvísúlfíðbrýrum og væntanlegri tengingu tvísúlfíðbrúa (Mynd 1D). KNOTER3D, tól í KNOTTIN gagnagrunninum [36] staðfesti að þetta líkan er með góðri hnútbrot og staðfesti áður tilgreint tvísúlfíðbindingamynstur á mynd 1D.

2.3. LhKNOT sýnir tilvist CPC klemmu, sem getur haft samskipti við heparín og önnur GAG

Til að leita að mögulegum LhKNOT aðgerðum voru fylgnir bygging-aðgerða á nánum burðarsamhverfum LhKNOT rannsökuð. Knottin prótein úr kaktusinum Pereskia bleo (PDB: 5XBD) [26] hefur heparínbindandi mótíf sem kallast CPC klemmurinn. Þetta burðarvirki myndar rúmfræðilega bundið klemmu af tveimur katjónískum og einum skautuðum leifum sem hafa samskipti við heparín með saltbrýrum og vetnistengi sem klemma það í stöðu innan jákvætt hlaðins yfirborðs klemmunnar [41].

Skipulagðar yfirbyggingar á kaktushnútnum og LhKNOT sýndu að byggingin tvö eru mjög svipuð, með heildarmun sem er minni en 2Å. Hlekkigreining á LhKNOT með heparíni, með því að nota sérstakar breytur ClusPro fyrir heparín sem bindil, leiddi í ljós að fyrir LhKNOT eiga sér stað skautar víxlverkanir sem passa við CPC klemmumótífið í leifum R1-S3-R14 (Mynd 3A) .

Mældar fjarlægðir (bæði á milli alfa-kolefna og massamiðja þátttakenda hliðarkeðja) voru frábrugðnar þeim í CPC klemmunni um minna en 1Å, sem bendir til tilvistar hugsanlegs CPC klemmu í LhKNOT (Mynd 3B). Yfirborðs rafstöðueiginleikar fyrirmyndaða LhKNOT sýndu einnig nærveru væntanlegs katjónískra bindivasa sem myndast af CPC klemmunni [41,42] (Mynd 3C).

Til að meta getu CPC klemmans til að hafa samskipti við önnur GAGs, var viðbótar tengingargreining gerð með LhKNOT og keratansúlfati (PDB ID: 1KES) og með LhKNOT og hýalúrónsýru (PDB ID: 1HYA). Í báðum tilfellum er jákvætt hlaðna bindiyfirborðið sem myndast af CPC klemmunni bundið við neikvætt hlaðnar sameindir. Ligplots mynduð af PDBSum staðfestu tengsl GAGs við CPC-myndandi leifar (viðbótarmyndir S2 og S3).

2.4. Önnur burðarsamstæður LhKNOT innihalda einnig CPC Clip Motif

Tilvist CPC klemmans bæði í LhKNOT og burðarsamstæðu hans frá Pereskia bleo (pB1) benti til möguleika á víðtækari varðveislu CPC klemmans innan knottin fjölskyldunnar. Greining á 21 nánum byggingarsamstæðum LhKNOT með tilraunaleystum PDBs í KNOTTIN gagnagrunninum leiddi í ljós að í öllum tilfellum hafa peptíðin CPC clip mótíf. Fyrir flest peptíð (td T. tridentatus) vikuðu mótífbreytur minna en 1Å frá kjarna knottinfoldinni, en fyrir önnur (td móðgandi knottins) var frávikið allt að 3Å mörkum (viðbótartafla S5). Á sama hátt sýndu módeluð knottin prótein af auðkenndum homologum að næstum öll þeirra voru með CPC klemmu.

Sextán raðir til viðbótar frá L. heteróatómi, 22 raðir frá L. boulardi og 8 raðir frá Ganaspis spp., án þekktrar þrívíddarbyggingar, voru mótaðar og greindar með tilliti til tilvistar CPC klemmumótífsins. Þó að 13 af 16 mögulegum L. heteroatom knottins og 20 af 22 mögulegum L. boulardi knottins sýndu CPC clip mótíf, innihéldu allar Ganaspis raðir CPC clips (viðbótartafla S5). Athyglisvert er að samlíkurnar sjö sem sýndu ekki CPC clip mótíf tilheyra (a) algengri frjóbjölluröðinni (B. aeneus (CAH0563829.1), (b) svepparöð R. necatrix (A0A1S8A723) og (c) þremur L. heterotoma knottins 4,5,6 og L. boulardi knottins 3 og 20 (viðbótartafla S5).

Könnun á hnútum í KNOTTIN gagnagrunninum, sem er ótengd LhKNOT, en er dæmigerð fyrir ýmsa flokka (keilusnigill, skeifukrabba, skordýr, plöntu, sporðdreka og könguló), sýndi CPC clip mótífið. Í öllum tilfellum er yfirborð rafstöðueiginleikasniðs CPC klemmumótífsins jákvætt hlaðið, líklega til að auðvelda samskipti við neikvætt hlaðna heparínið (Mynd 4). Hins vegar, svipað og bjöllu-, sveppa- og geitungahnútarnir sem lýst er hér að ofan, var CPC-klemman ekki auðkennd í hnútum frá plöntusýklótíðinni og svampunum (viðbótartafla S5).

Mynd 4. Niðurstöður heparíntengingar og rafstöðueiginleikar á yfirborði (A) sveppaeyðandi peptíðs af Phytolacca americana (PFAP-s; planta; PDB: 1DKC), (B) kalsíumganga sértækt omega-agatoxín af Agelenopsis aperta (Omega-agatoxín IV-A) ; kónguló; PDB: 1IVA), (C) sveppaeyðandi peptíð Acrocinus longimanus (Alo-3; bjalla; PDB: 1Q3J), (D) sáragræðandi peptíð af Pereskia bleo (pB1; kaktus; PDB: 5XBD) , (E) LhKNOT, (F) sveppaeyðandi peptíð "Drosomycin" frá Drosophila spp. (Drosomycin; fluga; PDB: 1MYN), (G) Conotoxin GS (Conotoxin GS; keilusniglar; PDB:1AG7), (H) örverueyðandi peptíð Tachystatin A einangrað úr hrossakrabba (Tachystatin A; hrossakrabba; PDB:1CIX) (I) Klórótoxín, lítið sporðdrekaeitur af Leiurus quinquestriatus (Klórotoxín; sporðdreki; PDB:1CHL) sem sýnir katjónískt CPC klemmumótíf. Tölur sem eru stilltar til að sýna uppbygging kostnaðar á smell klemmu sem best. Rafstöðueiginleikar yfirborðsins eru litaflokkaðir frá −4 kT/e (rautt) í plús 4 kT/e (blátt).

2.5. Í Silico stökkbreytingargreiningu á LhKNOT CPC Clip sýnir auka CPC Clip

Líkön af þremur í kísil LhKNOT stökkbreyttum (R1A, S3A, R14A) voru rannsökuð til að bera saman bindingarvíxlverkanir villigerðar og stökkbreyttra próteina. Í tilviki R14A stökkbreytileikans var sýnt fram á að heparín tengist á óvart auka CPC klemmu sem inniheldur R1, S3 og R30 leifarnar í stað R1, S3 og R14 mótífsins í villigerðinni (viðbótarmynd S4). Tvöföld eða þrefaldur stökkbrigði (R14A-R1A; R14A-S3A-R1A) sýndu hins vegar ekki víxlverkun við neina af frum- eða auka CPC klemmuleifunum (viðbótarmynd S4C, D).

In silico stökkbrigðin með R1A stökkbreytinguna (sem truflar bæði frum- og auka CPC klemmumyndirnar) sýndu hins vegar heparín sem tengist R29 og R30, þar sem þau veita eina katjóníska yfirborðið sem eftir er (viðbótarmynd S4C, D). Athyglisvert er að bindillinn kýs frekar að tengjast CPC klemmumótífinu, bæði þegar um er að ræða aðal- og aukaklemmurnar, yfir þetta viðbótar katjóníska yfirborð þegar mótífið er tiltækt, sem bendir til þess að sértæk víxlverkun CPC klemmans gæti leyft stöðugri tengingu yfir ósértæk rafstöðueiginleiki.

For more information:1950477648nn@gmail.com