Bætt andmelanogenesis og andoxunaráhrif fjölsykru úr Cuscuta Chinensis Lam fræjum eftir ensím vatnsrof

Ágrip

Cuscuta chinensis fjölsykra (CPS) var dregin út með því að nota heitt vatn og ensímvatnsrofið C. chinensis fjölsykra (ECPS) var framleitt með mannanasa ensímvatnsrofsferli. Tilgangur þessarar rannsóknar var að kanna virkni ECPS og CPS gegn sortuæxli í B16F10 sortuæxlisfrumum. Andoxunarvirkni in vitro var metin með því að draga úr járnjárni og DPPH hreinsiefni til að hreinsa sindurefna. Mólmassadreifing fjölsykra var ákvörðuð með því að nota SEC-MALLS-RI. CPS var niðurbrotið á ensímfræðilegan hátt með því að nota mannósa og vegin meðalmólþyngd CPS og ECPS var 434,6 kDa og 211,7 kDa. Niðurstöður líffræðilegra virknigreininga bentu til þess að ensímvatnsrofna fjölsykran hefði betri and-melanógenandi virkni og andoxunaráhrif en upprunalega fjölsykran. ECPS sýndi sortueyðandi virkni með því að minnka tjáningu tyrosinasa, MITF og TRP-1 án frumudrepandi áhrifa í B16F10 sortuæxlafrumum. Að lokum hefur ECPS möguleika á að verða húðhvítandi vara. Samkvæmt viðeigandi rannsóknum,cistancheer algeng jurt sem er þekkt sem "kraftaverkajurtin sem lengir lífið". Aðalhluti þess er cistanoside, sem hefur ýmis áhrif eins og andoxunarefni, bólgueyðandi og eflingu ónæmisvirkni. Vélbúnaðurinn á millicistancheoghúðhvíttunliggur í andoxunaráhrifum cistanche glýkósíða.Melaníní húð manna er framleitt með oxun týrósíns sem hvatar aftýrósínasa, og oxunarviðbrögðin krefjast þátttöku súrefnis, þannig að súrefnislausu stakeindir í líkamanum verða mikilvægur þáttur sem hefur áhrif á melanínframleiðslu. Cistanche inniheldur cistanoside, sem er andoxunarefni og getur dregið úr myndun sindurefna í líkamanum, þannig aðhamlar framleiðslu melaníns.

Kynning 

eftirlitsaðili fyrir melanín lífmyndun gena. MITF tekur einnig þátt í að stjórna litarefni sortufrumna, fjölgun og aðgreiningu (5). a-MSH-melanókortín 1 viðtakaboð eiga sér stað í sértækum ensímum sem valda sortu, þar á meðal TRP-1; tyrosinasa er einnig stjórnað af MITF (5). Mörg húðhvítandi efni hafa and-melanógenandi áhrif með því að stjórna tjáningu týrósínasa eða hamlandi áhrifum á virkni týrósínasa. Þar að auki hefur andoxunarmagn innanfrumu og framleiðsla sindurefna einnig áhrif á melaníninnihald (6). Þess vegna eru týrósínasahemlar og andoxunarefnasambönd oft valin sem húðhvítandi efni. Cuscuta chinensis Lam., kallað TuSiZi á kínversku, er hefðbundið kínverskt lyf sem almennt er notað sem hagnýtur matur og þekkt fyrir að auka æxlunarfæri (7). Á undanförnum árum hafa sumar skýrslur gefið til kynna notkun þess til að meðhöndla freknur og skjaldkirtil (8). Aðrar skýrslur hafa sýnt að það hefur jákvæð áhrif á húðvernd (9) og veldur hömlun á tyrosinasavirkni (10).

Smelltu á Rou Cong Rong Benefits For Whitening

Biðja um meira:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Fjölsykrur eru helstu innihaldsefnin úr vatnsþykkni C. chinensis Lam. fræ, sem eru talin hafa and-apoptosis (11) og ónæmisfræðilega virkni (12). Fyrri greiningarniðurstöður hafa bent til þess að C. chinensis Lam. fjölsykra er samsett úr frúktósa, mannósa, xýlósa og arabínósa; mannósi er aðal sykurþátturinn (13). Margir vísindamenn hafa sýnt fram á að seigju (14), dreifing mólþunga (Mw) (15) og hlutfall einsykrra (16) fjölsykra hafa mikil áhrif á lífvirkni þeirra. Þar að auki hafa nýlegar rannsóknir sýnt að niðurbrotnar fjölsykrur með lágt Mw sýna meiri andoxunar- og týrósínasa-hamlandi virkni en upprunalega fjölsykrurinn (17). Þannig er framleiðsla á fjölsykru með lágum Mw frá C. chinensis Lam. fræ er nauðsynlegt til að bæta lífvirkni þess. Meðal mismunandi niðurbrotsferla eru helstu kostir ensím niðurbrots hvarfefnissérhæfni, mikil sértækni og vægar aðstæður, sem framleiða vatnsrof með vel skilgreindum byggingum (18).

Á grundvelli þessara lyfjafræðilegu rannsókna höfum við getið okkur til um að C. chinensis fjölsykra (CPS) og ensímað vatnsrofið C. chinensis fjölsykra (ECPS) gætu verið áhrifarík grasalyf til að bæta oflitarefni. Mannasi var notað til að fá lágt Mw ECPS úr fræi. Að auki var and-melanógenun og andoxunarvirkni fjölsykra með mismunandi Mw metin og tengsl lífvirkni og Mw fjölsykra könnuð.

Efniviður og aðferðir

Hvarfefni

Efni fyrir ensím- og andoxunarvirkni voru keypt frá Sigma Co. (Bandaríkjunum). Öll önnur hvarfefni og efni voru keypt frá Aladdin (Kína).

Undirbúningur CPS og ECPS

Lyfjaefni Cuscuta chinensis Lam fræ voru veitt af Guang Dong Feng Chun Pharmaceutical CO., LTD (Kína). Um 500 g af þurru efni voru duftformuð og lögð í bleyti með 1200 ml af 80 prósent etanóli í 24 klst við stofuhita til að fjarlægja lípíð, fásykrur og lituð efni. Formeðhöndluðu sýnin voru síuð í með klút og síðan var þurrkuð leifin dregin út með 3000 mL vatni við 90 gráður þrisvar sinnum. Vatnskenndu útdrættirnir voru aðskildir frá leifinni með skilvindu (4000 g í 5 mínútur við 22 gráður) og síðan þéttir við 70 gráður undir lofttæmi; Þéttivatnið var fellt út með 60 prósent etanóli við 3 gráður í 24 klst. Að lokum var botnfallið afpróteinað með Sevag-aðferðinni, skilað með 3500 Da himnu, frostþurrkað og síðan merkt C. chinensis fjölsykra (CPS).

Ensímvatnsrofna C. chinensis fjölsykran (ECPS) var fengin með vatnsrofi með mannósa (0,1 prósent í natríum asetat jafnalausn) í mannósa og hvarfefnishlutfalli 5:1 (v/w) við 60 gráður, pH 4,5 í 6 klst. Síðan var hvarfahvarfinu hætt í sjóðandi vatni í 10 mín. Hvarflausnin var skilin í skilvindu við 10,000 g í 15 mínútur (4 gráður), og flotinu var safnað til skilunar við 3 gráður í 3 daga með 3500 Da himnu til að fjarlægja litlu sameindaefnin og var frostþurrkað.

SEC-MALLS-RI mæling

Frumuræktun og lífvænleikagreining

Murine B16F10 sortuæxlisfrumur voru keyptar frá Biochemistry and Cell Biology (Kína). Frumum var haldið í Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) sem bætt var við 10 prósent nautgripafóstursermi (FBS), 100 mg/ml streptomycin og 100 ae/ml penicillíni við 37 gráður í rakaðri kringumstæðum sem innihélt 5 prósent CO2. Frumum var sáð á ræktunarplötur og þeim bætt við mismunandi styrk sýna og a-melanocyte örvandi hormón (a-MSH) í 72 klst. til að mæla innanfrumu tyrosinasavirkni og magn melaníns.

3-(4,5-dímetýlþíasól-2-ýl)-2,5-dífenýltetrasólíumbrómíð (MTT) prófið var gert til að prófa lífvænleika frumna (20). Í stuttu máli, 96-brunnsplötur voru sáð með músa B16F10 sortuæxlisfrumum. Rúmmál af 50 mL af 2 mg/ml MTT var flutt í hvern brunn eftir meðferð með 100 mL af mismunandi sýnisstyrk í 24 klst. Eftir 4- klst. ræktun var hvarfinu hætt og dímetýlsúlfoxíðinu var bætt við til að leysa upp óleysanlega myndefnið. Frásog var mæld við 590 nm með örplötulesaranum.

Mæling á melaníninnihaldi

Greining á melaníninnihaldi var framkvæmd með örlítið breyttri aðferð (21). Eftir þvott með ísuðu PBS voru sortuæxlisfrumur (2 × 104 frumur í hverri brunn) sáð í 96-brunnsplötu og ræktaðar við 37 gráður í 48 klst. Síðan var 100 ml NaOH (1N) bætt við hvern brunn til að leysa sortuæxlisfrumur við 80 gráður í 30 mínútur. Lysatið var skilið í skilvindu við 15,000 g í 15 mínútur (4 gráður). Síðan var gleypni mæld með örplötulesaranum við 405 nm. Allar tilraunir voru gerðar í þríriti.

Innanfrumumæling á virkni tyrosínasa

Járnjárn dregur úr krafti

Járnskerðandi kraftgreiningin var framkvæmd samkvæmt áður birtri aðferð með smávægilegum breytingum (23). Mismunandi styrkleika sýna (2 ml) eða Vc (jákvæð viðmiðun) var blandað saman við 2 ml kalíumferrísýaníðs (1 prósent, W/V) og 2 ml fosfatjafna (0,2 M, pH 6,8). Eftir ræktun við 50 gráður í 30 mín., var 2 ml tríklórediksýra (10 prósent, W/V) flutt yfir í hvarfblönduna og skilið í skilvindu við 4000 g í 15 mínútur (22 gráður). Ofanvökvanum (2 ml) var blandað saman við blönduna sem innihélt 2 ml af eimuðu vatni og 0,4 ml FeCl3 (0,1 prósent, W/V). Eftir 10 mínútna ræktun við 37 gráður var gleypni mæld með örplötulesaranum við 700 nm.

DPPH virknipróf til að hreinsa róttæka

Prótein tjáningargreining með Western blot

Eftir meðhöndlun með mismunandi styrk af ECPS í 72 klst. voru frumurnar þvegnar með PBS og ljósaðar í RIPA jafnalausn (150 mM NaCl í 50 mM pH 8.0 Tris-HCl , 0,5 prósent natríumdeoxýkólat, 1,0 prósent nondiet P-40 og 0,1 prósent natríumdódecýlsúlfat). Eftir skilvindu við 10,000 g í 25 mínútur (4 gráður), var flotinu af lýsum safnað. Próteinin voru sett í 12 prósent SDS-PAGE og síðan flutt yfir á pólývínýlíden tvíflúoríð himnu. Lokun var framkvæmd í Tris-bufferuðu saltvatni með Tween-20 og 2 prósenta undanrennudufti (TBST), og síðan ræktað í 12 klst við 4 gráður. Aðalmótefnin sem notuð voru voru: andaktín (1:5000), and-TRP-1 (1:500), and-tyrosinasi (1:500) og and-MITF (1:1000). Aðal mótefnin voru fjarlægð og himnurnar hreinsaðar tvisvar með TBST. Eftir það voru himnur með piparrótarperoxidasa-tengdu aukamótefni (Santa Cruz, USA) ræktaðar í 60 mínútur við stofuhita. Próteinböndin voru þvegin með TBST aftur og sýnd með ECL setti (Amersham Pharmacia Biotech, Bandaríkjunum) með UVP myndgreiningarkerfinu (UVP, Bandaríkjunum).

tölfræðigreining

Allar niðurstöður eru skráðar sem meðaltal ± SD og tilraunirnar voru endurteknar þrisvar sinnum. Samanburður milli hópa var metinn með því að nota ANOVA og síðan Dunnett próf. Einstakur samanburður á milli tveggja hópa var gerður með t-prófi nemenda. Allar tölfræðilegar greiningar voru gerðar með SPSS hugbúnaði (útgáfa 16.0). Po0.05 var venjulega talið tölfræðilega marktækt.

Niðurstöður

Mw og heildarfjölsykrur ECPS og CPS

Heildarfjölsykrainnihald ECPS og CPS mælt með fenól-brennisteinssýruprófi var 89,17 og 90,26 prósent, í sömu röð. Á sama tíma var Mw ECPS og CPS mæld með SEC-MALLS-RI. Mw ECPS var 211,7 kDa, sem var lægra en CPS (434,6 kDa). Mynd 1A sýnir hlutfallslegan styrk (RI) fyrir ECPS og CPS; eftir ensímvatnsrof með mannósa var hámarks varðveislutími ECPS lengri en CPS. Eins og sýnt er á mynd 1B, voru mismunaþyngdarhlutar fjölsykra sýndir sem fall mólmassa fyrir sýni. Mólmassadreifing fjölsykra breyttist verulega við ensímvatnsrof. Mismunandi þyngdarhlutfall ECPS á lág Mw svæðinu jókst, sem benti til þess að CPS væri ensímað niðurbrotið í lág Mw fjölsykra.

Andoxunarvirkni fjölsykra

Greint er frá DPPH getu til að hreinsa sindurefna ECPS og CPS á mynd 2A. Hreinsunarvirkni sindurefna fjölsykrusýna og Vc sýndi skammtaháða virkni. Í núverandi rannsókn var getu CPS til að hreinsa sindurefna lægri en ECPS. Hins vegar sýndu bæði lægri sindurefnahreinsandi áhrif en jákvæða sýnið. IC50 gildi ECPS og CPS voru 0.39 og 0,51 mg/ml, í sömu röð. Eins og sýnt er á mynd 2B, er hægt að meta heildar andoxunarvirkni með því að prófa járn-járnminnkandi kraftinn. Styrkurinn var breytilegur frá 0,1 til 1 mg/ml; bæði fjölsykrusýni og Vc sýndu andoxunarvirkni á skammtaháðan hátt. Þar að auki var gleypnigildi ECPS alltaf hærra en CPS við sama styrk.

Áhrif ECPS og CPS á virkni tyrosinasa sveppa og lífvænleika frumna

Eins og sýnt er á mynd 2C sýndi týrósínasahamlandi virkni fjölsykra (0.1B1 mg/ml) skammtaháð samband. Þar að auki voru hamlandi áhrif ECPS alltaf meiri en CPS við sama styrk. MTT prófið var gert til að meta frumudrepandi áhrif ECPS og CPS í B16F10 sortuæxlisfrumum. Eins og sýnt er á mynd 2D voru engar marktækar breytingar á lífvænleika B16F10 frumna með mismunandi styrk (0B320 mg/mL) af ECPS og CPS. Byggt á þessum niðurstöðum notuðum við þessi styrkleikasvið í

Áhrif ECPS og CPS á innanfrumu tyrosinasavirkni og melaníninnihald

Áhrif ECPS á týrósínasa, MITF og TRP-1 próteinmagn í B16F10 frumum

Umræða

Náttúrulegu fjölsykrurnar frá C. chinensis hafa fengið athygli sem rekja má til góðra áhrifa þeirra á týrósínasa-hömlun, hreinsun sindurefna og húðvörn (25–27). Hins vegar hafa litlar rannsóknir beinst að andmelanogenesis virkni ensímbreytinga á fjölsykrum. Fyrri rannsóknir hafa sýnt fram á að niðurbrotnar fjölsykrur með ensímvatnsrofsferli sýndu yfirburða áhrif til að hreinsa sindurefna (28). Þar að auki er líffræðileg virkni fjölsykra nátengd Mw dreifingu þeirra. Fræðilega séð eru fjölsykrur með lág Mw virkari en há Mw fjölsykrur vegna mikillar gegnumsnúningseiginleika þeirra á frumuhimnur (29,30). Samt sem áður höfðu áhrif ECPS á B16F10 frumur ekki verið rannsökuð. Lág Mw fjölsykran var framleidd með ensímvatnsrofi með mannósa.