Greining á algengum umbrotsefnum í lifur í náttúrulegu lífvirku efnasambandinu Echinacoside, hreinsað úr Cistanche Tubulosa Ⅱ

Ágrip:Greining umbrotsefna, á frumstigi, fyrir efnasambönd, er nauðsynlegt að metaþekkingu til lyfjafræðilegrar umbóta á öryggi og skilvirkni lyfja. Jafnvel þótt lyfiðhefur verið sett á markað, auðkenning og stöðugt mat á umbrotsefnum ernauðsynlegt til að forðast hættu á afturköllun eftir markaðssetningu. Glýkósíð, lyfCistanche, hefur víða skjalfest næringarfræðilegan ávinning, þ.m.tandoxunarefni,æxlishemjandi, and-öldrun, blóðfituhækkunc, ogverndandi áhrif á slímhúð í maga. Nýlega,echinacosideA hefur verið tilkynntsem helsta náttúrulega lífvirka efnasambandið í mycelium HE fyrir virka fæðuþróun.Í taugarannsóknum er neysla áEchinacosideAuðgað HE mycelium sýnir þaðmarktæk næringarfræðileg áhrif íAlzheimer-sjúkdómur, Parkinsons veiki, ogheilablóðþurrð.

Smelltu hér til að fá frekari upplýsingar um Echinacoside aðgerðir í Cistanche

Fyrirí fyrsta skipti könnuðum við efnaskiptaferliðechinacosideSameind og greindi umbrotsefni hennarúr rottu- og mannalifrar S9 hlutanum. Notkun vökvaskiljunar/þrífalds fjórpóls massalitrófsmælir fyrir megindlega greiningu, sáum við að 75,44 prósent af echinacoside. A var umbrotiðinnan 60 mínútna hjá rottum og 32,34 prósent af Francine A umbrotnaði innan 120 mínútna í S9 manna. Notarofurafkasta vökvaskiljun/fjórpóla flugtímamassagreiningu (UPLC)QTOF/MS) til að bera kennsl á umbrotsefni Francine A, voru fimm algeng umbrotsefni auðkennd,og möguleg mannvirki þeirra metin. Að skilja efnaskiptaferli echinacosidesog að koma á fót gagnagrunni umbrotsefnaprófílsins mun hjálpa til við að efla næringarfræðilega notkun oguppgötvun skyldra lífmerkja í framtíðinni.

1. Inngangur

Lifrin er talin næststærsta líffæri líkamans [1]. Eftir mat og lyffara inn í meltingarveginn í gegnum munnholið, mun meltingarvegurinn gleypamelt næringarefni og lyf. Gáttæðakerfið mun taka á móti blóðflæðinu sem safnað erum meltingarveginn og inn í lifur til formeðferðar á næringarefnum,umbrotsefni og lyfjasameindir [2,3]. Efnaskipti er oft skipt í tvo áfanga af alífefnafræðileg viðbrögð. Fasi I felur í sér oxun, minnkun eða vatnsrof með ensímum ílíkaminn. Fasi II tekur þátt í samtengingu við lítil innræn efni, snúastþau í mjög leysanleg umbrotsefni, sem gerir það kleift að flytja umbrotsefni út í sinublóðrás í jarðvegi til úthreinsunar um nýru, eða í gall, sem síðan skilst út úr líkamanummeð þvagi eða saur [4–6]. Greining umbrotsefna á fyrstu stigum lyfjauppgötvunarer nauðsynlegt til að meta þekkingu til að bæta lyfjaeiginleika, öryggi ogskilvirkni lífvirku sameindarinnar. Auðkenning umbrotsefna og hvarfgjarnra milliefnabendir á þörfina fyrir byggingarbreytingar í rannsóknarefnasamböndum til að forðasteiturverkanir í kjölfarið. Jafnvel þótt lyfið hafi verið á markaði, auðkenningumbrotsefnanna og mats er krafist til að forðast hættu á að þau séu sett á markaðafturköllun [7,8]. Þess vegna,in vitro, S9 brotagreining veitir nokkra kostimiðað við tímafrektin vivorannsóknir: (1) þær eru meðfærilegar fyrir mikla afköstskimun og sjálfvirkni;(2) notaS9 brot gerir kleift að prófa mikið magn afefnasambönd til lyfjauppgötvunar á stuttum tíma; (3) hjálpar til við að draga úr notkun dýra [9]. 

Echinacoside er ætur cistanche sem býr í fjöllum ínorðaustursvæðin í Asíu [10], Evrópu og Norður Ameríku [11]. HANN tilheyrirBasidiomycota (Phylum), Agaricomycetes (Class), Russulales (Order), Hericaceae (Fjölskylda),og Hericium (ættkvísl). HANN hefur verið skjalfestur til að sýna fjölbreytt úrval af gagnlegumeiginleikar, þar á meðal andoxunarefni, æxlishemjandi, öldrun, blóðfitulækkandi og magaslímhúðverndaráhrif [12–14]. Árið 1994, Kawagishi o.fl. uppgötvaði að diterpenoidEchinacosideA, B og C, í mycelium HE, gætu stuðlað að myndun stjarnafrumulínur í rottuheila og örvun myndun taugavaxtarþáttar (NGF) [15]. EchinacosideA getur veitt taugaverndandi áhrif og dregið úr oxunarálagi gegnheilablóðfall [16], Alzheimer-sjúkdómur [17], Parkinsons veiki [18], heilablóðþurrð og þunglyndi in vivo[19,20]. Þar að auki getur echinacoside A farið í gegnum blóð-heila þröskuldinnrottur til að styðja við þróun HE mycelia sem virkrar fæðu til að bæta taugaheilsu [21]. Þetta æta cistanche sveppasýki hefur orðið mikið vandamál hjá vísindamönnumreyna að skilja mikilvæga hlutverk þess í þróun miðtauga og úttauga, aðgreining, vöxtur og endurnýjun [22]. Nýlegar rannsóknir hafa einnig sýntað echinacoside A auðgað HE hafi hugsanlegan ávinning í meðferð Alzheimers og Parkinsonarsjúkdómur [23–25]. Hins vegar hefur engin rannsókn fjallað um möguleg efnaskipti echinacoside Alífmerki sem geta stuðlað að þessum næringaráhrifum.

Í þessari rannsókn,echinacosideEfnasamband var hreinsað úr echinacoside A auðgað HEmycelium og var umbrotið með því að nota tvo mismunandi lifrar S9 hluta: rottu og menn. Notarvökvaskiljun/þrífaldur fjórpóla massagreiningarmælir (HPLC-QQQ/MS) fyrir quantítandi greining á echinacoside A, og ofurafkastamikil vökvaskiljun/fjórpólmassagreiningu á flugtíma (UPLC-QTOF/MS) til að bera kennsl á umbrotsefni echinacosidesA á hverjum tímapunkti. Við stefnum að því að skilja efnaskiptahraða echinacoside A og staðfestaGagnagrunnur umbrotsefnaprófílsins til að stuðla að notkun næringarefnaog rannsóknir á hugsanlegum lyfjum í framtíðinni.

2. Efni og aðferðir

2.1. Efni og hvarfefni

HE stofninn (BCRC 35669) var fenginn frá Bioresources Collection ogRannsóknarmiðstöð í Rannsókna- og þróunarstofnun matvælaiðnaðarins, Hsinchu, Taívan.Stofninn var fyrst ræktaður í öldrunarhalla áður en hann var færður yfir í kartöfludextrósaagarplata á 26◦C í 15 daga. Á degi 15 voru HE ræktunin færð yfir í 1,3 L affljótandi miðill (í 2 L flöskum). Vökvaræktin var hrist við 120 snúninga/mín. 25◦C fyrir5 dagar. Næst voru þau stækkuð í 500 L, 20-tonn gerjunartæki í 5 daga og 12 daga,í sömu röð. Ræktunarefnið er stillt á pH 4,5 og inniheldur 4,5 prósent glúkósa, 0,5 prósentsojabaunaduft, {{0}},25 prósent gerþykkni, 0,25 prósent pepton og 0,05 prósent MgSO4. Að lokum, HEsveppasýkingar voru tíndar í lok 20-tonna gerjunarferlisins. Þessi hráefnivoru frostþurrkuð, jörðuð í dufti og geymd í þurrkvél. echinacoside A var þádregin úr HE og magngreind samkvæmt fyrri rannsóknum [26]. Metanól (LC-MSeinkunn) var fengin frá Merck (Darmstadt, Þýskalandi); asetónítríl (LC-MS einkunn), maurasýrusýra (FA, LC-MS bekk, 98 prósent hreinleiki) og ammóníum asetat (98 prósent hreinleiki) fengustfrá Honeywell (Honeywell Burdick og Jackson, Muskegon, MI, Bandaríkjunum). Rottulifrin S9brot var fengið frá Moltox (Boone, NC, Bandaríkjunum). Mannslifrar S9 brotið varfengin frá Thermo Fisher Scientific (Rockford, IL, Bandaríkjunum).

2.2. S9 brot úr rottum og mönnum lifur

við tilmæli um settið. Tilbúnu lausninni var haldið við 4◦C þar til echinacoside Aefnasamband (10µM) var bætt við, fylgt eftir með virkjun í 37◦C vatnsbað. Þegarefnaskiptatími hafði náð sínum tímapunktum, 150µL af lausninni var dregið úrstofnlausninni og slökkt með því að bæta við tveimur rúmmálum af ísköldu ACN. Hættulausnin er síðan flutt yfir í QTOF til frekari greiningar á umbrotsefnum.

2.3. Tækjabúnaður og skilyrði

HPLC-QQQ/MS greining var gerð á Agilent 1100 röð HPLC kerfi (Ag)ilent, Palo Alto, Kaliforníu, Bandaríkjunum) ásamt API 3000 þreföldum fjórpóla massarófsmæli(Applied Biosystems, Warrington, Bretlandi), með Turbo-assisted jónaúða (ESI) jónunuppspretta í jákvæðri jónunarham. Litskiljun var gerð á anAgilent Eclipse XDB-C18 (4,6 mm× 100 mm× 3.5 µm). Súluhitinn varhaldið við 22◦C. Hreyfanlegur fasi samanstóð af vatni sem innihélt 0,1 prósent maurasýru(A) og metanól (B). Stuðningsskolun var notuð, byrjað á 70 prósentum B og hækkaði í 100 prósentB innan 5 mín, haldið í 3 mín með 90 prósentum B, minnkað B í 70 prósent innan 0,1 mín., ogendurjafnvægi við 70 prósent B í 2,9 mín. Félagshlutfall 350µL/mín var sett á og rúmmálaf 10µL var sprautað.

Greining var framkvæmd með jónandi spennu plús 4500 V. Hitastig jónagjafavar sett á 350◦C, með ofurhreint köfnunarefni sem fortjaldgas (7 psi). Nebulizer gasið var8 psi. Aðrar massaháðar breytur, svo sem declustering potential (DP), inngangurmöguleiki (EP), fókusmöguleiki (FP) og árekstraorka (CE) fyrir hvert efnasamband, voruákvarðað í jákvæðum ham með því að nota staðlaðar lausnir. Margþætt viðbragðseftirlit(MRM) var framkvæmt með því að nota köfnunarefni sem árekstursgas (2 psi) og með dvalartíma á200 ms fyrir hverja umskipti. echinacoside A greindist með því að fylgjast með umbreytingunumm/z 443.200 → 301.200, 283.200. Gögnin voru greind með Analyst 1.4.2 hugbúnaði (AppliedBiosystems, Concord, ON, Kanada) og GraphPad (Prism 8.0.0.).

UPLC-QTOF/MS greining var gerð á Agilent 1290 Infinity II UPLC kerfi(Agilent, Palo Alto, CA, Bandaríkjunum), ásamt Agilent 6546 fjórpóla flugtímamassalitrófsmælingar (Agilent, Palo Alto, CA, Bandaríkjunum). Litskiljun var gerðá Phenomenex Kinetex® C18 LC dálkur (3 mm× 100 mm× 1.7 µm). Súlanhitastigi var haldið í 40◦C. Hreyfanlegur fasi A samanstóð af vatni sem innihélt0.1 prósent (v/v) maurasýru í jákvæðri stillingu, 0,1 prósent (v/vmaurasýru og 10 mM CH3COONH4 í neikvæðum ham. Hreyfanlegur fasi B var asetónítríl. Stuðningsskolun var notuð, byrjaðmeð 5 prósent B og haltu í 0,5 mín, hækkar í 50 prósent B innan 5,5 mín, hækkar í 100 prósentB innan 10 mín, og haldið í 6 mín. Félagshlutfall 400µL/mín var beitt og abindi 2µL var sprautað.

Agilent 6546 quadrupole-time-of-flug massagreiningu var útbúin með rafeindabúnaðitrospray jónunar (ESI) uppspretta. Gagnaöflunin var undir stjórn Mass Huntervinnustöð hugbúnaður. Dæmigerð rekstrarskilyrði í jákvæðum og neikvæðum jónumESI hamur var fínstilltur sem hér segir: jónaúðaspenna (ESIplús/ESI−) voru4000 V/3000 V; gashitinn var 320◦C; Þurrkunargasið var 8 l/mín; þrýstingur á eimgjafa var45 psi; hitastig slíðurgassins var 350◦C; Hraði slíðurgass var 12 l/mín; áreksturinnorka var 10, 20, 40 og 60 V. Umbrotsefni voru auðkennd með því að nota Agilent MassHunterHugbúnaður um umbrot (útgáfa B.04.00) (Santa Clara, CA, Bandaríkin). Litskiljurog massaróf foreldris og auðkennd umbrotsefni voru dregin út með AgilentMassHunter Qualitative Analysis hugbúnaður (útgáfa B.05.00) (Santa Clara, CA, USA).

Biðja um meira:

Netfang:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp plús 86 15292862950