Fosfórríkt mataræði veldur uppstýringu á Bmp2 og Spp1 MRNA tjáningu í rottum nýrum

Hiroshi Matsuzaki, Kikue Mori, Shinichi Katsumata 

Til að skýra hvernig þróun nýrnakalsínósu af völdum fosfórríks (P) mataræðis, lögðum við áherslu á beinatengd prótein eins og beinformandi prótein 2 og osteopontin. Þessi rannsókn rannsakaði áhrif há-P mataræðis á mRNA tjáningu Bmp2 og Spp1 í rottumnýru. Wistar rottum var skipt í tvo hópa og fengu viðmiðunarfæði (viðmiðunarhópur) eða há-P fæði (há-P hópur).Nýrastyrkur kalsíums og P jókst marktækt í hópnum með hátt P miðað við samanburðarhópinn. MRNA tjáning bæði Bmp2 og Spp1 jókst marktækt í hópnum með hátt P miðað við samanburðarhópinn. Þessar niðurstöður benda til þess að mataræði með háu P veldur uppstjórnun á Bmp2 og Spp1 mRNA ínýru.

Leitarorð: fosfórríkt fæði, nýrnabólga, Bmp2, Spp1,nýru, rotta

Fyrir frekari upplýsingar vinsamlega hafið samband við:emily.li@wecistanche.com

cistanche til að meðhöndla nýrnasjúkdóm

Kynning

Nephrocalcinosis er sjúkdómur sem einkennist af kalsíum (Ca) útfellingum í nýrnabólga. Sérstaklega er fosfór (P) í fæðunni lykilþáttur í þróun þessa röskunar. Sýnt hefur verið fram á að gjöf há-P mataræðis leiðir til aukinnar Ca styrks ínýruog Ca útfellingar í nýrnahlífinni1-6）. Þrátt fyrir að áhrif há-P mataræðis á þróun nýrnakalsínósu hafi verið í brennidepli í áframhaldandi rannsóknum, er lítið vitað um gangverkið sem ber ábyrgð á þróun þessa röskunar. Þess vegna er nauðsynlegt að leysa þetta mál tímanlega.

Við greindum frá því að við vefjarannsókn með rafeindasmásjá, sáust hýdroxýapatit-líkir nálarlaga kristallar í nýrnapíplum rotta sem fengu há-P fæði6, 7）. Röntgengeisla örgreining benti til þess að Ca útfellingar af völdum há-P mataræðis eru aðallega samsettar af Ca og P7）. Þessar niðurstöður leiddu í ljós að Ca útfellingar af völdum há-P mataræðis eru mynd hýdroxýapatíts. Á grundvelli þessarar niðurstöðu gerum við ráð fyrir því að þróun nýrnabólga sé stjórnað með kerfi svipað og í beinamyndun. Þess vegna beindi þessi rannsókn að beinatengdum próteinum eins og beinformandi prótein 2 (BMP2). BMP2 er beinmyndandi þáttur sem sýnir beinmyndunarvirkni8, 9）. Það er athyglisvert að BMP2 var skilgreindur sem þáttur sem veldur utanlegsfrumumbeinmyndun10, 11). Þannig gerðum við tilgátu um að ef BMP2 gegnir mikilvægu hlutverki í þróun nýrnabólga, þá myndi tjáning þessa próteins ínýruværi stjórnað af háu P mataræði. Þessi rannsókn miðar að því að ákvarða hvort mataræði með háu P hafi áhrif á mRNA tjáningu Bmp2 ínýru.

Á sama tíma greindi fyrri rannsókn okkar frá því að mataræði með hátt P eykur tjáningu á osteopontin (OPN) í nýrnapíplum með því að nota ónæmisvefjaefnafræðilega greiningu, sem bendir til þess að OPN gæti átt þátt í þróun Ca útfellinga af völdum há-P mataræðis12）. Þess vegna könnuðum við breytingar á Spp1 mRNA tjáningu ínýrueinnig.

Niðurstöður þessarar rannsóknar geta veitt dýrmæta innsýn í aðferðina sem er ábyrgur fyrir þróun nýrnakalsínósu af völdum há-P mataræðis.

efni og aðferðir

Dýr og mataræði.

Þessi rannsókn var samþykkt af dýranotkunarnefnd Landbúnaðarháskólans í Tókýó og öllum dýrum var viðhaldið í samræmi við leiðbeiningar háskólans um umhirðu og notkun tilraunadýra (Samþykki nr. 300049).

Það er mikilvægt að hafa í huga að kvenkyns rottur fá nýrnakalsínósu auðveldara en karlkyns rottur13, 14）. Að auki greindum við frá því að mataræði með háu P eykur tjáningu OPN í nýrnapíplum kvenkyns rotta12）. Í þessari rannsókn var síðan notuð kvenkyns rottur sem tilraunadýr. Fjögurra vikna gamlar Wistar kvenkyns rottur (Clea Japan, Tókýó, Japan) voru geymdar í einstökum búrum úr ryðfríu stáli vírneti. Á tilraunatímabilinu voru búrin staðsett í herbergi með stýrðri lýsingu undir 12-klst birtu: myrkri hringrás (ljós, 0800-2000 klst), hitastig 22 ± 1 gráðu og hlutfallslegur raki 60 prósent í 65 prósent.

Samsetning tilraunafæðis er sýnd íTaflae 1. Tilraunafæði var útbúið með hliðsjón af AIN{{0}}G mataræði15). Tilraunafæði innihéldu tvo mismunandi P styrkleika (viðmiðunarfæði, 0,3 prósent; hátt P-fæði, 1,5 prósent). P styrkur í mataræði með háum P var stilltur á 1,5 prósent þar sem fyrri rannsóknir okkar sáu að 1,5 prósent P styrkur í mataræði veldur

alvarleg nýrnabólga6, 7, 12, 14）og mikil OPN tjáning12）. Allt tilraunafæði var með sama styrk af Ca (0,5 prósent). P og Ca styrkur, eins og hann er ákvarðaður með greiningu á tilraunafæðinu, er sýndur íTaflae 1. Áður en rannsóknin hófst voru allar rottur aðlagaðar í 7 daga, á þeim tíma fengu þær ókeypis aðgang að viðmiðunarfæðinu og afjónuðu vatni. Eftir aðlögunartímabilið var rottunum skipt af handahófi í tvo hópa með svipaða meðallíkamsþyngd og fengu annað hvort viðmiðunarfæði (viðmiðunarhópur) eða há-P fæði (há-P hópur) í 14 daga. Rottur fengu ókeypis aðgang að úthlutað tilraunafæði og afjónuðu vatni allan tilraunatímann. Í lok tilraunatímabilsins voru rottur aflífaðar með inndælingu í kviðarhol með svæfingablöndunni (medetomidín, mídazólam og bútorfanól) og blóði ognýrusýnum var safnað til greiningar. Blóðsýni voru skilin í skilvindu og yfirborðsvatn notað sem sermisýni. Nýru voru fjarlægð og nýrnahylkinu var hent. Serumið ognýrusýni voru geymd við -80 gráður þar til þörf var á til greiningar. Hægra nýrað var notað til magngreiningar á Bmp2 og Spp1 mRNA og það vinstranýruvar notað til að greina Ca og P styrk.

Steinefnagreining.

Sýnishorn af tilraunafæði ognýruvoru ösku við 550 gráður í 48 klst í múffuofni og steinefni voru dregin út í 1 mól/L af HCl til greiningar. Ca styrkur í tilraunafæði ognýruvoru ákvörðuð með atómgleypni litrófsmælingu16）. P styrkur í tilraunafæði ognýruvoru greind með aðferð Gomori17）.

Magngreining á Bmp2 og Spp1 mRNA.

Heildar-RNA var einangrað úr einsleita nýranu með því að nota TRIzol hvarfefni (Life Technologies, CA, USA) í samræmi við forskrift framleiðanda. Magn og hreinleiki RNA var metið með NanoDrop 2000c (Thermo Fisher Scientific, MA, Bandaríkjunum). cDNA var búið til með því að nota SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix fyrir qRT-PCR (Life Technologies) og síðan sett fyrir megindlega rauntíma RT-PCR með því að nota SYBR Select Master Mix (Life Technologies). Sérstakir grunnar18-20) voru notaðir við greiningu á Bmp2 (áfram, 5'-ACCGTGCTCAGCTTCCATCAC-3'; afturábak, 5'-TTCCTGCATTTTGTTCCCGAAA-3'), Spp1 (áfram, 5'- TGAGACTGGCAGTGGTTTGC-3'; afturábak, 5'-CCACTTTCACCGGGAGACA-3'), og Gapdh (áfram, 5'-TGGGAAGCTGGTCATCAAC-3'; afturábak, 5'-GCAT-CACCCCATTTGATGTT{{26} }'). Rauntíma PCR hvarfið var framkvæmt með því að nota StepOne rauntíma PCR kerfi (Applied Biosystems, CA, USA) og mRNA tjáningarmagn var staðlað í Gapdh mRNA gildi. Gildi samanburðarhópsins var talið vera 1,00.

Tölfræðigreining.

Niðurstöður eru settar fram sem meðaltal ± SEM fyrir hvern hóp af 6 rottum. Eftir að hafa gert F-próf ​​til að ákvarða einsleitni frávika var t-próf ​​nemenda notað til að ákvarða marktækan mun á hópunum tveimur. Ef einsleitni dreifni var ekki jöfn var t-próf ​​Welch notað í stað t-prófs nemenda. Mismunur var talinn marktækur á p ＜ 0.05

Niðurstöður

Líkamsþyngd, fæðuinntaka og sermisgreining.

Endanleg líkamsþyngd og fæðuinntaka minnkaði marktækt í hópnum sem fékk háa P samanborið við samanburðarhópinn (Tafla 2). Nýraþyngd og styrk steinefna.Nýrablaut og þurr þyngd jókst marktækt í hópnum með háa P samanborið við samanburðarhópinn (Tafla 3). NýraStyrkur Ca og P jókst einnig marktækt í hópnum með hátt P miðað við samanburðarhópinn.

Nýra Bmp2 og Spp1 mRNA tjáning.

Bmp2 mRNA gildi í há-P hópnum jukust marktækt miðað við samanburðarhópinn (Mynd.1A). mRNA tjáning Spp1 jókst einnig marktækt í hópnum með há-P samanborið við samanburðarhópinn (Mynd. 1B).

Umræða

Einn af vel þekktum lífeðlisfræðilegum áhrifum há-P mataræðis er þróun nýrnabólkunar. Í þessari rannsókn jókst þéttni Ca og P í nýrum í hópnum með hátt P miðað við samanburðarhópinn, sem er í samræmi við niðurstöður fyrri rannsókna1-6）. Fyrri rannsóknir greindu frá því að vefjafræðileg stig nýrnakalsínósu væru jákvæð fylgni við Ca og P styrk í nýrum4, 21）. Þannig að þrátt fyrir að engin vefjafræðileg athugun á nýrinu hafi verið framkvæmd í þessari rannsókn, bendir aukinn styrkur Ca og P í nýrum til þess að nýrnabólkunarbólga hafi verið framkölluð af há-P mataræði.

Vegna þess að Ca útfellingar af völdum há-P mataræðis eru almennt talin vera tegund hýdroxýapatíts6, 7）, gerðum við tilgátu um að þróun nýrnabólga sé stjórnað af aðferð svipað og bein tilurð. Þannig skoðuðum við áhrif há-P mataræðis á tjáningu Bmp2 mRNA í nýrum. Niðurstöðurnar

sýndi að tjáning Bmp2 mRNA í nýrum var aukin í há-P hópnum og að hátt P mataræði veldur uppstjórnun á tjáningu Bmp2 mRNA í nýrum. Þessi niðurstaða getur hjálpað til við að skýra hvernig nýrnakalsínósu þróast af völdum há-P mataræðis. Þó endanlegar sannanir sem styðja tilgátu okkar skorti, er einn möguleiki að tjáning beinmyndandi umritunarþátta sé hækkuð á kalkuðum svæðum í nýrum. BMP2 framkallar beinþynningaraðgreiningu og beinmyndun með því að stjórna beinmyndandi umritunarþáttum eins og Osterix, Runx2 og Msx28, 9）; þar af leiðandi getur BMP2 stuðlað að nýrnakalsínósu með stjórnun á slíkum beinmyndandi umritunarþáttum. Sem stendur er ítarlegt hlutverk BMP2 í þróun nýrnabólkunar óljóst. Þar að auki, þar sem aðeins Bmp2 mRNA tjáning var mæld í þessari rannsókn, er ekki vitað hvort munur sé á BMP2 prótein tjáningu. Hins vegar benda niðurstöður okkar til mögulegs kerfis þar sem breytingar á BMP2 tjáningu gegna öflugu hlutverki í meingerð nýrnabólkunar af völdum há-P mataræðis.

Þessi rannsókn beindist að Spp1 mRNA tjáningu auk Bmp2 mRNA tjáningar. Fyrri rannsókn okkar sem notaði ónæmisvefjaefnagreiningu benti til mikils OPN tjáningar í nýrnapíplum rotta sem fengu há-P mataræði12）. Þessi rannsókn leiddi í ljós að Spp1 mRNA tjáning var aukin um það bil 10-falt í hópnum með háa P. Niðurstöður núverandi og fyrri rannsókna sýna að mataræði með háu P veldur tjáningu OPN í nýrum. Á hinn bóginn hafa aðrir vísindamenn sýnt að OPN sem steinfylki er mikilvægur þáttur í myndun þvagsteina22, 23）; Þannig gaf fyrri skýrsla okkar til kynna að OPN gæti haft hlutverk sem fylkisþáttur í myndun Ca útfellinga af völdum há-P mataræðis12）. Hins vegar, Paloian o.fl. nýlega greint frá því að OPN gegnir hlutverki í að koma í veg fyrir nýrnakalkínósu af völdum há-P mataræðis í OPN KO músum24）. Lífeðlisfræðilegt hlutverk OPN á nýrnabólga af völdum há-P mataræðis virðist nefnilega vera bæling frekar en að stuðla að kölkun ínýru. Ennfremur er fyrri skýrslum lýst um að OPN gildi aukist til að vega upp á móti frekari meinafræðilegri utanlegs kalkkölkun ínýruog æðakerfi þar sem OPN er uppstýrt á þeim stað sem sjúkleg kölkun er.

Eins og getið er hér að ofan gaf þessi rannsókn til kynna mikilvægi BMP2 og OPN í nýrnabólsínósu af völdum hás mataræðis. Það er athyglisvert að áhrif BMP2 og OPN á þróun nýrnabólkunar eru talin stjórnast af mismunandi aðferðum. Þessi vélrænni munur getur bent til þess að undirliggjandi kerfi nýrnabólga sé flókið. Næsta atriði sem þarf að íhuga er að vaxtarhömlun gæti hafa haft áhrif á Bmp2 og Spp1 mRNA tjáningu ínýruvegna þess að núverandi rannsókn sá lækkun á endanlegri líkamsþyngd í hópi með hátt P. Athuganir í fyrri12） og núverandi rannsóknum okkar geta hjálpað til við að gera grein fyrir þessu atriði. Við greindum áður frá aukinni tjáningu OPN próteina í nýrnapíplum hjá rottum með vöxt

var ekki hamlað með há-P mataræði12）. Þar að auki sýndi þessi rannsókn vaxtarhömlun í há-P hópnum, en mikið magn af Spp1 mRNA tjáningu í nýrum. Byggt á þessum athugunum virðist þessi rannsókn hafa lítil áhrif á vaxtarhömlun á tjáningu Bmp2 og Spp1 mRNA. Hins vegar eru upplýsingar um sambandið milli vaxtarhömlunar og Bmp2 og Spp1 genatjáningar óljósar. Þess vegna er þörf á frekari rannsóknum til að skýra þetta atriði.

Að lokum, til að skýra hvernig þróun nýrnakalsínósu af völdum há-P mataræðis, ákvarðaði þessi rannsókn áhrif há-P mataræðis á Bmp2 og Spp1 mRNA tjáningu ínýru. Styrkur Ca og P í nýrum jókst marktækt í hópnum með há P miðað við samanburðarhópinn. Ennfremur var mRNA tjáning á Bmp2 og Spp1 marktækt aukin í hópnum með hátt P miðað við samanburðarhópinn. Þessar niðurstöður benda til þess að mataræði með hátt P stuðli að uppstjórnun á Bmp2 og Spp1 mRNA tjáningu ínýru.

Heimildir

1） Hitchman AJ, Hefur einhverja SA, Hitchman A, Harrison JE, Tam C: Fosfat-framkallað nýrnakölkun í rottum. Can J Physiol Pharmacol 57: 92-97, 1979

2） Parker HE: Innbyrðis tengsl magnesíums og fosfórs við nægjanlegt til of mikið fosfórmagn í fæðu. Nutr Rep Int 32: 1311-1318, 1985

3） Ritskes-Hoitinga J, Lemmens AG, Danse LHJC, Beynen AC: Fosfór-framkölluð nýrnabólga og nýrnastarfsemi í kvenkyns rottum. J Nutr 119: 1423-1431, 1989

4） Cockell KA, L'Abbe MR, Belonje B: Styrkur og hlutfall kalsíums og fosfórs í fæðu hefur áhrif á þróun nýrnabólga í kvenkyns rottum. J Nutr 132: 252-256, 2002

5） Katsumata S, Matsuzaki H, Uehara M, Suzuki K: Áhrif kalsíumuppbótar í fæðu á beinefnaskipti, styrk nýrnasteinefna og nýrnastarfsemi hjá rottum sem fengu fosfórríkt fæði. J Nutr Sci Vitaminol 61: 195-200, 2015

6） Matsuzaki H, Uehara M, Suzuki K, Liu QL, Sato S, Kanke Y, Goto S: Fæða með miklu fosfóri veldur fljótt nýrnabólga og skaða á nærpíplum hjá rottum. J Nutr Sci Vitaminol 43: 627-641, 1997

7) Liu QL, Sato S, Kishikawa T, Matsuzaki H, Yamanaka N: Árangur hefðbundinnar kínverskrar læknisfræði, Wulingsan, við að bæla þróun nýrnablóðsýkingar af völdum fosfórríks fæðis hjá ungum rottum. Med Electron Microsc 34: 103-114, 2001

8） Sirard C, Kim S, Mirtsos C, Tadich P, Hoodless PA, Its A, Maxson R, Wrana JL, Mak TW: Markviss röskun í músafrumum sýnir breytilega þörf fyrir Smad4 til að umbreyta vaxtarþáttartengdum merkjum. J Biol Chem 275: 2063-2070, 2000

9） Matsubara T, Kida K, Yamaguchi A, Hata K, Ichida F, Meguro H, Aburatani H, Nishimura R, Yoneda T: BMP2 stjórnar Osterix í gegnum Msx2 og Runx2 við aðgreining á beinhimnu. J Biol Chem 283: 29119-29125, 2008

10） Urist MR: Bein: Myndun með sjálfsörvun. Vísindi 150: 893-899, 1965

11） Wozney JM, Rosen V, Celeste AJ, Mitsock LM, Whitters MJ, Kriz RW, Hewick RM, Wang EA: Nýir eftirlitsaðilar beinamyndunar: Sameindaklónar og starfsemi. Vísindi 242: 1528-1534, 1988

12） Matsuzaki H, Katsumata S, Uehara M, Suzuki S, Miwa M: mataræði með miklu fosfóri veldur tjáningu á osteopontíni nýrnapípla hjá rottum. J Clin Biochem Nutr 41: 179-183, 2007

13） Frændur FB, Geary CPM: Kynákvörðuð nýrnakölkun hjá rottum. Nature 211: 980-981, 1966

14） Matsuzaki H, Katsumata S, Masuyama R, Uehara M, Nakamura K, Suzuki K: Kynjamunur á styrk steinefna í nýrum og útskilnaði albúmíns í þvagi hjá rottum sem fá mikið fosfórfóður. Biosci Biotechnol Biochem 66: 1737-1739, 2002

15） Reeves PG, Nielsen FH, Fahey GC Jr: AIN-93 hreinsað fæði fyrir nagdýr á rannsóknarstofu: Lokaskýrsla American Institute of Nutrition ad hoc ritnefndar um endurskipulagningu á AIN-76Nagdýrafæði . J Nutr 123: 1939-1951, 1993

16） Gimblet EG, Marney AF, Bonsnes RW: Ákvörðun kalsíums og magnesíums í sermi, þvagi, mataræði og hægðum með atómgleypnigreiningu. Clin Chem 13: 204-214, 1967

17）Gomori G: Breyting á litamælingu fosfórs til notkunar með ljósalitamælinum. J Lab Clin Med 27: 955-960, 1942

18) Ming LG, Lv X, Ma XN, Ge BF, Zhen P, Song P, Zhou J, Ma HP, Xian CJ, Chen KM: Prenýlhópurinn stuðlar að starfsemi fytóestrógen 8-prenynaringeníns til að auka beinmyndun og hindra beinupptöku in vitro. Endocrinology 154: 1202-1214, 2013

19) Kreke MR, Huckle WR, Goldstein AS: Vökvaflæði örvar tjáningu á osteopontíni og beinsíalópróteini í beinmergsstrómafrumum á tímabundinn hátt. Bone 36: 1047-1055, 2005

20) Drechsler J, Grotzinger J, Hermanns HM: Einkenni rotta oncostatin M viðtaka flókins sem líkist manninum en er frábrugðin cýtókínviðtaka músa. PLoS One 7: e43155, 2012

21) Hoek AC, Lemmens AG, Mullink JWMA, Beynen AC: Áhrif kalsíums í fæðu: fosfórhlutfalls á útskilnað steinefna og nýrnabólga í kvenkyns rottum. J Nutr 118: 1210-1216, 1988 

22) Kohri K, Suzuki Y, Yoshida K, Yamamoto K, Amasaki N, Yamate T, Umekawa T, Iguchi M, Shinohara H, Kurita T: Sameindaklónun og raðgreining cDNA sem kóðar þvagsteinsprótein, sem er eins og osteopontin. Biochem Biophys Res Commun 184: 859-864, 1992

23）Kohri K, Nomura S, Kitamura Y, Nagata T, Yoshioka K, Iguchi M, Yamate T, Umekawa T, Suzuki Y, Shinohara H, Kurita T: Uppbygging og tjáning mRNA sem kóðar þvagsteinsprótein (Osteopontin). J Biol Chem 268: 15180-15184, 1993

24) Paloian NJ, Leaf EM, Giachelli CM: Osteopontin mótmælir gegn háum fosfat-framkallaðri nýrnakalsínósu og æðakölkun. Nýra Int 89: 1027-1036, 2016

25）Giachelli CM, Bae N, Almeida M, Denhardt DT, Alpers CE, Schwartz SM: Osteopontin hækkar við myndun neointima í slagæðum rotta og er nýr hluti af æðakölkun manna. J Clin Invest 92: 1686-1696, 1993