Útdráttur á fenýletanóíð glýkósíðum úr Cistanche Tubulosa með háhraða klippingu einsleitarútdrátt

Tengiliður: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Netfang:audrey.hu@wecistanche.com

Wenjing Pei og Ruili Guo

Bakgrunnur:

Cistanche tubulosaer vel þekkt hefðbundin kínversk læknisfræði upprunnin í Xinjiang. Það er víða dreift í Norður-Afríku, Indlandi, o.fl. Markmið: Helsti lífvirki þátturinn íC. tubulosaer fenýletanóíð glýkósíð (PhGs). Echinacoside og acteoside eru leiðbeinandi þættirnir til að ákvarða PhGs og eru aðallega notuð til lifrarverndar, ónæmisverndar osfrv. Þess vegna er mjög mikilvægt að vinna PhGs úr C. tubulosa. Aðferðir: Í þessari rannsókn voru ómskoðunarstýrðar útdráttaraðferðir (UAE), örbylgjustýrðar útdráttur (MAE) og háhraðaklippingarjafnvægisútdráttur (HSHE) bornar saman. Ennfremur voru útdráttarskilyrði HSHE aðferðarinnar fínstillt. Niðurstöður: Niðurstöðurnar sýndu að HSHE aðferðin var betri en bæði UAE og MAE aðferðirnar, og ákjósanlegustu útdráttarfæribreytur HSHE voru etanólstyrkur 50 prósent, útdráttarhiti 70 gráður, snúningshraði á 16000 snúninga á mínútu, útdráttartími 2 mín, hlutfall fasts og vökva 1:9 og ein útdráttarlota. Afrakstur echinacosides og acteosides var 1,366 og 0,519 prósent, í sömu röð, og flutningshraðinn echinacoside og acteoside náði 87 og 94 prósentum, í sömu röð. Ályktanir: Það má draga þá ályktun að HSHE aðferðin sé einföld, hröð og skilvirk tækni til að draga út PhG úr C. tubulosa. Helstu atriði: Skilvirk og vistvæn HSHE aðferð hefur verið rannsökuð við útdrátt PhGs úr C. tubulosa. Kjörskilyrði HSHE aðferðarinnar fyrir útdrátt PhGs úr C. tubulosa fengust. Þessi rannsókn veitir nýja aðferð til iðnaðarútdráttar PhGs úrC. tubulosa.

Cistanche tubulosa

Cistanche tubulosaer algengt hefðbundið kínverskt lyf sem er upprunnið í Xinjiang. Það er víða dreift í norðurhluta Afríku, Arabíuskagans, Pakistan og Indlands og var opinberlega skráð í kínversku lyfjaskránni árið 2010. Helsti lífvirki þátturinn íC. tubulosaer fenýletanóíð glýkósíð (PhGs), flokkur vatnsleysanlegra náttúruafurða þar á meðal echinacoside, acteoside, isoacteoside og 2-asetýlakteósíð (1, 2). Uppbygging PhGs samanstendur af kanilsýru- og hýdroxýfenýletýlhlutum, sem báðir eru tengdir -glúkópýranósa í gegnum ester- og glýkósíðtengingar, í sömu röð (3). Lyfjafræðilegar rannsóknir hafa sýnt að PhGs af C. tubulosa hafa marga lækningalega eiginleika, svo sem þreytueyðandi (4), taugaverndandi (5–7), lifrarverndandi (8–10) og ónæmisverndandi áhrif (11). Þess vegna hefur áhrifarík útdráttur PhGs úr C. tubulosa mikla þýðingu fyrir þróun og nýtingu náttúruafurða.

Núverandi hefðbundnar útdráttaraðferðir PhGs eru útdráttur með heitu bakflæði, útdráttur með ómskoðun (UAE) og útdráttur með örbylgjuofni (MAE; 12–16). Þessar aðferðir hafa mismunandi ókosti, svo sem lítil skilvirkni, langur útdráttartími og hár kostnaður. Í samanburði við hefðbundnar aðferðir er háhraða klippa einsleitni útdráttur (HSHE) aðferðin ný, ný útdráttaraðferð og hefur þá kosti að hraðari útdráttartímar, minni leysisúrgangur, meiri ávöxtun, einfaldari tæki og auðveldari notkun (17). Vinnureglan í HSHE aðferðinni er byggð á snúnings innri skútu sem knúin er áfram af háhraða mótor. Öflugur klippikraftur er framleiddur af innri og ytri skeri til að trufla og blanda sýnunum. Á sama tíma veldur skútan með háhraða snúningi þrýstingsmun á innra og ytra holi skútunnar, sem leiðir til massaflutnings milli sýnanna og leysiefna. Með blöndu af miklum klippikrafti, árekstrakrafti, þrýstingi og öðrum kröftum er hægt að ná leysanlegu jafnvægi milli fastra sýna og leysiefna hratt (18). Þannig er hægt að ljúka útdráttarferli HSHE á nokkrum mínútum, og jafnvel eins fljótt og tugum sekúndna (19–22).

Nýlega hefur HSHE verið kannað við útdrátt lífvirkra íhluta úr ýmsum náttúruvörum (23–25). Cheng o.fl. notaði HSHE til að vinna fimm lignan úr ávöxtum Schisandra Chinensis (26). Niðurstöðurnar sýndu að ákjósanlegustu skilyrðin voru 75 prósent etanólstyrkur, 1 mín útdráttartími, hlutfall fasts og vökva 1:19, útdráttarspenna 180 V og sýnishorn stærð 120 möskva. Heildarafrakstur lignananna fimm var 13,89 ± 0,014 mg/g við bestu aðstæður. Tang o.fl. notaði HSHE til að fá lífvirka olíu úr perillufræjum (27). Bestu aðstæðurnar voru 2 mín útdráttartími, hlutfall fasts og vökva 1:10, útdráttarspenna 150 V og tvær útdráttarlotur. Afrakstur perilla fræolíu náði 59,3 prósentum. Ofangreindar niðurstöður benda til þess að HSHE hafi þá kosti stuttan útdráttartíma, lágan kostnað og mikla afrakstur. Hins vegar er skortur á rannsóknum á útdrætti PhGs af HSHE.

Í þessari rannsókn var HSHE notað til að kanna hugsanlega notkun þess við útdrátt PhGs úrC. tubulosa. Afrakstur PhGs var ákvarðað með HPLC. Útdráttaraðferðirnar þrjár, HSHE, UAE og MAE, voru bornar saman við sömu aðstæður. Könnuð voru áhrif etanólstyrks, útdráttarhitastigs, snúningshraða, útdráttartíma, hlutfalls fasts á móti vökva og fjölda útdráttarlota afrakstursins. Kostir og gallar þessarar vinnu og vísanir eru bornir saman og ræddir.

Efni og aðferðir

Efni og efnafræðileg hvarfefni

C. tubulosavar keypt af Xinjiang Congrongtang Biological Technology Co., Ltd (Xinjiang, Kína). Staðlar fyrir echinacoside (hreinleika meiri en eða jafnt og 98 prósent) og akteósíð (hreinleika meiri en eða jafnt og 98 prósent) voru keyptir frá Shanghai Standard Biological Technology Co., Ltd (Shanghai, Kína). Asetónítríl, metanól og ediksýra voru af HPLC bekk (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ). Etanólið af greiningargráðu var keypt frá Tianjin Yongsheng Fine Chemical Co., Ltd (Tianjin, Kína). Afjónað vatn var notað í tilraununum.

HPLC greining

HPLC greining var gerð á Waters e2695 vökvaskiljun (Waters, Milford, MA) með 2489 UV/Synjanlegt skynjara og Symmetry C18 súlu (Waters), 250 × 4,6 mm, 5 μm kornastærð. Styrkur echinacoside og acteoside var greindur með HPLC aðferð. Hreyfanlegur fasi samanstóð af (1) asetónítríl og (2) 2 prósenta ísediksýru vatnslausn. Gradient eluation program er sett fram í töflu 1.

Uppgötvuð bylgjulengd var 330 nm, flæðihraði var 1 ml/mín, inndælingarrúmmál var 10 μL og ofnhiti var stilltur á 30 gráður. Litskiljunartopp greiniefnisins var staðfest með því að bera saman varðveislutíma þess við staðla. Magngreining var framkvæmd með því að samþætta toppinn með ytri staðlaðri aðferð.

Nákvæmniprófið var gert með því að sprauta sömu útdráttarsýnunum fimm sinnum. Fyrir stöðugleikaprófið voru sömu sýni greind í þrepum um 0, 1, 2, 4, 12, 24 og 48 klst. Endurheimtarprófanir á echinacoside og acteoside voru framkvæmdar með því að bæta stöðlunum í útdráttarsýnin. Öll toppsvæði og varðveislutímar echinacosides og acteosides voru skráð. Niðurstöður kvörðunarferlanna fyrir echinacoside og acteoside eru taldar upp í töflu 2.

Útreikningur á ávöxtunarkröfu

Echinacoside og acteoside voru notuð sem leiðbeinandi þættir til að ákvarða PhGs. Afrakstur echinacoside eða acteoside var reiknaður út með því að nota eftirfarandi jöfnu:

Y=CV/B×100 prósent (1)

þar sem Y=afrakstur echinacosides eða acteosides (prósent); C=styrkur echinacoside eða acteoside (mg/ml); V=rúmmál útdráttarlausnarinnar (mL); og W=þyngd C. tubulosa duftsins (mg).

Útdráttaraðferðir PhGs

Stönglar C. tubulosa voru fyrst malaðir með rafkvörn (JC-500g; Yongkang Kaiyuan Industry & Trade Co., Ltd, Yongkang, Kína) og síaðir með síusigti (u.þ.b. 380 μm). Síðan var C. tubulosa duftið þurrkað í ofni við 70 gráður þar til þyngdin var stöðug. Fimm grömm af C. tubulosa dufti var blandað saman við útdráttarleysið og sett í útdráttarflösku. Eftir það var fljótandi blandan forhituð (30–80 gráður) í 5 mínútur í vatnsbaði með stöðugu hitastigi (DF-101S; Jintan Analytical Instrument Co., Ltd, Jintan, Kína).

(a) HSHE aðferð.—HSHE var framkvæmt með FA25 kerfi (FLUKO Co., Ltd, Shanghai, Kína), sem samanstóð af snúningsskeri, háhraðamótor og stjórnanda. Snúningshraði innri skerisins var stilltur á bilinu 10000–28000 snúninga á mínútu og útdráttartíminn var stilltur á bilinu 2–15 mín.

(b) UAE aðferð. — Fimm grömm af þurrkuðu sýni og 300 ml af metanóli voru vegin nákvæmlega og sett í útdráttarflösku. Útdráttarflöskunni var sökkt í úthljóðsbað og framkvæmt við úthljóðsstyrk upp á 300 W í 10 mínútur. Útdráttshitastigið var stillt á 30 gráður.

(c) MAE aðferð. — Fimm grömm af þurrkuðu sýni og 300 ml af metanóli voru vegin nákvæmlega og sett í útdráttarflösku. Útdráttarflaskan var sett í örbylgjuofninn og framkvæmd við 180 W í 10 mín. Útdráttshitastigið var stillt á 30 gráður.

HSHE aðferðin var borin saman við UAE og MAE aðferðirnar með sama útdráttarleysi, útdráttartíma, útdráttshitastig, hlutfall fasts og vökva og fjölda útdráttarlota. Útdráttarlausnin var síuð með 0.22 μm himnu og greind með HPLC til að ákvarða styrk echinacoside og acteoside. Öll útdráttarferlin voru endurtekin þrisvar sinnum

Ákvörðun millifærslugjalda

Byggt á stöðluðu aðferðinni í 2015 Kína lyfjaskránni var innihald echinacoside og acteoside í C. tubulosa dufti ákvarðað (28). Eitt gramm af C. tubulosa dufti og 50 ml af 50 prósenta metanóli var vegið nákvæmlega og bætt í 50 ml brúna mæliflösku. Vökvablandan var vigtuð og lögð í bleyti í 30 mín. Síðan var brúnu mæliflöskunni sökkt í úthljóðsbað og framkvæmt með úthljóðsafli upp á 250 W og tíðni 35 kHz í 40 mínútur. Vökvablandan var vegin aftur og 50% metanóli var bætt við til að afgreiða leysiefni. Útdráttarlausnin var síuð með 0,22 μm himnu og var greind með HPLC til að ákvarða styrk echinacoside og acteoside. Útdráttarferlið var endurtekið þrisvar sinnum.

Flutningshraði echinacoside eða acteoside var reiknaður út með því að nota eftirfarandi jöfnu:

X= M1/M2 ×100 prósent (2)

þar sem X=flutningshraði echinacosides eða acteosides ( prósent ); M1=gæði echinacoside eða acteoside í útdrættinum (mg); og M2=gæði echinacoside eða acteoside í C. tubulosa dufti (mg).

Niðurstöður og umræður

Staðfesting á HPLC aðferð

HPLC prófíl echinacoside og acteoside frá C. tubulosa með því að nota HSHE eru sýnd á mynd 1. RSD á toppsvæðum echinacoside og acteoside var 1,89 og 1,40 prósent, í sömu röð. Niðurstöðurnar sýndu að HPLC aðferðin hefur góða nákvæmni í magngreiningu á echinacoside og acteoside. Á ýmsum tímum (0–48 klst.) voru RSD á toppsvæðum echinacosides og acteosides 1,71 og 1,70 prósent, í sömu röð, sem gefur til kynna að sýnið hafi verið stöðugt eftir 48 klst. Endurheimt echinacoside og acteoside var 99,3 og 99,1 prósent, í sömu röð, og RSD þeirra var 0,70 og 0,67 prósent, í sömu röð, sem staðfesti áreiðanleika HPLC aðferðarinnar.

Samanburður á mismunandi útdráttaraðferðum

Gerður var samanburður á HSHE aðferðinni við MAE og UAE aðferðirnar varðandi uppskeru echinacoside og acteoside, en niðurstöður þeirra eru sýndar á mynd 2. Í ljós kom að uppskera echinacoside og acteoside sem fengust með HSHE var hærri en þær sem fengust af bæði MAE og UAE. Samanborið við MAE var uppskeran af echinacoside og acteoside sem fengust með HSHE meiri um 20,5 og 20,8 prósent, í sömu röð. Og samanborið við Sameinuðu arabísku furstadæmin, var ávöxtun echinacoside og acteoside fengin með HSHE meiri um 6,6 og 7,4 prósent, í sömu röð. Þessar niðurstöður benda til þess að HSHE geti aukið afrakstur PhGs verulega.

Hagræðing á HSHE-aðferðinni

Útdráttarbreytur PhGs með HSHE innihalda etanólstyrk, útdráttshitastig, snúningshraða, útdráttartíma, hlutfall fasts og vökva og fjölda útdráttarlota (26, 29).

Áhrif etanólstyrks á útdrátt PhGs

Styrkur etanóls er mikilvægur þáttur sem hefur áhrif á afrakstur PhGs. Eins og sést á mynd 3 var afrakstur echinacoside og acteoside frá C. tubulosa við mismunandi styrk etanóls rannsakaður. Það leiddi í ljós að afrakstur echinacosides jókst úr 0 í 30 prósent og lækkaði síðan úr 30 í 90 prósent með aukinni styrk etanóls. Afrakstur akteósíðs jókst úr 0 í 70 prósent og minnkaði síðan úr 70 í 90 prósent með auknum styrk etanóls. Þegar etanólstyrkurinn var 50 prósent var summan af uppskeru echinacosides og acteosides í hámarki. Mismunandi styrkur etanóls hefur mismunandi skautun, sem leiðir til mismunandi leysni echinacosides og acteosides. Þannig var ákjósanlegur etanólstyrkur 50 prósent.

Áhrif snúningshraða á útdrátt PhGs

Mynd 5 sýnir áhrif mismunandi snúningshraða á afrakstur PhGs. Afrakstur echinacoside og acteoside jókst með auknum snúningshraða. Aukning snúningshraða getur aukið klippikraft innri og ytri skera og þannig aukið afrakstur PhGs. Besti snúningshraði var 16000 rpm.

Áhrif útdráttartíma á útdrátt PhGs

Afrakstur echinacosides og acteosides við mismunandi útdráttartíma er sýndur á mynd 6. Uppskeran af echinacoside og acteoside var stöðug með vaxandi útdráttartíma. Því má álykta að hægt sé að draga PhGs að fullu úr C. tubulosa á 2 mínútum og ákjósanlegur útdráttartími var 2 mínútur.

Áhrif fasts-til-vökvahlutfalls á útdrátt PhGs

Eins og sýnt er á mynd 7 var fjallað um heimtur echinacoside og acteoside undir mismunandi hlutföllum fasts og vökva. Uppskeran af echinacoside og acteoside jókst úr 1:3 í 1:9 og varð stöðug úr 1:9 í 1:24. Vegna þess að lítið magn af útdráttarleysi getur ekki alveg leyst upp echinacoside og acteoside, minnkaði massaflutningshraðinn. Of mikil útdráttur leysiefna olli óþarfa sóun. Þess vegna var ákjósanlegt hlutfall fasts og vökva 1:9.

Áhrif fjölda útdráttarlota á útdrátt PhGs

Mynd 8 sýnir að áhrif fjölda útdráttarlota á afrakstur PhGs. Afrakstur echinacoside og acteoside jókst með auknum fjölda útdráttarlota. Hins vegar jókst útdráttartíminn ótrúlega með auknum útdráttarlotum og meiri orku var neytt. Besti fjöldi útdráttarlota var ein.

Samanburður á HSHE aðferðinni við aðrar útdráttaraðferðir til að vinna út PhGs

Niðurstöður HSHE aðferðarinnar í samanburði við aðrar útdráttaraðferðir til að draga út PhG úr C. tubulosa eru taldar upp í töflu 3. HSHE er einfaldari og auðveldari en tengiaðferðirnar eins og ómskoðunaraðstoðuð vatnskennd tveggja fasa útdráttur og ultrasonic örbylgjuútdráttartækni aðferðir. Að auki er útdráttarþrýstingur HSHE lægri en útdráttaraðferðin með vökvaþrýstingi og rekstrarskilyrði þess fyrrnefnda eru öruggari. Meira um vert, það má sjá af töflu 3 að HSHE sýnir stysta útdráttartímann og minnsta leysiefnanotkun af öllum útdráttaraðferðum. Það má draga þá ályktun að HSHE aðferðin hafi marga kosti eins og mikil afköst, væg rekstrarskilyrði, lágt neyslustig, einfaldur búnaður og auðveld aðgerð til að vinna úr náttúruvörum.

Ályktanir

Í þessari rannsókn hefur skilvirk og vistvæn HSHE aðferð verið rannsökuð við útdrátt PhGs úr C. tubulosa. Í samanburði við UAE og MAE aðferðirnar framleiðir nýja HSHE aðferðin hærri afrakstur PhGs við sömu aðstæður. Í samanburði við MAE aðferðina jókst afrakstur echinacosides og acteosides um 20,5 og 20,8 prósent í sömu röð. Og samanborið við Sameinuðu arabísku furstadæmin, jókst afrakstur echinacoside og acteoside um 6,6 og 7,4 prósent, í sömu röð. Útdráttarfæribreytur HSHE af PhGs frá C. tubulosa voru fínstilltar. Samkvæmt fínstilltu breytunum náði ávöxtun echinacoside og acteoside 1,366 og 0,519 prósent, í sömu röð, og flutningshraði echinacoside og acteoside náði 87 og 94 prósentum, í sömu röð. HSHE aðferðin hefur kosti mikillar skilvirkni, mildra rekstrarskilyrða, lágs neyslustigs, einfalds búnaðar, auðveldrar notkunar og lágs kostnaðar. Þessi rannsókn veitir nýja aðferð til iðnaðarútdráttar PhGs úr C. tubulosa.