Utanfrumusýrublóðsýring takmarkar eins kolefnis umbrot og varðveitir stofn T-frumu

Uppsöfnun súrra efnaskiptaúrgangsefna í æxlisörumhverfinu hindrar áhrifavirkni æxlisuppblásandi eitilfrumna (TIL). Hins vegar er enn óljóst hvernig súrt umhverfi hefur áhrif á umbrot og sérhæfingu T-frumna. Hér sýnum við að langvarandi útsetning fyrir sýru endurforritar innanfrumuefnaskipti T-frumna og hæfni hvatbera og varðveitir stofn T-frumna. Vélrænt, hækkuð utanfrumublóðsýring skerðir metíónínupptöku og umbrot með niðurstýringu á SLC7A5, og breytir því útfellingu H3K27me3 á frumkvöðlum lykil T-frumna stofngena. Þessar breytingar stuðla að því að viðhalda „stöngullíku minni“ ástandi og bæta langtímaþol í lífi og æxlishemjandi verkun hjá músum. Niðurstöður okkar sýna ekki aðeins óvænta getu utanfrumusýrublóðsýringar til að viðhalda stofnlíkum eiginleikum T-frumna heldur auka einnig skilning okkar á því hvernig metíónínefnaskipti hafa áhrif á stofnstærð T-frumna.

cistanche plöntuaukning ónæmiskerfi

Smelltu hér til að skoða Cistanche Enhance Immunity vörur

【Biðja um meira】 Netfang:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Ættleiðingarflutningur á sértækum T-frumum sem eru sértækar fyrir æxlismótefnavaka er stórt framfarir á sviði krabbameinsmeðferðar, þar sem það hefur leitt til algjörrar afturgöngu tiltekinna illkynja sjúkdóma. Meðferðarárangur þess byggist að miklu leyti á þrautseigju og aðgreiningarstöðu yfirfærðra T-frumna1,2. Minni aðgreindar T-minnisfrumur eru ákjósanlegasti hópurinn fyrir ættleiðingar-T frumuflutning (ACT) vegna stofnfrumulíkra eiginleika þeirra sjálfsendurnýjunar og fjölvirkni3,4. Reyndar hefur verið sýnt fram á að notkun stofnlíkra T-minnisfrumna fyrir ACT nái betri æxlissvörun5. Í samanburði við endanlega aðgreindar áhrifa-T-frumur, sýna stofnlíkar T-frumur sérstök einkenni6. Stofnlíkar T-frumur úr mönnum og músum einkennast af tjáningu þeirra á mótefnavaka-reyndum og homing-tengdum sameindum, þar á meðal mikið magn af CD62L og CCR7 (tilvísun 7). Skilningur okkar á umritunarsniðum, epigenetic breytingum og efnaskiptaferlum sem stjórna stofnlíkum T frumum hefur stóraukist á undanförnum árum8-10. Tilkynnt hefur verið um nokkra umritunarþætti, svo sem TCF1, KLF2 og LEF1, gegna mikilvægu hlutverki við að knýja áfram eða viðhalda stofnfrumu T-frumna9. Sérstaklega er TCF1 lykilumritunarþátturinn sem stuðlar að myndun langlífra T-minnisfrumna11. Meðan á langvinnum sýkingum stendur heldur lítið brot af TCF1+ stofnlíkum T-frumum við T-frumuviðbrögðum gegn afleiddri sýkingu1,12. Epigenetic breytingar veita T-frumum leið til að koma af stað umritunarbreytingum sem liggja til grundvallar öflun minnisfrumueiginleika og viðhalda þessum umritunartjáningarmynstri13. Margar rannsóknir hafa sýnt fram á að þrímetýlering á históni H3 við K4 (H3K4me3), sem er virkjunartengd breyting, fæst á minnistengdum genastöðum, þar á meðal TCF7, KLF2, LEF1, CCR7 og SELL, við aðgreining á barnalegum geisladiskum{{47 }} T frumur inn í minni T frumur, en þrímetýlering H3 við K27 (H3K27me3), bælandi breyting, tapast á þessum staði13–15. Aftur á móti sýna áhrifartengd gen (GZMB, PRF1, IFNG og TBX21) minnkuð bælandi og auknar virkjanandi epigenetic breytingar á þessum stað í T-frumum áhrifavalda13,16. Að lokum benda uppsafnaðar vísbendingar til þess að efnaskiptahringrásir ráði ákvörðunum um örlög T-frumna og mótar erfðafræðilegt og virkniástand þeirra17. Skammlífar T-verkunarfrumur eru mjög glýkólýsandi og háðar efnaskiptum eins kolefnis18,19, en stofnlíkar T-minnisfrumur sýna mismunandi efnaskiptasnið sem einkennist af aukinni fitusýruoxun (FAO) og hvatbera varaöndunargetu (SRC), kardinal eiginleikar sem taka þátt í langtíma þrautseigju20–22. Þess vegna er endurforritun efnaskipta mikilvæg fyrir skilvirka öflun stofns og langtímalifunar T-frumna.

cistanche ávinningur fyrir karla styrkir ónæmiskerfið

Ónæmisbælandi æxlismíkróumhverfið (TME), sem einkennist af lágu pH, súrefnisskorti, glúkósaskorti og mjólkursýruauðgun, er lykilhindrunin sem hindrar rétta útþenslu, aðgreiningu og virkni T-frumna23,24. Reyndar, efnaskiptaálag sem TME veldur dregur úr getu og hæfni hvatbera, sem veldur efnaskiptabilun og truflun á starfsemi T-frumna í æxli25–28. Það er forvitnilegt að flestar æxlisíferðar eitilfrumur (TIL) eru óvirkar, en lítið brot hefur stofnlíkt minni eða forvera eiginleika7,29. Þessi stilklíka TIL undirhópur viðheldur útbreiðslumöguleika og þrávirkni og tengist hagstæðri svörun við blokkun ónæmiseftirlitsstaða (ICB) og TIL-ACT hjá fólki með krabbamein11,30. Fyrri rannsóknir hafa sýnt að aukin utanfrumublóðsýring (↑[H+ ]) bældi frumuvirkni T-frumna bæði in vitro og in vivo31–33. Að auki hefur súra TME töluverð áhrif á virkni og sérhæfingu mergfruma sem síast æxli, svo sem dendritic frumur (DCs) og æxlistengdra átfrumna (TAMs)34–36. Hins vegar eru áhrif ↑[H+] á stofnstærð T-frumna og efnaskiptahæfni að mestu óþekkt. Hér greinum við frá því að langtíma in vitro ↑[H+] útsetning auðveldar aðgreiningu á stofnlíkum CD8+ T-frumum úr mönnum og músum á kostnað endanlegra CD8+ T-frumna. Við komumst að því að langtíma ↑[H+] meðferð endurskapar efnaskipti T-frumna og viðheldur öndunargetu hvatbera. Ennfremur, viðvarandi ↑[H+] útsetning skerðir metíónínupptöku og efnaskipti, sem í kjölfarið leiðir til minnkaðrar H3K27me3 útfellingar á minnistengdum genum og auðveldar þar með að viðhalda stöðu „stöngullíks minnis“. Að lokum sýnir ættleiðingarflutningur T-frumna sem ræktaðar eru við ↑[H+]-aðstæður öfluga æxlishemjandi virkni in vivo, í samræmi við minna útkeyrt svipgerð þeirra. Þannig leiðir rannsókn okkar í ljós óvænt hlutverk utanfrumusýrublóðsýringar við að varðveita stofnfrumu T-frumna með endurgerð á efnaskiptum frumna og erfðafræðilegum mynstrum.

Niðurstöður

↑[H+ ] útsetning stuðlar að CD8+ T-frumustofni

Til að ákvarða hvort utanfrumu ↑[H+] hafi áhrif á stofnlíka T-frumuaðgreiningu, gerðum við frumuflæðisgreiningu á helstu stofnlíkum svipgerðum á T-frumum úr mönnum sem ræktaðar voru í 12 daga í öðrum hvorum samanburðarmiðlinum, ↑[H+ ] miðli sem innihélt 10 mM mjólkursýru (líkir eftir laktatstyrknum í meinalífeðlisfræðilegum aðstæðum23,35) eða súrum miðli (~pH 6,6, með saltsýru) (Mynd 1a). Hærra hlutfall stofnlíkra CD8+ T-frumna, þar með talið snemma minni (CD45RO− CD27+) og miðminni (CD45RO+ CD27+), sást í T-frumum sem voru skilyrtar í ↑ [H+] á móti stýrimiðli (útvíkkuð gögn mynd 1a). Að auki komumst við að því að T-frumur ræktaðar í ↑[H+] miðli höfðu hærra hlutfall stofnlíkra frumna (CCR7+ CD62L+) (mynd 1b). Athygli vekur að við tókum eftir marktækri aukinni TCF1 tjáningu, sem er lykilþátturinn sem veldur aðgreiningu á stofnlíkum og miðminni, á próteinstigi í CD8+ T-frumum bæði manna og músa sem verða fyrir ↑[H+] (Mynd 1c og Útvíkkuð gögn mynd 1b). Að auki var [H+]-styrk háð áhrif á CCR7 og TCF1 tjáningu (Extended Data Fig. 1c). Í samræmi við stofnlíka svipgerð ↑[H+]-skilyrtra T-frumna minnkaði framleiðsla á innanfrumu interferón- (IFN- ) og æxlisdrepþáttum (TNF- ) marktækt í þessum frumum (mynd 1d).

Til að kanna betur aðgreiningarstöðu T-frumna, gerðum við RNA raðgreiningu (RNA-seq) greiningu og komumst að því að langtíma in vitro ↑[H+] útsetning leiddi til sérstakrar umritunarsniðs (útvíkkuð gögn mynd 1d). Útsetning fyrir ↑[H+] leiddi til ótrúlegrar minnkunar á tjáningu gena sem kóða fyrir áhrifasameindir, eins og PRF1, GZMB og IFNG, og sam-hemjandi viðtakann BTLA (Mynd 1e,f og Extended Data Fig. 1e). Aftur á móti sýndu ↑[H+]-ræktaðar T-frumur meiri tjáningu á BACH2, CCR7, LEF1 og TCF7, sem eru í fylgni við stofnstærð T-frumna (Mynd 1e,f og Extended Data Fig. 1e). Genasett auðgunargreining (GSEA) sýndi að umritunarmynstrið sem framkallað er af ↑[H+] útsetningu var svipað og í minni T frumum (Mynd 1g og Extended Data Mynd 1f). Ennfremur staðfesti megindleg pólýmerasa keðjuverkun (qPCR) greining aukna mRNA tjáningu á BACH2, KLF2, LEF1 og TCF7 eftir ↑[H+] meðferð (mynd 1h). Samanlagt styðja þessar athuganir þá staðreynd að ↑[H+ ] meðferð mótar mjög umritunarsnið T-frumna til að koma á stofni. Við komumst að því að ↑[H+] meðferð hamlaði útbreiðslu T-frumna og skekkti dreifingu frumuhringsins í átt að G1-fasanum og í burtu frá S-fasanum (viðbótarmynd 1a–c). Næst skoðuðum við virkjun T-frumna við ↑[H+] meðferð við TCR-örvun og komumst að því að ↑[H+] útsetning hefur engin marktæk áhrif á tjáningu T-frumuvirkjunarmerkja eða frumustærð (aukamynd. 2a,b). Að auki staðfestum við enn frekar að ↑[H+] útsetning eftir virkjun T-frumna gæti samt framkallað stofnlíkt ástand T-frumna (viðbótarmynd 2c-f). Þessar niðurstöður útiloka þann möguleika að T-frumur sem verða fyrir ↑[H+ ] séu einfaldlega ónæmar fyrir örvun, öfugt við að taka upp stofnlíkt ástand.

cistanche tubulosa-bæta ónæmiskerfið

Fyrri skýrslur hafa sýnt að súrt umhverfi hamlar bráðfrumuvirkni T-frumna bæði in vitro og in vivo23,31. Við komumst einnig að því að skammtíma útsetning fyrir ↑[H+] skerti framleiðslu frumuvaka en hafði lítil áhrif á stofnlíka svipgerð í T-frumum (útvíkkuð gögn mynd 1g-i og viðbótarmynd 3a-c). Ennfremur eru hamlandi áhrif cýtókínframleiðslu með ↑[H+] útsetningu tímabundin og afturkræf vegna þess að fjarlæging á ↑[H+] endurheimtir hratt frumumyndun T-frumna (Extended Data Fig. 1h). Þannig er hömlun á T-frumuáhrifavirkni af völdum súrs umhverfis mjög hröð, en endurforritun á stofnfrumu T-frumna krefst langvarandi ↑[H+] útsetningar. Vegna þess að laktat er til staðar í lausn annaðhvort í ótengdu formi (mjólkursýra) eða sem jónasalt (natríumlaktat), reyndum við næst að ákvarða hvort natríumlaktat sýndi svipuð áhrif á stofn T-frumna og komumst að því að natríumlaktat stuðlaði einnig að stofneinkennum, þótt virkni þess hafi verið mun minni en mjólkursýrumeðferðar (10 mM) (útvíkkuð gögn mynd 1j, k og viðbótarmynd 4a–f). Þessar niðurstöður benda bæði til mikilvægis ↑[H+] og munar þess frá meðferð með laktatjónum, í framköllun á stofnlíkri svipgerð CD8+ T-frumna.

Mynd 1|↑[H+] útsetning auðveldar aðgreiningu stofnlíkra CD8+ T-frumna. a Skýringarmynd af virkjun T-frumna í mönnum við tilgreindar aðstæður: pH 7,4 (–↑[H+], viðmiðun), pH 6,6 (+↑[H+], saltsýra), eða 10 mM mjólkursýra (+↑[H+ ]). PBMC, einkjarna frumur í útlægum blóði. b, fulltrúa CCR7 og CD62L tjáningarsnið í CD8+ T frumum manna við mismunandi aðstæður á degi 12. n=3 óháð sýni. c, dæmigerð súlurit og magngreining á TCF1 tjáningu í CD8+ T frumum manna við mismunandi aðstæður á degi 12. n=3 óháð sýni. MFI, meðalstyrkur flúrljómunar. d, T-frumur úr mönnum voru stækkaðar eins og í a í 12 daga og örvaðar með forbóli 12-myristat 13- asetati (PMA) sem innihélt brefeldín A (BFA) í 4,5 klst. Innanfrumu tjáningarsnið IFN- og TNF- er sýnd fyrir T frumur í pH 7,4 (vinstri), 10 mM mjólkursýru (miðja) eða pH 6,6 (hægri) ástand. n=3 óháð sýnishorn. e,f, RNA-seq greining á T-frumum úr mönnum sem voru stækkaðar í samanburði (pH 7,4) eða mjólkursýru (10 mM). Hitakort af völdum genum (e) og eldfjallauppdráttur allra gena þar sem gen tengd minni, áhrifavaldi og útkeyrðum T frumum voru merkt (f). Í eldfjallauppdrættinum táknar x-ásinn log2-umbreytt faltbreytingargildi (FC) fyrir frumur sem eru meðhöndlaðar með mjólkursýru miðað við stýringar á degi 12, og y-ásinn táknar leiðrétt P gildi. n=4 óháð sýnishorn. g, GSEA plot þar sem samanburður er borinn saman við mjólkursýruskilyrði T-frumur fyrir áhrifavald á móti minni auðgun. NES, staðlað auðgunarstig. h, Magnbundin mRNA tjáning umritunarþátta sem tengjast stofnfrumu T-frumna (BACH2, KLF2, LEF1, TCF7) í T-frumum við tilgreindar aðstæður. n=3 óháð sýnishorn. Gögnin eru sett fram sem meðaltal ± sem Tölfræðilegar greiningar voru ákvarðaðar með óparuðu tvíhliða t-prófi nemenda (b–d,h). Nafngildi P og hlutfall falskra uppgötvunar (FDRs) voru reiknuð út með sjálfgefna aðferð GSEA hugbúnaðarins (g).

Hækkað [H+] kallar á endurforritun efnaskipta

Fyrir utan hinar aðgreindu umritunaráætlanir, öðlast stofnlíkar T-frumur einnig helst einstaka efnaskiptaeiginleika, þar á meðal hækkað FAO og takmarkað glýkólýtískt umbrot17,20,37. Til að kanna efnaskiptaeiginleika langtíma in vitro ↑[H+ ]-útsettra T-frumna, gerðum við auðgunargreiningu á Gene Ontology (GO) og fundum verulegan mun á tjáningu gena sem tengjast efnaskiptaferlum, svo sem umbrotum lítilla sameinda og glýkólýsu (mynd 2a). Reyndar sýndu langtíma ↑[H+]-skilyrtar T frumur skert glýkólýsu og amínósýruumbrot í mótsögn við aukin langkeðju fitusýruefnaskipti (Útvíkkuð gögn mynd 2a,b). Ólíkt langtíma ↑[H+] útsetningu, hamlaði skammtíma ↑[H+] meðferð aðeins glýkólýsu, en hafði engin marktæk áhrif á FAO (viðbótarmynd 5a). Megindleg PCR greining staðfesti ennfremur að glýkólýsugenin SLC2A1, SLC2A3 og LDHA voru marktæk minnkuð í ↑[H+]-útsettum T frumum (útvíkkuð gögn mynd 2c). Aftur á móti stuðlaði ↑[H+] skilyrðing fyrir tjáningu karnitínpalmitóýltransferasa 1 (kóðuð af CPT1A), hraðatakmarkandi ensími sem tekur þátt í FAO (Extended Data Fig. 2c). Til að skýra frekar efnaskiptabreytingarnar af völdum ↑[H+] gerðum við óhlutdræga efnaskiptagreiningu og fundum 285 mismunandi milliefni í T-frumum sem ræktaðar voru með ↑[H+] á móti viðmiðum (útvíkkuð gögn mynd 2d). Sérstaklega minnkaði útsetning fyrir ↑[H+] marktækt glýkólýsandi milliefni og ákveðnar nauðsynlegar amínósýrur í stað þess að fjölga mörgum karnitíntegundum, virkjaðri form fitusýra sem er flutt til hvatbera til oxunar (Unbreidd gögn mynd 2e–g). Efnaskiptaflæðisgreining með [13C6]glúkósa eða [13C16]palmitati sýndi fram á að útsetning fyrir ↑[H+] hindraði verulega innlimun [13C6]glúkósa í TCA milliefni og mjólkursýru á sama tíma og það stuðlaði að innlimun [13C16]palmitats í asetýl-CoA og sítratið, sem styður við að utanfrumublóðsýring bælir glýkólýsu og eykur FAO í T-frumum (mynd 2b–e). Þessar ↑[H+]-skilyrtu T frumur sýndu takmarkanir með tilliti til næringarefnaupptöku, eins og sést af minni neyslu á [13C6]glúkósa og frásogi lípíðhliðstæðna (BODIPY FL C16), niðurstöðu sem gæti stafað af auknum rafefnafræðilegum halla (Unbreidd gögn mynd 2h, i).

Takmörkuð næringarefnaupptaka og skipting um efnaskipti frumna gæti leitt til breytinga á boðnetum í T-frumum. GO auðgunargreining á T-frumum sem voru meðhöndlaðar með mjólkursýru leiddi í ljós að flest sýkt gena eru fyrst og fremst þátt í PI3K–AKT, mTOR og TCR merkjasendingum (útvíkkuð gögn mynd 3a). mTOR boð gegna lykilhlutverki við að samþætta ónæmismerki og efnaskiptavísbendingar fyrir rétta virkjun T-frumna, og hömlun á mTOR boðsendingum skekkir frumur í átt að myndun CD{3}} T-frumna í minni í stað aðgreiningar áhrifavalda38–40. GSEA greining okkar gaf til kynna að virkni bæði AKT-mTOR og NF-KB merkja í ↑[H+]-skilyrtum T frumum var minnkuð samanborið við það í T-viðmiðunarfrumum (Mynd 2f og Extended Data Fig. 3b). Þetta var enn frekar staðfest með minni fosfórun S6 (við Ser235 og Ser236), 4EBP1 (við Thr37 og Thr46), AKT (við Ser473) og NF-кB (við Ser536) í ↑[H+]-skilyrtum T frumum (mynd. 2g,h og aukin gögn mynd 3c). Vitað er að mTOR er mikilvægur eftirlitsaðili margvíslegra líffræðilegra ferla, þar á meðal frumustærð, orkumyndun og próteinmyndun41. Reyndar komumst við að því að frumustærð ↑[H+]-skilyrtrar T-frumna var minnkuð samanborið við T-viðmiðunarfrumna (Extended Data Fig. 3d). Næst metum við líforkuháða próteinmyndun í ↑[H+]-skilyrtum T-frumum með því að nota SCENITH, nýþróaða aðferð sem notar púrómýsín innlimun sem útlestur á próteinmyndunarstigum42. Eins og búist var við, bældi ↑[H+] útsetning orkufreka próteinmyndun (Mynd 2i), sem bendir til þess að orkuefnaskipti í CD8+ T frumum hafi verið breytt. Þessar niðurstöður eru í samræmi við fyrri niðurstöður um að hömlun á mTOR virkni af völdum rapamýsíns jók tjáningu á umritunarþáttum tengdum stöngli (Útvíkkuð gögn mynd 3e,f). Þegar niðurstöður okkar eru teknar saman, komumst við að þeirri niðurstöðu að langtíma ↑[H+] útsetning skipuleggur efnaskiptarofa og bælir mTOR virkni og auðveldar þar með öflun og viðhald T-frumustofns.

cistanche tubulosa-bæta ónæmiskerfið

↑[H+]-miðluð takmörkun á efnaskiptum metíóníns varðveitir ættarfæðingu

Uppsafnaðar vísbendingar benda til þess að eins kolefnis efnaskipti ráði ákvörðunum um örlög T-frumna og mótar virkniástand þeirra43,44. RNA-seq greiningin okkar sýndi lélega auðgun fyrir eins kolefnis efnaskiptaferlið og metíónín hringrás einkenni í T frumum sem verða fyrir langtíma, frekar en skammtíma, ↑[H+] meðferð (Mynd 3a, Ítarleg gögn Mynd 4a, og aukamynd 5b). Í samræmi við það hamlaði ↑[H+] útsetning tjáningu gena sem kóða fyrir ensím sem tengjast metíónínhringrás (MTR, AHCY og BHMT) sem og fólatumbrotum (SHMT1 og SHMT2) (útvíkkuð gögn mynd 4b). Frekari efnaskiptagreining leiddi í ljós að T-frumur ræktaðar í mjólkursýru sýndu marktæka minnkun á umbrotsefnum innanfrumu sem taka þátt í metíónínhringnum, þar á meðal metíónín, S-adenósýlmeþíónín (SAM) og S-adenósýlhómósýstein (SAH), en aukið magn seríns og hómósýsteins (lengd Gögn mynd 4c). [13C5]meþíónín rakning staðfesti enn frekar að upptaka og innanfrumumagn metíóníns, 13C-merkt innanfrumu SAM (m+5), SAH (m+4) og 5'-metýl-þíóadenósíns (MTA, m +1) minnkaði marktækt í ↑[H+]-útsettum T-frumum (mynd 3b–d og útvíkkuð gögn mynd 4d). Athygli vekur að utanaðkomandi metíónínuppbót endurheimti upptöku og innanfrumumagn [13C5]meþíóníns sem og viðeigandi milliefni í ↑[H+]-útsettum T-frumum (mynd 3c,d og útvíkkuð gögn mynd 4d), sem bendir til þess að utanaðkomandi metíónín viðbót gæti endurheimt metíónínupptöku og umbrot ↑[H+]-útsettra T-frumna. Við könnuðum næst hvort metíónín takmörkun gæti knúið stofnfrumu T-frumu. Við komumst að því að metíónínskortur stuðlaði að örvun TCF1+ CD8+ T-frumuþýðisins en hafði engin áhrif á tjáningu CD62L og CD44 (Útvíkkuð gögn mynd 4e,f). Til að rannsaka frekar hlutverk metíóníns umbrota í ↑[H+ ]-framkölluðum T-frumustofni, ræktuðum við T-frumur með ↑[H+ ] miðli ásamt metíóníni, SAM eða SAH. Svipgerð T-frumustofns sem framkallað er af utanfrumusýrublóðsýringu var að hluta til bönnuð með viðbót við metíónín eða SAM, en ekki SAH (mynd 3e og útvíkkuð gögn mynd 4g-i). Innanfrumu metíóníni er breytt í SAM, mikilvægan metýlhópgjafa fyrir DNA og histón metýlerunarviðbrögð (Útvíkkuð gögn mynd 5a). Þannig auðkenndum við histónmetýlerunarmynstur og komumst að því að hækkað [H+] dró verulega úr heildarmagni H3K27me3 í T-frumum, en hafði ekki marktæk áhrif á tjáningu annarra histónmetýleringarmerkja (mynd 3f og útbreidd gögn mynd 5b). Eins og búist var við, endurheimti metíónínuppbót við T frumur undir ↑[H+] útsetningu heildarstig H3K27me3 tjáningar (mynd 3f). Sértæk lækkun á H3K27me3 stigi sem sést í T frumum sem gengust undir langtíma↑[H+] meðferð varð til þess að við gerðum tilgátu um að ↑[H+] útsetning stýri sértækt metýltransferasa sem er sértækur fyrir útfellingu H3K27me3. Reyndar sáum við marktækt skerta tjáningu á EZH2, lykilmetýltransferasa fyrir H3K27me3, bæði á mRNA- og próteinstigi í ↑[H+]-útsettum T-frumum (Extended Data Fig. 5c,d). Ennfremur jók hömlun á EZH2 virkni með mjög sértækum hemli, GSK126, tjáningu TCF1, sem og hlutfall CCR7+ CD62L+ CD8+ T frumna (útvíkkuð gögn mynd 5e,f) , sem var í samræmi við fyrri skýrslu um að EZH2 gæti stjórnað minni-T frumu möguleikum með sértækum epigenetic breytingum45. Til að bera kennsl á breytingar á erfðafræðilegum mynstrum ↑[H+]-framkallaðrar T-frumnastofnunar um allt erfðamengi, gerðum við CUT&Tag-seq prófið og fundum lágmarksbreytingar á hlutfalli H3K4me3 og H3K27me3 útfellingar meðal mismunandi meðhöndlaðra hópa meðfram verkefnisstjóra, genalíkama og intergenic svæði (Extended Data Fig. 5g). Sérstaklega leiddi epigenomic profiling í ljós minnkað magn af bælandi histónmerki H3K27me3 á minnistengdum genastöðum (til dæmis TCF7, CCR7, ID3, LEF1 og KLF2) í langtíma ↑[H+]-meðhöndluðum T frumum (mynd 3g) . Mikilvægt er að viðbót metíóníns undir ↑[H+ ] útsetningu endurheimti H3K27me3 stigið að hluta á ofangreindum staði, sem og genatjáningu þeirra, sem bendir til mikilvægs hlutverks metíóníns í epigenetic mótun þessara minnistengdu gena (Mynd 3g og Útvíkkuð gögn mynd 5h). Í samræmi við fyrri rannsókn14, öðluðust áhrifagen eins og PRF1, GZMB, IFNG, TBX21 og NR4A2 virkjandi histónmetýleringarmynstur (H3K4me3hi og H3K27me3lo) (mynd 3g). Athygli vekur að umráðasvæði H3K4me3 á frumkvöðlasvæðum þessara áhrifa gena voru skert í T frumum sem ræktaðar voru undir ↑[H+] útsetningu og voru endurheimtar með metíónínuppbót (mynd 3g). Á heildina litið benda þessar niðurstöður til þess að ↑[H+]-miðluð truflun á metíónínhringnum stuðli að epigenetic varðveislu T-frumnastofns.

Nokkrir metíónínflutningstæki (SLC), þar á meðal SLC7A5, SLC38A1, SLC38A2 og SLC43A2, geta miðlað metíónínflutningi46. Til að kanna hvernig ↑[H+] útsetning dregur úr metíónínupptöku og umbrotum í T-frumum, greindum við tjáningarmynstur mismunandi SLCs og komumst að því að ↑[H+] dró verulega úr tjáningu SLC7A5 og SLC38A2, en hafði lítil áhrif á SLC38A1 tjáningu (Extended). Gögn mynd 6a,b). Að auki minnkaði ↑[H+] útsetning tjáningu og virkni MYC (Extended Data Fig. 6c,d), sem hefur verið greint frá að stjórna tjáningu metíónínflutningsefna eins og SLC7A5 (tilvísun 47). Við sýndum ennfremur fram á mikla notkun á MYC á SLC7A5 verkefnisstjóranum og í minna mæli á SLC38A2 verkefnisstjóranum (útvíkkuð gögn mynd 6e). Mikilvægt er að marktækt minni MYC binding við þessar staðsetningar sást í langtíma ↑[H+]-meðhöndluðum T frumum (útvíkkuð gögn mynd 6e). Í samræmi við þessar athuganir endurheimti oftjáning MYC á ótrúlega hátt tjáningu SLC7A5 og SLC38A2 í ↑[H+]-útsettum T frumum (útvíkkuð gögn mynd 6f). Þessar niðurstöður styðja mikilvægt hlutverk MYC í minni tjáningu metíónínflutningsefna við ↑[H+] útsetningu. Athyglisvert komumst að því að viðbót metíóníns getur einnig endurheimt tjáningu MYC og SLC7A5 í ↑[H+]-útsettum T-frumum (útvíkkuð gögn mynd 6g), sem bendir til þess að metíónínuppbót gæti endurheimt metíónínupptökugetu T-frumna með því að að hækka tjáningu metíónínflutningsaðila SLC7A5 á MYC-háðan hátt. Fyrri rannsókn hefur sýnt að SLC7A5 er algengasti metíónínflutningsefnið í virkum T frumum47. Þetta, ásamt fyrri niðurstöðum okkar, bendir til þess að SLC7A5 gæti gegnt mikilvægu hlutverki í ↑[H+ ]-framkölluðu metíóníni takmörkun og viðhaldi á stofnlíku ástandi. Reyndar komumst við að því að oftjáning SLC7A5 skerti að hluta til ↑[H+]-framkallaða stofnlíka svipgerð (Extended Data Fig. 6h, i), sem styður enn frekar þátt metíónínflutningsefnisins SLC7A5 í ↑[H+]-framkallað T-frumu minni. -lík svipgerð. Með því að greina mismunandi undirhópa CD8+ T-frumna sem síast æxli, fundum við minnkaða tjáningu bæði MYC og SLC7A5 í minnislíkum CD8+ TIL-um (Extended Data Fig. 7a,b), sem er í takt. með in vitro niðurstöðum okkar. Þannig benda þessar niðurstöður til þess að MYC–SLC7A5–meþíónín ásinn gæti hugsanlega stuðlað að því að varðveita minnislíka stöðu TIL.

Mynd 2|↑[H+] útsetning kveikir á endurforritun á efnaskiptum og bælir mTOR boð. a, GO greining með því að nota RNA-seq gögn, sem sýna dæmigerð misjafnlega tjáð efnaskiptagen í stjórn og mjólkursýruskilyrðum T-frumum úr mönnum (leiðrétt P gildi <4,23 × 10-2). b, Skýringarmynd af [13C6]glúkósa eða [13C16]palmitate merkingarmynstri. c, Hlutfall af tilgreindu m+3 laktati af heildarlaktati eða af m+3 pýruvati af heildarpýruvati í T-frumum. n=3 óháð sýnishorn. d, Hlutfall samsætufjölda fyrir TCA milliefnin, eins og sítrat (m+2), malat (m+2), og súksínat (m+2), unnið úr [13C6]glúkósa. n=3 óháð sýnishorn. e, Hlutfall tilgreinds m+2 asetýl-CoA af heildar asetýl-CoA eða af m+2 sítrat samsætu af heildarsítrati í T frumum úr [13C16] palmítati. n=4 óháð sýnishorn. f, GSEA með tölfræðilegri greiningu á genasettinu sem tengist mTORC1 merkjasendingum í stjórn á móti mjólkursýruskilyrðum (vinstri) eða pH 6.6-skilyrtum (hægri) T frumum úr mönnum. g,h, frumuflæðisgreining og magngreining fyrir S6 fosfórýlerað við Ser235 og Ser236 (g) og 4EBP1 fosfórýlerað við Thr37 og Thr46 (h) í CD8+ T frumum manna við tilgreind skilyrði. n=3 óháð sýnishorn. I, Flæðifrumugreining og magngreining á orkufrekri próteinmyndun í samanburðarhópum eða mjólkursýru- eða pH 6.6-skilyrtum T-frumum úr mönnum. n=3 óháð sýnishorn. Gögn eru sett fram sem meðaltal ± sem Tölfræðilegar greiningar voru ákvarðaðar með einhliða Fisher nákvæma prófi með Benjamini-Hochberg margfeldissamanburðarprófi (a) eða óparaðu tvíhliða t-prófi nemenda (c-e,g-i). Nafngildi P og FDR voru reiknuð út með sjálfgefna aðferðinni í GSEA hugbúnaðinum (f).

Mynd 3|Aukið [H+] breytir metíónínumbrotum T-frumna til að varðveita ættarfæðingu. GSEA samsæri af genasettinu sem tengist einskolefnis umbrotum og cysteini og metíónínumbrotum í stjórn á móti mjólkursýruskilyrðum T-frumum úr mönnum. b, Skýringarmynd af [13C5] metíónín merkingarmynstri. c, Hlutfall innanfrumu SAM (m+5), SAH (m+4) og MTA (m+1) ​​unnin úr [13C5]meþíóníni, af heildarsafni þeirra, í T frumur ræktaðar við viðmiðunaraðstæður eða með 10 mM mjólkursýru eða 10 mM mjólkursýru ásamt metíóníni (10 mM + Met). n=3 óháð sýnishorn. d, Hlutfallslegt magn af [12C5]meþíóníni og [13C5]meþíóníni í T-frumum. e, dæmigerð súlurit og magngreining á TCF1 í CD8+ T-frumum úr mönnum sem ræktaðar eru við ýmsar aðstæður. n=3 óháð sýnishorn. f, Áhrif metíónínuppbótar á histónmetýleringu í T-frumum manna. H3K4me3, histón H3 þrímetýlerað við K4; H3K79me2, H3 dímetýlerað við K79; H3K27me3, H3 trímetýlerað við K27; H3K9me2, H3 dímetýlerað við K9. n=3 óháð sýnishorn. g, Erfðamengisbrautarmynd af dæmigerðum genastöðum sem sýna H3K27me3 (rauðan, fyrir ofan línuna) eða H3K4me3 (bláan, fyrir neðan línuna) toppa. CUT&Tag-seq gögn eru úr tveimur óháðum sýnum. Gögnin eru sett fram sem meðaltal ± sem Nafngildi P og FDR voru reiknuð út með sjálfgefna aðferð GSEA hugbúnaðarins (a). Tölfræðilegar greiningar voru gerðar með því að nota tvíhliða dreifigreiningu (ANOVA) með Tukey's multiple-comparisons prófi (c–f).

Útsetning fyrir ↑[H+ ] viðheldur hæfni hvatbera 

Með hliðsjón af minni orkufrekri próteinmyndun í ↑[H+]-skilyrtum T-frumum, gerðum við tilgátu um að langvarandi útsetning fyrir ↑[H+] gæti leitt til töluverðra breytinga á orkuefnaskiptum frumna. Bæði viðmiðunar- og ↑[H+]-skilyrt T frumur voru greindar með því að nota SCENITH42 til að reikna út glúkósafíkn, hvatberafíkn, glýkólýsugetu og FAO og amínósýruoxunargetu (mynd 4a og útbreidd gögn mynd 8a). Í samræmi við efnaskipti okkar og niðurstöður samsæta-rakningar, sáum við aukið umbrot hvatbera í ↑[H+]-útsettum T-frumum, en glýkólýsuhraði var lækkaður (mynd 4b,c og útvíkkuð gögn mynd 8b), sem bendir til endurforritunar á innanfrumu. orkumikil efnaskipti í ↑[H+ ]-skilyrtum T frumum. Sjóhestagreining leiddi ennfremur í ljós að ↑[H+]-skilyrtar T frumur sýndu hærri súrefnisneyslu (OCR) sem og SRC, aðaleinkenni langlífrar minni CD8+ T frumna22 og lægri utanfrumu súrnunarhraða ( ECAR) (Mynd 4d–h og aukin gögn mynd 8c–f). Þar sem aukinn massi/samruni hvatbera og minnkuð hvatberahimnugeta (Δψm) eru mikilvæg fyrir viðhald T-frumnastofns48–50, skoðuðum við frekar magn og gæði hvatbera ↑[H+ ]-skilyrtra T-frumna og komumst að því að ↑[H+ ] meðferð jók hvatberamassa bæði í T-frumum úr mönnum og músum (mynd 4i, j og útvíkkuð gögn mynd 8g, h), sem einnig viðhalda lægri Δψm (mynd 4k og útvíkkuð gögn mynd 8i). Ofbyggingargreining með rafeindasmásjá (EM) leiddi í ljós að ↑[H+ ]-útsettar T frumur voru með stóra, þéttpakkaða hvatbera dreifða í umfryminu og höfðu marga þétta, þrönga krista samanborið við T-viðmiðunarfrumur, sem er í samræmi við birtar niðurstöður tengdar að formgerð hvatbera í T minnisfrumum (mynd 4l,m). Í samræmi við þessa niðurstöðu, sáum við einnig aukna genatjáningu nokkurra mikilvægra eftirlitsaðila á samruna hvatbera í ↑[H+]-skilyrtum T-frumum (Extended Data Fig. 8j), sem hefur verið talið gegna nauðsynlegt hlutverki fyrir T-minnismyndun50. Alls benda þessar niðurstöður til þess að ↑[H+] útsetning auki massa/samruna hvatbera og hæfni til að stuðla að myndun stofnlíkra T-frumna.

cistanche plöntuaukning ónæmiskerfi

↑[H+] útsetning eykur virkni CD8+ T frumu æxla gegn æxli 

Stofnlíkar T-frumur styðja ígræðslu, stækkun og virkni gegn æxli í ættleiðingarónæmismeðferð51. Til að kanna hvort langtíma in vitro ↑[H+ ]-viðhald CD8+ T frumur sýni aukna þenslu eða viðvarandi við flutning, CD45.1+ OT-I T frumur sem voru stækkaðar í stjórn eða ↑[ H+]-skilyrt miðill var fluttur til ættleiðingar í CD45.2+C57BL/6N mýs án ígrædds æxlis (mynd 5a). Þrátt fyrir að örlítið aukinn fjöldi apoptótískra frumna greindist við ↑[H+] skilyrðingu (Extended Data Fig. 9a), var marktækt hærra hlutfall T-frumna í útæðablóði músa sem fluttar voru með T-frumum stækkaðar í ↑[H+ ] ástandinu. samanborið við þær sem stækkaðar voru í samanburðarmiðli (viðmiðunar-T frumur) (mynd 5b). Á sama hátt greindist marktækt hærri tíðni T-frumna í milta og eitlum (LNs) (Unbreidd gögn mynd 9b,c). Að auki fundum við marktækt aukna uppsöfnun T-frumna í æxlum, milta og tæmandi eitlum í B16-OVA æxlisberandi músum þar sem ↑[H+]-stækkaðar frumur höfðu verið fluttar til ættleiðingar samanborið við það í músum sem mótteknar stjórnfrumur, sem bendir til þess að CD8+ T frumur sem viðhaldið er í ↑[H+] hafi bætta þrautseigju (Mynd 5c–e og Extended Data Mynd 9d). Í samræmi við þessar niðurstöður jókst hlutfall T minnisfrumna marktækt í milta og LNs músa sem fengu ↑[H+] skilyrtar T frumur (Mynd 5f og Extended Data Mynd 9e). Athyglisvert er að ↑[H+]-stækkaðar OT-I T frumur sýndu verulega seinkun á æxlisvexti samanborið við viðmiðunar T frumur (mynd 5g). Við rannsökuðum næst meðferðaráhrif ↑[H+]-stækkaðra CD19 kímerískra mótefnavaka-viðtaka-breyttra (CAR) T-frumna með in vivo æxlislíkani þar sem CD19-K562 æxlisfrumum var sprautað undir húð í hliðar NCG mýs (mynd 5h). Við komumst að því að útsetning fyrir ↑[H+] stuðlaði einnig að CAR-T frumustofni en hafði engin áhrif á frumudauða (útvíkkuð gögn mynd 9f), eins og sést af marktækt auknu hlutfalli CCR7+ CD62L+ stofnlíks CAR-T frumur ásamt uppstýrðri tjáningu TCF1 (Extended Data Fig. 9g,h). Að auki var meiri tíðni CAR-T frumuuppsöfnunar í æxlisstöðum og milta NCG músa eftir innrennsli með ↑[H+]-skilyrtum T frumum (mynd 5i). Eins og við var að búast sýndu NCG mýs sem voru ættleiddar með CAR-T frumum sem höfðu verið stækkaðar í ↑[H+] meiri úthreinsun á ígræddu CD19+ æxli samanborið við þær sem fengu CAR-T frumur sem höfðu verið stækkaðar. í stjórnmiðli (mynd 5j). Samanlagt sýndu þessi gögn að ↑[H+] meðferð stuðlar að þrávirkni in vivo og æxlisvirkni T-frumna.

Útsetning fyrir ↑[H+] takmarkar þreytu T-fruma

Til að kanna frekar áhrif þrálátrar ↑[H+ ] útsetningar á þreytu T-frumna in vitro, mældum við LAG-3 og TIM-3 tjáningu í ↑[H+ ]-frumuðum T-frumum úr mönnum sem gengust undir margar umferðir af frekari örvun með and-CD3 mótefnum og voru skilyrt í samanburðarmiðli (mynd 6a). Við fundum bæði LAG-3 og TIM-3 tjáningu minnkað í ↑[H+]-útsettum T-frumum (mynd 6b og útvíkkuð gögn mynd 10a), sem gefur til kynna að ↑[H+] meðferð leiði til minnkunar T-fruma þreyta. Ennfremur komumst við að því að hár styrkur metíóníns leiðir til aukningar á tjáningu hamlandi merkja, eins og PD-1, LAG-3 og TIM-3, en meðferð með lágum metíónín styrkur dró lítillega úr tjáningu þessara merkja (aukamynd. 6a-c). Athyglisvert er að við langvarandi in vitro ↑[H+] útsetningu var tíðni TIM-3+ LAG-3+ sem síast inn í OT-I T frumur og CD19-CAR T frumur í æxlunum að mestu leyti. minnkað eftir ættleiðingarflutning (mynd 6c–e og útvíkkuð gögn mynd 10b), sem er í samræmi við minni þreytu þeirra in vitro og bætta æxlisstjórnunargetu in vivo. Ennfremur sýndum við fram á að langtíma ↑[H+] skilyrtar T frumur sýndu marktækt skerta TOX tjáningu bæði in vitro og in vivo (mynd 6f, g og útbreidd gögn mynd 10c, d). Eins og áður hefur verið lýst er almennt hægt að skipta tæmum T-frumum í undirmengi sem er tæmdur eða endanlega tæmdur, eins og ákvarðað er af TCF1 og TIM-3 tjáningu52,53. Sem slík mældum við tjáningarmynstur TCF1 og TIM-3 í CD45.1+ TIL og tókum eftir því að tíðni TCF1− TIM-3+ endanlega útkeyrðra T frumna minnkaði að miklu leyti, með marktækt aukið hlutfall TCF1+ TIM-3– forvera T frumur undir ↑[H+] skilyrðingu (mynd 6h). Ennfremur sýndum við aukinn LY108+ TIM-3– stofn T-frumna stofna (útvíkkuð gögn mynd 10e) sem og aukna tíðni IFN- + TNF- + T frumur (Extended Data Fig. 10f), sem styðja enn frekar þá staðreynd að langtíma in vitro ↑[H+]-stækkaðar T-frumur sem fluttar eru til ættleiðingar takmarka þreytu og varðveita stofn.

Umræða

Æxlissértæk ACT er efnileg nálgun til að meðhöndla einstaklinga með þrálát æxli, en meðferðaráhrifin eru að mestu takmörkuð af truflun á T-frumum í TME. Nýlega hefur töluverð athygli verið lögð á að formeðferð T-frumna með tímabundinni glúkósasvelti, glutamíntakmörkun eða hækkuðu utanfrumu kalíum (↑[K+]) við in vitro ræktun til að varðveita stofnfrumu T-frumna og bæta meðferðarárangur54–56. Í þessari rannsókn sýndum við fram á að ræktun CD8+ T-frumna undir miklu [H+]-gildi meðan á frumun stendur ýtti furðu undir öflun T-frumnastofns og jók viðnám gegn þreytu T-frumna, sem bætti til muna æxlishemjandi áhrif T-frumur sem fluttar eru til ættleiðingar.

Mikil uppsöfnun mjólkursýru innan TME hefur lengi verið talin lykilþáttur í ónæmisflótta æxla. Til dæmis hefur verið sýnt fram á að mjólkursýra og súra TME bæla CD{{0}} frumueyðandi virkni T-frumna og frumumyndun31–33,57. Í samræmi við þessar niðurstöður komumst við einnig að því að skammtíma útsetning fyrir ↑[H+] in vitro var nægjanleg til að hamla djúpt í framleiðslu cýtókíns á áhrifavalda en hafði engin áhrif á TCF1 tjáningu eða efnaskiptaeiginleika tengda stöngli. Samt studdi langtíma ↑[H+] meðferð óvænt TCF1 tjáningu og viðheldur svipgerð stofnlíkra T-frumna með endurforritun efnaskipta og endurskipulagningar á erfðaefni. Útsetning T-frumna fyrir ↑[H+ ] eftir fulla virkjun þeirra getur einnig framkallað stofnlíka svipgerð og útilokar þannig þann möguleika að T-frumur sem verða fyrir lágu pH-gildi séu einfaldlega orðnar óþolandi fyrir örvun, frekar en að hafa tekið upp stofnlíkt ástand. Lífeðlisfræðilegur mjólkursýrustyrkur í blóði heilbrigðra einstaklinga er um 1,5–3,0 mM, en hann getur hækkað í 10 mM til 40 mM í TME35,58. Með því að nota viðvarandi and-CD3/CD28 örvunarlíkan, Feng o.fl. hafa nýlega greint frá því að hár styrkur natríumlaktats eykur H3K27ac gildin á TCF7 ofur-enhancer locus með því að hindra histon deacetylase virkni, sem leiðir til aukinnar TCF1 tjáningar og eflingar CD8+ T frumustofns59. Aftur á móti komumst við að því að langvarandi útsetning fyrir tiltölulega lágum styrk mjólkursýru (10 mM), en ekki natríumlaktati, getur auðveldlega kallað fram stofnlíka einkenni T-frumna með því að takmarka umbrot metíóníns og stjórna H3K27me3 útfelling á stofnstengdum genastöðum, sem greinilega styður sérstaka æðasýkingastjórnun með natríumlaktati og mjólkursýru. Hins vegar hefur lágsýrustig (pH 6,9) meðferð ekki marktæk áhrif á TCF1 tjáningu við viðvarandi and-CD3/CD28 örvun, sem bendir til þess að stofnlíkar einkenni CD8+ T frumna framkallast af ↑[H+ ] váhrif geta verið hnekkt með TCR örvun. TCR virkjun getur aukið metíónín upptöku og endurforritað metíónín umbrot til að aðstoða við virkjun T-frumna19,60. Við veltum því fyrir okkur að TCR örvun gæti styrkt upptöku metíóníns í ↑[H+ ]-meðhöndluðum T-frumum, sem höfðu takmarkað umbrot metíóníns og truflað því ↑[H+ ]-framkallaða ættarfæðastíflu. Að auki gætu T frumur notað laktatjónir sem utanfrumu kolefnisgjafa til að auðvelda öflun stofns í nærveru eða fjarveru viðvarandi TCR örvunar. Efnaskiptavirkni er nátengd aðgreiningu T-frumna og ákveðnar efnaskiptaaðgerðir geta mjög stuðlað að langlífri myndun minni-T-frumna21,37,61,62. Í samræmi við það styðja efnaskipti okkar og ísótóprakningargreiningar þá hugmynd að langvarandi ↑[H+] útsetning leiði til sláandi endurforritunar á efnaskiptum, svo sem minni upptöku glúkósa og minnkaðs glýkólýsu og umbrota í TCA hringrás. Nokkrar rannsóknir hafa sýnt að CD8+ T minnisfrumur nýta FAO til að fullnægja orkuþörf sinni, þó að þetta sé líklega aðlögun að aðgreiningu minnisættarinnar og oftjáning á Cpt1 stuðlar að langlífi T-frumna21,22,63,64. Hins vegar, í líkani þeirra af T-frumu-sértækri erfðaeyðingu á Cpt1a, Raud et al. sýndi nýlega fram á að LC-FAO er að mestu ómissandi fyrir T frumuvirkjun og myndun CD8+ T minnisfrumna65. Það er enn áskorun að útskýra slíkt misræmi. Í tengslum við rannsóknina okkar veltum við því fyrir okkur að endurforritun á fitusýruumbrotum sem knúin er áfram af utanfrumusýrublóðsýringu tengist líklega myndun T-minnisfrumna, þó að nákvæm aðferðin sem liggur til grundvallar þessari tilgátu krefjist frekari rannsóknar. Ennfremur komumst við að því að ↑[H+] útsetning hamlaði mTOR virkni, sem getur verið framkölluð af glýkólýtískri hömlun. Sérstaklega getur bæling mTOR merkja einnig stuðlað að efnaskiptabreytingu frá glýkólýsu til hvatberaöndunar. Reyndar sýndu þessar ↑[H+]-stækkuðu T frumur bætta hvatberahæfni, eins og sést af áberandi auknum SRC og hvatberamassa og minnkaðri Δψm. Þessar hvatbera einkenni, sem eru auðguð í stofnlíkum T-frumum og tengjast langlífi og yfirburða æxlisvirkni in vivo, eru náið stýrðar af samruna hvatbera og klofningsvirkni22,48,50. Hvatbera innri himnusamrunaprótein OPA1 gegnir ómissandi hlutverki í myndun minni-T frumna50. Í samræmi við það komumst við að því að utanfrumublóðsýring stuðlaði einnig að tjáningu OPA1 í T-frumum, sem að lokum leiddi til formfræðilegs jafnvægis í átt að samruna í T-frumum. Sýnt hefur verið fram á að mörg frumuumbrotsefni stuðla beint að epigenetic breytingum. Til dæmis geta eins kolefnis umbrot myndað alhliða metýlgjafann SAM fyrir histónmetýleringu66.

Mynd 4|Hvatberahæfni er viðvarandi í T-frumum sem verða fyrir ↑[H+]. SCENITH greining á T-frumum manna í stjórn- eða mjólkursýruskilyrðum T-frumum. Sýnt er dæmigert þýðingarstig (anti-Puro) (n=3 óháð sýnishorn). Strikaða línan táknar bakgrunnsstigið sem fæst eftir 2-deoxý-d-glúkósa + oligomýsín (2-DG+O) meðferð. b,c, Magngreining á glýkólýsugetu (b) og hvatberaháð (c) innan a. n=3 óháð sýnishorn. d–f, OCR (d) á viðmiðunar- og mjólkursýruskilyrðum T-frumum var mæld í rauntíma við grunnskilyrði sem svar við tilgreindum hemlum. FCCP, karbónýlsýaníð-p-tríflúormetoxýfenýlhýdrasón; ROT/AA, rotenone og andmycin A. Fulltrúi tölfræðileg greining á grunn OCR (e), hámarksöndun (e) og SRC (f). n=9 próf; 3 óháð sýni voru greind og hvert sýni mæld 3 sinnum. g,h, ECAR (g) af viðmiðunar- eða mjólkursýruskilyrðum T-frumum mældar sem svar við tilgreindum hemlum. Fulltrúi tölfræðileg greining á basal ECAR og áherslu ECAR (h). n=9 próf; 3 óháð sýni fundust og hvert sýni var mælt 3 sinnum. i, Immunoblot greining á COXIV og TIM23 í T-frumum úr mönnum við tilgreind skilyrði. Aktín var notað sem hleðslustjórnun. j,k, dæmigerð súlurit eða útlínur og tölfræðileg greining á massa hvatbera (MTG) (j) og hvatberahimnugetu (TMRM) (k), í sömu röð, í samanburði eða mjólkursýru- eða pH 6.{{30} }skilyrtar T-frumur úr mönnum. n=3 óháð sýnishorn. l,m, dæmigerð hvatbera formgerð T-frumna sem ræktaðar eru í viðmiðunarástandi, mjólkursýru eða pH 6,6 ástandi í 12 daga, greind með EM (kvarðastöng, 1 μM) (l). Flatarmál einstakra hvatbera í T frumum (m), n=45 frumum. Gögnin eru sett fram sem meðaltal ± sem Tölfræðilegar greiningar voru gerðar með því að nota óparað tvíhliða t-próf ​​nemenda.

Mynd 5|↑[H+]-stækkaðar T frumur sýna aukna virkni gegn æxli. a,b, viðmiðunar- eða mjólkursýru-stækkaðar CD8+ T-frumur voru greindar með tilliti til þráláts eftir ættleiðingarflutning (n=6 mýs). Nýeinangruð mús CD45.1+ OT-I T frumur voru virkjaðar með mús IL-2 og plötubundnum CD3 og CD28 mótefnum gegn músum í 2 daga og síðan haldið í ræktunarmiðli með mús IL-2 þar til ættleiðingarflutningur (CD3&CD28+IL-2). Skýringarmynd af dýratilrauninni (a) ásamt dæmigerðum FACS reitum og tölfræðilegri greiningu á CD45.1+ og CD45.2+ T-frumur í blóði eru sýndar í (b). c–g, CD45.1+ OT-I T frumur voru stækkaðar í samanburðar- eða mjólkursýrumiðli í 7 daga og fluttar yfir í B16-OVA-æxlisberandi mýs og íferð hlutfalls var metin (n=5 mýs). Skýringarmynd af dýratilrauninni með B16-OVA æxlisberandi músum (c), ásamt dæmigerðum FACS reitum (vinstri) og tölfræði fyrir fjölda (hægri) yfirfærðra CD45.1+ OT- I T frumur í æxlinu (d). sc, inndæling undir húð. Tölfræði fyrir hlutfall CD45.1+ T frumur (e) og dæmigerð gögn (vinstri) og tölfræði fyrir hlutfall (hægri) CD62L+ CD44+ CD45.1+ T frumur (f ) í milta eru sýndar. Æxlisvaxtarferill (g) (n=5 mýs, dagur 14). h–j, CD19-CAR T frumur voru stækkaðar í samanburðar- eða mjólkursýrumiðli í 12 daga og fluttar í CD19-oftjáðu K562 æxlisberandi NCG mýs og íferðarhlutfallið í æxli og milta var metnar (n=6 mýs). Skýringarmynd af dýratilrauninni (h), dæmigert hlutfall yfirfærðra T-frumna í æxlinu og milta (i), og æxlisvaxtarferlar (j) eru sýndar (n=6 mýs, dagur 10). Gögnin eru sett fram sem meðaltal ± sem Tölfræðilegar greiningar voru gerðar með því að nota óparað tvíhliða t-próf ​​nemenda.

Mynd 6|↑ [H+ ] útsetning takmarkar þreytu T-frumna. a Skýringarmynd af langvarandi örvun T-frumna manna in vitro. b, Representative FACS plots fyrir LAG-3 og TIM-3 í langvarandi örvum T-frumum úr mönnum sem ræktaðar eru við stjórn eða mjólkursýruskilyrði. n=3 óháð sýni. c, Tjáning LAG-3 og TIM-3 í CD45.1+ TIL frá B16-OVA æxlisberandi C57BL/6N músum (n=5 músum ). d, Magngreining á tjáningu LAG-3, TIM-3 og PD-1 í CD45.1+ TIL frá B16-OVA-æxliberandi C57BL/ 6N mýs (n=5 mýs). e, tjáning LAG-3 og TIM-3 í CD19-CAR T frumum sem síast í æxli frá CD19-K562 æxlisberandi NCG músum, eins og ákvarðað er með frumuflæðismælingu (n=6 mýs). f, Tjáning TOX í CD45.1+ TIL frá B16-OVA æxlisberandi C57BL/6N músum (n=5 músum). g, Súlumyndir og tölfræðileg greining á TOX í CD19-CAR T frumum sem síast í æxli frá CD19-K562 æxlisberandi NCG músum (n=6 músum). h, Vinstri, dæmigerður flæðifrumumælingar fyrir TIM-3 og TCF1 í CD45.1+ TIL frá B16-OVA æxlisberandi C57BL/6N músum (n=5 mús) . Hægri, hlutfall TCF1+ TIM-3– eða TCF1– TIM-3+ íbúa. Gögnin eru sett fram sem meðaltal ± sem Tölfræðilegar greiningar voru gerðar með því að nota óparað tvíhliða t-próf ​​nemenda.

Greint hefur verið frá því að umbrotsefni, eins og S-2-hýdroxýglútarat og -hýdroxýbútýrat, virki sem erfðafræðilegir stjórnendur á aðgreiningu minni-T frumna67,68. Niðurstöður okkar sýndu að þrálát ↑[H+ ] meðferð takmarkar metíónínupptöku og metíónín umbrot með minnkuðu innanfrumu metíóníni, SAM og SAH með því að hindra tjáningu metíónínflutningsefna. Þessar niðurstöður gætu að hluta útskýrt hvers vegna T-frumur eru ekki færar um að keppa fram úr æxlisfrumum fyrir metíónínupptöku í TME69. Á vélrænan hátt sýndum við fram á að útsetning fyrir ↑[H+] dró verulega úr MYC tjáningu og bindingu þess við SLC7A5 hvata, sem leiddi af sér minni SLC7A5 tjáningu og skert metíónín umbrot í T frumum. Það er forvitnilegt að metíónínuppbót getur endurheimt tjáningu MYC og SLC7A5, sem og flæði metíóníns hringrásar í ↑[H+]-útsettum T-frumum, sem bendir til þess að endurheimt metíónínupptökugetu hafi líklega verið vegna uppstjórnunar metíónínflutningsefnisins. SLC7A5 á MYC-háðan hátt. Tilkynnt hefur verið um að mTOR virkni stjórnar MYC þýðingu70. Í samræmi við það, höfum við getgátur um að ↑[H+]-framkallað niðurstýring á MYC sé líklega vegna þýðingarbælingar með stigvaxandi hömlun á mTOR og skertri upptöku metíóníns. Slíkri bælingu gæti verið snúið við með utanaðkomandi metíónínuppbót, þó að nákvæma aðferðin þurfi frekari rannsókn. SAM unnin úr metíónín hringrásinni hefur verið talið miðla histónmetýleringu og epigenetic endurgerð meðan á áhrifa-T frumuaðgreiningu stendur8,71. Í samræmi við minnkun á innanfrumu SAM í ↑[H+]-stækkuðum T-frumum, komumst við að því að heildarmagn H3K27me3 og umráð þess á frumkvöðulum T-frumna-stofnsstaða minnkaði bæði mikið. H3K27me3 og H3K4me3 eru sértækt breytt á þann hátt sem tengist tjáningu gena sem eru miðlæg í áhrifa- eða stofnfrumuáætlun T-frumna14. Reyndar var minni auðgun H3K4me3 innan áhrifa-gena hvata í ↑[H+]-stækkuðum T frumum. Þannig leiðir minnkuð magn metýlgjafa SAM sem stafar af skertri metíónínupptöku og efnaskiptum við ↑[H+] ástandið til epigenetic breytingar sem að lokum stuðla að aðgreiningu T-frumna í minnisstöðu. Athyglisvert er að viðbót metíóníns undir ↑[H+] útsetningu bjargar ekki aðeins tjáningu MYC og SLC7A5 í ↑[H+]-útsettum T-frumum, heldur endurheimtir einnig heildarmagn H3K27me3 tjáningar, sem styður mikilvægt hlutverk fyrir MYC–SLC7A5 -metíónín umbrotsás til að stjórna ↑[H+ ]-framkallaðri epigenetic stamness. Reyndar komumst við að því að oftjáning á SLC7A5 skerti að hluta til ↑[H+]-framkallaða stilkurlíka svipgerð, sem styður enn frekar mikilvægu hlutverki metíónínflutningsmannsins SLC7A5 við öflun T-frumu minnislíka svipgerðarinnar undir ↑[H+] útsetningu.

Sögulega hefur verið talið að flest TIL-efni séu uppgefin vegna stöðugrar útsetningar fyrir TCR innan æxla, en þversagnakennt er að lítill undirhópur T-frumna-klóngerða í TIL-um sem tjá umritunarþáttinn TCF1 heldur stofnfrumulíkum eiginleikum. Niðurstöður okkar leiddu í ljós að ↑[H+] útsetning vegur á móti virkni T-frumuáhrifa og varðveitir stofnfrumu T-frumna í gegnum MYC–SLC7A5–meþíónín efnaskiptaásinn, sem gefur mögulega skýringu á núverandi þversögn á því hvers vegna lítið brot af TIL hefur enn stofn- eins og minni eða forvera eiginleika. Reyndar hefur verið greint frá svipuðum niðurstöðum þar sem kalíumjónir í TME gegna tvíþættu hlutverki sem hafa áhrif á virkni T-frumuáhrifa og stofnstig56,72, sem styður enn frekar við flókin áhrif TME ónæmisbælandi þátta (td langvarandi TCR örvun, súrefnisskortur og lágt glúkósa) á starfsemi T-frumna og sérhæfingu. Að auki eru súru svæðin innan æxla mjög kraftmikil og bæði staðbundin og tímabundin, og hæfni T-frumna sem eru aðlagaðar að utanfrumusýrublóðsýringu falli líklega í skuggann þegar þær lenda í öðrum erfiðum TME þáttum sem geta haft áhrif á virkni T-frumna í æxli og aðgreiningu. Þar að auki sáum við meiri tjáningu á MYC í endalausum T-frumum (LY108− TIM-3+) en í T-frumum sem tæmdar voru forvera (LY108+ TIM-3–), sem er í samræmi við fyrri skýrslur um að MYClo T frumur eignist helst minnisörlögin73. Í samræmi við minnkaða SLC7A5 tjáningu og metíónínupptöku í ↑[H+ ]-útsettum T-frumum, var tjáning SLC7A5 einnig marktækt minni í LY108+ TIM-3–forfrumna-útreyndu T-frumuþýði innan æxla, sem bendir til þess að MYC–SLC7A5–meþíónín stýriásinn gæti einnig starfað in vivo. Nú er ljóst að minna aðgreindar stofnlíkar T-minnisfrumur hafa betri æxlislæknandi áhrif vegna langvarandi þrautseigju og ónæmis gegn þróun vanvirkni51,74. Við höfum hér lagt fram sannfærandi sönnunargögn um að langtíma ↑[H+ ]-skilyrt CD8+ T frumur sýndu aukna þrautseigju og betri æxlisgetu in vivo, með minnkaðri endalausri T-frumuþýði (TCF1− TIM{ {39}} ) og aukið stofnlíkt forfeðra undirmengi (TCF1+ TIM-3–) innan æxla. Að lokum veitir núverandi rannsókn okkar innsýn í fjölvíða áhrif ↑[H+] útsetningar á bælingu á áhrifavirkni T-frumna og samhliða áhrif hennar á stofnstærð T-frumna.

Aðferðir

Mýs og frumulínur

Allar dýratilraunir voru gerðar með samþykki dýraumönnunar- og notkunarnefndar (IACUC) Suzhou Institute of Systems Medicine (ISM-IACUC-0151-R), og dýr voru hýst í sérstökum sjúkdómsvaldalausum músaaðstöðu. Mýsnar voru geymdar við staðlaðar aðstæður, með 12-klst/12-klst ljós/myrkri hringrás og stjórnað hitastigi 22–24 gráður og rakastig 60%, með ótakmarkaðan mat og vatn framboð og voru skoðaðar daglega. Allar æxlisbyrði fór ekki yfir leyfið sem samþykkt var af dýraumönnunar- og notkunarnefnd Suzhou Institute of Systems Medicine. CD45.1+ kvenkyns OT-I TCR erfðabreyttar mýs á C57BL/6N bakgrunni voru vistaðar saman. CD45.2+ kvenkyns C57BL/6N mýs á aldrinum 6-8 vikna voru keyptar frá Vital River sem viðtakendur. Kvenkyns NCG (NOD/ ShiLtJGpt-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22/Gpt) mýs á aldrinum 6-8 vikna voru keyptar frá GemPharmatech. Fyrir eina sjálfstæða tilraun in vivo voru CD45.1+ og CD45.2+ mýsnar (6–12 vikur) kynjaðar. HEK-293T-frumum frá American Type Culture Collection (ATCC) var haldið í DMEM miðli sem bætt var við 10% nautgripafóstursermi (FBS) og 1% penicillín-streptomycini. Mús sortuæxli frumulína B16, frá ATCC, var umbreytt til að tjá OVA og haldið í DMEM miðli bætt við 10% FBS og 1% penicillín-streptomycin. K562 frumur frá ATCC voru umbreyttar til að tjá CD19 úr mönnum og ræktaðar í RPMI 1640 miðli bætt við 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin, 1% GlutaMAX, 0,1 M HEPES, 1% ónauðsynlegar amínósýrur, 1 mM natríumpýrúvat og 500 μM -merkaptóetanól. Öll ofangreind hvarfefni voru keypt frá Gibco.

Einangrun frum T-frumna, virkjun og afturveiruflutningur

Mús CD{{0}} T eitilfrumur voru einangraðar úr milta 6–12 vikna karlkyns eða kvenkyns OT-I músa með því að nota CD8 barnalegt T frumu einangrunarsett (BioLegend) og ræktaðar í RPMI{{5} } miðli bætt við 10% FBS, 1% penicillín-streptómýsíni, 1% ónauðsynlegum amínósýrum, 1% GlutaMAX, 1 mM natríumpýruvati, 0,1 M HEPES og 50 μM -merkaptóetanóli í viðurvist músa IL -2 (20U/ml, Peprotech). Fyrir eina sjálfstæða tilraun in vitro voru karl- og kvenmýsnar (6-12 vikur) sem notaðar voru kynjaðar. Hreinsaðar frumur voru virkjaðar með mótefnum gegn músum CD3 (2 ug/ml, BioLegend) og mótefni gegn músum CD28 (1 ug/ml, BioLegend) í 48 klst. Einkjarna frumur úr útlægum blóði (PBMC) frá heilbrigðum gjöfum voru keyptar frá Sailybio og ræktaðar í RMPI-1640 miðli ásamt 5% Human Serum AB (Gemini), 1% penicillin-streptomycin, 1% ónauðsynlegar amínósýrur, 1% GlutaMAX, 1 mM natríumpýrúvat, 0,1 M HEPES og 50 μM -merkaptóetanól í viðurvist manna IL-2 (100 U/ml, Peprotech). Einstofna mótefni gegn mönnum CD3 (1 ug/ml, BioLegend) og CD28 gegn mönnum (1 ug/ml, BioLegend) voru notuð til að virkja PBMC í 3 daga. Hreinsaðar músa- og T-frumur úr mönnum voru virkjaðar og stækkaðar við tilgreindar ræktunaraðstæður: pH 7,4, pH 6,6, mjólkursýra (Sangon) eða natríumlaktat (Sangon). Eftirfarandi umbrotsefni voru notuð til að bæta við pH 6,6 eða mjólkursýru (10 mM) miðli: metíónín 800 μM (MCE), SAM 100 μΜ (MCE) eða SAH 100 μM (Sigma). Fyrir veiruflutning voru 1 × 106 PBMC virkjuð í hverri brunn í 24-brunnsplötum. Eftir 48 klst. af virkjun var meirihluta miðilsins skipt út fyrir ósamþjappað retroveiru flot með 10 ug/ml polybrene (Santa Cruz). Eftir skilvindu við 600 g í 90 mínútur við 30 gráður voru frumur ræktaðar í hitakassa í 24 klst með fersku æti. Ummyndunin var endurtekin 24 klukkustundum síðar og síðan aftur sett í ferskan miðil til ræktunar. Lág sækni taugavaxtarþáttarviðtaka (LNGFR) var notaður til að mæla virkni sýkingarinnar.

Flæðifrumumæling

Frumur voru litaðar með flúrljómandi mótefnum og síðan greindar með frumuflæðismælingu. Til litunar á yfirborðsmerkjum voru frumur litaðar með flúrljómandi samtengdum mótefnum og lifandi/dauða festanlegu dauðfrumulitunarsetti (Invitrogen) í FACS jafnalausn (fosfatbufferuð saltlausn (PBS) með 2% FBS), síðan fest með 2% paraformaldehýði (Casmart) í 20 mínútur við stofuhita. Fyrir innanfrumu litun á fosfópróteinum voru forlitaðar frumur festar með Fixation Buffer (BioLegend) og síðan litaðar með fosfósértækum mótefnum í Permeabilization Buffer (Invitrogen). Til að greina innanfrumu cýtókína voru frumur örvaðar með phorbol myristat asetati (PMA) í viðurvist Brefeldin A (BFA) (BioLegend) í 4,5 klst. Síðan voru forlituðu frumurnar festar og litaðar með cýtókínmótefnum í gegndræpi. Fyrir litun með umritunarþætti innan frumu voru frumur forlitaðar með lifandi/dauðum festanlegum dauðum frumum litunarsettum og flúrljómandi samtengdum mótefnum í FACS jafnalausn til að greina yfirborðsmerki. Frumurnar voru síðan festar í 30 mínútur á ís með því að nota FOXP3/Transcription Factor Fixation Buffer (Invitrogen) og litaðar með umritunarþáttum mótefnum í Permeabilization Buffer. Eftir litun voru frumur endursviflausnar í FACS biðminni fyrir frumuflæðisgreiningu. Gögnum um flæðifrumumælingar var safnað með BD LSR Fortessa og BD FACSDiva (v8.0.2), og greind með FlowJo (v10.4) hugbúnaði. Fulltrúar hliðaraðferðir eru gefnar upp á mynd 10b í auknum gögnum.

RNA raðgreiningu

RNA-seq greining var framkvæmd með því að nota 12-dagsstækkaðar T frumur sem ræktaðar voru við tilgreindar aðstæður eins og sýnt er á mynd 1a. Í stuttu máli, 12 dögum eftir stækkun T-frumna, var heildar-RNA dregið út með einsleitni í TRIzol (Takara) og frystingu í RNase-lausum rörum með fljótandi köfnunarefni. Heilleiki RNA var metinn með því að nota Agilent 2100 lífgreiningartækið (Agilent). Söfnin voru smíðuð með því að nota TruSeq RNA sýni undirbúningsbúnaðinn (FC-122-1001, Illumina). Bókasöfnin voru síðan raðgreind með Illumina NovaSeq 6000 (PE150) vettvangi og um það bil 40 milljón pöruð lestur voru búnar til (Novogene). Hrá lestölur voru dregnar út og síðan staðlaðar með stærðarstuðlum safnsins með því að nota DESeq2 (v1.28.1). Reglubundin logaritmi (r-log) umbreytingin var notuð til að koma á stöðugleika á dreifni yfir sýnin. GO og KEGG ferlaauðgunargreining á genum sem tjáð eru með mismunandi hætti var gerð með klasasniði (v3.16.0). Tjáningarhitakort voru framleidd með R pakkanum 'pheatmap' (v1.0.12). GSEA v.4.0 var notað fyrir GSEA greiningu.

CUT&Tag-seq

CUT&Tag-seq var framkvæmd eins og áður hefur verið lýst75, með því að nota Hyperactive Universal CUT&Tag prófunarbúnaðinn fyrir Illumina (TD903, Vazyme). Í stuttu máli voru T-frumur úr mönnum stækkaðar í 12 daga við eftirlitsaðstæður, mjólkursýru eða mjólkursýru með 800 μM metíóníni. Síðan voru 1 × 105 T frumur ljósaðar til útdráttar á kjarnaefnum og þær ræktaðar með ConA perlum við stofuhita í 10 mín. Frumur voru endursviflausnar í 50 µL mótefnajafna sem var blandað saman við frummótefni (and-H3K27me3 eða and-H3K4me3) og ræktaðar yfir nótt við 4 gráður. Sýnin voru ræktuð með aukamótefninu við stofuhita í 30 mínútur og síðan ræktuð með próteininu A/G-Tn5 transposasa við stofuhita í 1 klst. til að trufla DNA sundrun. Hreinsað DNA var notað til undirbúnings safns og raðgreint með PE150 með Illumina Nova6000 raðgreiningartæki.

CUT&Tag-seq greining

FastQC (v{{0}}.11.4) (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) var notað til að athuga lesgæði raðgreiningar. Lesið var gæðaklippt niður í Phred-einkunn að lágmarki 20 með því að nota trimmomatic (v0.39) (http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic) . Öll lestur framleidd af CUT&Tag-seq af H3K27me3 og H3K4me3 var samræmd hg38 erfðamengi mannsins með því að nota Bowtie2 (v2.2.8) (https:// bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml) með valkostum: –local– mjög viðkvæmt-staðbundið–nei-unal–ekki-blandað–engin-ósamræmi–phred33 -I 10 -X 700. Sýnin án DNA-dna voru staðlað með ChIPseqSpikeInFree aðferðinni, sem er ný stöðlunaraðferð til að ákvarða stærðarstuðla á áhrifaríkan hátt fyrir sýni yfir mismunandi aðstæður og meðferðir76. Fyrir H3K27me3 voru toppar kallaðir með MACS2 (v2.2.6) (https://hbctraining.github.io/Intro-to-ChIPseq/lessons/05_ peak_calling_macs .html) með valmöguleikum '-g hs -f BAMPE–keep-dup all– broad–broad-cutoff 0.1'. Fyrir H3K4me3 notaði hámarkskall MACS2 með breytunum '-g hs -q 0.01 -f BAMPE–keep-dup all'. Toppar voru merktir með ChIPseeker (v1.22.1) (https://guangchuangyu.github.io/software/ ChIPseeker/) og sjónmyndir voru búnar til með deepTools (v3.5.1) (https://deeptools.readthedocs.io/en /develop/) og pyGenomeTracks (v3.7) (https://pygenometracks.readthedocs.io/en/latest/).

QRT–PCR

Heildar-RNA var einangrað með TRIzol (Takara) og öfugt umritað í cDNA með HiScript Reverse Transcriptase (Vazyme), samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Fyrir megindlega rauntíma PCR var ABI prisma 7500 rauntíma PCR System (Thermo Fisher) og 2×SYBR Green qPCR Master Mix (Bimake) notað samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. ACTB var notað sem innri staðall. Hlutfallsleg tjáning mRNA var reiknuð út með 2−ΔΔCT aðferðinni. Grunnraðir sem notaðar eru fyrir qPCR má finna í viðbótartöflu 1.

Western blotting

Fyrir prótein tjáningargreiningu var frumum safnað saman og skolað með köldu PBS og heildarpróteinið var dregið út með því að nota 1% SDS (Sangon) á ís. Próteinstyrkur var mældur með BCA próteingreiningarsetti (Merck). Próteinsýni voru aðskilin með SDS–PAGE hlaupum og síðan flutt yfir á PVDF himnur (Millipore). Himnur voru stíflaðar með 5% fitulausri mjólk í PBS sem innihélt Tween20. Eftir lokun voru himnur ræktaðar með frummótefnum yfir nótt við 4 gráður og HRP-tengd aukamótefni í 2 klst við stofuhita. HRP merkið var þróað með rafefnaljómun (ChemeMINI610) og safnað af Sage Capture (v2.19.12). Gagnagreining var framkvæmd með ImageJ (v1.8.0) hugbúnaði.

Formfræðigreining hvatbera

Í hverjum brunni af {{0}}brunnsplötum voru PBMCs virkjuð með and-CD3 og and-CD28 mótefnum úr mönnum í 3 daga og voru ræktuð í RPMI-1640 miðli við mismunandi aðstæður í 12 daga. Síðan var 1 × 106 PBMCs safnað og fest í forkældu festingarbuffi (2,5% glútaraldehýð, 0,1 M fosfatjafnalausn (PB), pH 7,4) yfir nótt við 4 gráður. Eftir að hafa verið þvegið með PBS þrisvar sinnum, voru frumur eftirfixaðar í 1% osmíumtetroxíði í PBS í 2 klst, þurrkaðar og felldar inn í Spurr's plastefni, samkvæmt stöðluðu ferlinu. Ofurþunnir hlutar voru litaðir með úranýlasetati og blýsítrati. Formgerð hvatbera var mynduð með Hitachi HT-7800 rafeindasmásjá (TEM) (v01.20) og AMT-XR81DIR myndavél.

Mótefni og hvarfefni

Mótefni sem notuð voru fyrir frumuflæðisgreiningu voru sem hér segir. APC and-manna NGFR (cat. nr. 345108, 1:1,000 fyrir FACS), FITC and-manna CD4 (cat. nr. 357406, 1:200 fyrir FACS), Pacific Blue and-manneskju CD8 (cat. nr. 300928, 1:200 fyrir FACS), APC-Cy7 and-manna/mús CD44 (cat. nr. 103028, 1:200 fyrir FACS), PE and-manneskju CCR7 (cat. nr. 353204, 1 :200 fyrir FACS), PE and-mann TNF- (cat. nr. 502909, 1:200 fyrir FACS), PE-Cy7 and-manneskju CD45RO (cat. nr. 304230, 1:200 fyrir FACS), APC and- manna IFN- (cat. nr. 502512, 1:200 fyrir FACS), PE-Cy7 and-manna LAG-3 (cat. nr. 369310, 1:200 fyrir FACS), PE and-manna TIM{{ 52}} (cat. nr. 345006, 1:200 fyrir FACS), BV711 and-manna PD-1 (cat. nr. 329928, 1:200 fyrir FACS), Percp-Cy5.5 and-manneskju CD62L (cat. nr. 304824, 1:200 fyrir FACS), APC anti-manneskju CD27 (cat. nr. 302810, 1:200 fyrir FACS), BV711 anti-mús CD8 (cat. nr. 100748, 1:200 fyrir FACS ), PE-Cy7 andstæðingur mús CD62L (cat. nr. 104418, 1:200 fyrir FACS), APC-Cy7 andstæðingur mús CD45.2 (cat. nr. 830789, 1:200 fyrir FACS), Pacific Blue andstæðingur- mús CD45.1 (cat. nr. 110722, 1:200 fyrir FACS), APC andstæðingur-mús Ly108 (cat. nei. 134610, 1:200 fyrir FACS), PE and-mús LAG-3 (cat. nr. 125207, 1:200 fyrir FACS), Alexa Fluor 488 anti-c-MYC mótefni (cat. nr. 626811, 1 :200 fyrir FACS), PE and-mús TNF- (cat. nr. 506306, 1:200 fyrir FACS), og APC and-mús IFN- (cat. nr. 505810, 1:200 fyrir FACS) voru keyptir frá BioLegend . Lifandi/dauð festanleg dauðfrumublettasett, PerCP-eFluor710 músavörn PD-1 (vörunr. 46-9981-82, 1:200 fyrir FACS), PE fosfór-S6 (Ser235/236) (köttur) . nr. 12-9007-42, 1:200 fyrir FACS), PE andstæðingur-mann/mús TOX (cat. nr. 12-6502-82, 1:200 fyrir FACS), og PE-Cy7 andstæðingur-mús TIM{ {149}} (cat. nr. 25-5870-82, 1:200 fyrir FACS) voru keyptir frá Thermo Fisher. Alexa Fluor 647 anti-TCF1 (cat. nr. 6709, 1:200 fyrir FACS) og fosfór-4E-BP1 (Thr37/46) (cat. nr. 2846, 1:200 fyrir FACS) voru keyptir frá Cell Signaling Technology. Alexa Fluor 647 and-puromycin (cat. nr. MABE343-AF647, 1:800 fyrir FACS) var keypt frá Merck. Mótefni sem notuð voru fyrir Western blot voru sem hér segir. Kanína and-fosfó-Akt (Ser473) (cat. nr. 4060, 1:1,000 fyrir IB), and-fosfó-NF-kB p65 (Ser536) (cat. nr. 3033, 1:1 ,000 fyrir IB), and-c-MYC (cat. nr. 18583, 1:1,000 fyrir IB), and-EZH2 (cat. nr. 5246, 1:1,{ {200}} fyrir IB), and-trí-metýl-histon H3 (Lys27) (cat. nr. 9733, 1:1,000 fyrir IB), and-trí-metýl-histon H3 (Lys4) (cat. nr. 9751, 1:1,000 fyrir IB), and-dí-metýl-histon H3 (Lys9) (cat. nr. 4658, 1:1,000 fyrir IB) , and-dí-metýl-histon H3 (Lys79) (cat. nr. 5427, 1:1,000 fyrir IB), and-histone H3 (cat. nr. 9715, 1:1,{{242 }} fyrir IB), and-COXIV (cat. nr. 850, 1:1,000 fyrir IB), and-kanínu IgG (HRP-tengd) (cat. nr. 7074, 1:2,{ {253}} fyrir IB), og IgG gegn músum (HRP-tengd) (cat. nr. 7076, 1:2,000 fyrir IB) voru keyptir frá Cell Signaling Technology. Mouse anti-Tim23 (cat. nr. 611223, 1:1,000 fyrir IB) var frá BD Biosciences. Músa-- -aktín (cat. nr. 66009-1-Ig, 1:5,000 fyrir IB), and-SLC7A5 (cat. nr. 67951-1-Ig, 1: 1,000 fyrir IB), og kanínu-anti-SLC38A1 (cat. nr. 12039-1-AP, 1:1,000 fyrir IB) voru frá Proteintech. Kanínu-anti-SLC38A2 (cat. nr. BMP081, 1:1,000 fyrir IB) var keypt frá Medical & Biological Laboratories.

T-frumu efnaskiptapróf

Til að athuga BODIPY FL C16 upptöku í stjórn eða ↑[H+ ]-meðhöndluðum T frumum voru T frumur ræktaðar með nýuppleystu 1 μM BODIPY FL C16 (Invitrogen) í 1 klst, síðan þvegnar tvisvar með PBS fyrir yfirborðslitun. Til að kanna frekar efnaskiptafíkn í mismunandi meðferðarhópum voru tilraunir gerðar með því að nota SCENITH (einfrumu orkuefnaskipti með því að sniðganga þýðingarhindrun) aðferð42. Í stuttu máli var T-frumum sáð í 96-brunnsplötur við 1 × 106 frumur/ml. Síðan voru frumur meðhöndlaðar með stýringu (Ctrl), 2-deoxý-d-glúkósa (lokastyrkur 100 mM), oligomycin (endastyrkur 5 μM), eða blöndu af hemlum við lokastyrk í 40 mínútur við 37 gráðu. Puromycin (lokastyrkur 10 ug/ml) var bætt við á síðustu 30 mín. Eftir puromycin meðferð voru frumur þvegnar með köldu PBS og forlitaðar með Live/Dead Fixable Dead Cell Stain Kit og mótefnum gegn yfirborðsmerkjum. Litun á innanfrumu púrómýsíni var fylgt eftir með litunarferli fyrir innanfrumu umritunarþætti.

Efnaskiptagreining með LC-MS/MS

Efnaskiptagreining og sýnasöfnun voru framkvæmd eins og í fyrri skýrslum77. Í stuttu máli voru PBMCs virkjuð hver fyrir sig í 24-brunnsplötum með and-CD3/CD28 manna í 3 daga og voru ræktuð í RPMI 1640 miðli með viðmiðunar- eða mjólkursýru til 12. dags. Síðan, 8 × 106 frumum í hverju sýni (n=4 óháð sýni í hverjum hópi) var safnað og flutt í 1.5-ml rör til skilvindu við 300 g í 5 mínútur við 4 gráður og síðan þvegið með köldu PBS. Eftir skilvindu við 300 g í 5 mínútur aftur, var 80% köldu metanóli bætt við og hrært kröftuglega til að trufla frumukúluna alveg, og síðan voru frumurnar fluttar í frysti við -80 gráður. Sýnin voru skilin í skilvindu við 12,000 g í 10 mínútur við 4 gráður. Ofanvökvanum var safnað. Að lokum voru útdrættirnir frostþurrkaðir og greindir með UHPLC-MS/MS í Novogene. Hrágagnaskrárnar sem UHPLC–MS/MS mynduðu voru unnar með því að nota Compound Discoverer (v3.1, Thermo Fisher) til að framkvæma toppjöfnun, topptínslu og magngreiningu fyrir hvert umbrotsefni. Metaboanalyst (v5.0) hugbúnaður var notaður fyrir frekari gagnagreiningu og síðan voru marktækt auðgaðir leiðir valdar með því að nota P < 0,05.

Stöðug-samsætu-merkingartilraunir

13C efnaskiptaflæðið var framkvæmt á T-frumum með því að nota áður lýstar aðferðir60,78,79. Í stuttu máli voru PBMCs virkjuð í hverri brunn í 24-brunnsplötum með and-CD3/CD28 úr mönnum í 3 daga, eins og lýst er hér að ofan. Til að rekja glúkósa [13C6] var efnið skipt eftir 11 daga yfir í glúkósafrítt RPMI (Gibco) ásamt 10% skilun FBS (Thermo Fisher Scientific), 1% penicillin-streptomycin, 1% ónauðsynlegar amínósýrur, 50 μM -merkaptóetanól og 0,1 M HEPES, sem inniheldur 11 mM [13C6] glúkósa (Cambridge Isotope Laboratories) með samanburði eða 10 mM mjólkursýru, í 24 klst. Fyrir [13C16]palmitat rekja voru 2 × 107 T frumur virkjaðar og settar í fullbúið miðil með viðmiðunar- eða 10 mM mjólkursýruskilyrðum eins og lýst er hér að ofan á degi 12, sem innihélt 200 μM [13C16]palmitat (Cambridge Isotope Laboratories), í 8 h. Til að rekja [13C5] metíónín, voru T frumur stækkaðar undir stjórn, mjólkursýra eða mjólkursýra með 800 μM metíónínskilyrðum í 12 daga. Síðan var skipt um 4 × 107 T frumur yfir í metíónín-frítt fullkomið RPMI miðil (Gibco) og ræktaðar við eftirlitsaðstæður, mjólkursýru eða mjólkursýru ásamt metíóníni (inniheldur 100 μM, 100 μM eða 800 μM [13C5] metíónín) (Cambridge Isotope Laboratories), í 8 klst. Viðkomandi floti var safnað og síðan geymt við -80 gráður. Frumur voru pelaðar með skilvindu (300 g, 4 gráður, 5 mín), þvegnar tvisvar með saltvatni og leifturfrystar strax í fljótandi köfnunarefni og geymdar við -80 gráður. Umbrotsefnin voru dregin út með því að nota ísköld HPLC-gráðu 80% metanóls og hrærð í stutta stund, fylgt eftir með því að bæta við 200 ml af HPLC-gráðu vatni, síðan 500 ml HPLC-gráðu klóróforms (metanól:vatn: klóróform hlutfall, 5:2:5 ). Blandan var hringd í hring og skilvindu til að ná fasaaðskilnaði. Fljótandi vökvinn voru þurrkaðir með lofttæmissnúningi fyrir síðari afleiðumyndun og síðan ræktuð með 2% (wt/vol) metoxýamínhýdróklóríði (226904, Sigma-Aldrich) í pýridíni í 60 mínútur við 37 gráður og silýleruð með N-metýl-N-( tert-bútýldímetýlsílýl) tríflúorasetamíði með 1% tert-bútýldímetýlklórsílani (TBDMS, 18162-48-6, Regis Technologies) í 30 mínútur við 45 gráður. [13C6]glúkósaafleiðurnar voru greindar með GC-HRMS, Trace 1310 gasskiljunni (Thermo Fisher) með DB–35MS súlunni (Agilent Technologies) og Q Exactive GC Orbitrap GC–MS/MS kerfinu (Thermo Fisher). GC–MS/MS efnaskiptagreiningar voru framkvæmdar af Metabo-Profile. Umbrotsefnin voru auðkennd og magngreind með Xcalibur (v4.1) og TraceFinder (v5.1) (Thermo Fisher), þar á meðal varðveislutíma, hlutfall hleðslu og massa jónabrota og hámarksstyrk. [13C16]palmitat og [13C5] metíónín afleiður voru greindar með ofurháþrýsti vökvaskiljun – þrefaldur fjórpóla massarófsmælir (UPLC–TQMS). Hrá gögnin frá UPLC–TQMS voru greind með MassLynx hugbúnaði Waters (v4.1, Waters) fyrir hámarksútdrátt, samþættingu, auðkenningu og magngreiningu umbrotsefnanna. R tungumál (v4.1.1) var notað fyrir síðari tölfræðigreiningu.

B16 æxlislíkan og frumuflutningsónæmismeðferð

Til að kanna æxlisvirkni T-frumna in vivo var 0.2 × 106 B16-OVA sortuæxlisfrumum sprautað undir húð í C57BL/6N kvenkyns músum. Níu dögum eftir æxlisígræðslu var músum sprautað í bláæð með 5 × 106 T frumum úr kvenkyns OT-I músum sem stækkaðar voru í 7 daga við mismunandi aðstæður. Æxlisberandi mýs fengu 5 Gy af banvænni geislun fyrir ACT. Æxlissvæðið var mælt á tveggja daga fresti og reiknað sem lengd (mm) × breidd (mm). Mýs með æxlissvæði sem nálgaðist 300 mm2 voru aflífaðar. Til að kanna þrávirkni stækkaðra T-frumna við mismunandi aðstæður, voru 4 × 106 CD45.1+ T-frumur úr kvenkyns OT-I músum fluttar með ættleiðingu í C57BL/6N kvenkyns mýs. Viku síðar voru mýs aflífaðar og frumurnar úr einangruðu blóði, milta og eitlum taldar. Hlutfall yfirfærðra T-frumna var ákvarðað með hliðrun á T-frumum sem tjá CD45.1+ og CD45.2+ í gegnum frumuflæðisgreiningu.

NCG múslíkan og CD19-CAR-T meðferð

Kvenkyns NCG mýs voru græddar undir húð með 1 × 106 CD19-K562 frumum. Þegar æxlisrúmmál náði 75 mm3 fengu mýs 5 × 106 T-frumur sem ekki voru umbreyttar og CD19-CAR T-frumur ræktaðar í samanburði eða 10 mmM mjólkursýru-innihaldsefni. Æxlisvöxtur var mældur á 2ja daga fresti með rafrænum mælum og reiknaður með lengd (mm) × breidd (mm). Mýs með æxlissvæði stærra en 300 mm2 voru aflífaðar. Æxlunum var safnað saman, melt og unnin með Percoll (Sigma) og síðan var virkni T-frumna og svipgerð ákvörðuð með frumuflæðismælingu.

Grunnsúrefnisneysluhraði og utanfrumu súrnunarhraðagreining

Til greiningar á efnaskiptaeiginleikum voru OCR og ECAR metin með sjóhesta XF24 greiningartæki (Agilent). Í stuttu máli, T-frumur úr mönnum sem ræktaðar voru við mismunandi aðstæður í 12 daga voru formeðhöndlaðar með XF-miðli sem ekki var jafnað (non-buffered RPMI 1640 sem innihélt 10 mM glúkósa 1 mM natríumpýrúvat og 2 mM glútamín) . Næst var T-frumum úr mönnum sáð í 0,5 × 106 frumum í hverri brunn í XF24 frumuræktar örplötu og þær ræktaðar í útungunarvél án CO2 í 1 klst. við 37 gráður. Til að auka viðloðun frumna voru plöturnar snúnar við stofuhita í 5 mínútur við 100 g með núllbremsu. Súrefnisneysla og utanfrumu súrnun voru greind við grunnskilyrði og sem svar við 1,25 μM oligomycin, 50 mM 2-deoxý-d-glúkósa, 1,5 μM FCCP, 0,5 μM rótenón og 0,5 μM andmycin A. SRC var reiknað frá. grunn OCR frá hámarks OCR.

Chip–qPCR

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) var framkvæmd eftir leiðbeiningum framleiðanda sem fylgir með ChIP-IT express ensímklippingarsettinu (Active Motif). Í stuttu máli voru 15 milljónir manna T frumur ræktaðar í stjórn eða 10 mM mjólkursýruskilyrðum festar með formaldehýði í 10 mínútur við stofuhita og festingarviðbrögðin stöðvuð með því að bæta við 1× glýsíni. Föstum frumum var pelletrað með PMSF og próteinhömlunarkokteil og geymdar við -80 gráður fyrir frumugreiningu. Síðan var þíða kögglan endurleyst í 1 ml ísköldu lýsisbuffi með PMSF og próteinhömlunarkokteil á ís í 30 mínútur til að fá kjarnaefni. Kjarnakúlan var síðan endurleyst og melt með ensímkokteil til að skera chromatin í 15 mínútur við 37 gráður. Krómatín var ræktað með próteini G segulperlum með anti-c-MYC (CST, tegund nr. 18583, 1:100 fyrir ChIP) og and-IgG (CST, tegund nr. 2729, 1:100 fyrir ChIP) kl. 4 stiga hiti í nótt. Síðan voru segulmagnaðir perlur þvegnar með ChIP stuðpúða fjórum sinnum og skolaðar með 50 ul skolunarpúða. Skolið DNA var öfugt krossbundið í 2,5 klst við 65 gráður og síðan hreinsað með fenól-klóróform útdrætti. Hreinsað DNA var notað til að framkvæma ChIP-qPCR til að greina auðgun MYC á markgenum. Primera sem notaðir eru fyrir ChIP–qPCR má finna í viðbótartöflu 2.

Hvatberamassa og himnumöguleikagreining

Hvatberamassi og himnugeta voru greind með MitoTracker Green og tetramethyrhodamine metýl ester (TMRM). Frumur voru litaðar með 250 nM MitoTracker Green (Thermo Fisher) eða 50 nM TMRM (Thermo Fisher) í hitakassa við 37 gráður (5% CO2) í 1 klst áður en frumu yfirborðslitun var lituð. Frumur voru þvegnar með FACS jafnalausn þrisvar sinnum, fylgt eftir með yfirborðsmerkjum litun til frekari FACS greiningar.

tölfræðigreining

Tölfræðileg greining var gerð með GraphPad Prism útgáfu 8.0. Niðurstöður eru sýndar sem meðaltal ± sem Tvíhliða t-próf ​​nemenda var notað til að bera saman meðferðir við samanburðarhópa. Tvíhliða ANOVA með Tukey's Sidak's eða Dunnett's multiple-samanburðarprófi var beitt fyrir margfaldan samanburð. P < 0.05 var talið vera tölfræðilega marktækt.

Heimildir

1. Gattinoni, L., Speiser, DE, Lichterfeld, M. & Bonini, C. T minnisstofnfrumur í heilsu og sjúkdómum. Nat. Med. 23, 18–27 (2017).

2. Gao, S. o.fl. Stofnfrumulíkar T-minnisfrumur: sjónarhorn frá myrku hliðinni. Cell Immunol. 361, 104273 (2021).

3. Rosenberg, SA & Restifo, NP Ættleiðandi frumuflutningur sem persónuleg ónæmismeðferð við krabbameini í mönnum. Vísindi 348, 62–68 (2015).

4. Ribas, A. & Wolchok, JD Krabbameinsónæmismeðferð með stöðvunarstöðvun. Vísindi 359, 1350–1355 (2018).

5. Lugli, E., Galletti, G., Boi, SK & Youngblood, BA Stöngull, áhrifavaldur og blendingsástand CD8+ T-frumna í minni. Trends Immunol. 41, 17–28 (2020).

6. Galletti, G. o.fl. Tvö undirmengi stofnlíkra CD8+ minni T-frumuforfeðra með mismunandi örlagaskuldbindingar hjá mönnum. Nat. Immunol. 21, 1552–1562 (2020).

7. Gattinoni, L. o.fl. T-frumuundirmengi manna með stofnfrumulíka eiginleika. Nat. Med. 17, 1290–1297 (2011).

8. Franco, F., Jaccard, A., Romero, P., Yu, YR & Ho, PC Efnaskipta- og erfðafræðileg stjórnun á þreytu T-frumna. Nat. Metab. 2, 1001–1012 (2020).

9. Kaech, SM & Cui, W. Transcriptional control of effector and memory CD8+ T cell differentiation. Nat. Séra Immunol. 12, 749–761 (2012).

10. Huang, Q. o.fl. Frumaðgreining á æxlissértækum minni CD8+ T-frumum sem svörun við PD-1/PD-L1 blokkun í tæmandi eitlum. Cell 185, 4049–4066 (2022).

11. Siddiqui, I. o.fl. Intratumoral Tcf1+ PD-1+ CD8+ T frumur með stofnlíka eiginleika stuðla að æxlisstjórnun sem svar við bólusetningu og ónæmismeðferð með eftirlitsstöðvum. Immunity 50, 195–211 (2019).

12. Jeannet, G. o.fl. Nauðsynlegt hlutverk Wnt ferli áhrifavaldsins Tcf-1 til að koma á fót starfhæfu CD8 T frumuminni. Frv. Natl Acad. Sci. USA 107, 9777–9782 (2010).

13. Henning, AN, Roychoudhuri, R. & Restifo, NP Epigenetic control of CD8+ T cell differentiation. Nat. Séra Immunol. 18, 340–356 (2018).

14. Crompton, JG o.fl. Ættlæg tengsl CD8+ T frumu undirmengja koma í ljós með stigvaxandi breytingum á erfðafræðilegu landslaginu. Cell Mol. Immunol. 13, 502–513 (2016).

15. Yu, B. o.fl. Epigenetic landslag sýna umritunarþætti sem stjórna CD8+ T frumuaðgreiningu. Nat. Immunol. 18, 573–582 (2017).

16. Araki, Y. o.fl. Erfðamengis-vítt greining á histónmetýleringu leiðir í ljós stjórnun á litningaástandi á genaumritun og virkni minni CD8+ T-frumna. Immunity 30, 912–925 (2009).

17. Moller, SH, Hsueh, PC, Yu, YR, Zhang, L. & Ho, PC Efnaskiptaáætlanir sníða ónæmi T-frumna við veirusýkingu, krabbameini og öldrun. Cell Metab. 34, 378–395 (2022).

18. Phan, AT o.fl. Stofnuð glýkólýsandi umbrot styður CD8+ T frumuáhrifa minni aðgreiningu við veirusýkingu. Ónæmi 45, 1024–1037 (2016).

19. Sinclair, LV o.fl. Stýring mótefnavakaviðtaka á umbrotum metíóníns í T-frumum. eLife 8, e44210 (2019).

20. O'Sullivan, D. o.fl. Minni CD8+ T frumur nota frumu-innri fitusundrun til að styðja við efnaskiptaforritun sem nauðsynleg er fyrir þróun. Immunity 41, 75–88 (2014).

21. Pearce, EL o.fl. Auka CD8 T-frumu minni með því að stilla fitusýruefnaskipti. Náttúra 460, 103–107 (2009).

22. Van der Windt, GJ o.fl. Öndunargeta hvatbera er mikilvægur eftirlitsaðili fyrir þróun CD8+ T frumuminnis. Immunity 36, 68–78 (2012). 23. Boedtkjer, E. & Pedersen, SF Súra æxlisörumhverfið sem drifkraftur krabbameins. Annu. Séra Physiol. 82, 103–126 (2020). 24. Thommen, DS & Schumacher, TN T frumu vanstarfsemi í krabbameini. Krabbameinsfruma 33, 547–562 (2018).

25. Scharping, NE o.fl. Æxlissmáumhverfið bælir niður lífmyndun t-frumu hvatbera til að knýja fram efnaskiptabilun og truflun á t-frumu í æxli. Immunity 45, 374–388 (2016).

26. Yu, YR o.fl. Trufluð gangverki hvatbera í CD8+ TIL styrkir þreytu T-fruma. Nat. Immunol. 21, 1540–1551 (2020).

27. Chang, CH o.fl. Efnaskiptasamkeppni í örumhverfi æxlis er drifkraftur framvindu krabbameins. Cell 162, 1229–1241 (2015).

28. Scharping, NE o.fl. Hvatbera streita framkallað af stöðugri örvun undir súrefnisskorti knýr hratt T-frumuþreytu áfram. Nat. Immunol. 22, 205–215 (2021).

29. Jansen, CS o.fl. Innan æxlis sess viðheldur og aðgreinir stofnlíkar CD8 T frumur. Nature 576, 465–470 (2019).

30. Im, SJ o.fl. Skilgreina CD8+ T frumur sem gefa út fjölgunarlosun eftir PD-1 meðferð. Náttúra 537, 417–421 (2016).

31. Haas, R. o.fl. Laktat stjórnar efnaskipta- og bólgueyðandi hringrásum til að stjórna flutningi T-frumna og áhrifavirkni. PLoS Biol. 13, e1002202 (2015).

32. Wu, H. o.fl. T-frumur framleiða súr veggskot í eitlum til að bæla niður eigin áhrifavirkni. Nat. Commun. 11, 4113 (2020).

33. Calcinotto, A. o.fl. Stöðun á sýrustigi örumhverfisins snýr við ónæmi í T-eitilfrumum sem síast æxli í menn og músa. Cancer Res. 72, 2746–2756 (2012). 34. Gottfried, E. o.fl. Mjólkursýra sem er unnin úr æxlum stjórnar virkjun tannfrumu og mótefnavaka. Blóð 107, 2013–2021 (2006).

35. Colegio, OR o.fl. Virknin skautun æxlistengdra átfrumna með æxlisafleiddri mjólkursýru. Náttúra 513, 559–563 (2014).

36. Erra Diaz, F. o.fl. Utanfrumublóðsýring og hömlun á mTOR knýja fram aðgreiningu á monocyte-afleiddum dendritic frumum úr mönnum. Cell Rep. 31, 107613 (2020).

37. Sukumar, M. o.fl. Hamling á glýkólytískum efnaskiptum eykur CD8+ T frumu minni og æxlishemjandi virkni. J. Clin. Fjárfestu. 123, 4479–4488 (2013).

38. Scholz, G. o.fl. Stöðun mTOR-boða kallar á myndun stofnfrumulíkra T-minnisfrumna. EBioMedicine 4, 50–61 (2016).

39. Pollizi, KN o.fl. mTORC1 og mTORC2 stjórna sértækt CD8+ T frumuaðgreiningu. J. Clin. Fjárfestu. 125, 2090–2108 (2015).

40. Zhang, L. o.fl. Spendýramarkmið rapamýsínfléttu 2 stjórnar CD8 T frumuminni aðgreiningu á Foxo1-háðan hátt. Cell Rep. 14, 1206-1217 (2016).

41. Zhou, H. & Huang, S. Hlutverk mTOR merkja í hreyfanleika æxlisfrumna, innrásar og meinvarpa. Curr. Prótein Pept. Sci. 12, 30–42 (2011).

42. Arguello, RJ o.fl. SCENITH: aðferð sem byggir á flæðifrumumælingum til að gera grein fyrir orkuefnaskiptum með einfrumuupplausn. Cell Metab. 32, 1063–1075 (2020).

43. Ron-Harel, N. o.fl. Lífmyndun hvatbera og endurgerð próteóma stuðla að efnaskiptum eins kolefnis fyrir virkjun T-frumna. Cell Metab. 24, 104–117 (2016).

44. Han, C., Ge, M., Ho, PC & Zhang, L. Fueling T-cell antitumor immunity: amínósýruefnaskipti endurskoðuð. Krabbamein Immunol. Res. 9, 1373–1382 (2021).

45. Kakaradov, B. o.fl. Snemma umritunar- og epigenetic stjórnun CD8+ T frumuaðgreiningar sem kemur í ljós með einfrumu RNA raðgreiningu. Nat. Immunol. 18, 422–432 (2017).

46. ​​Wang, W. & Zou, W. Amínósýrur og flutningsefni þeirra í T frumuónæmi og krabbameinsmeðferð. Mol. Cell 80, 384–395 (2020).

47. Marchingo, JM, Sinclair, LV, Howden, AJ & Cantrell, DA Megindleg greining á því hvernig Myc stjórnar T-frumu próteómum og efnaskiptaferlum við virkjun T-frumna. eLife 9, e53725 (2020).

48. Sukumar, M. o.fl. Hvatberahimnumöguleiki auðkennir frumur með aukinn stofnstyrk fyrir frumumeðferð. Cell Metab. 23, 63–76 (2016).

49. Alizadeh, D. o.fl. IL15 eykur æxlishemjandi virkni CAR-T frumna með því að draga úr mTORC1 virkni og varðveita svipgerð stofnfrumuminnis þeirra. Krabbamein Immunol. Res. 7, 759–772 (2019).

50. Buck, MD o.fl. Virkni hvatbera stjórnar örlögum T-frumna með efnaskiptaforritun. Cell 166, 63–76 (2016).

51. Krishna, S. o.fl. Stöngullíkar CD8 T frumur miðla svörun ættleiðingarfrumna ónæmismeðferðar gegn krabbameini í mönnum. Vísindi 370, 1328–1334 (2020).

52. Burger, ML o.fl. Mótefnavaka yfirráðastigveldi móta TCF1+ forvera CD8 T frumu svipgerða í æxlum. Cell 184, 4996–5014 (2021).

53. Guo, Y. o.fl. Efnaskiptaendurforritun á endalausum CD8+ T-frumum með IL-10 eykur ónæmi gegn æxlum. Nat. Immunol. 22, 746–756 (2021).

54. Klein Geltink, RI o.fl. Efnaskiptaskilyrði CD8+ verkunar T-frumna fyrir ættleiðingarfrumumeðferð. Nat. Metab. 2, 703–716 (2020).

55. Suzuki, J., Nabe, S., Yasukawa, M. & Yamashita, M. Glútamín stjórnar æxlishemjandi virkni CD8 T-frumna. Gan To Kagaku Ryoho 47, 11–15 (2020).

56. Vodnala, SK o.fl. Stofnleiki T-frumna og truflun í æxlum koma af stað með algengum aðferðum. Science 363, eaau0135 (2019).

57. Bosticardo, M. o.fl. Hlutdræg virkjun T-eitilfrumna úr mönnum vegna lágs utanfrumu pH er mótvirkt með B7/CD28 samörvun. Eur. J. Immunol. 31, 2829–2838 (2001).

58. Pucino, V. o.fl. Uppsöfnun laktats á þeim stað þar sem langvarandi bólgu kemur fram ýtir undir sjúkdóm með því að örva endurrás á CD4+ T frumu efnaskiptum. Cell Metab. 30, 1055–1074 (2019).

59. Feng, Q. o.fl. Laktat eykur stöngleika CD8+ T-frumna til að auka ónæmi gegn æxlum. Nat. Commun. 13, 4981 (2022).

60. Roy, DG o.fl. Metíónín umbrot mótar svörun T-hjálparfrumna með því að stjórna endurforritun epigenetic. Cell Metab. 31, 250–266 (2020).

61. Zhang, L. & Romero, P. Efnaskiptastýring á ákvörðunum um örlög á CD8+ T-frumum og ónæmi gegn æxlum. Trends Mol. Med. 24, 30–48 (2018).

62. Cham, CM, Driessens, G., O'Keefe, JP & Gajewski, TF Glúkósaskortur hamlar mörgum lykilgenatjáningaratburðum og áhrifavirkni í CD8+ T-frumum. Eur. J. Immunol.38, 2438-2450 (2008).

63. O'Sullivan, D. o.fl. Minni CD8+ T frumur nota frumu-innri fitusundrun til að styðja við efnaskiptaforritun sem nauðsynleg er fyrir þróun. Immunity 49, 375–376 (2018).

64. Lin, R. o.fl. Fitusýruoxun stjórnar lifun CD8+ vefja í minni t-frumu í kirtilkrabbameini í maga. Krabbamein Immunol. Res 8, 479–492 (2020).

65. Raud, B. o.fl. Virkni etómoxírs á stjórnunar- og minnis-T frumur eru óháðar Cpt1a-miðlaðri fitusýruoxun. Cell Metab. 28, 504–515 (2018).

66. Sharma, U. & Rando, OJ Efnaskiptainntak inn í epigenome. Cell Metab. 25, 544–558 (2017).

67. Tyrakis, PA o.fl. S-2-hýdroxýglútarat stjórnar örlögum CD8+ T-eitilfrumna. Nature 540, 236–241 (2016).

68. Zhang, H. o.fl. Ketogenes-myndað beta-hýdroxýbútýrat er erfðafræðilegur stjórnandi á CD8+ T-frumu minnisþróun. Nat. Cell Biol. 22, 18–25 (2020).

69. Bian, Y. o.fl. Krabbamein SLC43A2 breytir T-frumu metíónínumbrotum og histónmetýleringu. Náttúra 585, 277–282 (2020).

70. Wall, M. o.fl. Þýðingarstýring á c-MYC með rapamycini stuðlar að endanlegri mergfrumugreiningu. Blóð 112, 2305–2317 (2008).

71. Yerinde, C., Siegmund, B., Glauben, R. & Weidinger, C. Efnaskiptastjórnun á erfðafræði og hlutverki þess í CD8+ T frumuaðgreiningu og virkni. Framan. Immunol. 10, 2718 (2019).

72. Eil, R. o.fl. Jónísk ónæmisbæling innan æxlismíkróumhverfisins takmarkar virkni T frumuáhrifa. Náttúra 537, 539–543 (2016).

73. Guo, A. o.fl. cBAF flóknir þættir og MYC vinna snemma í örlögum CD8+ T-frumna. Náttúra 607, 135–141 (2022).

74. Raynor, JL, Chapman, NM & Chi, H. Efnaskiptastýring á T-frumumyndun minni og stofnstyrk. Cold Spring Harb. Sjónarhorn. Biol. 13, a037770 (2021).

75. Kaya-Okur, HS o.fl. CUT&Tag fyrir skilvirka epigenomic prófíl á litlum sýnum og stökum frumum. Nat. Commun. 10, 1930 (2019).

76. Jin, H. o.fl. ChIPseqSpikeInFree: ChIP–seq normalization nálgun til að sýna alþjóðlegar breytingar á histon breytingum án spike-in. Lífupplýsingafræði 36, 1270–1272 (2020).

77. Sellick, CA, Hansen, R., Stephens, GM, Goodacre, R. & Dickson, AJ Umbrotsefnisútdráttur úr sviflausnarræktuðum spendýrafrumum fyrir alþjóðlegt umbrotsefni. Nat. Protoc. 6, 1241–1249 (2011).

78. Li, C. o.fl. Niðurbrot amínósýra stjórnar próteostasi blóðmyndandi stofnfrumna um GCN2–eIF2 ás. Frumu stofnfruma 29, 1119–1134 (2022).

79. Wenes, M. o.fl. Hvatbera pýruvatberinn stjórnar aðgreiningu T-frumna í minni og æxlisvirkni. Cell Metab. 34, 731–746 (2022).