Extra-veiru DNA í Adeno-tengdum veiru vektor undirbúningi framkallar TLR9 háð meðfædd ónæmissvörun í plasmacytoid dendritic frumum manna

Adeno-associated veirus (AAV) vektor sviflausnir framleiddar í annað hvort HEK frumum af mönnum eða í Spodoptera frugiperda (Sf9) skordýrafrumum eru mismunandi hvað varðar leifar hýsilfrumuhluta sem og tegundasértækar breytingar eftir þýðingu sem birtast á AAV capsid próteinum . Hér greindum við áhrif þessa muns á ónæmisvaldandi eiginleika ferjunnar. Við örvuðum plasmacytoid dendritic frumur úr mönnum með ýmsum hellingum af HEK frumuframleiddum og Sf9 frumuframleiddum AAVCMV-eGFP vektorum sem eru fengnir frá mismunandi framleiðendum. Við komumst að því að AAV8-CMV-eGFP sem og AAV2-CMV-eGFP vektorar ollu lotu-sértækum en ekki framleiðsluvettvangssértækum eða framleiðandasértækum bólgusvörun cýtókína. Hægt væri að draga úr þessum eða afnema með því að hindra toll-like receptor 9 boð eða með því að minnka DNA á ensímafræðilegan hátt í vektorlotunum með því að nota DNase. Árangursrík HEK frumuflutningur með DNase-meðhöndluðum AAV lotum og DNA greiningar sýndu fram á að DNasi hafði ekki áhrif á heilleika ferjunnar heldur brotnaði niður utanveiru DNA. Við komumst að þeirri niðurstöðu að bæði HEK- og Sf9-frumu unnin AAV efnablöndur geti innihaldið ónæmisvaldandi utanveiru DNA þætti sem geta kallað fram lotusértæk bólguónæmissvörun. Þetta bendir til þess að bættar aðferðir til að fjarlægja aukaveiru DNA óhreinindi geti verið mikilvægur þáttur í að draga úr ónæmisvaldandi eiginleikum AAV vektorefnablöndur.

cistanche tubulosa-bæta ónæmiskerfið

Síðasta áratug hefur gífurlegur áhugi orðið á þróun nýrra raðbrigða adenoassociated veira (AAV) aðferða fyrir bæði grunnrannsóknir og klíníska notkun1–3. Aðalástæðan liggur í þeirri staðreynd að AAV ferjur hafa verið einstaklega fjölhæf tæki á sviði genameðferðar, enda getu þeirra til að skila lækningalegum genum á skilvirkan og öruggan hátt til markvefja4. Hins vegar, vaxandi fjöldi rannsakenda tilkynnir sjálfstætt um niðurstöður sem benda til staðbundinnar og almennrar ónæmissvörunar eftir afhendingu AAV í forklínískum og klínískum rannsóknum5-8.

Sýnt hefur verið fram á að AAV ferjur virkja meðfædda ónæmismynsturþekkingarviðtaka eins og toll-like receptor (TLR)2 og TLR9 sem leiðir til losunar bólgusýtókína og interferóna af tegund I (IFN)9,10. Ónæmisvaldandi þættir AAV sem gætu örvað þessi svörun eru ma kapsíðprótein og erfðamengi ferju9,10. Ónæmissvörun eftir notkun AAV gæti einnig komið af stað vegna óhreininda í vektorsviflausninni5,11. Þessi óhreinindi hafa verið skilgreind sem hvaða efnisþáttur sem er til staðar í hreinsuðu AAV vektor sviflausninni annar en æskileg afurð12 og stafa af framleiðsluferli ferjunnar. Tvær af helstu aðferðum til að framleiða klínískar raðbrigða AAV ferjur fela í sér flutning á plasmíði DNA í HEK frumur og sýkingu Spodoptera frugiperda (Sf9) skordýrafrumna með bacoluvirus13. Í samræmi við það gætu hugsanlega ónæmisvaldandi óhreinindi sem eru í AAV-ferjusviflausnum innihaldið endotoxín, frumuræktunarmiðilhluti, hvarfefni sem eru notuð til AAV-hreinsunar, prótein og DNA úr hýsilfrumum og leifar af bakkelsi-DNA eða plasmíði DNA5. Viðbótarþættir sem gætu haft áhrif á ónæmingargetu AAV-ferjusviflausna eru post-translational modifications (PTMs) sem eru áprentaðar á hylkið af mismunandi ferjurframleiðslupöllum5. Mikilvægt er að HEK frumur fengnar og Sf9 frumur fengnar AAV ferjur eru mjög mismunandi hvað varðar PTM, leifar hýsilfrumu prótein óhreininda þeirra11, og hugsanlega einnig í DNA óhreinindum þeirra (HEK frumu DNA á móti Sf9 frumu DNA sem og leifar plasmíð DNA DNA) á móti bakkelsuveira DNA)14. Plasmacytoid dendritic frumur (pCDs) eru sérhæfð meðfædd ónæmisfrumugerð sem seytir miklu magni af tegund I IFN og bólgueyðandi frumudrepum við veirusýkingar9,15 og gegna stóru hlutverki í skynjun AAV ferja9. Í samræmi við það, til að greina hvort munurinn á HEK frumuframleiddum og Sf9-frumuframleiddum AAV ferjum valdi mismun á ónæmisvaldandi eiginleikum þeirra, örvuðum við pDCs úr mönnum með mismunandi lotum af sama AAV ferjunni sem fengin var úr framleiðslukerfunum tveimur og mismunandi framleiðendur. Við komumst að því að helmingur ferjulotanna sem skoðaðir voru framkallaði lotu-sértæk bólgueyðandi ónæmissvörun sem hvorki tengdist kerfisframleiðslu ferjunnar né framleiðanda. Þessum svörum var miðlað af TLR9 merkjum og næm fyrir meðhöndlun á vektorlotunum með DNase. Árangursrík HEK frumuflutningur með bæði ómeðhöndluðum og DNase-meðhöndluðum AAV vektorlotum og DNA greiningar á AAV efnablöndur bentu til þess að DNasi hefði ekki áhrif á heilleika AAV agna heldur frekar miða á óhjúpað utanveiru DNA. Samanlagt bendir þetta til þess að AAV-ferjublöndur geti innihaldið óhjúpað utanveiru-DNA sem getur haft áhrif á ónæmisvaldandi eiginleika AAV-ferjuefnablandna í pDCs úr mönnum.

Kostir cistanche tubulosa-styrkja ónæmiskerfið

Niðurstöður

AAV framkallar lotu-sértæk meðfædd ónæmissvörun í pDCs úr mönnum.

Rannsóknir hafa sýnt fram á að HEK frumur fengnar og Sf9 frumur fengnar, AAV ferjur eru mismunandi hvað varðar PTM og óhreinindi sem eru í veiru sviflausnum11. Við gerðum þá tilgátu að þessir þættir gætu leitt til mismunar á ónæmisvaldandi eiginleikum milli HEK frumu- og Sf9 frumuafleiddra vektorlota. Til að prófa þessa tilgátu greindum við alls átta AAV sermisgerð 8 (AAV8) vektorlotur sem innihéldu sömu DNA röð cýtómegalóveiruhvata (CMV) og eins transgen fyrir aukið grænt flúrljómunarprótein (eGFP) (AAV8- CMV-eGFP; fimm HEK- og þrjár Sf9 frumur unnar lotur) og fjórar AAV2-CMV-eGFP lotur (tvær HEK- og tvær Sf9 frumur fengnar lotur) frá þremur mismunandi framleiðendum [framleiðandi A; Veiru vektor kjarnaaðstöðu háskólans í Iowa (Iowa, Bandaríkjunum), framleiðandi B; Virovek (CA, Bandaríkjunum) og framleiðanda C; Vigene Biosciences (MD, Bandaríkin)]. Til að hámarka líkindi milli lotanna voru sjö AAV8 loturnar frá framleiðanda A og framleiðanda B (tafla 1) framleiddar með því að nota sama upprunalega plasmíðið. Að auki var dropa digital PCR (ddPCR) skráning á erfðamengi ferjunnar (vg) af AAV vektorlotunum framkvæmd í hlið við hlið mælingu með tveimur mismunandi markmiðum: annað innan CMV röðarinnar og hitt innan eGFP röðarinnar vektorarnir. Niðurstöður sem fengust með magngreiningu á CMV markinu voru notaðar til að títra AAV vektorloturnar í eftirfarandi tilraunum (tafla 1). pDC eru sérhæfðir veiruskynjarar sem framleiða gríðarlega tegund I IFN við veirusýkingu15, þar á meðal AAV ferjur9. Til að kanna hvort HEK-frumuframleiddar og Sf9-frumuframleiddar AAV-ferjur eru mismunandi hvað varðar getu þeirra til að framkalla meðfædd ónæmissvörun í ónæmishæfum frumum, örvuðum við pDCs úr mönnum með AAV-ferjulotunum hér að ofan. Í þessu skyni voru pDCs hreinsuð úr einkjarnafrumum í útlægum blóði (PBMC) einstakra heilbrigðra mannagjafa með neikvæðu vali með segulvirkjaðri frumuflokkun (MACS). Flæðifrumugreining staðfesti hreinleika einangruðu pDCs yfir 90% (mynd S1). Tíu pDCs einstakra gjafa voru sáð og örvaðir með AAV8 og AAV2 vektorlotum við MOI 1:1 × 106 vg/frumu í 18 klst. MOI upp á 1:106 vg/frumu sem er sett á samtals 12.500 frumur í 50 ul/brunn þýðir 2,5× 1011 vg/ml titer. Við notuðum þennan titra vegna þess að hann er innan marka þess sem er notað í rannsóknum á genameðferð í sjónhimnu hjá mönnum (td 1× 1012 vg/ml16 eða 4 × 1011–1,3 × 1012 vg/ml17) og prímötum sem ekki eru menn (td 5 × 1011–5 × 1012 vg/ml6). Örvun með ökutækinu þjónaði sem stjórn. Ræktun með AAV8 og AAV2 vektorlotum leiddi ekki til neinnar greinanlegrar tjáningar transgena í pDCs. Hins vegar, fjórar af átta AAV8 hlutum (hluti A-HEK-1, A-HEK-2, A-HEK-3, A-Sf9-1) og tveir af fjórar AAV2 lotur (lotur B-Sf9-1, B-Sf9-2) framkölluðu hvarfgjörn frumufjölgun í örvuðum pDCs (mynd 1a). Þessu fylgdi losun bólgueyðandi cýtókína (IP-10, MIP-1 og TNF-) og tegund I IFN (IFN-). Aftur á móti var hvorki frumufjölgun né frumulosun framkölluð af AAV8 sem eftir var (lotur A-Sf9-1, B-HEK-1, B-Sf9-1, C-HEK{{92} }) og AAV2 lotur (lotur C-HEK-1, C-HEK-2). Þessar niðurstöður voru staðfestar í þremur til fjórum sjálfstæðum tilraunum sem hver um sig var framkvæmd með frumum eins einstaks gjafa (mynd 1a-c og tafla S1). Lotasértækur munur á frumustyrknum í þessum óháðu tilraunum var tölfræðilega greindur með því að nota línulegt blandað áhrif líkan og Post hoc Dunnett's próf (Q=2.6) með því að bera saman minnstu ferninga meðaltal mismunandi AAV vektorlota með stjórn ökutækisins (töflur S2 og S3). Þetta sýndi tölfræðilega marktækan mun á cýtókínsvörunum milli „ónæmisvaldandi“ AAV vektorlota (AAV8 lotur A-HEK-1, A-HEK-2, A-HEK-3, A-Sf{ {114}}, eða AAV2 lotur B-Sf9-1, B-Sf9-2 í sömu röð) og stjórn en enginn marktækur munur á "óónnæmisvaldandi" AAV vektorlotum (AAV8 lotur A-Sf{{ 123}}, B-HEK-1, B-Sf9-1, C-HEK-1 eða AAV2 lotur C-HEK-1, C-HEK-2 í sömu röð) og stjórn (tafla S3). Styrkur afgangsins af mældum frumudrepum sem voru innifalin í multiplexprófinu var annaðhvort undir greiningarsviðinu (þ.e. IL-1, IL-2, IL-4, IL-5 , IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, GM-CSF, IFN-) eða hvorki „ónæmisvaldandi“ né "óónæmisvaldandi" vektorloturnar ollu marktækri aukningu á losun þeirra (þ.e. IL-7, IL-8, G-CSF, MCP-1) (mynd S2), sem bendir til þess að ákveðinn sérhæfni í AAV-miðluðu cýtókínsvörun. Til að rannsaka cýtókínsvörun á fyrri tímapunkti voru pDCs örvuð með „ónæmisvaldandi“ AAV8 vektorlotunni A-HEK-1. Við sáum marktæka aukningu á styrk TNF- í flotinu þegar 2 klst. eftir pDC örvun. Þetta svar mynstur gæti verið staðfest í þremur tilraunum, hver framkvæmd með frumum eins einstaks gjafa (mynd S3). Til að kanna hvort stærri skammtur af „ónæmisvaldandi“ AAV8 vektorlotu gæti kallað fram ónæmissvörun örvuðum við pDCs með tæknilega hámarks MOI (1:4,61× 106 vg). Athyglisvert var að hvorki hvarfgjörn frumufjölgun né cýtókínviðbrögð greindust við örvun með þessari auknu titer (mynd S4). Andstætt tilgátu okkar sýna þessar niðurstöður að meðfædd ónæmissvörun við AAV í pDCs var lotu-sértæk og ekki tengd sérstöku framleiðslukerfi eða framleiðanda/hreinsunaraðferð.

Tafla 1. Mismunandi lotur af AAV8 og AAV2 veiruferjum notaðar í þessari rannsókn.

Mynd 1. Framleiðslu á AAV vektor lotu-sértæk ónæmissvörun í pDCs úr mönnum. PDCs úr mönnum voru örvaðir með mismunandi fjölda AAV8-CMV-eGFP og AAV2-CMV-eGFP (MOI: 1:1× 106 vg) í 18 klst. (a) Fulltrúar bjartar sviðsmyndir af pDC ökutækjastjórnun (efri mynd) eða ónæmisvaldandi AAV vektorlotu (neðri mynd). Kvarðastöngin er 100 μm. (b) Cýtókínlosun IP-10, MIP-1, TNF- og IFN- 2 af AAV8-örvuðum pDCs. (C) Cýtókínlosun með AAV2-örvuðum pDCs. Fulltrúar lóðir einnar af þremur til fjórum sjálfstæðum tilraunum. Þar sem í IFN- 2 mælingum (b,c) og TNF- mælingum (c) féllu sum gildi undir mælingarsviðinu, var fastanum 1 bætt við öll mæld IFN- 2 og TNF- gildi til framsetningar í hálflogaritmískum söguþræði. Sýnd eru miðgildi og millifjórðungsbil. Í merkingum einstakra vektorlotna eru framleiðendurnir þrír táknaðir með bókstöfunum A, B og C; HEK-frumuafleiddir og Sf9-frumuafleiddir vektorar eru auðkenndir með "HEK og "Sf9" og samsvarandi lotur frá sama framleiðanda og sama framleiðslukerfi eru númeraðar "1, 2, 3". Hringur: HEK-afleiddur vektorlota; þríhyrningur: Sf9-afleiddur vektorlotur; svartur: vektorlotur frá framleiðanda A; appelsínugulur: vektorlotur frá framleiðanda B; grænn: vektorlotur frá framleiðanda C.

Ónæmissvörun við AAV örvun í pDCs er ekki undir áhrifum frá mismun á capsid/VG hlutfalli.

Forklínískar rannsóknir hafa sýnt að munur á fjölda fullra og tómra vektoragna í AAV vektor sviflausnum getur haft áhrif á ónæmissvörun18. Til að meta hvort munurinn á ónæmisvaldandi eiginleikum milli greindu ferjulotanna stafaði af mismun á hlutfalli fullra og tómra ferjuagna, ákváðum við titrið af ferjukapsíðum í öllum AAV lotunum með AAV títrun ELISA og reiknuðum út capsíð/VG hlutfall. Athyglisvert er að mikill munur á capsid/vg hlutfalli fannst á milli allra AAV lota (mynd 2). Um það bil tvisvar sinnum fleiri capsids en vg (2:1) fundust í AAV8-CMV-eGFP lotum A-HEK-1, A-HEK-3, A-Sf{{11} } og AAV2-CMV-eGFP B-Sf9-1; og fjórum sinnum meira (4:1) í AAV8 lotu A-Sf9-1. Hlutfallið 1:1 kom fram í restinni af hlutunum. Hins vegar fannst enginn marktækur munur á kappsíð/vg hlutföllum „ónæmisvaldandi“ og „ónæmisvaldandi“ AAV vektorlota í AAV8 (P=0.27) né í AAV2 (P=0.37) vektorlotur (mynd 2). Þetta bendir til þess að munurinn á ónæmisvaldandi eiginleikum greindu AAV-ferjulotanna hafi heldur ekki verið tengdur mismun á hlutfalli fullra og tómra vektoragna.

Kostir cistanche viðbót - hvernig á að styrkja ónæmiskerfið

Viðurkenning á „ónæmisvaldandi“ AAV8 vektorlotum með TLR9.

Sýnt hefur verið fram á að meðfædd ónæmisþekking AAV af músa- og mannapDCs er miðlað af DNA-skynjun TLR99. Í samræmi við það, metum við hvort TLR9 hafi einnig tekið þátt í viðurkenningu á „ónæmisvaldandi“ AAV8 vektorlotum okkar. Í þessu skyni voru pDCs sáð eins og lýst er og ræktuð með TLR9 mótlyfinu H154 (50 µM) fylgt eftir með örvun með „ónæmisvaldandi“ AAV8 vektorlotunum A-HEK-1, A-HEK-2, A -HEK-3 og A-Sf9-1 (MOI: 1:1× 106 vg). Eftir 18 klst. sáust engar vísbendingar um frumufjölgun (mynd 3a) og marktæk minnkun á losun IP-10, MIP-1, TNF- og IFN- mældist (mynd. 3b). Þetta gefur til kynna að ónæmissvörun við "ónæmisvaldandi" AAV8 vektorlotum í pDCs úr mönnum sé miðlað af TLR9 merkjum.

Mynd 2. Samanburður á capsid/vg hlutföllum milli mismunandi AAV8-CMV-eGFP og AAV2-CMV-eGFP vektorlota. Capsid/vg hlutföllin koma frá gleypnimælingum (ELISA) og ddPCR niðurstöðum úr (a) átta AAV8 vektorlotum og (b) fjórum AAV2 vektorlotum. Striklaðar línur aðgreina "ónæmisvaldandi" frá "ónæmisvaldandi" AAV vektorlotum. Súlur gefa til kynna meðaltal og staðalfrávik endurtekningar. Tölfræðileg marktekt var ákvörðuð með því að nota óparað t-próf ​​nemenda.

Mynd 3. Viðurkenning á „ónæmisvaldandi“ AAV8-CMV-eGFP vektorlotum með pDC er TLR9 háð. PDCs úr mönnum voru meðhöndlaðir með TLR9 mótlyfinu H154 (50 μM) fylgt eftir með örvun með „ónæmisvaldandi“ AAV8 vektorlotum (MOI: 1:1× 106 vg) í 18 klst. (a) Fulltrúar bjartar sviðsmyndir af hreinsuðum pDCs meðhöndlaðir með "ónæmisvaldandi" AAV vektorlotum (efri mynd) eða "ónæmisvaldandi" AAV vektorlotum og H154 (neðri mynd). Kvarðastikan er 100 μm. (b) Cýtókín losun IP-10, MIP-1, TNF- og IFN- 2 af örvuðum pDCs. Þar sem í IFN- 2 mælingunum féllu sum gildi undir mælingarsviðinu, var fastanum 1 bætt við öll mæld IFN- 2 gildi til framsetningar í hálflogaritmískri mynd. Sýnd eru meðaltöl og staðalfrávik. Tölfræðileg marktekt var ákvörðuð með einstefnu ANOVA og Holm-Sidak post hoc greiningu. P gildi: Minna en eða jafnt og 0,05: *; Minna en eða jafnt og 0,01: **; Minna en eða jafnt og 0,001: ***.

DNase meðferð dregur úr ónæmissvörun „ónæmisvaldandi“ AAV8 og AAV2 vektorlota.

Þó að "ónæmisvaldandi" AAV8 vektorar hafi framkallað TLR9-háð ónæmissvörun í pDCs, voru engin slík svör framkölluð af "ónæmisvaldandi" lotunum. TLR9 er virkjað sem svar við DNA, sérstaklega DNA sem inniheldur ómetýleruð CpG mótíf9. Mikilvægt er að ddPCR mælingar okkar staðfestu að sömu veiru DNA þættirnir voru til staðar í bæði „ónæmisvaldandi“ og „ónæmisvaldandi“ vektorlotum. Samanlagt benti þetta til þess að ópakkað/frítt DNA í veiru sviflausninni frekar en innanveiru DNA gæti verið orsakavaldur ónæmissvörunar sem komu fram við "ónæmisvaldandi" AAV ferjulotum. Þess vegna, ef leifar af lausu DNA var til staðar í veirusviflausninni af "ónæmisvaldandi" AAV8 ferjulotunum, ætti meðfædda ónæmissvörun að veikjast með DNase. Til að prófa þessa tilgátu voru "ónæmisvaldandi" AAV8 og AAV2 vektorlotur formeðhöndlaðar með DNase I (100 µg/ml) í 30 mínútur fyrir AAV örvun. Til að útiloka ósértæk áhrif DNase meðferðar á pDCs eða AAV agnirnar, í AAV örvunum eingöngu, voru ferjurnar látnar fara í DNasemok meðferð fyrir pDC örvun. Í þessum sýndarmeðferðum án DNase voru AAV agnirnar ræktaðar við 37 gráður í eins DNase meltingarmiðli í sama tíma og AAV sem fengu DNase. Tíu, pDCs voru sáð og örvuð með DNase formeðhöndluðum eða sýndarmeðhöndluðum „ónæmisvaldandi“ AAV vektorlotum (MOI: 1:1× 106 vg). pDC sem voru ræktuð með DNase eingöngu eða sýndarmeðhöndluð með burðarefni þjónuðu sem viðmið. Athyglisvert er að DNase meðferð á „ónæmisvaldandi“ AAV8 og AAV2 vektorlotum dró úr viðbrögðum frumufjölgunar (mynd 4a) og annað hvort afnumin algjörlega (AAV8 lotur A-HEK-2 og A-Sf9-1; AAV2 lotur B-Sf9-1 og B-Sf9-2) eða verulega minnkað (AAV8 lotur A-HEK-1 og A-HEK-3) losun IP{{40} }, MIP-1, TNF- og IFN- eftir AAV örvun (Mynd 4b,c). Til að staðfesta að DNasaáhrifin sem komu fram væri í raun af völdum meltingar á utanveiru DNA en ekki áhrifum DNasans á heilleika ferjunnar, könnuðum við hvort DNase meðferð á AAV vektorlotum hefði áhrif á flutningsgetu AAV. Þar sem AAV umsóknin leiddi ekki til neinnar greinanlegrar pDC flutnings, voru HEK frumur notaðar fyrir þessar prófanir þar sem HEK frumur eru vel þekkt frumulíkan til að greina flutningsvirkni við AAV flutning19. Við örvuðum HEK293T frumur með DNase-meðhöndluðum og sýndarmeðhöndluðum AAV8 og AAV2 vektorlotum (MOI: 1:8× 104 vg) og metum flutningsskilvirkni með flúrljómunarsmásjárskoðun 3 dögum eftir ferjurásetningu. Eins og lýst er sýndu AAV2 vektorar meiri flutningsgetu samanborið við AAV8 vektora. Mikilvægt er, þar að auki, formeðferð með DNase dró hvorki úr flutningsvirkni í HEK-afleiddum né í Sf9-frumum afleiddum AAV8 og AAV2 vektorlotum (mynd S5a,b). Þessar niðurstöður gefa frekari vísbendingar um að áhrif DNase á ónæmisvaldandi eiginleika ferjulotanna séu vegna niðurbrots á DNA utan veiru. Þrátt fyrir að TLR9 mótlyfið H154 hafi í meginatriðum afnumið losun bólgueyðandi frumuefna fyrir allar fjórar ónæmisvaldandi AAV8 loturnar (mynd 3), gæti DNasa formeðferð einnig útrýmt bólgueyðandi frumueyðandi svörun fyrir AAV8 loturnar A-HEK{{75} } og A-Sf9-1, á meðan það fjarlægti það ekki alveg fyrir AAV8 lotur A-HEK-1 og A-HEK-3 (mynd 4). Til að kanna hvort aukinn DNasa meðferðartími gæti stöðvað þessa cýtókínsvörun, endurtókum við hermitilraunir pDCs eftir tífalda aukningu á DNase ræktunartíma viðkomandi lota (A-HEK-1 og A-HEK{{87} }). Við sáum að eftir DNase-meðferð á fernunum í 5 klst. minnkaði meðalstyrkur cýtókíns í floti AAV-örvuðu frumanna enn frekar og var ekki lengur marktækt frábrugðinn styrkur burðarefnis. Þetta svar mynstur gæti verið staðfest í þremur tilraunum, hver framkvæmd með frumum eins einstaks gjafa (mynd S6). Þetta bendir til þess að aðalorsök TLR9-háðs bólgueyðandi ónæmissvörunar í pDCs sé örugglega utanveiru DNA. Til að kanna hvort losun á DNA innan veiru eykur ónæmisörvandi virkni AAV-ferja, opnuðum við vísvitandi veiruhylkin í "ónæmisvaldandi" AAV8 lotunni A-HEK-1 með hitameðferð við 95 gráður í 10 mínútur . Hitameðhöndlaða vektorlotan var síðan notuð til að örva pDCs. Þrátt fyrir að enginn munur hafi verið á hvarfgjörnu frumufjölgun við AAV8 lotu A-HEK-1 örvun með og án hitameðferðar, var marktæk aukning á losun IP-10, MIP-1 , TNF- og IFN- í hitameðhöndluðu ástandi, sem gefur til kynna að losun hjúpaðs veiru-DNA í ferjusviflausninni geti stuðlað að framkalli ónæmissvörunar (mynd 5). Saman benda þessi gögn til þess að AAV vektorefnablöndur geti innihaldið DNA-mengun utan veiru sem geta kallað fram lotusértæk ónæmissvörun í pDCs. Þessum svörum er miðlað af TLR9 merkjum og hægt er að minnka/afnema þær með því að meðhöndla vektorloturnar með DNase.

Mynd 4. DNase formeðferð dregur úr ónæmissvörun sem framkallast af "ónæmisvaldandi" AAV8-CMV-eGFP og AAV2-CMV-eGFP vektorlotum. PDCs úr mönnum voru örvaðir með DNase-meðhöndluðum „ónæmisvaldandi“ AAV8 vektorlotum í 18 klst (MOI: 1:1× 106 vg). (a) Fullkomnar bjartar sviðsmyndir af hreinsuðum pDC örvuðum með "ónæmisvaldandi" AAV vektorlotum (efri mynd) og "ónæmisvaldandi" AAV vektorlotum sem voru formeðhöndlaðir með 1{{30}}0 ug/ml af DNasa I (neðri mynd). Kvarðastöngin er 500 μm. (b) Cýtókínlosun IP-10, MIP-1, TNF- og IFN- 2 af AAV8-örvuðum pDCs. (c) Cýtókín losun með AAV2-örvuðum pDCs. Þar sem í IFN- 2 mælingum (b og c) og TNF- mælingum (b), féllu sum gildi undir mælingarsviðinu, var fastanum 1 bætt við öll mæld IFN- 2 og TNF- gildi fyrir framsetning í hálflogaritmískri söguþræði. Sýnd eru meðaltöl og staðalfrávik. Tölfræðileg marktekt var ákvörðuð með einstefnu ANOVA og Holm–Sidak post hoc greiningu. P gildi: Minna en eða jafnt og 0,05: *; Minna en eða jafnt og 0,01: **; Minna en eða jafnt og 0,001: ***.

Könnunargreining á DNA-mengun utan veiru í AAV8-ferjurblöndum.

Til að framkvæma fyrstu könnunargreininguna á utanveiru DNA þáttunum í AAV vektorlotunum, er dæmigert "ónæmisvaldandi" (A-HEK-1) og "ónæmisvaldandi" (B-HEK-1) HEK frumuafleidd vektorlota var greind. Þessar lotur voru annaðhvort meðhöndlaðar með DNase í pDC miðli í 30 mínútur við 37 gráður eins og lýst er hér að ofan, eða voru meðhöndlaðir með gervi og ofsíunar með því að nota 100 kDa afskurðarsíubúnað, eða voru aðeins meðhöndlaðir með líki (mynd S7a– g). Aðskilnaður og mat á hreinsuðu DNA í röð með Bioanalyzer LabChip leiddi í ljós sambærilegt magn af vektor DNA (mynd S7b–g) í meðhöndluðum og sýndarmeðhöndluðum sýnum úr hverri lotu sem staðfestir að hvorki ofursíun né DNase-meðferð hafi haft áhrif á DNA innihaldið. inni í hlífinni. Að auki sýndi það að aðeins „ónæmisvaldandi“ (mynd S7a–d) en ekki „ónæmisvaldandi“ vektorlotan (mynd S7a, e–g) innihélt viðbótar DNA sameindir á bilinu 100 til 450 bp (mynd S7c,d og h). Mikilvægt er að þessar viðbótar DNA sameindir gætu verið greind í spotta-meðhöndlaða sýninu og ofursíuðu sýninu en voru nánast fjarverandi í DNase-meðhöndlaða sýninu (mynd S7a-d). Þetta gefur til kynna að þessar DNA sameindir tákna utan veiru DNA mengunarefni sem hægt er að brjóta niður af DNasa en ekki er hægt að fjarlægja þær úr vektorsviflausninni með ofursíun. Fjármögnun þess að þessi aðskotaefni væri aðeins hægt að greina í „ónæmisvaldandi“ en ekki í „ónæmisvaldandi“ ferjulotunni sannar að tilvist þessara utanveiru DNA sameinda er lotasértæk og gæti auk þess bent til þess að þessar sameindir örva eða stuðla að að ónæmisörvandi eiginleikum ferjunnar. Til að meta hugsanlega uppsprettu mengandi DNA í „ónæmisvaldandi“ (A-HEK-1) og „óónnæmisvaldandi“ (B-HEK-1) hellingum af magnbundinni (q)PCR greiningu á HEK frumu DNA, plasmíð DNA og AAV vektor DNA var gert. Sniðmát DNA úr DNase-meðhöndluðu, sýndarmeðhöndluðu og ofsíuðu og aðeins sýndarmeðhöndluðu sýni úr hverri lotu var notað til mögnunar á Alu endurtekningu, kjarnaerfðamengi fjölritaðs NPIP gens og hvatbera 16S rRNA genaröðum (mt16S) af HEK frumu uppruna , til mögnunar á AAV8 hvolfi endanlegu endurteknu magni (ITR2; vektor og transgen plasmíð DNA uppruna), og til mögnunar á amplicon fyrir blah (ampicillin ónæmi) genið (Amp; plasmíð DNA uppruna) (tafla S4). Samanburður á hlutföllum ΔCt-gilda HEK frumu DNA-sértæks amplicon á móti ITR2 amplicon (þ.e. Alu vs. ITR2, NPIP vs. ITR2 og mt16S vs. ITR2) og plasmíð DNA-sértæku amplicon á móti ITR2 amplicon (Amp) á móti ITR2), hvort um sig gefur til kynna að loturnar tvær innihalda hverfandi magn af HEK frumu kjarna- og hvatbera DNA. Aftur á móti leiddi greiningin í ljós ágætis magn af plasmíði DNA í bæði „ónæmisvaldandi“ og „ónæmisvaldandi“ vektorlotunni (um 1/32 og 1/50, í sömu röð, hvað varðar fjölda eintaka miðað við AAV DNA), hlutfall sem er vel innan marka gilda sem greint er frá fyrir aðra AAV vektora12 (mynd S7). Engu að síður var enginn augljós munur á hlutfallslegu hlutfalli vektor DNA til plasmíðs og HEK frumu DNA milli DNase-meðhöndlaðra og spottameðhöndlaðra eða ofursíuðra og spottameðhöndlaðra sýna af báðum vektorlotum (mynd S8). Þetta gæti bent til þess að ópakkað mengunar-DNA sé svipað í samsetningu markraðar og hins pakkaða DNA. Hins vegar er takmörkun á qPCR greiningu stærð mengunar DNA (100–450 bp) sem mun innihalda ágætis brot af brotum með ófullkominni markröð.

Mynd 5. Losun á DNA innan veiru með hitameðhöndlun á vigrum eykur bólgueyðandi cýtókínviðbrögð í pDC. Cýtókínlosun IP-10, MIP-1, TNF- og IFN- 2 af pDCs 18 klst. eftir örvun með hitameðhöndluðum AAV8 lotu A-HEK-1 (MOI: 1:1× 106 vg). Láréttar línur gefa til kynna meðaltal og staðalfrávik. Tölfræðilega marktækur munur á cýtókínviðbrögðum framkölluðum af hitameðhöndluðum og ómeðhöndluðum ferjum var ákvarðaður með því að nota Student t-prófið. P gildi: Minna en eða jafnt og 0.01: **; Minna en eða jafnt og 0,001: ***.

Umræða

AAV ferjur eru eitt af efnilegustu verkfærunum í genameðferð. Hins vegar, uppsöfnun sönnunargagna ögrar þeirri skoðun að ónæmingargeta AAV sé hverfandi5. Í ljósi þessa hefur það orðið sífellt mikilvægara að skilja betur hvernig ónæmissvörun við AAV eiga sér stað. Í þessari rannsókn sýnum við fram á að (1) AAV8 og AAV2 framkalla lotssértæk meðfædd ónæmissvörun í pDCs úr mönnum sem eru hvorki sértæk fyrir hylki/vg hlutfallið né framleiðsluvettvanginn né framleiðanda/hreinsunaraðferðina; (2) meðfædd ónæmissvörun í pDCs eru háð TLR9 merkjum og hægt er að draga úr þeim með formeðferð með DNase; (3) DNasameðferð hefur ekki áhrif á heilleika ferjuagnarinnar þar sem hún dregur ekki úr flutningshraða AAV8 og AAV2 ferjulota í HEK293T frumum; og (4) AAV vektorlotur geta falið í sér utanveiru DNA sameindir sem hægt er að fjarlægja með því að meðhöndla ferjulotuna með DNasa. Þetta bendir til þess að bæði HEK- og Sf9-frumu-afleidd AAV efnablöndur geti innihaldið aukaveiru DNA óhreinindi sem örva meðfædd ónæmissvörun. Í nýlegri rannsókn var gerð samanburðargreining með því að nota AAV ferjur frá mismunandi hýsilfrumutegundum (HEK frumur og Sf9 frumur)11. Höfundarnir komust að því að HEK- og Sf9-afleiddir vektorar eru ólíkir hvað varðar PTM og leifar hýsilfrumupróteinóhreininda í öllum AAV sermisgerðum og framleiðendum sem þeir prófuðu. Ennfremur greindu þeir cýtókínsvörun frumtrefja úr mönnum við AAV flutning og komust að því að HEK- og Sf9-afleiddir ferjur gætu verið mismunandi hvað varðar ónæmisvaldandi eiginleika þeirra. Í rannsókn okkar bárum við einnig saman þessi tvö helstu framleiðslukerfi með því að nota mismunandi lotur af sömu AAV smíði frá mismunandi framleiðendum og tvær mismunandi sermisgerðir. Hins vegar voru ónæmissvörun af völdum vektor sem við sáum í pDC líkani okkar manna ekki sérstaklega tengd tilteknu framleiðslukerfi, framleiðanda eða sermisgerð, heldur voru þau lotusértæk. Fyrri forklínískar og klínískar rannsóknir á genameðferð í sjónhimnu hafa greint frá því að ónæmissvörun við AAV ferjurum, eins og augnbólgu eða íferð ónæmisfrumna, gæti haft áhrif á mismun á hylki/vg hlutföllum18 eða skammtamismun5. Timmers o.fl.18 sýndu fram á að með því að fjarlægja tóm AAV hylki úr veirudreyfinu dró úr bólgu og bætti veiruflutning í forklínískri rannsókn með prímötum sem ekki voru af mönnum. Samt sýndu niðurstöður okkar að hækkuð hylki/vg hlutföll voru til staðar í bæði „ónæmisvaldandi“ og „ónæmisvaldandi“ AAV ferjulotum, sem þýðir að meiri fjöldi hylkja (tóma hylkja) í veiru dreifunni var ekki ábyrg fyrir framkallun vektorlotssértæku ónæmissvörunin í pDC líkani okkar manna. Fyrir utan það höfum við áður sýnt að AAV8 framkallar ónæmissvörun á skammtaháðan hátt hjá prímötum sem ekki eru menn6,8. Hins vegar var það ekki nóg að auka skammtinn af "óónnæmisvaldandi" AAV ferjunum í þessari rannsókn til að koma af stað ónæmissvörun í pDCs úr mönnum. Þess vegna, til að skilja orsök mismunar á ónæmisvaldandi eiginleikum fernanna, könnuðum við gangverkið sem tekur þátt í viðurkenningu á "ónæmisvaldandi" AAV lotunum. Notkun in vitro ónæmishæfra frumumódela hefur gert vísindamönnum kleift að rannsaka hlutverk TLR ferla í meðfæddri ónæmissvörun sem myndast af AAV ferjurum með nákvæmari hætti9,10. Zhu o.fl.9frst lýstu því að pDCs, en ekki hefðbundin DCs eða non-pDCs, losa mikið magn af tegund I IFN og bólgueyðandi frumudrepum til að bregðast við AAV örvun og sýndu þátttöku TLR9 ferilsins í greiningu AAV8 og AAV2 með því að nota mús pDCs. Höfundarnir sáu einnig að AAV2 framkallaði TLR9-háð ónæmissvörun í pDCs úr mönnum. Í rannsókn okkar, með notkun eins af sértækustu TLR9 mótlyfjunum, H1549,21–24, höfum við óbeint sýnt fram á að ekki aðeins AAV2, heldur einnig AAV8 vektorar framkalla TLR9-háð meðfædd ónæmissvörun í pDCs úr mönnum, en á mjög sérstakan hátt. Þar sem TLR9 er DNA viðtaki benti þetta til þess að ónæmissvörun við „ónæmisvaldandi“ AAV vektorlotum væri framkallað af DNA hlutum. Hins vegar, þó að ddPCR mælingar okkar hafi staðfest að sömu pakkuðu DNA þættirnir væru til staðar í bæði „ónæmisvaldandi“ og „óónnæmisvaldandi“ vektorlotum, kveiktu „ónæmisvaldandi“ loturnar ekki ónæmissvörun í pDCs. Að auki dró DNase meðferð annaðhvort úr eða afnam ónæmisörvandi eiginleika hinna „ónæmisvalda“ AAV-ferjulota, en minnkaði ekki flutningsgetu þessara ferja í HEK-frumum, sem bendir til þess að DNase-meðferð á AAV hafi miðað við óinnkaplað utanveiru-DNA í vektor sviflausn en hafði ekki áhrif á heilleika genamengis ferjunnar innan ósnortna hylkisins. Þetta var enn frekar staðfest með samanburðar DNA greiningum á dæmigerðum DNase-meðhöndluðum og sýndarmeðhöndluðum "ónæmisvaldandi" og "óónæmisvaldandi" vektorlotum.

cistanche tubulosa-bæta ónæmiskerfið

Smelltu hér til að skoða Cistanche Enhance Immunity vörur

【Biðja um meira】 Netfang:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Samanlagt benda allar þessar tilraunir til þess að ónæmissvörun við "ónæmisvaldandi" vektorlotum í pDCs hafi ekki verið skipulögð af DNA sem er í AAV ögnum (þ.e. erfðamengi ferju eða hugsanlegum DNA óhreinindum pakkað í AAV hylkin) heldur með aðgengilegu utanveiru DNA. innihaldsefni sem eru í veirusviflausnum (þ.e. DNA utan eða óvarið af veiruhylki). Við tókum einnig eftir því að þegar DNA sem er í veiruhylkinu í "ónæmisvaldandi" vektorlotu var útsett fyrir frumunum með hitameðhöndlun á ferjunni var aukning á ónæmissvöruninni. Ekki er ljóst hvort aukningin á ónæmisörvandi virkni eftir að hylkin voru opnuð stafaði af einþátta DNA ferjunnar eða vegna hugsanlegra óhreininda sem pakkað er í AAV hylkin eins og kjarnsýrur í hýsilfrumum, leifar af hjálpar-DNA röðum, hryggjaröð. brotum pakkað ásamt snældunni eða öfug frumun frá ITR sem leiðir til lítilla hryggjarhluta sem pakkað er inn í AAV12,25. Nákvæmur gangur pDC upptöku DNA utan veiru er enn óþekktur. Svörun pDCs fyrir CpG fákirni sýnir að pDCs geta brugðist við lausu DNA26. Þetta bendir til þess að ónæmissvörun í pDCs gæti komið af stað með upptöku á frjálsu mengandi DNA sem er í vektorsviflausninni. Að auki hefur verið sýnt fram á að pDCs geta tekið upp AAV ferjur27 sem bendir til annars að hugsanlegt kappsíðbundið DNA gæti verið flutt inn í frumuna meðan á upptöku AAV agna stendur. Tilvist utanveiru-DNA-mengunar í AAV-ferjublöndum gæti annað hvort verið eðlislægur eiginleiki viðkomandi ferjulotu sem stafar af framleiðslu og hreinsunarferli fernanna, eða það gæti stafað af losun hjúpaðs DNA vegna óviðeigandi geymsluaðstæðna . Allar vektorlotur sem skoðaðar voru í þessum tilraunum voru fengnar á sama tímabili (5 af 8 AAV8 vektorlotum sem skoðaðar voru, þar af tveir „ónæmisvaldandi“ (A-HEK-2; A-HEK-3) og þrír voru "ekki ónæmisvaldandi" (A-Sf9-2; B-Sf9-1; B-Sf9-2) voru meira að segja framleidd samhliða sérstaklega fyrir þessa rannsókn), loturnar frá hver framleiðandi var sendur í sömu flutningskössum og við móttöku voru allar lotur geymdar hlið við hlið í sömu skúffu í hitaviðvörunarvarnum −80 gráðu frysti áður en skammtar af öllum lotum voru þiðnar samtímis og settar á pDCs. í tilraunum hlið við hlið. Þetta bendir eindregið til þess að AAV framleiðslu- og hreinsunarferlið, frekar en óviðeigandi geymsla, hafi verið ábyrg fyrir muninum á utanveiru DNA innihaldi og ónæmisörvandi eiginleikum þessara lota. Áður fyrr voru lotur af klínískum AAV-ferjurum sem framleiddar voru fyrir genameðferð (alipogene tiparvovec, Glybera) ekki lengur leyfðar vegna mikils magns óhreininda, þar með talið hugsanlega ónæmisvaldandi leifar hýsilfrumu DNA28. Fjarlæging á DNA óhreinindum úr veiru sviflausnum fer venjulega fram í framleiðsluferlinu. Hér er Benzonase29 eða DNase30 meðferð beitt reglulega til að eyða DNA leifum úr loka veiru sviflausninni. Þessi meðferð, fer eftir samskiptareglum, varir á milli 30 mín og 3 klst og síðan er ensímið óvirkt af efnum eins og sesíumklóríðsöltum30. Í tilraunum okkar reyndust fjórar af fimm AAV8 lotum sem fengnar voru frá Veiru vektor Core Facility við háskólann í Iowa og báðar AAV2 vektorloturnar frá Virovek vera ónæmisvaldandi í pDCs. Eins og lýst er í hlutanum „Efni og aðferðir“, felur hreinsunarferlið á vigrulotunum frá báðum þessum framleiðendum í sér nokkur hreinsunarþrep, sem sum hver eru mjög frábrugðin hvert öðru. Hreinsunarferlið í kjarnaaðstöðunni í Iowa felur því í sér Turbonuclease-meðferð, fylgt eftir með jodixanól halli útskilvindu, anjónaskiptasúluskiljun, flutter dauðhreinsun og stuðpúðaskipti með miðflóttasíur. Aftur á móti beitir Virovek bensónasameðferð, örskilvindu í CsCl fylgt eftir með afsöltun og dauðhreinsun með síu. Hreinsunarferlið Vigene, aftur á móti, felur ekki í sér DNase meðferð, en, eins og er notað af Core Facility í Iowa, felur það í sér jodixanol halla útskilvindu. Það kemur hins vegar á óvart að enginn af vigrulotunum þremur sem fengnar eru frá Vigene (AAV8: C-HEK-1; AAV2: C-HEK-1 og 2) framkallaði ónæmissvörun í pDCs, sem bendir til þess að „ónæmisvaldandi " Einnig er hægt að búa til vektorlotur með framleiðsluferlum sem fela ekki í sér DNase meðferð.

Kostir cistanche viðbót - hvernig á að styrkja ónæmiskerfið

Á heildina litið gera hin að hluta til svipuðu og að hluta til ólík hreinsunarþrep sem framleiðendurnir þrír nota það erfitt að tengja ónæmisvaldandi eiginleika fernanna sem sjást í pDC við eitt skref í framleiðsluferlinu. Í klínískum rannsóknum er notaður vigur af gæða framleiðsluhætti (GMP) sem eru háðir ströngu gæðaeftirliti. Enginn af ferjurnar frá framleiðendunum þremur sem notaðar eru í þessari rannsókn eru af góðri rannsóknarstofuvenju (GLP) og geta því verið af lægri hreinleika en ferjur af klínískri einkunn. Þess vegna er mikilvægt að viðurkenna að GMP ferjur sem notaðar eru í klínískum rannsóknum á mönnum geta sýnt mismuninn sem við sáum í þessari rannsókn eða ekki og að mikilvægi niðurstaðna okkar fyrir klíníska notkun genameðferða er ekki ljóst. Hins vegar, í okkar eigin reynslu, getur töluverður lotu-sértækur munur á styrk mengandi innihaldsefna eins og hýsilfrumupróteina komið fram jafnvel með GMP-gráðu ferjum, og jafnvel í GMP-gráðu ferjum eru engar samræmdar forskriftir um hvaða magn eru viðunandi 5. Sameiginlega er það lykilatriði að bæta framleiðsluferli AAV-ferja til að forðast tilvist óhreinindaleifa í veirusviflausnum til að lágmarka möguleika á óviljandi ónæmissvörun. Að lokum sýndum við fram á að aukaveiru DNA óhreinindi geta haft áhrif á ónæmisvaldandi eiginleika AAV ferja í pDCs úr mönnum. Frekari rannsókna er krafist til að kanna hvaða áhrif þessar niðurstöður hafa á öryggi AAV-miðlaðrar genameðferðar hjá dýralíkönum eða mönnum.

Heimildir

1. Gaj, T., Epstein, BE & Schafer, DV Genome engineering using Adeno-associated virus: Basic and clinical research applications. Mol. Ter. 24, 458–464 (2016).

2. Garita-Hernandez, M. o.fl. AAV-miðluð genasending til þrívíddar lífrænna sjónhimnu sem fengnar eru úr fjölhæfum stofnfrumum af mönnum. Alþj. J. Mol. Sci. 21, 994 (2020).

3. Russell, S. o.fl. Verkun og öryggi voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) hjá sjúklingum með RPE65-miðlaðan arfgengan sjónhimnu: Slembiröðuð, stýrð, opin, 3. stigs rannsókn. Lancet 390, 849–860 (2017).

4. Hann, X., Urip, BA, Zhang, Z., Ngan, CC & Feng, B. Þróun AAV-afgreidd lækningalyf í átt að fullkomnum lækningum. J. Mol. Med. 99, 1–25. https://doi.org/10.1007/s00109-020-02034-2 (2021).

5. Bucher, K., Rodríguez-Bocanegra, E., Dauletbekov, D. & Fischer, MD Ónæmissvörun við genameðferð í sjónhimnu með því að nota adeno tengda veiruferjur - Áhrif á árangur og öryggi meðferðar. Prog. Retin. Eye Res. 83, 100915 (2020).

6. Reichel, FF o.fl. AAV8 getur framkallað meðfædd og aðlögunarhæf ónæmissvörun í auga prímata. Mol. Ter. 25, 2648–2660 (2017).

7. Boyd, RF o.fl. Minnkuð sjónhimnuflutningur og aukin ónæmisvaldandi ónæmisvaldandi genamyndun með gjöf rAAV í glerhlaup eftir aftari glerungseyðingu hjá hundum. Gene Ter. 23, 548–556 (2016).

8. Rodríguez-Bocanegra, E. o.fl. Langtímamat á of-reffective brennipunktum í sjónhimnu eftir afhendingu á adeno tengdum veiru undir sjónhimnu í prímötum sem ekki eru úr mönnum. Þýðing. Vis. Sci. Tækni. 10, 15 (2021).

9. Zhu, J., Huang, X. & Yang, Y. Te TLR9-MyD88 ferillinn er mikilvægur fyrir aðlögunarsvörun ónæmissvörunar við genameðferðarferjurum sem tengjast veiru í músum. J. Clin. Rannsaka. 119, 2388–2398 (2009).

10. Hösel, M. o.fl. Toll-eins viðtaka 2-miðlaði meðfædda ónæmissvörun í lifrarfrumum sem ekki eru parenchymal manneskjur gagnvart adeno tengdum veiruferjum. Hepatology 55, 287–297 (2012).

11. Rumachik, NG o.fl. Aðferðir skipta máli: Staðlaðir framleiðsluvettvangar fyrir raðbrigða AAV framleiða efnafræðilega og virkni aðgreinda vektora. Mol. Ter. Aðferðir Clin. Dev. 18, 98–118 (2020).

12. Wright, JF Vörutengd óhreinindi í raðbrigðum AAV ferjurum af klínískri gráðu: Einkenni og áhættumat. Biomedicines 2, 80–97 (2014).

13. Clément, N. & Grieger, JC Framleiðsla á raðbrigðum adeno-tengdum veiruferjurum fyrir klínískar rannsóknir. Mol. Ter. Aðferðir Clin. Dev. 3, 16002 (2016).

14. Penaud-Budloo, M., François, A., Clément, N. & Ayuso, E. Lyfjafræði raðbrigða adeno-tengdra veira framleiðslu. Mol. Ter. Aðferðir Clin. Dev. 8, 166–180 (2018).

15. Ye, Y., Gaugler, B., Mohty, M. & Malard, F. Plasmacytoid dendritic frumulíffræði og hlutverk þess í ónæmismiðluðum sjúkdómum. Clin. Þýðing. Immunol. 9, e1139 (2020).

16. Fischer, MD o.fl. Verkun og öryggi genameðferðar í sjónhimnu með því að nota adeno-tengda veiruferjur fyrir sjúklinga með kóroideremia: Slembiraðað klínísk rannsókn. JAMA Oftalmól. 137, 1247–1254 (2019).

17. Weleber, RG o.fl. Niðurstöður 2 árum eftir genameðferð fyrir RPE65-vant Leber meðfæddan amaurosis og alvarlega sjónhimnuskekkju snemma í æsku. Augnlækningar 123, 1606–1620 (2016).

18. Timmers, AM o.fl. Bólgueyðandi svörun í augum við inndælingu í glerhlaup á adenó-tengdum veiruferjurum: Hlutfallslegt framlag erfðamengis og capsíðs. Humm. Gene Ter. 31, 80–89 (2020).

19. Ran, G. o.fl. Staðstýrð stökkbreyting bætir flutningsskilvirkni raðbrigða AAV-ferja sem eru afleidd af kapsíðsafni. Mol. Ter. Aðferðir Clin. Dev. 17, 545–555 (2020).

20. Ellis, BL o.fl. Könnun á ex vivo/in vitro flutningsskilvirkni frumfrumna og frumulína spendýra með níu náttúrulegum adeno-tengdum vírusum (AAV1-9) og einni mótaða adeno-tengda vírussermisgerð. Virol. J. 10, 1–10 (2013).

21. Yamada, H. o.fl. Áhrif bælandi DNA á CpG-framkallaða ónæmisvirkjun. J. Immunol. 169, 5590–5594 (2002).

22. Zhang, P. o.fl. Toll-eins viðtaka 9 mótlyf bælir húmorsónæmi í tilrauna sjálfsofnæmis vöðvabólgu. Mol. Immunol. 94, 200–208 (2018).

23. Chan, YK o.fl. Verkfæra adeno-tengda veiruferjur til að forðast meðfædd ónæmis- og bólgusvörun. Sci. Þýðing. Med. 13, eabd3438 (2021).

24. Bayik, D., Gursel, I. & Klinman, DM Uppbygging, vélbúnaður og lækningalegt gagnsemi ónæmisbælandi fákjarna. Pharmacol. Res. 105, 216–225 (2016).

25. Brimble, MA o.fl. 547. AAV efnablöndur innihalda mengun frá DNA röðum í framleiðslu plasmíðum beint utan ITR. Mol. Ter. 24, S218–S219 (2016).

26. Latz, E. o.fl. TLR9 merki eftir flutning frá ER til CpG DNA í leysisóminu. Nat. Immunol. 5, 190–198 (2004).

27. Veron, P. o.fl. Helstu undirmengi dendritic frumna úr mönnum eru umbreytt á skilvirkan hátt með sjálfsuppfyllandi adenó-tengdum veiruferjum 1 og 2. J. Virol. 81, 5385–5394 (2007).

28. Námsmatsskýrsla: Glybera. https://www.ema.europa.eu/en/documents/assessment-report/glybera-epar-public-assessment report_en.pdf. Skoðað 3. mars 2022 (2012)

29. Arden, E. & Metzger, J. Ódýr, sermisgerð óháð siðareglur fyrir innfædda og lífverkfræðilega raðbrigða adeno-tengda vírushreinsun. J. Biol. Aðferðir 3, e38 (2016).

30. Grieger, JC, Choi, VW & Samulski, RJ Framleiðsla og lýsing á adeno-tengdum veiruferjum. Nat. Protoc. 1, 1412–1428 (2006).

31. Kimura, T. o.fl. Framleiðsla á adenótengdum veiruferjum fyrir in vitro og in vivo notkun. Sci. Rep. 9, 13601 (2019).

32. Ayuso, E. o.fl. Mikill hreinleiki AAV vektor leiðir til sermisgerðar- og vefjaóháðrar aukningar á flutningsskilvirkni. Gene Ter. 17, 503–510 (2010).