Mat á inntöku kalsíumalginataloftgeli á breytingum á örveru í þörmum og lifrar- og nýrnastarfsemi Wistar rotta

Tengiliður:ali.ma@wecistanche.com

Mohammad AA Al-Najjar o.fl

Ágrip

Í þessari rannsókn er metið áhrif kalsíumalgínats aerogel sem hugsanlegs lyfjabera, á lifur ognýrnastarfsemi, og á örveru í þörmum Wistar rotta. Rannsóknirnar algínat loftgel var útbúið í formi nanóagna með því að nota jet cutting tækni og þær einkenndust með tilliti til sérstakrar yfirborðsflatar, ytri formgerðar og kornastærðardreifingar. Fyrir in vivo rannsóknina var kalsíumalgínat aerogel gefið til inntöku og lifur ognýrnastarfsemivoru prófuð í eina viku og í fjórar vikur í tveimur aðskildum rannsóknum. Í skammtímarannsókninni in vivo var saursýnum safnað til útdráttar bakteríu-DNA og fylgt eftir með 16S rRNA genagreiningu til að greina breytingar á örveru í þörmum. Niðurstöður sýndu að tilbúna algínat-loftgelið hefur að meðaltali BET-sérstakt yfirborðsflatarmál um 540 m2/g, með holrúmmál 7,4 cc/g og holubreidd 30–50 nm. In vivo rannsóknin leiddi í ljós að magn þess sem rannsakað varnýruog lifrarensím fóru ekki yfir hæsta gildi eðlilegra marka. Rannsóknin á örveru í þörmum sýndi mismunandi mynstur; ákveðnum hópum baktería, eins og Clostridia og Bacteriodia, fjölgaði á meðanloftgellurmeðferð og hélt áfram að aukast eftir að loftgelið var hætt. Á meðan aðrir hópar eins og Erysipelotrichia og Candidatus Sacha bakteríur jukust á meðanloftgellurmeðferð og minnkaði síðan aftur eftir einn mánuð. Meðlimir Bacilli bekkjarins sýndu einstaka þróun, það er, eftir að hafa verið algengasti hópurinn (63 prósent) á tímanum 0, minnkaði hlutfallslegt magn þeirra verulega þar til það náði < 5="" prósent;="" sem="" var="" raunin="" jafnvel="" eftir="" að="" úðameðferðinni="" var="">

Cistanchetubulosa kemur í veg fyrirnýrusjúkdómur, aukaverkanir, smellur.

Kynning

AerogelsHugtök komu fram í fyrsta skipti árið 1931 af Samuel Kistler, sem skilgreindi þau sem efnin sem halda svitahola og netbyggingu ósnortinni við að skipta um svitaholuvökva með gasi [1]. Eftir 60 ára uppgötvun þeirra, lífrænloftgellurvoru lagðar til fyrir lífeðlisfræði og lyfjagjöf vegna stórs innra yfirborðs þeirra og opinnar svitaholabyggingar [2]. Framúrskarandi eiginleikar þessa efnisflokks leyfa ekki bara að auka hleðsluskilvirkni heldur einnig að bæta aðgengi, stöðugleika og losunarhvarfafræði hlaðna sameindanna.

Rannsóknir áloftgellurfyrir lyfjagjöf til inntöku sem upphaflega var lögð áhersla á notkun kísilsloftgellurvegna sveigjanlegrar og þekktrar sol-gel efnafræði þeirra, sem og möguleika á afleiðumyndun [3]. Engu að síður veldur notkun kísilloftgella í lyfjablöndur sem eru hönnuð til inntöku enn ákveðnar áhyggjur vegna takmarkaðs lífbrjótanleika þeirra. Þess vegna skapast frekari þörf fyrir að þróa loftgel burðarefni sem er bæði lífsamrýmanlegt og niðurbrjótanlegt. Þetta gæti verið mögulegt með því að nota náttúruleg lífræn efni eða lífbrjótanlegar fjölliður, eins og algínat [4] hýalúrónsýru [5], kítósan, sellulósa [6] og prótein [7].

Alginat (Alg), unnið úr brúnþörungum, er línuleg samfjölliða sem samanstendur af ß-1,4-D-mannúrónsýru og -L-gúlúrónsýru einliðum, sem eru á milli einsleitra eða misleitra blokklíkra mynstra. . Algínöt hafa verið notuð í matvæla- og lyfjaiðnaði vegna þess að þau eru ekki eitruð, ódýr, niðurbrjótanleg og lífsamrýmanleg [8, 9]. Fjölgildar katjónir, eins og Ca2 plús, Ba2 plús eða Sr2 plús, geta framkallað jónandi krosstengingu Alg, umbreytt því úr leysanlegu í óleysanlegt (gel) form.

Alg hefur verið mikið notað í matvæli og sem lyfjaaukefni, svo sem hleypiefni og töfluupplausnarefni [10, 11]. Það hefur einnig verið notað í lífeðlisfræðilegum forritum, þar á meðal lyfjagjöf og vefjaverkfræði [12]. Eins og aðrar ætar matartrefjar eru Alg og fáliðuafleiður þess ónæmar fyrir meltingu með innrænum ensímum manna. Hins vegar er hægt að melta það verulega af örveru í þörmum manna [13]. Þrátt fyrir mikilvægi þess er lítið vitað um örveru í þörmum sem er ábyrg fyrir niðurbroti Alg.

Matvælaöryggisstofnun Evrópu (EFSA) hefur lýst yfir öryggi algínsýru og salta hennar, sem og gerjunarafurða þeirra. In vivo prófanir á frásogi og útskilnaði vatnslausna og sviflausna af algínsýru og söltum hennar hjá dýrum sýndu vanhæfni þeirra til að frásogast eða umbrotna af ensímum sem eru til staðar í meltingarvegi, óháð því formi sem notað er við gjöf. Hins vegar myndu þau brotna niður að hluta til við gerjun á meðan þau fara í gegnum þörmum vegna virkni loftfirrðrar örveru í þörmum, sem veldur stækkandi hálsi sem EFSA taldi aðlögunarferli sem tengist stórum skömmtum sem prófaðir voru sem matvælaaukefni [14] . Engu að síður hefur engin fyrri rannsókn in vivo kannað áhrif kalsíumalgínats (Ca-Alg) í formi loftgelis álifur, nýru,eða bakteríusamfélagið í þörmunum.

Örverur í þörmum eru ómissandi þáttur í meltingarfærum mannsins, þar sem þær hjálpa til við niðurbrot fæðu sem tekin er inn, sérstaklega þær sem mannslíkaminn hefur ekki nauðsynleg ensím fyrir [15, 16]. Örverur í þörmum geta einnig hindrað blómgun sjúkdómsvaldandi örvera með því að keppa við þær um auðlindir næringarefnanna eða með því að framleiða efnafræðileg efni til að hindra vöxt þeirra. Hins vegar hefur verið sýnt fram á að niðurbrot meltanlegra trefja sem tekin eru inn, eins og Alg, á sér aðallega stað af gerjuðum bakteríum í ristli [17]. Afurðir þessa ferlis eru stuttar fitusýrur (SCFA), sem eru gagnlegar fyrir ristilbólgu og virka sem krabbameinslyf. Brownlee o.fl. greint frá því að ræktun Alg og saurörflóru manna sýndi að mestu niðurbroti Alg fylgir breyting á örveru í þörmum. Einnig leiðir slík ræktun til framleiðslu á SCFA og gasi eftir 24 klukkustundir [17].

efni og aðferðir

Efni

Algínsýrunatríumsalt var útvegað af BASF, Þýskalandi. Kalsíumklóríð (CaCl2) var keypt frá Th. Geyer GmbH & Co. KG, Þýskalandi. Koldíoxíð (hreinleiki 99,5 prósent) var útvegað af Praxair (Þýskalandi), etanól 99,8 prósent var fengið frá Carl Roth (Þýskalandi). Öll efni voru notuð eins og þau voru móttekin. Notuð voru greiningarsett í atvinnuskyni til að mæla ALP og kreatínínsett voru keypt frá Biostsystems SA, Spáni. MO BIO'S PowerMax SoilDNA einangrunarsettið var keypt frá MO BIO Laboratories, Bandaríkjunum. Afjónað vatn var notað í gegnum rannsóknina.

Aðferðir

Undirbúningur loftgel agna.

Fyrsta skrefið við undirbúning loftgelsagnanna var að útbúa stofnlausnina; fyrir það var natríumalgínatdufti (Alg) bætt við eimað vatn í styrkleika 1% w/w og var haldið undir segulhræringu yfir nótt við stofuhita. Til að undirbúa hydrogel agnirnar, aðferðin sem lýst er af Preibisch o.fl. [18] var fylgt eftir með því að nota Jet Cutter Type S frá genia Lab, Braunschweig (Þýskalandi). Í þotuskurðarferlinu var algínatlausninni kastað í gegnum stút (350 μm í þvermál) með þrýstilofti (1–3 bör) til að mynda strók (massaflæðishraði 1 g/s). Strókurinn var skorinn í aðskildar agnir með snúningsskífu (40 vírar með 100 μm vírþvermál skurðardiska, strokkahlutfall 5). Eftir að hafa farið í gegnum skífuna féll fjölliðalausnin niður í hlaupabaðið með CaCl2 lausn upp á 5 g/L. Til að forðast þéttingu hlaupagnanna var rúmmál hlaupabaðsins að minnsta kosti fjórfalt heildarrúmmál unnu líffjölliðalausnarinnar og innihald baðanna var hrært með segulstöng (60 snúninga á mínútu). Aðskilnaðarfjarlægð milli stútsins og hlaupabaðsins var haldið við 50–70 cm. Eftir að hlaupagnunum var safnað saman var hræringunni haldið áfram í 60 mínútur til að tryggja fullkomna hlaup og forðast þéttingu. Hlaupaðar agnir voru síðan aðskildar frá hlaupabaðinu með síun og var haldið áfram til leysisskiptanna.

Leysiskiptaskipti (vatn í etanól) voru framkvæmd á söfnuðu ögnunum í skrefum (30,60, 90, 100 prósent v/v etanól). Til að tryggja fullkomið skipti var þéttleiki bleytivökvans eftir síðasta leysiskiptaþrep mældur með þéttleikamæli (DMA4500, Anton PaarCompany, Austurríki). Þéttleikinn var síðan endurreiknaður í etanólinnihald. Alcogel agnirnar sem mynduðust voru að lokum pakkaðar í síupappír og þurrkaðar með ofurkritískum CO2 í autoclave við stöðugt hitastig 50˚C og 120 bör þrýsting. Stöðugt flæði CO2 (20–80 g/mín.) var stillt þar til alger útdráttur af etanóli var lokið (2–4 klst.). Eftir það var hægt að draga úr þrýstingi á autoclave (1-3 bör/mín.). Þegar umhverfisþrýstingi var náð var autoclave opnaður og loftgel örkúlum af kalsíumalgínati (táknað sem Ca-Alg hér á eftir) var safnað saman og geymt í vel lokuðum ílátum við þurrar aðstæður.

Einkenni loftgel agna

tiltekin yfirborðsflatarmál agna í loftgeli voru mæld með lághita köfnunarefnisaðsog/-afsog (BET) (Quantachrome Nova 3000e, Odelzhausen, Þýskalandi og Micromeritics TriStar II 3020, Þýskalandi). Fyrir mælingar voru sýni þurrkuð í 20 undir lofttæmi (< 1="" mpa)="" at="">

Rannsókn á ytri formgerð tilbúnu loftgelsagnanna var gerð með skanna rafeindasmásjá (SEM) greiningu (Zeiss Supra VP55, Jena, Þýskalandi) við hröðunarspennu 3 kV og vinnufjarlægð 9.0– 9,4 mm. Sýni voru gullsputtuð (10nm þykkt) fyrir myndatöku til að lágmarka hleðslu og bæta birtuskil myndarinnar.

Kornastærðarmælingar voru gerðar þrisvar sinnum fyrir hvert sýni sem samanstóð af um það bil 10,000 ögnum. Kvikmyndagreining var framkvæmd með því að nota aCamsizer XT með X-Jet mát (Retsch GmbH, Þýskalandi) með loftþrýstingi við 50 kPa.

Rannsóknir á lifrar- og nýrnastarfsemi og örverurannsóknir í þörmum

Gerð var tilraunarannsókn á litlum fjölda dýra sem skipt var í mismunandi hópa til að ná yfir fjögur skammtastig af meðferðarefnum. Það var gert í stuttan tíma (1 viku) til að sjá hámarksskammt sem mögulegt er af Ca-Alg úðagelum sem hefur engin mikil áhrif á nýrna- eða lifrarstarfsemi og sýnir ekki merki um sjúkdóma eða dánartíðni. Skammtar voru vandlega valdir með hliðsjón af LD50 til inntöku af algínati (meira en 5,000 mg/kg líkamsþyngdar) [19]. Samt sem áður var hámarks mögulegur skammtur sem náðist með lágmarks æsingi hjá dýrum 2,000mg/kg líkamsþyngdar.

Í seinni hluta rannsóknarinnar voru dýrin útsett fyrir föstum skammti í tvær vikur. Varðandi aldurs- og þyngdarbreytingar og búskaparaðstæður meðan á þessari rannsókn stóð var fylgt leiðbeiningum Efnahags- og framfarastofnunarinnar (OECD) (kóði nr. 206). Allar tilraunareglur voru samþykktar af siðanefndinni (IRB, samþykkisnúmer: 2019-PHA-12, meðfylgjandi í S1 skrá) frá Applied Science Private University (ASU), Jórdaníu. Allir starfsmenn í dýrahúsinu á ASU eru vel þjálfaðir til að fylgjast með öllum breytingum sem gætu orðið á dýrinu vegna inngripsins. Sérstaklega fylgjast þeir með breytum eins og þyngdarbreytingum, óeðlilegri hegðun, úfnum feld, skerta hreyfigetu, líkamsstöðu eða tjáningu á sérstökum líkamsvökvamerkjum. Ef um er að ræða alvarlegar óeðlilegar breytingar á dýrastöðu er þeim heimilt að nota mannúðlega lokareglur sem eru samþykktar af siðanefnd ASU. Í lok tilraunanna voru rottur aflífaðar með blóðþurrð undir svæfingu með því að nota 2,5 prósent thiopental natríum (Abbott Laboratories, North Point, Hong Kong) við 20 mg/kg í bláæð.

Dýr

Í bæði skammtíma og langtíma in vivo rannsóknum voru tíu vikna gamlar, heilbrigðar Wistar rottur með meðalþyngd 240 ± 37 g geymdar við 21–23 ˚C hita og 35 prósent –70 prósent raka. í stýrðum herbergjum, með 12 klst. ljós-12 klst. myrkri hringrás. Rottur voru auðkenndar og settar hver fyrir sig í skýrum hliðum búr til að auðvelda athugun án þess að trufla hegðun þeirra. Viðarspænir voru notaðir sem rúmföt. Rottum var gefið fæði sem fæst í verslunum (Local Sup tang, Jórdanía) og ferskvatn var boðið frjálst.

Fjöldi rotta í hverjum hópi í mismunandi tilraunum var valinn í samræmi við áður birt verk (dæmi; [20–22]), og eftir ströngum reglum um „umönnun og notkun dýra“ á landsvísu og á alþjóðavettvangi, sem leggur áherslu á að lágmarka fjölda dýra sem notuð eru í rannsóknum. Þetta felur í sér, en takmarkast ekki við, „Animal Care and Use Program“ við háskólann í Kaliforníu, Berkeley (https://acuc.berkeley.edu/about.html), og norsku leiðbeiningarnar um dýranotkun (https:// www.forskningsetikk.no/en/guidelines/ science-and-technology/ethical-guidelines-for-the-use-of-animals-in-research/).

Pilot in vivo rannsókn (7 daga endurteknir skammtar)

Endurtekinn skammtur til inntöku í eina viku var gerður til að skilgreina hámarksskammt af úðagelum sem sýna fram á öryggi hjá Wistar rottum. Ca-Alg loftgel var gefið til inntöku í fjórum skammtastigum, 50, 100, 250 og 500 mg, sem samsvaraði meðalskammti upp á 200, 400.1000 og 2000 mg/kg (þyngd líkamsþyngdar), í sömu röð. Niðurstöðurnar voru bornar saman við tvo jákvæða samanburðarhópa sem fengu 50 og 500 mg af óspilltu natríumalgínati (Na-Alg) sem samsvaraði meðalskammtastigum 200 og 2000 mg/kg líkamsþyngdar, í sömu röð. Að lokum var öllum fyrri hópum Ca-Alg aerogel og Na-Alg meðferða vísað til samanburðarhóps (lyfleysu). Síðarnefndi hópurinn fékk fosfatjafna í skammti sem jafngildir hámarksskammti þegar það er gefið sem burðarkerfi fyrir prófunarefnin. Viðmiðunar- og meðferðarhópar fyrir tilraunarannsóknina samanstóð af 4 rottum/hópi (tvær kvendýr og tveir karldýr/hópur). Föst duft af Ca-Alg aerogel og Na-Alg var hvort um sig sviflausn í fosfatbuffi (pH 7,4) og blandað vel saman beint fyrir inntöku þar sem rotturnar neituðu að borða þær í þurru ástandi. Fyrir alla hópa var gjöf til rotta hafin á sama tíma á hverjum degi með inntöku.

Langtímarannsókn á útsetningu in vivo (15 daga rannsókn á endurteknum skömmtum)

Byggt á niðurstöðum úr fyrri kafla var skammturinn af 250 mg af Ca-Alg loftgeli valinn til að vera metinn frekar fyrir langtíma (15 daga) útsetningarrannsókn Wistar rottur sáust fyrir tafarlausar eða seinkar aukaverkanir á nýru og/eða lifur áhrif sem gætu komið fram þegar það verður fyrir Ca-Alg loftgeli eða þegar það verður fyrir Na-Alg. af. Fyrir hvert prófað efni voru notaðir þrír dýrahópar sem innihéldu samanburðarhóp, meðferð og gervihnattahóp. Samanburðarhópurinn samanstóð af 6 Wistar rottum/hópi (3 karldýr og 3 kvendýr), en meðferðar- og gervihnattahóparnir samanstóð af 10 Wistar rottum/hópi (5 karldýr og 5 kvendýr). Wistar rotturnar í meðferðarhópunum fengu dagskammtinn 250 mg af prófunarefnunum (Ca-Alg loftgel eða Na-Alg) í 15 daga og þeim var fórnað á degi 16. Meðan gervihnattahóparnir voru meðhöndlaðir í sama tíma eins og fyrir meðferðarhópana, en var frekar haldið undir eftirliti í 15 daga til viðbótar eftir meðferð og þeim var fórnað á 30. degi.

Þess má geta að ekki var hægt að gera tvær rannsóknir á Ca-Alg aerogel og Na-Alg samhliða. Af þessum sökum var ekki hentugt að nota einn samanburðarhóp fyrir báða. Þessir samanburðarhópar fengu fosfatjafna til inntöku í aðeins 15 daga og síðan var fylgst með þeim í 14 daga til viðbótar. Þar sem um skammtímatilraun var að ræða, var föstu duftinu af Ca-Alg aerogel og Na-Alg einnig dreift í fosfatbuffi (pH 7,4) og blandað vel saman beint fyrir inntöku. Fyrir alla hópa var gjöf til rotta hafin á sama tíma á hverjum degi með inntöku.

Klínísk og atferlisathugun

Í samræmi við viðmiðunarreglur OECD 407 var fylgst með dýrum daglega með tilliti til hvers kyns óeðlilegra klínískra einkenna eða breytinga á hegðun meðan á rannsóknartímabilinu stóð, með sérstakri athygli á fyrstu fjórum klukkustundum eftir gjöf prófunarefnisins. Dýr í gervihnatta- og samanburðarhópum voru fylgst frekar með í 15 daga til viðbótar án meðferðar. Gervihnattahópurinn gerir kleift að greina hvers kyns klínísk einkenni sem koma seint fram sem benda til áhrifa á lifur og/eða nýru með því að mæla alkalískan fosfatasa (ALP) og kreatínínmagn.

Lífefnafræði í sermi og saurgreiningar

Spánn. Blóðsýnunum var safnað úr sinus bláæðum Wistar rottnanna, sem síðan voru notaðar til að skipta seruminu upp. Þetta safnað sermi úr sýnunum var síðan flutt í sæfð Eppendorf glös og geymt í djúpfrysti til frekari prófunar á lífefnafræðilegum breytum. Saursýnum var einnig safnað annan hvern dag til að kanna breytinguna á uppbyggingu örverusamfélagsins. Saurnum var safnað saman í hrein, dauðhreinsuð 15 ml glös með skrúfuðu loki og þeim var haldið beint við -20˚C þar til öllum sýnunum var safnað. Fyrir 15-daga rannsóknina með endurteknum skömmtum var aðeins blóðsýnum safnað vikulega til að mæla magn alkalíns fosfatasa (ALP) og kreatíníns, það er á degi 0, degi 7, degi 14, dag 21, og dag 30 (dagur 21 og dagur 30 giltu eingöngu fyrir stjórnunar- og gervihnattahópana).

Greining á örverusamfélagi í þörmum

DNA-útdráttur úr saursýnunum sem safnað var var framkvæmd með MO BIO'S PowerMaxSoil DNA einangrunarsetti (MO BIO Laboratories, Bandaríkjunum), eftir leiðbeiningum framleiðanda. Polymerase Chain Reaction (PCR) hreinsun og raðgreining erfðafræðilegs DNA (gDNA) var síðan framkvæmd með því að nota Mr. DNA Lab (Molecular Research LP, USA). PCR mögnun 16S rRNA gensins og raðgreining þess í kjölfarið var gerð með Illumina. 16SrRNA gen V4 breytilegt svæði PCR grunnurinn ill27F mod (AGRGTTTGATCMTGCTCAG)/ill519R og mod (GTNTTACNGCGGCKGCTG) með strikamerki á framhliðinni voru notaðir í 30 lotum með HotStarTaq Plus Master Mix Kit (Qiagen, Bandaríkjunum). Eftir mögnun voru PCR vörur athugaðar í 2 prósent agarósa hlaupi til að ákvarða árangur mögnunar og hlutfallslegan styrkleika banda.

Síðan var sameinað og hreinsað PCR afurðin notuð til að útbúa Illumina DNA safnið. Raðgreining var framkvæmd með MR DNA á örveru raðgreiningu (MiSeq) í samræmi við leiðbeiningar framleiðanda. Röð gögn voru unnin með því að nota MR DNA greiningarleiðsluna. Í stuttu máli voru raðir sameinaðar, síðan voru tæmdar af strikamerkjum, eftir það voru raðir < 150="" bps="" og="" raðir="" með="" óljósum="" grunnköllum="" fjarlægðar.="" raðir="" voru="" afmerktar="" og="" rekstrarlegar="" flokkunareiningar="" (outs)="" voru="" búnar="" til="" og="" chimeras="" fjarlægðar.="" otus="" voru="" skilgreind="" með="" þyrpingum="" við="" 3="" prósent="" frávik="" (97="" prósent="" líkt).="" loka="" otus="" voru="" flokkuð="" samkvæmt="" flokkunarfræði="" með="" því="" að="" nota="" blastn="" á="" móti="" gagnagrunni="" sem="" er="" unnin="" úr="" rdp-ii="" og="" ncbi.="" pakki="" af="" mismunandi="" tölfræðilegum="" greiningum="" innifalinn="" í="" "r"="" hugbúnaði="" var="" notaður="" fyrir="" stigveldisþyrpinga="" (útgáfa="" 3.5.1,="" vegan="">