Aukning á nýmyndun fenýletanóíð glýkósíða í frumuræktun Cistanche Deserticola með osmósuálagi

Tengiliður:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Chun-Zhao Liu. Xi-Yu Cheng

ÁgripÁhrif osmósuálags á frumuvöxt og phenylethanoid glycosides (PeGs) lífmyndun voru rannsökuð í frumusviflausnumCistanche deserticolaYC Ma, lækningajurt í eyðimörk sem ræktuð er í vesturhluta Kína. Ýmsir upphafsstyrkur súkrósa hafði marktæk áhrif á frumuvöxt og PeGs lífmyndun í sviflausnarræktunum og hæsta þurrþyngdin og PeGs uppsöfnunin náði 15,9 gl–1-DW og 20,7 mg g–1-DW í sömu röð við upphafs osmósu. streita 300 mOsm kg–1 þar sem súkrósastyrkur var 175,3 mM. Stoichiometric greining með mismunandi samsetningum af súkrósa og óefnaskiptum sykri (mannitóli) eða osmótískum efnum sem ekki eru sykur (PEG og NaCl) leiddi í ljós að osmósuálag sjálft var mikilvægur þáttur til að efla PeGs lífmyndun í frumusupplausnarræktum afCistanche deserticola. Hámarks PeGs innihald 26,9 og 23,8 mg g–1-DW fékkst eftir 21 dag við samsetningar 87,6 mM súkrósa með 164,7 mM mannitóli (303 mOsm kg–1) eða 20 mM PEG í sömu röð, sem var hærra en það af C. deserticola frumuræktun sem ræktuð var við upphafsstyrk súkrósa sem er 175,3 mM eftir 30 daga. Örvuð PeGs uppsöfnun í frumusvöðrunarræktunum var í tengslum við aukningu á virkni fenýlalanín ammóníum lýasa (PAL) af völdum osmótísks streitu.

Leitarorð Cistanche deserticola, Eyðimerkur lækningajurt, fenýletanóíð glýkósíð, osmótísk streita, fenýlalanín ammóníak-lyasi

Cistanchetubulosahefur mörg áhrif, smelltu hér til að vita meira

Kynning

Cistanche deserticolaYC Ma, dýrmæt kínversk jurt, sníklar rætur Haloxylon ammodendrun og vex á eyðimerkursvæðum í vesturhluta Kína. Fenýletanóíð glýkósíð (PeGs), helstu lífvirku efnisþættirnir sem eru einangraðir úr C. deserticola, hafa áberandi virkni í að hreinsa sindurefna, auka ónæmi, bæta kynlíf o.s.frv. (Zong o.fl. 1996; Lu 1998; Wang o.fl. 2001). Vegna stjórnlausrar hagnýtingar og nýtingar áCistanche deserticola, náttúruauðlindCistanche deserticola var á mörkum þreytu. Með hliðsjón af þessum vandamálum hefur PeGs framleiðsla með frumudreifaræktun C. deserticola verið talin vænlegur valkostur til að leysa skort áCistanche deserticolaplöntuefni (Lu og Mei 2003; Ouyang o.fl. 2003; Cheng o.fl. 2005a).

Osmótísk streita er mikilvægur þáttur sem hefur áhrif á vöxt plantna, þroska, formgerð og myndun afleiddra umbrotsefna. Greint hefur verið frá aukinni framleiðslu á afleiddum umbrotsefnum úr in vitro vefjaræktun undir ákjósanlegu osmósuálagi í nokkrum lækningajurtategundum (Kim o.fl. 2001; Wang o.fl. 1999; Wu o.fl. 2005). Súkrósa er venjulegt osmótískt streituefni sem notað er í þessum tilvikum og þjónar einnig sem mikilvægur kolefnis- og orkugjafi. Þess vegna er mjög erfitt að aðgreina áhrif osmósuálags og næringarhlutverks sykurs sem kolefnisgjafa. Aukning á osmótískri streitu í upphafi með mannitóli, sorbitóli og PEG sem ekki er umbrotsefni bætti einnig uppsöfnun paklítaxels í Taxus Chinensis frumuræktun, uppsöfnun sapóníns og fjölsykru í Panax notoginseng frumuræktun og uppsöfnun eleutherosides í Eleutherococcus sessili et al. o.fl. 2001; Shohael o.fl. 2006). Niðurstöður þeirra gáfu til kynna að áhrif kolvetnastyrks og osmótískrar streitu væru mismunandi eftir plöntutegundum og afleiddum umbrotsefnum.

Markmið þessarar rannsóknar beinist að osmósuáhrifum súkrósa, mannitóls, PEG og NaCl á frumuvöxt og PeGs lífmyndun íCistanche deserticolaræktun frumusviflausna. PAL virkni í sviflausnarræktunum var rannsökuð undir mismunandi samsetningum af upphafs osmótískum efnum og mögulegur gangur á bættri PeGs uppsöfnun með því að auka osmósuálag er rædd.

efni og aðferðir

Plöntuefni og callus induction

Fræ afCistanche deserticolaYC Ma var safnað frá eyðimerkursvæðum í Xinjiang héraði í Kína og geymt í 4C fyrir notkun. Grasafræðileg auðkenni var staðfest með samanburði við viðmiðunarstaðla hjá Grasafræðistofnuninni, Kínverska vísindaakademíunni, PR Kína. Fræ voru sótthreinsuð á yfirborði með því að dýfa í 70 prósent etanól í 30 s, síðan sökkt í 20 prósent vatnslausn af 5,4 prósent natríumhýpóklórít í vatni í 20 mínútur, fylgt eftir með þremur skolun með dauðhreinsuðu eimuðu vatni. Kalli voru framkölluð úr yfirborðssótthreinsuðu fræiCistanche deserticolaá MS (Murashige og Skoog 1962) miðli bætt við 1.0 mg l–1 naftalenediksýru (NAA), 2.0 mg l–1 6-bensýladenín ({{7} }BA), 0,25 mg l–1 2, 4-díklórfenoxýediksýra (2, 4-D), 6 gl–1 agar (PhytoTechnology LaboratoriesTM, vöruauðkenni: A181) og 30 gl–1 súkrósa í 60 daga í vaxtarskáp í myrkri við 25C. Kallúsræktirnar sem framkallaðar voru af fræútgræðslunum voru síðan undirræktaðar í ofangreindan fasta miðil með 30 daga millibili (Cheng o.fl. 2005a).

Stofnun og viðhald frumusvifaræktunar

Kalluræktunin í sviflausninni (3,0 g fersk þyngd) sem voru síuð í gegnum 1,000 lm möskva skjá og haldið eftir á 200 lm möskva skjá, voru undirræktaðar í 500-ml Erlenmeyer flaska sem inniheldur 100 ml af ofangreindum fljótandi miðli á hringhristara við 110 snúninga á mínútu við 25C í myrkri með 18 daga millibili undirræktunar. pH miðilsins var stillt á 5,8 með 1 M NaOH eða 1 M HCl áður en það var farið í sjálfvirkt klofning. Sviflausnarræktirnar sem voru undirræktaðar eftir tíu sinnum voru notaðar sem sáðefni fyrir eftirfarandi tilraunaflaskaræktun. Allar flöskutilraunir voru gerðar í 250 ml Erlenmeyer flöskum sem innihéldu 50 ml fljótandi miðil með 30 gl-1 súkrósa og sáð með 1,5 g ferskum þyngd af 18-dagsgömlum frumusviflausnarræktum. Þessar Erlenmeyer flöskur voru ræktaðar á snúningshristara (110 rpm) við 25C í myrkri.

Osmotic streitu tilraun

Til að kanna áhrif upphafs súkrósastyrks áfrumuvöxtur og PeGs uppsöfnun,Cistanche deserticolasviflausnarræktanir voru ræktaðar í MS miðli með 87,6,175,3 og 262,9 mM súkrósa. Fyrir osmósuálag,Cistanche deserticolasviflausnarræktanir voru ræktaðar í MSmiðill sem inniheldur 87,6 mM súkrósa ásamt164,7 mM mannitól. Önnur osmótísk efni (PEG 4,000 ogNaCl) var bætt við í jafngildi osmólarstyrks á87,6 mM súkrósa. Styrkur osmósujafngildisosmótískra efna voru ákvörðuð með tilraunum sem PEG4,000 af 20 mM og NaCl af 50 mM, í sömu röð. Notaðar voru þríteknar flöskur í öllum tilraunum og öllum gildumvoru meðaltal þrískipta flöskur ± SD.

Greining

Cistanche deserticolaræktaðar frumur undir mismunandi osmósuálagi sáust með Nikon AFX-DX ljóssmásjá (Nikon, Japan) við 400· stækkun. Osmólarstyrkur ræktunarmiðilsins var mældur með gufuþrýstings osmometer (Fiske One-Ten Osmometer, MA, USA). Til að ákvarða ferskþyngd (FW) skalCistanche deserticolafrumum var þrýst varlega á síupappír til að fjarlægja umfram vatn og vegnar. Í kjölfarið voru frumurnar þurrkaðar í ofni við 60C í 24 klst og þurrþyngdin (DW) skráð. Sykurleifarstyrkurinn var ákvarðaður með því að nota fenól og óblandaða brennisteinssýru, með glúkósa sem staðal (Dubois o.fl. 1956).

PeGs voru dregin út úr þurrkuðum frumum með metanóli í 15 mínútur við 60C í ultrasonic vatnsbaði (KQ2200, Shanghai Cany Precision Instrument Co., Ltd, Kína) með tíðninni 40 kHz og afl 100 W. Síuvökvinn var þéttur og leifin leyst upp í eimuðu vatni og síðan látin fara í gegnum stórnetlaga plastefnissúlu (AB-8, efnaframleiðsla Nankai háskólans, Tianjin, Kína). Metanólsklútinu var safnað og heildar PeGs innihaldið var mælt við 333 nm með því að nota echinacoside sem staðal (Du og Liu 1993a; Du o.fl. 1993b).

Lífvænleiki frumna var metinn með lækkun á 2,3, 5-trífenýltetrasólíumklóríði (TTC) (Steponkus og Lanphear 1967). Lífvænleikavísitalan er skilgreind sem gleypni mæld á hvert gramm af ferskum vef. Ákvörðun PAL virkni var byggð á aðferð Koukol og Conn (1961). Ein eining af PAL virkni (U) er skilgreind sem magn gleypnibreytingar upp á 0.01.

Niðurstöður og umræður

Áhrif upphafs styrks súkrósa á frumuvöxt og PeGs lífmyndun í frumusvöðvaræktunCistanche deserticola.Viðbrögð fráCistanche deserticolafrumusviflausnarræktanir til upphafs súkrósastyrks á milli 87,6 og 262,9 mM voru prófaðar. Eins og sýnt er á mynd 1, uxu ​​frumurnar og söfnuðu PeGs hratt við lágan upphaflegan súkrósastyrk upp á 87,6 mm, og frumuvöxtur og PeGs uppsöfnun voru augljóslega bæld við háan upphafsstyrk súkrósa upp á 262,9 mM. Hlutfall ferskrar þyngdar og þurrþyngdar minnkaði þegar upphafsstyrkur súkrósa jókst úr 87,6 úr 262,9 mM (gögn ekki sýnd). Hámarksþurrþyngd 15,9 gl–1 og PeGs innihald 20,7 mg g–1-DW fengust á degi 30 við upphafsstyrk súkrósa upp á 175,3 mM, þar af var osmólarstyrkur um 300 mOsm kg–1. Við smásjárskoðun voru frumuveggir aðskildir frá umfrymi þeirra við hæsta osmósuálag, 388 mOsm kg–1 þar sem upphafsstyrkur súkrósa var 262,9 mM (mynd 2), og mesta osmósuálagið gæti truflað efnaskipti frumna og valdið alvarleg vaxtarbæling og samdráttur í nýmyndun PeGs. Svipað fyrirbæri kom einnig fram í sviflausnarræktum T. Chinensis sviflausnarfrumuræktar og ákjósanlegur súkrósastyrkur fyrir paklítaxelframleiðslu var 175,3 mM (Kim o.fl. 2001). Hins vegar var upphafsstyrkur súkrósa upp á 204,5 mM gagnlegur fyrir vöxt E. sessiliflorus frumuræktunar. Hærri súkrósastyrkur, 262,9 mM, jók nýmyndun eleutherosides, phenols og flavonoids í Eleutherococcus ræktunum (Shohael o.fl. 2006). Ljóst er að upphafsstyrkur súkrósa er mikilvægur fyrir vöxt og uppsöfnun efri umbrotsefna í plöntufrumuræktun og áhrif hans tengjast ákveðinni frumulínu.

Áhrif mismunandi osmótískra efna á frumuvöxt og PeGs lífmyndun í frumusviflausnarræktum C. deserticola

Til að skilja osmótískt hlutverk efnaskipta súkrósa og annarra efnafræðilegra hvarfefna sem ekki eru umbrotsefni á nýmyndun PeGs í frumusvifurræktunCistanche deserticola, röð tilrauna voru framkvæmdar með því að nota súkrósa ásamt óefnaskipta osmótískum efnum (mannitóli, PEG og NaCl). Í þessum tilraunum var 164,7 mM mannitóli, 20 mM PEG og 50 mM NaCl bætt við miðilinn sem innihélt 87,6 mM súkrósa og gerði upphafsosmólarstyrkinn um 300 mOsm kg–1, sem var jafngilt osmótískt ástand sambærilegt við miðilinn með 175,3 mM súkrósa.

Eins og sýnt er á mynd 3a, b, hamlaði viðbót mannitóls (ómótefnalauss sykursýkis) og PEG (ógegndræps osmótísks efnis) örlítið frumuvöxt en jók verulega nýmyndun PeGs íCistanche deserticolaræktun frumusviflausna. Hámarks PeGs innihald 26,9 og 23,8 mg g–1- DW fékkst, í sömu röð, á degi 21 þegar frumurnar voru ræktaðar í samsetningum 87,6 mM súkrósa með annað hvort 164,7 mM mannitóli (303 mOsm kg–1) eða 20 mM PEG (299 mOsm kg–1). PeGs upphæðir voru hærri enCistanche deserticolafrumuræktun ræktuð í MS fljótandi miðli með upphafsstyrk súkrósa upp á 175,3 mM á degi 30. Sykurs var neytt smám saman á meðanCistanche deserticolafrumuræktun, og þá lækkaði osmósustreitan af völdum sykurs í samræmi við það (mynd 3c, d). Osmótísk streita vökvamiðilsins með upphafsstyrk súkrósa 175,3 mM lækkaði úr 280 í 110 mOsm kg-1 þegar PeGs í frumuræktunum fóru að safnast fyrir á degi 9 og náðu hámarki á degi 30 (gögn ekki sýnd). Osmósuefni sem ekki voru efnaskipti (mannitól og PEG) voru ekki neytt í frumuræktuninni, sem gerir það að verkum að osmósuálag á fljótandi miðli haldist á milli 200 og 280 mOsm kg–1, osmósuþrýstingur sem er hagstæður fyrir PeGs lífmyndun. Þessar niðurstöður sýndu að osmósustreita sjálft gegndi mikilvægu hlutverki við að auka PeGs lífmyndun íCistanche deserticolafrumuræktun.

Tilkynnt var um að viðbót NaCl bæti nýmyndun indólalkalóíða og sapóníns í frumuræktun Catharanthus roseus og Panax ginsengs (Smith o.fl. 1987; Wu o.fl. 2005), en meðferð á NaCl bældi frumuvöxt T. Chinensis. en sýna engan mun á nýmyndun palitaxels (Kim o.fl. 2001). Þess vegna er ítarleg rannsókn nauðsynleg fyrir hvert mál. Viðbót á osmósujafngildi 50 mM NaCl bæla frumuvöxt og PeGs lífmyndun. Þessi niðurstaða gæti stafað af gegndræpi eðli NaCl sem er ekki gagnlegt fyrir frumuræktun þessarar eyðimerkurplöntutegundar sem þolir þurrkálag mjög vel.

Mynd 3 Áhrif samsetninga súkrósa og annarra osmósuefna sem ekki eru umbrotsefni á frumuvöxt (a), uppsöfnun PeGs (b), sykurneyslu (c) og osmósuálagsbreytingu (d) í gegnum C. deserticola frumu. menningu. Gildi eru meðaltal þrískipta flöskur ± SD

Áhrif mismunandi osmótískra efna á lífvænleika frumna og PAL virkni í frumusvöðrunarræktun Cistanche deserticola

Í fyrri rannsóknum okkar (Cheng o.fl. 2005b, 2006) örvaði elicitor viðbót verulega PeGs lífmyndun íCistanche deserticolafrumuræktun, og var örvunin í tengslum við aukna virkni PAL, fyrsta lykilensímsins í PeGs lífmyndun (Hahlbrock og Grisebach 1979). Eins og sýnt er á mynd 4, dró lítillega úr lífvænleika frumna að bæta 164,7 mM mannitóli eða 20 mM PEG í MS fljótandi miðli sem innihélt 87,6 mM súkrósa, en jók verulega PAL virkni sem var hærri en sú sem var framkölluð af upphafsstyrk súkrósa á 175,3 mM. Aukin PeG uppsöfnun íCistanche deserticolaræktun frumusviflausna tengdist aukningu á PAL virkni örvuð af osmósuálagi sjálfu. Upphafsstyrkur súkrósa upp á 175,3 mM í MS fljótandi miðli olli minnkun á lífvænleika frumna á 15 dögum og hamlaði PAL virkni á 21 degi. Eftir tímabil sykurneyslu af vaxandiCistanche deserticolafrumuræktun, bæði frumulífvænleiki og PAL virkni ræktuðu frumanna jukust og náðu hámarki á 24. degi og 30. degi, í sömu röð. Aukin PAL virkni vegna osmótískrar streitu sást einnig til að bæta sapónín lífmyndun í P. ginseng frumuræktun og alkalóíðasöfnun í C. roseus ræktuðum frumum (Godoy-Hernandez o.fl. 2000; Wu o.fl. 2005). Hins vegar, að bæta gegndræpi NaCl í MS fljótandi miðil sem innihélt 87,6 mM súkrósa dró úr lífvænleika frumna og hindraði PAL virkni á öllu ræktunartímabilinu. Fyrir vikið var augljóslega bælt bæði frumuvöxtur og PeGs lífmyndun.

Mynd 4 Breytileiki á lífvænleika frumna (a) og PAL virkni (b) í C. deserticola frumuræktun undir mismunandi osmósuálagi á meðanCistanche deserticolafrumurækt. Gildi eru meðaltal þrískipta flöskur ± SD

Cistanche deserticolaer eyðimerkurtegund og rannsókn á eyðimerkurtegundinni in vitro frumurækt gaf nýjar áskoranir og tækifæri til að skilja lífeðlisfræði plantna og vistfræðilega aðlögun. Í þessari rannsókn þróuðum við kerfi með möguleika á að rannsaka osmósuálagsmiðlaða merkjaflutningsferil, og kerfið lagði grunninn að stórfelldri framleiðslu á PeGs með því að notaCistanche deserticolafrumuræktun með nýrri osmótískri streitustýrðri stefnu.

Viðurkenningar

Höfundarnir viðurkenna fjárhagslegan stuðning frá nýsköpunarrannsóknaráætlun kínversku vísindaakademíunnar.

Úr: 'Aukning á nýmyndun fenýletanóíð glýkósíða í frumuræktum Cistanche deserticola með osmótískri streitu' eftir Chun-Zhao Liu. Xi-Yu Cheng

---Plant Cell Rep (2008) 27:357–362 DOI 10.1007/s00299-007-0443-3

Heimildir

Cheng XY, Wei T, Guo B, Ni W, Liu CZ (2005a)Cistanche deserticolafrumufjöðrunarræktun: Fenýlethanoid glýkósíð lífmyndun og andoxunarvirkni. Process Biochem 40:3119-3124
Cheng XY, Guo B, Zhou HY, Ni W, Liu CZ (2005b) Endurtekin framköllun eykur uppsöfnun fenýletanóíð glýkósíða í frumusvöðvaræktunCistanche deserticola. Biochem Eng J 24:203–207
Cheng XY, Zhou HY, Cui X, Ni W, Liu CZ (2006) Endurbót á nýmyndun fenýletanóíð glýkósíða í Cistanche deserticola frumu sviflausnarræktun með kítósan elicitor. J Líftækni 121:253-260
Du NS, Liu JL (1993a) Ákvörðun á fenýletanóíð glýkósíðum íCistanche deserticolameð macro reticular resin litrófsmælingu. Nat Prod Res Dev 5:30–33
Du NS, Wang H, Yi YH (1993b) Einangrun og auðkenning á fenýletanóíð glýkósíðum fráCistanche deserticola. Nat Prod Res Dev 5:5–8
Dubois M, Gilles KA, Hamilton JK (1956) Litamælingaraðferðir til að ákvarða sykur og skyld efni. Anal Chem 28:350–357

Godoy-Hernandez GC, Vazquez-Flota FA, Loyola-Vargas VM (2000) Útsetning fyrir trans-kanilsýru osmótískra streitu Catharanthus roseus frumna sem ræktaðar eru í 14-l lífhverfa eykur uppsöfnun alkalóíða. Líftækni Lett 22:921–925
Hahlbrock K, Grisebach H (1979) Ensímstýringar í lífmyndun ligíns og flavonoids. Ann Rev Plant Physiol 30:105–130
Kim SI, Choi HK, Kim JH (2001) Áhrif osmósuþrýstings á paclitaxel framleiðslu í sviflausnarfrumuræktun Taxus Chinensis. Enzyme Microb Tech 28:202–209
Koukol J, Conn EE (1961) Umbrot arómatískra og eiginleika phenylalanine deaminasa Hordeum vulgare. J Biol Chem 236:2692-2698
Lu MC (1998) Rannsóknir á róandi áhrifumCistanche deserticola.J Ethnopharmacol 59:161–165

Lu CT, Mei XG (2003) Endurbætur á phenylethanoid glýkósíðframleiðslu með sveppavaldi í frumusviflausnarræktunCistanche deserticola. Líftækni Lett 25:1437–1439
Murashige T, Skoog F (1962) Endurskoðaður miðill fyrir hraðan vöxt og lífgreiningar með tóbaksvefjaræktun. Plant Physiol 15:473–497
Ouyang J, Wang XD, Zhao B, Yuan XF, Wang YC (2003) Áhrif sjaldgæfra jarðefnaþátta á vöxtCistanche deserticolafrumur og myndun fenýletanóíð glýkósíða. J Líftækni 102:129-134
Shohael AM, Hakrabarty D, Ali MB, Yu KW, Hahn EJ, Lee HL, Paek KY (2006) Aukning á framleiðslu eleutherosides í fósturmyndandi ræktun Eleutherococcus sessiliflorus til að bregðast við súkrósa-völdum osmósuálagi. Process Biochem 41:512-518
Smith JL, Smart NJ, Kurd WGW, Misawa M (1987) Notkun lífrænna og ólífrænna efnasambanda til að auka uppsöfnun indólalkalóíða í Catharanthus roseus (L.) Don frumufjöðrun. J Exp Bot 38:1507–1511
Steponkus PL, Lanphear FO (1967) Hreinsun á trifenýltetrasólíumklóríðaðferðinni til að ákvarða kuldaskaða. Plant Physiol 42:1423-1426Wang HQ, Wu JT, Zhong JJ (1999) Veruleg framför á taxanframleiðslu í sviflausnarræktun Taxus Chinensis með súkrósafóðrun. Process Biochem 35:479-483
Wang XW, Jiang XY, Wu LY, Wang XF (2001) Hreinsandi áhrif glýkósíða afCistanche deserticolaum sindurefna og vernd þeirra gegn OH-völdum DNA skemmdum in vitro. Chin Pharm J 36:29–31
Wu JY, Wong K, Ho KP, Zhou LG (2005) Aukning á sapónínframleiðslu í Panax ginseng frumurækt með osmótískri streitu og næringarefnafóðrun. Enzyme Microb Technol 36:133–138
Zhang YH, Zhong JJ, Yu JT (1995) Áhrif osmótísks þrýstings á frumuvöxt og framleiðslu Ginseng saponin og fjölsykru í sviflausnarræktun Panax Notoginseng. Biotechnol Lett 17:1347–1350
Zong GZ, He W, Wu GL, Chen LH (1996) Samanburður á milliCistanche deserticolaYC Ma og Cistanche tubulosa (Scheak) Wight nokkur lyfjafræðileg starfsemi. Tradit Chin Med J 21:436–438