Áhrif undirbúnings jurtaplöntunnar á cistanche á áhrif jurtablöndunnar cistanche á Iin Vitro N vitro ccytokine tjáningu með rottum beinþynningar

Tengiliður: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Netfang:audrey.hu@wecistanche.com

ÁSTANDUR

Osteoblasts (OB) gegna mikilvægu hlutverki við endurgerð beina. Osteoblasts (OB) gegna mikilvægu hlutverki við endurmótun beina með því að losa frumufrumur eins og losun frumuefna eins og osteoprotegerin (OOPG), viðtakavirkjun kjarnaþáttar kappa- B bindill (RA PG), viðtakavirki fyrir kjarnaþátt kappa-B bindil NKL) og osteopontín (OPN). Markmið rannsóknarinnar okkar var að meta áhrif kínverskra jurtaútdrátta afCistanche(Cistanche deserticola) um in vitro tjáningu þessara cýtókína í OB-frumuræktun rotta. Aðal OB voru einangruð frá rottuhauskúpunni með trypsíni og kollagenasa meltingu. Frumusvipgerðin var ákvörðuð með svissnesku litunaraðferðinni, alkalískum fosfatasa litun, Von Kossa litun og Alizarin rauðri litun. Genatjáning OPG, RANKL og OPN var greind með magnbundinni rauntíma PCR. Allar meðferðir með jurtajurtaútdrætti af Cistanche jók genatjáningu OPG og RANKL eftir 72 klst. ræktun, sérstaklega við styrk upp á 5×10-2 mg/ml, sem var marktækt frábrugðinn samanburðarræktunum. Meðferð minnkaði marktækt tjáningu OPG/RANKL hlutfallsins eftir 48 klukkustundir og tjáningu OPN mRNA eftir 72 klukkustunda ræktun. In vitro útsetning OB fyrir plöntublöndunni af Cistanche stuðlaði að genatjáningu OPG og RANKL og minnkaði genatjáningu OPG/RANKL og OPN, og gæti þannig viðhaldið jafnvægi beinmyndunar og uppsogs við beinefnaskipti.

Leitarorð:Cistanche, osteoblasts, osteoprotegerin, RANKL, osteopontin, rotta

gegn osteoblast:Cistanche jurt

Kynning

Beinstyrkur ræðst af uppbyggingu og samsetningu. Beinvefur lagar sig að margvíslegu álagi með því að gera líkan á vaxtarskeiði og endurmóta alla ævi. Beinbreytingin minnkar með öldrun vegna minnkunar á rúmmáli beina sem myndast í grunnfjölfrumueiningunni, kynhormónaskorts og minni beinmyndunar í beinhimnu (SEEMAN, 2008). Ójafnvægi í endurgerð beina getur valdið beinatengdum sjúkdómum, svo sem beinþynningu, og aukinni hættu á beinbrotum.

Beinþynning, sem veldur beinbrotum, verkjum og truflunum á hreyfingu, hefur áhrif á milljónir einstaklinga í Bandaríkjunum (NAYAK o.fl., 2012; SILVERMAN, 2010). Lykilferlið við að koma í veg fyrir tíðni beinatengdra sjúkdóma er að viðhalda getu til að endurbyggja beina.

Beinendurgerð er kraftmikið jafnvægi beinmyndunar og uppsogs (SEEMAN og DELMAS, 2006). Þessum ferlum er aðallega stjórnað af beinfrumum (OBs) og osteoclastum í fullorðinsbeini og með tjáningu frumuefna, vaxtarþátta og hormóna (PARFITT, 2000). OBs, sem eru unnin úr frumum mesenchymal frumum, finnast á yfirborði beina. Obs eru ábyrg fyrir beinmyndun og hafa óbeint áhrif á beinupptöku (MACKIE, 2003). Cýtókínin sem tjáð eru af OBs, eins og beinprótegerín (OPG), viðtakavirkja kjarnaþáttar kappa-B bindilsins (RANKL), og osteopontín (OPN), geta stuðlað að lækningu beinbrota og aukið beinmyndun í beinþynningu (LINKHART o.fl., 1996) . Þróun OB er raðbundið ferli sem felur í sér fjölgun beinfrumna, þroska fylkis og steinefnamyndun frumna (GIUSTINA o.fl., 2008). Þetta ferli er stjórnað af mörgum OB-tengdum genum og er mjög tengt þróun beinamyndunar (HUNG o.fl., 2010). Framgangur beinmyndunar örvar beinmyndun meðan á beinbrotum stendur. Þannig eru rannsóknir á tjáningu beinmyndandi frumuefna og áhrifum þeirra á steinefnamyndun beina nauðsynlegar í leit að nýstárlegu og áhrifaríku meðferðarefni af náttúrulegum uppruna til að koma í veg fyrir beinatengda sjúkdóma.

Hefðbundin kínversk læknisfræði hefur verið notuð í þúsundir ára við meðhöndlun beinasjúkdóma. Jurtplantan Cistanche, sem er mikið notuð til að endurlífga nýrun og til meðferðar á beinsjúkdómum, tilheyrir ættkvísl Orobanchaceae fjölskyldunnar. Greint hefur verið frá því að innihaldsefni Cistanche tegundanna eru: fenýletanóíð glýkósíð (PhGs), iridoids, lignans, alditols og oligosaccharides (JIANG og TU, 2009; LI o.fl., 2010). Cistanche plöntur eru fjölærar sníkjujurtir, sem aðallega vaxa í eyðimörkinni eða á hrjóstrugum saltsleikjum, aðallega dreift í þurrum og hlýjum eyðimörkum í norðvestur Kína. Í hefðbundinni kínverskri læknisfræði er Cistanche talið óvenjulegt tonic og er nefnt "Ginseng eyðimerkurinnar". Rannsókn sem gerð var á rottum með eggjastokkum (LIANG o.fl., 2011) sýndi aðCistanche útdrættirgefið til inntöku jókst verulega beinþéttni og steinefnainnihald beina á skammtaháðan hátt. Hins vegar eru nákvæmar verkunaraðferðir Cistanche á beinmyndun enn óljósar. Þess vegna voru markmið þessarar rannsóknar að meta áhrif Cistanche á in vitro tjáningu gena fyrir OPG, RANKL og OPN frumuræktun með OB frumuræktun rotta, og meta hvernig Cistanche stuðlar að beinaheilun eða kemur í veg fyrir/stjórnar. sjúkdómar sem tengjast beinum.

Cistanche jurt til að koma í veg fyrir beinatengda sjúkdóma

efni og aðferðir

Undirbúningur beinþynningar í rottum. Rottufrumur voru útbúnar úr nýbura rottum (calvarias)<24 hours)="" and="" processed="" by="" the="" trypsin="" (sigma,="" usa)="" and="" collagenase="" ii（sigma,="" usa）digestion="" methods.="" the="" cells="" were="" cultured="" in="" dulbecco's="" modified="" eagle="" medium="" (dmem,="" gibco,="" usa)="" supplemented="" with="" 15="" %="" inactivated="" fetal="" calf="" serum,="" penicillin="" (100="" iu/ml),="" streptomycin="" (100="" iu/ml)="" and="" l-glutamine="" in="" 6="" well="" culture="" plates,="" and="" incubated="" at="" 37="" °="" c="" with="" 5="" %="" co2="" in="" the="" air.="" the="" cellular="" phenotype="" was="" determined="" by="" the="" swiss="" dyeing="" method,="" alkaline="" phosphatase="" staining,="" and="" von="" kossa="" and="" alizarin="" red="" dye="">

Framleiðsla á vatnsútdrætti af Cistanche í raðþynningum. Cistanche sem notað var í þessari rannsókn var veitt frá Tongrentang Pharmacy í Kína. Þurrir bitar af Cistanche voru malaðir í duft. Cistanche fljótandi útdrættirnir voru útbúnir með því að afkoka 50 g af jurtadufti í 1 klukkustund. Næst var efnablöndunin þétt í 100 ml með snúningsuppgufunarbúnaði og síuð í gegnum 0,22 mm síur. Síuefnið var geymt við 4 gráður í myrkri. Vökvaþykkni Cistanche var þynnt í raðþéttni á bilinu 5×10 -1 til 5×10-4 mg/ml með DMEM vökvanum.

Einangrun RNA og öfug umritun PCR. Þriðja kynslóð ræktaðra OBs var meðhöndluð með mismunandi styrk af Cistanche útdrætti í 24, 48 og 72 klst. OB frumuræktunarmeðferðirnar voru framkvæmdar í þrígang. Frumurnar voru þvegnar með fosfatjafnaðar saltvatni (PBS) tvisvar og RNA var einangrað úr frumunum með TransZol hvarfefni (Beijing TransGen Biotech Co., Ltd.; Beijing, Kína) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda, og dregið út með klóróformi, botnfellt út með ísóprópýli. alkóhól, þvegið með 75 prósent etýlalkóhóli og síðan leyst upp í vatni. Öfug umritun RNA (5 μL) var framkvæmd með TransScript First-Strand cDNA Synthesis Supermix (Trans, Peking, Kína).

Staðfesting á rauntíma PCR vörum. Eftir rafdrætti á 1,5 prósent agarósageli var gerð DNA raðgreining til að sanna að PCR afurðir væru kóðun genahluta OPG, RANKL og OPN í rottum OB.

Stofnun plasmíðs sem inniheldur markgenið. DNA röðin í 2 prósent agarósa hlaupi var hreinsuð og endurheimt með EZNA hlaupútdrætti (Kangweishiji, Kína) og flutt í pEASY-T3 klónunarsett (Beijing TransGen Biotech Co., Ltd.; Peking, Kína). Frumuumbreytingunni var náð með smíðað plasmíði sem innihélt markgenið. Jákvæðar þyrpingar voru skimaðar með Blá-hvítum blettaskimunarprófi og síðan raðgreindar. Plasmíðin sem dregin voru út úr jákvæðu þyrpingunum, sem innihéldu markgenið, voru þynnt í réttu hlutfalli með afjónuðu vatni til að ná stöðluðu ferli. Magntíma PCR (RTQ PCR). Sérstakir frumrar voru smíðaðir í samræmi við útgefnar genaraðir (NCBI, Nucleotide Database) og smíðaðir af Liuhe-Nuada Gene (Peking, Kína) eins og sýnt er í töflu 1.

Tjáning mRNA í sýnunum var magngreind með því að nota sérstakar plasmíð staðalferla sem lýst er hér að ofan. Vörurnar voru bornar saman við heimilisgenið -aktín. Magn markgena var magnmælt með RTQ PCR, með því að nota SYBR Green RealMaster Mix (TIANGEN, Kína) samkvæmt samskiptareglum framleiðanda. PCR aðstæður voru sem hér segir: 94 gráður í 1 mínútu, 58 gráður í 30 sekúndur, 68 gráður í 1 mínútu og voru endurteknar í 40 lotur. Gögnin voru reiknuð með 7500 rauntíma PCR kerfinu (Applied Biosystems; Waltham, MA, Bandaríkjunum).

Tölfræðilegar greiningar. Gögnin voru unnin með einhliða ANOVA, með því að nota tölfræðihugbúnað (SPSS 17.0, IBM Corporation; Armonk, NY, USA). Niðurstöðurnar voru gefnar upp sem meðaltal ± staðalfrávik markgenanna og -aktín hlutfall. Mismunur var talinn verulegur hjá P<0.05>

Ávinningur af cistanche jurtum: koma í veg fyrir beinsjúkdóma

Niðurstöður

Auðkenningin á rottum OB. OBs voru auðkennd með sérstökum frumulitunaraðferðum og var sýnt fram á svipgerð eins og sýnt er á mynd 1. (A, B, C og D)

Staðfesting á markgenunum. Bandastærðir markgenanna voru greindar í 2 prósent agarósa hlaupi og reyndust vera í samræmi við væntanleg stærð (mynd 2).

Niðurstöður sem fengust fyrir OPG, RANKL, OPN og -aktín genahluta sem innihéldu markgen plasmíð raðir voru bornar saman við samsvarandi gena raðir sem áður voru birtar í GENBANK með BLAST-N greiningu, og reyndust vera: 100 prósent , 100 prósent , 100 prósent og 99 prósent eins, í sömu röð.

Áhrif fljótandi útdráttar af Cistanche á OPG, RANKL og OPN tjáningu. Magn OPG mRNA var stillt niður þegar OBs voru útsett fyrir öllum beittum styrk Cistanche í 24 klst. og 48 klst (tafla 2).

Marktækur munur sást við styrkleika 5×10-1, 5×10-2 og 5×10-4 mg/ml eftir 24 klukkustundir og við styrkleika 5×10-1 og 5 ×10-2 mg/ml eftir 48 klukkustunda ræktun (Bls<0.05). however,="" when="" compared="" with="" control="" cultures,="" the="" expression="" of="" opg="" was="" significantly="" increased="" after="" treatment="" with="" cistanche="" for="" 72="" hours,="" cistanche="" concentrations="" of="" 5×10-2="" mg/ml="" and="" 5×10-3="" mg/ml="" had="" particularly="" increased="" opg="" expression=""><0.01). in="" contrast,="" the="" rankl="" mrna="" expression="" was="" down-regulated="" after="" 24="" hours="" with="" the="" concentration="" of="" 5×10-1="" mg/ml="" and="" 5×10-2="" mg/ml="" cistanche="" extracts="" compared="" to="" the="" controls.="" however,="" rankl="" mrna="" was="" up-regulated="" after="" culturing="" with="" cistanche="" extracts="" for="" 48="" hours="" and="" 72="" hours,="" especially="" the="" cistanche="" extract="" concentrations="" of="" 5×10-2="" mg/ml,="" 5×10-3="" mg/mland="" 5×10-4="" mg/ml="" (table="" 3).="" the="" rankl="" content="" continued="" to="" increase="" signifi="" cantly="" after="" 72="" hours="" of="">

Umræða

Osteoblasts (OBs) gegna ekki aðeins mikilvægu hlutverki við að skapa beinbyggingu heldur einnig í kalsíumjafnvægi, með því að stjórna beinþynningarvirkni (MACKIE, 2003). Það eru ákveðnir beinsjúkdómar sem tengjast OB-virkni eða truflun, svo sem beinþynningu. Svipgerðarmerki um útlit OB eru fyrst og fremst fjölgun þeirra og aðgreining, og í öðru lagi steinefnamyndun beinhnúða (PAN o.fl., 2005). OPG og RANKL eru meðlimir æxlisdrepsþáttar (TNF) fjölskyldu cýtókína og þau eru OB-afleidd prótein sem eru mikilvæg fyrir stjórnun og viðhald beinmassa (HUMPHREY o.fl., 2006; REINHOLZ o.fl., 2002). RANKL stjórnar aðgreiningu beinþynninga, virkjun og lifun. RANKL getur einnig aukið beinupptöku með því að hafa samskipti við viðtaka þess á beinhimnu (SODEK o.fl., 2000). OPG er tálviðtakinn fyrir RANKL og kemur í veg fyrir að RANKL bindist viðtaka hans (RANK). RANK/RANKL/OPG sambandið stjórnar jafnvægi milli beinmyndunar og upptöku, með því að stjórna OB og beinþynningarvirkni (SODEK o.fl., 2000; HUMPHREY o.fl., 2006; MAZZIOTI o.fl., 2012). Í samræmi við það mætti ​​draga þá ályktun að lækkað OPG/RANKL hlutfall geti framkallað beinupptöku með því að auka virkjun beinþynningar.

Í þessari rannsókn jók allar meðferðir með jurtablöndur af Cistanche geninu tjáningu OPG og RANKL eftir 72 klst., sérstaklega við styrkleikana 5×10-2 mg/ml og 5×10-3 mg/ml, sem voru verulega frábrugðin samanburðarræktunum.

Aftur á móti var OPG tjáning marktækt niðurstýrð eftir 24 og 48 klukkustunda ræktun með Cistanche útdrætti. Tjáningu OPG/RANKL hlutfallsins var marktækt niðurstýrt þegar OBs voru meðhöndluð með Cistanche í 24 klukkustundir og 48 klukkustundir. Einnig hafði Cistanche útdrátturinn engin marktæk áhrif á OB ræktun eftir 72 klukkustunda meðferð. Við gerum ráð fyrir að fljótandi útdrættir af Cistanche geti bætt beinþynningarvirkjun eftir 24 klukkustundir og 48 klukkustundir með stýrðri OPG/RANKL tjáningu, en gæti ekki haft nein áhrif á beinþynningarvirkjun eftir 72 klukkustundir. OPN hefur nokkra virkni í beinamyndun og endurgerð sem tengist grundvallarhlutverkum OPN í vörn hýsils og viðgerð vefja. Meginhlutverk OPN virðist vera stjórnun á neikvæðri endurgjöf á kerfisbundnu stigi, að stuðla að viðloðun OB frumu, framkalla snemma kölkun og einnig stjórn á stærð og lögun steinefnakristallanna (SODEK o.fl., 2000). Ennfremur hefur verið staðfest að OPN getur táknað brúarprótein, aukið slagæðastífleika meðan á bólgu stendur og getur þar af leiðandi valdið liðskemmdum og aukið hættu á hjarta- og æðasjúkdómum hjá sjúklingum með iktsýki (BAZZICHI o.fl., 2009).

Í rannsókn okkar höfum við sýnt að fljótandi útdráttur af Cistanche stjórnaði tjáningu OPN. Tilhneigingin til minnkandi OPN styrks í OB ræktunum samanborið við viðmiðunarræktirnar sem sáust eftir 24 klst. og 48 klst. ræktun, og marktækt lægra magn skráð eftir 72 klst., bendir til þess að Cistanche geti bætt beinmyndun, eins og sýnt var með in vitro tilrauninni.

In vitro útsetning OB ræktunar fyrir Cistanche ýtti verulega undir genatjáningu OPG og RANKL eftir 72 klukkustundir, minnkaði genatjáningu OPG/RANKL eftir 24 klukkustundir og 48 klukkustundir og minnkaði tjáningu OPN eftir 72 klukkustunda ræktun.

TheCistanche jurter alltaf notað sem lyfseðil sem samanstendur af mörgum kínverskum jurtum, því er klínísk virkni Cistanche sem notuð er í þessari rannsókn og innihaldsefnin í fljótandi útdrættinum flókin og enn ekki skýr. Niðurstöður rannsóknarinnar okkar sýna að Cistanche þykkni hefur áhrif á OPG og RANKL tjáningu þegar það er notað á rottu OB í frumurækt, en tjáningarstigið er breytilegt, allt eftir styrk Cistanche útdrætti og lengd ræktunar. Viðeigandi styrkur vökvaseyðis af Cistanche deserticola, ásamt viðeigandi tímalengd útsetningar fyrir rottum, getur viðhaldið jafnvægi milli beinmyndunar og uppsogs meðan á beinefnaskiptum stendur.

Frekari rannsókna er þörf til að bæta þekkingu okkar á lífvirkum innihaldsefnum Cistanche og styrk þeirra í efnablöndur, til að þau verði fullgilt sem frumustillingar til að endurheimta og laga beina.

cistanche viðbót: koma í veg fyrir beinmissi

Heimildir

BAZZICHI, L., L. GHIADONI, A. ROSSI, M. BERNARDINI, M. LANZA, F. DE FEO, C. GIACOMELLI, I. MENCARONI, K. RAIMO, M. ROSSI, AM MAZZONE, S. TADDEI, S BOMBARDIERI (2009): Osteopontin tengist aukinni slagæðastífleika í iktsýki. Mol. Med. 15, 402-406.

GIUSTINA, A., G. MAZZIOTTI, E. CANALIS (2008): Vaxtarhormón, insúlínlíkir vaxtarþættir og beinagrind. Endocr. Rev. 29, 535-559.

HUMPHREY, EL, JH WILLIAMS, MW DAVIE, MJ MARSHALL (2006): Áhrif aðgreindra sykurstera á OPG og RANKL í beinfrumum. Bein 38, 652-661.

HUNG, TY, TL CHEN, MH Liao, WP HO, DZ LIU, WC CHUANG, RM CHEN(2010): Drynaria fortunei J. Sm. stuðlar að þroska osteoblasts með því að framkalla aðgreiningartengda genatjáningu og vernda gegn oxunarálagi af völdum apoptotic móðgunar. J. Ethnopharmacol. 131, 70-77.

JIANG, Y., PF TU (2009): Greining á efnafræðilegum innihaldsefnum í Cistanche tegundum. J. Chromatogr. A. 1216, 1970-1979.

LI, Y., Y. SONG, H. ZHANG (2010): Framfarir í rannsóknum á efnafræðilegum innihaldsefnum og lækningavirkni cistanche. Kínverska villta plöntuauðlindir 29, 7-11.

LIANG, H., F. YU, Z. TONG, Z. HUANG (2011): Áhrif Cistanches Herba vatnsþykkni á beinmissi í rottum sem hafa verið gerðar á eggjastokkum. Alþj. J. Mol. Sci. 12, 5060-5069.

LINKHART, TA, S. MOHAN, DJ BAYLINK (1996): Vaxtarþættir fyrir beinvöxt og viðgerð: IGF, TGF beta og BMP. Bein 19, S1-S12.

MACKIE, EJ (2003): Osteoblasts: skáldsaga hlutverk í skipulagningu beinagrindararkitektúrs. Alþj. J. Biochem. Cell Biol. 35, 1301-1305.

MAZZIOTTI, G., J. BILEZIKIAN, E. CANALIS, D. COCCHI, A. GIUSTINA (2012): Nýr skilningur og meðferðir við beinþynningu. Innkirtla 41, 58-69.

NAYAK, S., MS ROBERTS, SL GREENSPAN (2012): Áhrif almenns alendrónatkostnaðar á kostnaðarhagkvæmni skimunar og meðferðar á beinþynningu. PLoS ONE 7(3): e32879. doi:10.1371/journal.pone.0032879.

PAN, W., LD QUARLES, LH SONG, YH YU, C. JIAO, HB TANG, CH JIANG, H.

W. Deng, YJ LI, HH ZHOU, ZS XIAO (2005): Genistein örvar beinþynnuaðgreiningu með NO/cGMP í beinmergsræktun. J. Cell Biochem. 94, 307-316.

PARFITT, AM (2000): Verkunarháttur tengingar: hlutverk æðakerfisins. Bein 26, 319-323. REINHOLZ, MM, SJ ITURIA, JN INGLE, PC ROCHE (2002): Mismunagn

tjáning TGF-fjölskyldumeðlima og osteopontíns í greiningu á brjóstaæxlisvef með rauntíma magni PCR. Brjóstakrabbamein Res. Dekra við. 74, 255-269.

SEEMAN, E. (2008): Beingæði: efnis- og byggingargrundvöllur beinstyrks. J. Bone Miner. Metab. 26, 1-8.

SEEMAN, E., PD DELMAS (2006): Beingæði - efni og uppbygging grunnur beinstyrks og viðkvæmni. N. Engl. J. Med. 354, 2250-2261.SILVERMAN, SL (2010): Beinþynningarmeðferðir: vísbendingar úr gagnagrunnum á heilsugæslu og þýðisrannsóknum. Calcif. Tissue Int. 87, 375-384.

SODEK, J., B. GANSS, MD MCKEE (2000): Osteopontin. Crit. Séra Oral Biol. Med. 11, 279- 303.