tlhTungumál
Saga / Þekking / Innihald

Þekking

DNA bólusetning framkallað verndandi ónæmi gegn SARS CoV-2 sýkingu í hamsturum

Nov 17, 2023

Ágrip

Þróun skilvirkra bóluefna gegn COVID-19 er brýn þörf fyrir alþjóðlega lýðheilsu. Toppprótein af alvarlegu bráðu öndunarfæraheilkenni coronavirus 2 (SARS-CoV-2) er aðalmarkmið fyrir COVID-19 bóluefnið. Til að bregðast fljótt við uppkomu SARS-CoV-2 heimsfaraldursins er bóluefni sem byggir á kjarnsýrum nýr valkostur, umfram hefðbundið óvirkjað veirubóluefni eða raðbrigða próteinbóluefni. Hér greinum við frá DNA bóluefni sem inniheldur spike genið til afhendingar með rafporun. Gaddagenin SARS-CoV og SARS-CoV-2 voru fínstillt fyrir tjáningu spendýrafrumna og síðan klónuð inn í tjáningarferjur spendýrafrumna, kallaðar pSARS-S og pSARS2-S, í sömu röð. Spike prótein tjáning var staðfest með immunoblotting eftir tímabundna tjáningu í HEK293T frumum. Eftir ónæmisaðgerð var sermi safnað fyrir mótefnavakasértæk mótefni og hlutleysandi mótefnatítragreiningu. Við komumst að því að bæði pSARS-S og pSARS2-S ónæmisaðgerðir olli svipuðu magni mótefna gegn S2 af SARS-CoV-2. Aftur á móti framkallaði aðeins pSARS2-S ónæmisaðgerð mótefni gegn viðtakabindandi léni SARS-CoV-2. Við komumst ennfremur að því að pSARS2-S ónæmisaðgerð, en ekki pSARS-S ónæmisaðgerð, gæti framkallað mjög háa títra hlutleysandi mótefna gegn SARS-CoV-2. Við greindum frekar SARS-CoV-2 S próteinsértæk T-frumuviðbrögð og komumst að því að ónæmissvörunin var hlutdræg í átt að Th1. Mikilvægt er að pSARS2-S bólusetning í hömstrum gæti framkallað verndandi ónæmi gegn SARS-CoV-2 áskorun in vivo. Þessi gögn benda til þess að DNA bólusetning gæti verið vænleg aðferð til að verjast COVID-19.


Desert ginseng—Improve immunity (23)

cistanche ávinningur-styrkir ónæmiskerfið

Samantekt höfunda

SARS-CoV-2 heldur áfram að ógna heilsu heimsins og þróun SARS-CoV-2 bóluefnisins er brýnt forgangsverkefni til að stöðva COVID-19 faraldurinn. Hér þróuðum við DNA bóluefni sem innihalda spike genið frá SARS-CoV-2 og afhent með rafporun. Við sáum að DNA bóluefnið framkallaði langvarandi húmorsvörun gegn SARS-CoV-2 og framkölluð sermismótefni lokuðu á skilvirkan hátt bindingu SARS-CoV-2 RBD við inngangsviðtaka þess (ACE2). Mikilvægt er að DNA bóluefnið framkallaði sterk Th1-hlutdræg ónæmissvörun gegn SARS-CoV-2, sem gæti veitt verndandi áhrif með litlum aukaverkunum. Að lokum sýndum við fram á að SARS-CoV-2 DNA bóluefnið veitti verndandi virkni gegn SARS-CoV-2 sýkingu í sýrlenskum hömstrum. Niðurstöður okkar bentu til þess að DNA bólusetning gæti verið gagnleg aðferð til að hafa hemil á COVID-19 heimsfaraldrinum í náinni framtíð.

Kynning

Smitsjúkdómurinn sem er að koma upp COVID-19, af völdum alvarlegs bráðrar öndunarfæraheilkennis tengdrar kransæðaveiru 2 (SARS-CoV-2), hefur haft veruleg efnahagsleg áhrif í löndum sem urðu fyrir áhrifum af sjúkdómsfaraldrinum 2019–2020 [1]. Á heimsvísu hafa verið meira en 118 milljónir staðfestra tilfella af COVID-19 og meira en 2,6 milljónir manna létust af COVID-19 í mars 2021 [2]. Dánartíðni tilfella á heimsvísu er um það bil 2,2%. Þrátt fyrir að dánartíðni SARS-CoV-2 sé lægri en MERS-CoV og SARS-CoV sýkingar, er smitun þess hærri. Nokkur COVID-19 bóluefni hafa verið samþykkt til bráðanotkunar í desember 2020, en COVID-19 heimsfaraldurinn er enn alþjóðleg ógn þegar þetta er skrifað.

Desert ginseng—Improve immunity (23)

cistanche tubulosa-bæta ónæmiskerfið

Spike (S) prótein er kórónavírus yfirborðsprótein sem er ábyrgt fyrir ferlum við vírustengingu við hýsilviðtaka angíótensín umbreytandi ensím 2 (ACE2), frumuinngangi og samruna vírusfrumuhimnu til að losa veiru-RNA í hýsilfrumur. Meðal byggingarpróteina SARS-CoV er topppróteinið ríkjandi mótefnavaki sem framkallar hlutleysandi mótefni [3]. Byggt á fyrri rannsóknum á SARS og MERS hefur verið sýnt fram á að bóluefni sem byggjast á S-próteinum framkalla hlutleysandi mótefni og T-frumu ónæmissvörun við kransæðaveirum og vernda dýr gegn veiruáföllum [4, 5]. Vegna mikils ónæmisvaldandi áhrifa S próteins gæti það verið hugsanlegt skotmark fyrir SARS-CoV-2 bóluefnisþróun [5–7]. COVID-19 bóluefnisframbjóðendur gætu verið þróaðir með því að nota óvirkjaða veiru, raðbrigða eða tilbúna veiruhluta, raðbrigða veiru eða veiru mRNA eða DNA. Síðarnefnda aðferðin er sérstaklega aðlaðandi vegna þess að hægt er að framleiða veiru-DNA á fljótlegan og auðveldan hátt um allan heim án kaldkeðjukerfis. Þar að auki gæti fullkomlega tilbúið DNA sem er unnið úr röðinni sem kóðar veirupróteinið framkallað bæði húmor og frumumiðlað ónæmissvörun gegn sýkla [8, 9].

DNA bóluefnið er kjörinn bóluefnisvettvangur með nokkra kosti, þar á meðal auðveld hönnun og framleiðslu, stöðugleika við mismunandi hitastig og lágan framleiðslukostnað. Þess vegna er DNA bóluefnisvettvangurinn hentugur fyrir hraða og stórfellda framleiðslu meðan á smitsjúkdómum stendur. Fyrri rannsóknir hafa greint frá því að DNA bóluefni geti á áhrifaríkan hátt örvað frumu- og húmorsvörun gegn sýkla í áskorunarlíkönum [10]. Ennfremur benda nýlegar klínískar rannsóknir til þess að DNA bóluefni séu örugg og áhrifarík til að meðhöndla eða koma í veg fyrir smitsjúkdóma, svo sem HIV-1, Zika veira, ebóluveiru, MERS-CoV og inflúensuveirur [11]. Þar sem COVID-19 heimsfaraldurinn hefur breiðst út um allan heim og alvarlega greindu nýlegar rannsóknir að DNA bóluefni kölluðu fram mótefnavakasértæk T-frumuviðbrögð og hlutleysandi mótefni og vernduðu dýr frekar gegn SARS-CoV-2 áskoruninni [12, 13].

Helsta áskorun DNA bóluefna er léleg skilvirkni DNA afhendingu inn í frumur fyrir tjáningu mótefnavaka og þar af leiðandi léleg virkni bóluefnanna. Til að auka skilvirkni DNA afhendingu er hægt að nota eðlisfræðilegar aðferðir eða efnafræðilegar aðferðir. Eðlisfræðilegu aðferðirnar fela í sér háþrýstingsloftstraum (þ.e. Biojector), gjöf gullagna húðaðs DNA með genabyssu, örnálar og rafporun (EP). Efnafræðilegu aðferðirnar fela í sér lípósóm, vírusóm, nanóagnir og frumupenetríð peptíð [14]. Í Zika-veirufaraldrinum árið 2015 var Zika DNA bóluefni, gefið með rafporun, þróað í 1. stigs klíníska rannsókn innan 7 mánaða.15]. EP ásamt DNA bólusetningu eykur verulega virkni DNA bóluefna [16–18]. Vegna árangursríkra niðurstaðna dýratilrauna eftir DNA bólusetningu með EP hafa mörg mismunandi rafskautatæki verið þróuð fyrir menn, þar á meðal Cellectra® (Inovio Inc., Bandaríkjunum) og TriGrid® (Ichor Medical Systems, Bandaríkjunum).

Þessi rannsókn lýsir DNA bólusetningu með EP sem getur framkallað hlutleysandi mótefni og 1-hlutdræg ónæmissvörun. Hamstrar sem voru bólusettir með þessari tækni mynduðu hlutleysandi mótefni gegn SARS-CoV-2. Ennfremur sýndu bólusettu hamstrarnir verndandi ónæmi í SARS-CoV-2 veiruáskorun.

Aðferðir

Siðferðisyfirlýsing

Allar dýratilraunareglur voru samþykktar af stofnananefnd um umönnun og notkun dýra (IACUC) NHRI (bókun nr: NHRI-IACUC-109077-A).

Cell Lines

Mannsfósturnýrnafrumulína HEK293T var ræktuð í Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, GIBCO) bætt við 10% hitaóvirkjuð fóstursermi (FBS, HyClone), 100 U/mL penicillín/streptomycin (GIBCO) og 2 mM L-glutamine (GIBCO). Vero frumur voru ræktaðar í M199 miðli (GIBCO) með 5% FBS við 37 gráður.

Vírustítrun

SARS-CoV-2 afbrigði (hCoV-19/Taiwan/4/2020 og hCoV-19/Taiwan/78/2020 (D614G afbrigði)) voru fengin frá Centers for Disease Control (CDC) ) í Taívan. Veiran var mögnuð upp í Vero frumum sem ræktaðar voru í M199 miðli bætt við 2 ug/mL TPCK-trypsín (Sigma) við 37 gráður. Veirutíterinn var ákvarðaður með tilliti til 50% sýkingarskammts vefjaræktunar (TCID50) með því að nota staðlaða aðferð [19]. Í stuttu máli var Vero frumum sáð (2,4×104 frumur/hverja brunn) í 96-brunnsplötur og ræktaðar í M199 miðli með 5% FBS við 37 gráður í 24 klst til að mynda einlag. Daginn eftir voru raðþynningar 10-faldaðar og þynntu veirunni (100 μL/brunn) var bætt á Vero frumu einlög með átta endurteknum í hverri þynningu. Eftir 4 daga ræktun við 37 gráður voru vírusvöldum frumuáhrifum (CPE) í hverri brunn skráð og niðurstöðurnar eru gefnar upp sem TCID50/ml samkvæmt aðferð Reed og Muench. Allar tilraunir með SARS-CoV-2 voru gerðar á líföryggisstigi 3 (BSL-3) rannsóknarstofu og voru samþykktar af Taívan CDC.

Desert ginseng—Improve immunity (10)

cistanche ávinningur-styrkir ónæmiskerfið

Smelltu hér til að skoða Cistanche Enhance Immunity vörur

【Biðja um meira】 Netfang:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Plasmíð smíði og einkenni

DNA raðirnar sem kóða fyrir SARS-Spike í fullri lengd (GenBank aðgangsnúmer DQ412574) og SARS-CoV-2 gaddagen (GenBank aðgangsnúmer: MN908947) voru fínstilltar fyrir notkun músakódona og myndaðar af GenScript Biotech. Mismunandi brot af S (tRBD, tRBDTM, tSARS2-S, tSdTM) voru einnig smíðuð og mögnuð hver fyrir sig með PCR. Öll gen voru undirklónuð inn í klínískt notaða ferjuna pVAX1 með Kozak röðinni innlimuð í 5' enda genanna. Plasmíðinu var umbreytt í DH5 E. coli fyrir plasmíð mögnun. Plasmíð voru dregin út og hreinsuð með endotoxínfríu Qiagen súlukerfi (EndoFree Plasmid Mega Kit).

Tímabundin tjáning og vestrænt blettur

HEK293T frumur voru umbreyttar með tilgreindum DNA plasmíðum með því að nota PolyJet™ hvarfefni (SignaGen Laboratories) samkvæmt samskiptareglum framleiðanda. 24 tímum eftir sýkingu voru frumulýsin safnað og þau látin fara í rafdrætti á 8% SDS-PAGE. Próteinin voru síðan flutt yfir á PVDF himnur og þeytt með fjölstofna mótefni fyrir kanínuna (40592-T62, Sino Biological). Piparrótarperoxíðasa (HRP)-tengd mótefni gegn kanínu voru notuð sem aukamótefni. Sérstök prótein á himnunni voru sýnd með ECL hvarfefni (Thermo Scientific).

Dýrabólusetning

BALB/c, C57BL/6 mýs og sýrlenskir ​​hamstrar voru fengnir frá National Laboratory Animal Breeding and Research Center (Taipei, Taívan). Mýs eða hamstrar voru notaðir á aldrinum 6 til 12 vikna. Svæfingar mýs eða hamstrar voru bólusettir með 100 μL af lausn sem innihélt tilgreint DNA á 3-viku millibili, fylgt eftir með rafporun með BTX rafporator (ECM830) með tveggja nála array rafskautum (5-mm þvermál ( BTX 45–0121)). Rafskaut í vöðva var framkvæmd við 75 V stöðuga spennu með 10 púlsum við 50 msek/púls og 100 msek á milli púlsa. Blóðsýnum af músum og hömstrum var safnað með blóðsýnatöku undir kjálka eða afturhvarf. Öll dýrin voru geymd á Rannsóknardýrastöð Heilbrigðisrannsóknastofnunarinnar (NHRI) og þeim haldið í samræmi við dýraverndarreglur stofnana.

Ónæmisprófun

Tilvist S-sértæk mótefna í sermi var ákvörðuð með ELISA. Í stuttu máli voru 50 μL af 4 ug/mL raðbrigða próteini (Sino Biological) í 0.1 M karbónatbuffi (pH 9,5) húðuð á 96-brunn örplötur með ræktun yfir nótt við 4 gráðu. Húðaðar plötur voru þvegnar tvisvar með 0,05% Tween 20 í PBS og síðan lokaðar með 3% BSA í PBS við stofuhita í 2 klukkustundir. Þynnt sermi frá bólusettum dýrum var sett á brunna við stofuhita í 2 klukkustundir. Eftir að HRP-tengdu geita-and-mús-IgG (Thermo Scientific) eða HRP-conjugated geita-and-hamstra-IgG (Arigo Biolaboratorie) var bætt við, var greiningin þróuð með því að nota SureBlue TMB 1-Component Peroxidase Substrate (KPL). Gleypið var mælt með því að nota ELISA lesanda við 450 nm.

Hlutleysing SARS-CoV-2 veirusýkingar

Vero frumum var sáð (2,4×104 frumur/brunn) í 96-brunnsplötur í 24 klst til að mynda einlag. Forónæmissermi og mótsæri gegn SARS-CoV-2 S próteini voru formeðhöndluð við 56 gráður í 30 mínútur til að eyða hitaóþolandi ósértækum veiruhamlandi efnum. Sermi voru þynnt í upphafsþynningu 1/20 með M199 miðli, bætt í brunn sem innihélt 200 TCID50 af SARS-CoV-2 veiru í rúmmáli 0,2 ml og síðan ræktuð við 37 gráður í 2 klst. Í kjölfarið var vírus-sermi blandan sáð á Vero frumu einlög og ræktuð við 37 gráður. Fjórfalt var útbúið fyrir hverja sermisþynningu. CPE eiginleikar í hverri holu voru skráðir eftir 4-5 daga ræktun. Hlutleysingartítrinn var í réttu hlutfalli við hæstu þynningu sermis sem kom í veg fyrir sýkingu í 50% fjórfaldra sáninga.

ACE2 keppni ELISA

ACE2 keppnis ELISA var framkvæmd með því að nota Anti-SARS-CoV-2 hlutleysandi mótefnatíter Serologic Assay Kit (ACROBiosystems) í samræmi við ráðlagða siðareglur. Í stuttu máli, 96-brunnsplötur voru húðaðar með 0.5 ug/mL SARS-CoV-2-S RBD próteini yfir nótt við 4 gráður. Platan var þvegin og stífluð með stífpúðalausn við 37 gráður í 1,5 klst. Eftir þrjá þvotta var bíótínýleruðu ACE2 úr mönnum (0.12 ug/mL) bætt við brunnana, fylgt eftir með þynningu á sermissýnunum og ræktun við 37 gráður í 1 klukkustund. Til að búa til staðlaða feril var and-SARS-CoV-2 hlutleysandi mótefni, eins og settið var með, notað sem viðmiðun. Platan var þvegin og streptavidín-HRP vinnulausn var bætt við hvern brunn í 1 klukkustund við 37 gráður. Platan var síðan þvegin og greiningin var þróuð með ræktun með TMB hvarfefnisvinnulausn við 37 gráður í 20 mínútur. Hvarfið var stöðvað með stöðvunarlausn sem fylgir með. Gleypið var mælt með því að nota ELISA lesanda við 450 nm. Samkeppnisvirkni mótefna í sermi var gefin upp sem samsvarandi magn viðmiðunarmótefna.

Cýtókín framleiðslupróf

T-frumuviðbrögð voru metin með því að nota cytokine ELISA. Miltfrumur úr bólusettum músum voru húðaðar með þéttleikanum 5×106 frumur í hverri brunn í 24-brunnsplötum. Frumurnar voru örvaðar með 5 ug/mL raðbrigða SARS-CoV-2 Spike próteini (ACROBiosystems) við 37 gráður í 3 daga. Fljótandi vökvinn var safnað og prófaður með tilliti til frumumyndunar. Mús IL-2, IL-5, IL-13 og IFN- voru magngreind með ELISA með því að nota samsvarandi mótefnasett (Invitrogen) í samræmi við leiðbeiningar framleiðanda.

Dýraáskorun

Sýrlenskir ​​hamstrar (n=8 í hverjum hópi) voru bólusettir í vöðva með nálsprautun með plasmíði DNA (100 ug/dýr), fylgt eftir með BTX rafporun eins og nefnt er hér að ofan. Fjórum vikum eftir síðustu bólusetningu voru hamstarnir skornir í nefið með 105 TCID50 SARS-CoV-2 (hCoV-19/Taiwan/4/2020) í 50 μL undir svæfingu ísóflúran. Líkamsþyngd þeirra (n=4 á hóp) var skráð á hverjum degi í 9 daga eftir áskorunina. Fjórum hömstrum í hverjum hópi var fórnað á 3. degi eftir áskorun til að mæla veirumagn. Til að ákvarða veirumagn í lungum var vinstri lungnavefur einsleitur í 2 ml af PBS með því að nota gentleMACS® Dissociator (Miltenyi Biotec). Eftir skilvindu við 600 xg í 5 mínútur var hreinsaða flotið safnað fyrir lifandi veiru títrun (TCID50 prófun) og veiru RNA magngreiningu.

Magngreining á veiru RNA hleðslu

Skýrt flot af einsleitum vinstri lungnavef frá SARS-CoV-2-sýktum hamsturum var safnað til að greina veiruálag. RNA útdráttur var framkvæmdur á vefjafljótandi vökva sem var leystur með TRIzol LS (Ambion), og 10 ng af RNA var notað sem sniðmát fyrir RT-qPCR viðbrögð. RT-qPCR var framkvæmt á QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System (ABI) með því að nota KAPA PROBE FAST Universal One-Step qRT-PCR settið (KR1282, Roche) með primerum og rannsaka sem eru sértækar fyrir SARS-CoV-2 (E_Sarbeco áfram: ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT, E_Sarbeco afturábak: ATATTGCAGCAGTACGCACACA, E_Sarbeco rannsaka: FAM-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-BHQ1) [20].

Cistanche deserticola—improve immunity (7)

Kostir cistanche tubulosa-styrkja ónæmiskerfið

Tölfræðigreining

Tölfræðileg gögn voru búin til með GraphPad Prism hugbúnaði. Tölfræðilega mikilvægi mismunarannsókna milli tilraunahópa var ákvarðað með tvíhliða Mann-Whitney prófinu. Mismunur var talinn tölfræðilega marktækur ef p-gildið var minna en eða jafnt og 0.05.

Niðurstöður

Plasmíðbygging og mótefnavaka tjáning bóluefnisframbjóðenda

Fimm afbrigði af SARS-CoV-2 og einni SARS-CoV smíði sem innihélt mismunandi brot af spike próteinkóða DNA voru mynduð (Mynd 1A). Vegna þess að tjáning mótefnavaka var í sterkri fylgni við virkni bóluefnisins, hönnuðum við mismunandi spike próteinbrot, þar á meðal RBD (aa319-aa541), RBD til TM (aa319-aa1236), eða Spike with transmembrane domain (TM) brottfall (aa13-aa1213), með plasmínógenvirkjun í mönnum (tPA) leiðtogaröð sem getur aukið seytingu mótefnavaka [21]. RBD til TM lénið getur haldið S2 léninu sem er mikilvægt til að mynda sex helix uppbyggingu fyrir frumusamruna [22, 23]. Þessar smíðar voru sem hér segir: S af SARS-CoV í fullri lengd (pSARS-S) og SARS-CoV-2 (pSARS2-S), toppur í fullri lengd með leiðara röð vef-plasmínógens virkja (ptSARS2-S), RBD svæði (ptRBD), RBD yfir í himnusvæði (ptRBDTM) og toppur með brottfellingu á yfirhimnusvæðinu (PTSD). Vigur, pSARS-S og pSARS2-S voru umbreyttir inn í og ​​tjáðir í HEK293T frumum. Frumulýsin voru greind með SDS-PAGE. Hægt var að greina S í fullri lengd við samsvarandi mólmassa (Mynd 1B). Afbrigði S af SARS2-CoV-2 með leiðara röð vefja-plasmínógenvirkja greindist með fjölstofna mótefni gegn broddum. Gögnin sýndu að hvert afbrigði sást við væntanlega mólmassa (Mynd 1C). Tjáningarstig ptSARS2-S, ptRBDTM og ptSdTM afbrigða voru svipuð, en ptRBD tjáning var hærri í öllum afbrigðum.

Fig 1. Design and expression of SARS-CoV and SARS-CoV-2 spike construct variants. (A) Schematic diagram of SARS-CoV and SARS-CoV-2 spike construct variants. tPA, leader sequence from tissue-plasminogen activator; TM, transmembrane domain. (B, C) Western blot analysis of spike protein. HEK293T cells were transfected with the indicated plasmids (vector, pSARS-S, pSARS2-S, and S variants fused with the tPA leader sequence). The cell lysates were collected and probed with an anti-spike antibody, and an anti-β-actin antibody was used as an internal control.


Mynd 1. Hönnun og tjáning á SARS-CoV og SARS-CoV-2 gadda smíðafbrigðum.

(A) Skýringarmynd af SARS-CoV og SARS-CoV-2 gaddabyggingarafbrigðum. tPA, leiðtogaröð frá vefja-plasmínógenvirkja; TM, transmembrane domain. (B, C) Western blot greining á topppróteini. HEK293T frumur voru umbreyttar með tilgreindum plasmíðum (vektor, pSARS-S, pSARS2-S og S afbrigði sameinuð tPA leiðara röðinni). Frumulýsunum var safnað og rannsakað með and-spike mótefni og and- -aktín mótefni var notað sem innra eftirlit.

Ónæmingargeta bóluefnisframbjóðenda

Til að kanna ónæmingargetu mismunandi afbrigða var BALB/c músum sprautað tvisvar í vöðva með 3-viku millibili með 100 ug af vektor, pSARS-S og pSARS2-S, fylgt eftir með in vivo rafporun (Mynd 2A). Serum var safnað í viku 4 og viku 6 eftir fyrstu bólusetningu. Gögnin sýndu að sermi úr pSARS-S og pSARS2-S bólusettum dýrum gæti þekkt bæði S- og S2 svæði í fullri lengd SARS-CoV-2 með svipaða IgG mótefnatítra (Mynd 2B og 2C). Aftur á móti gætu sermi frá pSARS2-S bólusettum dýrum hækkað háa and-RBD (SARS-CoV-2) mótefnatítra í viku 4 og viku 6 (Mynd 2D), samanborið við pSARS-S hópinn. Samkvæmt því gætu sermi úr pSARS2-S bólusettum dýrum en ekki pSARS-S bólusettum dýrum hlutleyst SARS-CoV-2 sýkingu (Mynd 2E). Rúmfræðilegir meðaltítrar (log2) hlutleysandi mótefna í pSARS2-S bólusetningarhópnum í viku 4 og 6 voru 9,3 og 10,3, í sömu röð. Þessar niðurstöður gáfu til kynna að pSARS-S ónæmisaðgerð getur ekki framkallað krosshlutleysandi mótefni gegn SARS-CoV-2 sýkingu. RBD-sértæku mótefnin voru mikilvæg fyrir hlutleysandi virkni gegn SARS-CoV-2 sýkingu. S af SARS-CoV-2 í fullri lengd getur örugglega framkallað mikið magn hlutleysandi mótefnatítra gegn SARS-CoV-2 sýkingu.

Fig 2. Antibody response in mice after immunization with SARS-CoV and SARS-CoV-2 S DNA vaccines. (A) BALB/c mice (n = 4 per group) were intramuscularly immunized twice at a 3-week interval with 100 μg of indicated plasmid, followed by electroporation. Serum samples were collected at the indicated time points after the first immunization. (B-D, F, G) Antibodies against the SARS-CoV-2 full-length spike protein, S2 region, and RBD were evaluated by ELISA. (E, H) Vaccine-induced neutralizing antibody against SARS-CoV-2 was evaluated by neutralization assay. Antibody titers are presented as the mean ± SEM, and neutralization titers are expressed as the geometric mean with a 95% confidence interval. *p<0.05 by the Mann-Whitney test.

Mynd 2. Mótefnasvörun í músum eftir bólusetningu með SARS-CoV og SARS-CoV-2 S DNA bóluefni.

(A) BALB/c mýs (n=4 í hverjum hópi) voru bólusettar í vöðva tvisvar með 3-viku millibili með 100 ug af tilgreindu plasmíði, fylgt eftir með rafporun. Sermissýnum var safnað á tilgreindum tímapunktum eftir fyrstu bólusetningu. (BD, F, G) Mótefni gegn SARS-CoV-2 topppróteini í fullri lengd, S2 svæði og RBD voru metin með ELISA. (E, H) Hlutleysandi mótefni af völdum bóluefnis gegn SARS-CoV-2 var metið með hlutleysingarprófi. Mótefnatítrar eru sýndir sem meðaltal ± SEM og hlutleysingartítrar eru gefnir upp sem rúmfræðilegt meðaltal með 95% öryggisbili. *bls<0.05 by the Mann-Whitney test.

Til að kanna frekar hvort skipting leiðtogaröðarinnar geti aukið próteinseytingu, notuðum við leiðararöð úr vefjaplasmínógenvirkja til að bræða saman mismunandi afbrigði af SARS-CoV-2 S próteini. Öll afbrigði innihalda RBD svæði SARS-CoV-2 S próteins. Eftir tvo skammta af DNA bólusetningu voru sermi sem safnað var í viku 4 og viku 6 greint með tilliti til IgG mótefna og hlutleysandi mótefnatítra. Bólusetning með ptSARS2-S olli hærri mótefnatítrum gegn S-próteini í fullri lengd í viku 4 en ptRBD, ptRBDTM og ptSdTM bólusetning (S1A mynd). And-RBD mótefnatítrar á ptRBD ónæmisaðgerð voru hærri en við ptSARS2-S ónæmisaðgerð (1496.2 á móti 530.9, p=0.057) í viku 4 (S1B mynd). Hins vegar, ptRBD og ptSARS2-S ónæmisaðgerð olli svipuðu magni hlutleysandi mótefna í viku 4 (S1C mynd). Sömu niðurstöður sáust í sermigreiningu viku 6; ptRBD ónæmisaðgerð olli hærra magni and-RBD mótefna samanborið við ptSARS2-S ónæmisaðgerð (12589.3 á móti 1000.0, p=0.028) en sama magn hlutleysandi mótefna (9.3) á móti 9,6 (log2)) (mynd 2F, 2G og 2H). Vegna þess að tPA leiðtogaröðu-brædd afbrigði leiddu ekki til hærri hlutleysandi mótefnatítra en pSARS2-S ónæmisaðgerð, notuðum við pSARS2-S til frekari rannsókna.

Samkeppnisbinding sermismótefna og ACE2 við SARS-CoV-2 RBD

Til að kanna getu sermismótefna til að trufla ACE2-RBD milliverkunina, gerðum við samkeppnishæf SARS-CoV-2 sermisgreining. Í þessari greiningu var mótefnum í sermi bætt við ELISA plötur sem voru forhúðaðar með SARS-CoV-2 RBD próteini, fylgt eftir með því að bæta við ACE2 próteini úr mönnum. Sérstakt hlutleysandi mótefni gegn SARS-CoV-2 RBD var notað til viðmiðunar. Eins og sýnt er íMynd 3, sermismótefni frá pSARS2-S bólusettum músum bundust RBD og lokuðu ACE2-bindingu, sem jafngilti um það bil 353 ug/mL viðmiðunarmótefni, en pSARS-S sermi jafngilti 56 ug/mL viðmiðunarmótefni. Þess vegna bentu gögn okkar til þess að pSARS2-S ónæmisaðgerð gæti framkallað samkeppnismótefni sem hindra á skilvirkan hátt bindingu SARS-CoV-2 RBD við ACE2 viðtakann. Þessi niðurstaða var í samræmi við ELISA titer gegn SARS-CoV2 RBD (Mynd 2D), og studd af rannsókninni á mismun RBD raða milli SARS-CoV og SARS-CoV-2 [24].


Fig 3. Competitive activity of immunized mouse sera against the RBD/ACE2 interaction. BALB/c mice (n = 4 per group) were intramuscularly immunized twice at a 3-week interval with 100 μg of vector, pSARS-S or pSARS2-S, followed by electroporation. Serum samples were collected at week 8 after the first immunization. Serum antibodies that compete with ACE2 for RBD binding were evaluated by competitive SARS-CoV-2 serology assay. The competitive activity of the mouse sera is expressed as the equivalent level of anti-RBD (SARS-CoV-2 spike protein) antibody (reference antibody). Antibody titers are presented as the mean ± SEM. *p<0.05 by the Mann-Whitney test.

Mynd 3. Samkeppnisvirkni bólusettra músaserma gegn RBD/ACE2 víxlverkuninni.

BALB/c mýs (n=4 í hverjum hópi) voru bólusettar í vöðva tvisvar með 3-viku millibili með 100 ug af vektor, pSARS-S eða pSARS2-S, fylgt eftir með rafporun. Sermissýni voru tekin í viku 8 eftir fyrstu bólusetningu. Mótefni í sermi sem keppa við ACE2 um RBD-bindingu voru metin með samkeppnishæfri SARS-CoV-2 sermisgreiningu. Samkeppnisvirkni sermi músa er gefin upp sem jafngildi and-RBD (SARS-CoV-2 toppprótein) mótefnis (viðmiðunarmótefni). Mótefnatítrar eru sýndir sem meðaltal ± SEM. *bls<0.05 by the Mann-Whitney test.

SARS-CoV-2 S DNA bóluefni af völdum langtíma húmorsónæmi og boðið upp á krossvörn gegn SARS-CoV-2 með D614G stökkbreytingu

Sérstaklega sást langtíma viðhald IgG mótefnatítra gegn S í fullri lengd 20 vikum eftir fyrstu bólusetningu (Mynd 4A). Rúmfræðilegir meðaltítrar (log2) fyrir SARS-CoV-2 hlutleysandi mótefni náðu 10,8 í viku 8 eftir pSARS2-S bólusetningar, lækkuðu lítillega í 9,1 í viku 12 og í 8,8 í viku 20 (Mynd 4B). Þessar niðurstöður bentu til þess að pSARS2-S bólusetning veitir langvarandi húmorsvörun gegn SARS-CoV-2. Ennfremur framkallaði pSARS2-S DNA bóluefnið með D614 arfgerðinni hlutleysandi mótefnasvörun gegn veirunni sem inniheldur D614G stökkbreytinguna (Mynd 4C), sem er svipað hlutleysingartítra gegn D614 arfgerðinni. Þess vegna er pSARS2-S fær um að veita krossvörn gegn algengustu og ríkjandi D614G afbrigði SARS-CoV-2.

Fig 4. SARS-CoV-2 S DNA vaccine induced long-term humoral immunity and cross-protection against the SARS-CoV-2 with D614G mutation. BALB/c mice (n = 4 per group) were intramuscularly immunized three times at a 3-week interval with 100 μg of vector, pSARS-S or pSARS2-S, followed by electroporation. Serum samples were collected at the indicated time points after the first immunization. (A) Antibodies against the SARS-CoV-2 full-length spike protein were evaluated by ELISA. (B, C) Vaccine-induced neutralizing activity against SARS-CoV-2 with D614 or G614 genotypes was evaluated by neutralization assay. Antibody titers are presented as the mean ± SEM, and neutralization titers are expressed as the geometric mean with a 95% confidence interval. *p<0.05 by the Mann-Whitney test.

Mynd 4. SARS-CoV-2 S DNA bóluefni framkallaði langtíma húmorónæmi og krossvörn gegn SARS-CoV-2 með D614G stökkbreytingu.

BALB/c mýs (n=4 í hverjum hópi) voru bólusettar þrisvar sinnum í vöðva með 3-viku millibili með 100 ug af vektor, pSARS-S eða pSARS2-S, fylgt eftir með rafporun. Sermissýnum var safnað á tilgreindum tímapunktum eftir fyrstu bólusetningu. (A) Mótefni gegn SARS-CoV-2 topppróteini í fullri lengd voru metin með ELISA. (B, C) Hlutleysandi virkni af völdum bóluefnis gegn SARS-CoV-2 með D614 eða G614 arfgerðum var metin með hlutleysunarprófi. Mótefnatítrar eru sýndir sem meðaltal ± SEM og hlutleysingartítrar eru gefnir upp sem rúmfræðilegt meðaltal með 95% öryggisbili. *bls<0.05 by the Mann-Whitney test.

Framleiðsla Th1- Eða Th2-hlutdræg svör

Effector CD4+ T-frumur má skipta niður í tvö helstu starfhæfa undirmengi, Th1 og Th2, byggt á seyttum cýtókínum við virkjun. Th1 frumur framleiða bólgusýtókín (IFN-) og taka þátt í frumumiðluðum ónæmissvörun gegn innanfrumubakteríum og vírusum, en Th2 frumur sem seyta hjálpa B-frumum að framleiða mótefni en stuðla einnig að eósínófílmiðluðu ónæmi (IL-5 og IL{ {9}}), sem leiðir til húmors eða ofnæmisviðbragða [25, 26]. Þar að auki getur Th2 frumuháð kerfi stuðlað að bóluefnistengdum auknum öndunarfærasjúkdómi (VAERD), eins og rannsóknir á SARS-CoV bóluefnisframbjóðendum sýna [27, 28], sem undirstrika að jafnvægi T-frumuviðbragðs er mikilvægt fyrir örugga þróun COVID-19 bóluefnis [29]. Til að leysa þetta vandamál voru BALB/c og C57BL/6 mýs bólusettar með vektor, pSARS-S og pSARS2-S tvisvar með 3-viku millibili. Músum var fórnað 7 dögum eftir seinni bólusetninguna og miltisfrumur voru örvaðar með SARS-CoV-2 S próteini (5 ug/mL) í 3 daga. Í BALB/c músum (Mynd 5A–5D), seyting Th1 tegundar frumuefna IFN- (19641,3 pg/mL ± 8823,5) og IL-2 (599,5 pg/mL ± 37,7) var mikil eftir örvun með S próteini í pSARS2-S bólusetningarhópi, en mjög lágt magn Th2-gerð cýtókína IL-5 (18,1 pg/mL ± 11,8) og IL-13 (567,2 pg/mL ± 166,2) greindist. Svipaðar niðurstöður sáust hjá C57BL/6 músum, pSARS2-S bólusetningarhópur olli meira magni af IFN- (33918,8 pg/mL ± 11646,1) og IL-2 (800,3 pg/mL ± 109,5) en það af IL-5 (4,6 pg/mL ± 2,9) og IL-13 (545,7 pg/mL ± 117,4) (Mynd 5E–5H). Þessi gögn bentu til þess að pSARS2-S gæti framkallað 1-hlutdræg ónæmissvörun.

Fig 5. T cell response in mice after immunization with pSARS-S and SARS2-S DNA vaccines. BALB/c (A-D) and C57BL/6 (E-H) mice (n = 4 per group) were intramuscularly immunized twice at a 3-week interval with 100 μg of vector, pSARS-S or pSARS2-S, followed by electroporation. Splenocytes were collected at week 4 after the first immunization, and the levels of secreted IFN-γ (A, E), IL-2 (B, F), IL-5 (C, G), and IL-13 (D, H) were evaluated after restimulation with recombinant SARS-CoV-2 S protein. Antibody titers are presented as the mean ± SEM. *p<0.05 by the Mann-Whitney test.

Mynd 5. T frumusvörun í músum eftir bólusetningu með pSARS-S og SARS2-S DNA bóluefnum.

BALB/c (AD) og C57BL/6 (EH) mýs (n=4 í hverjum hópi) voru bólusettar í vöðva tvisvar með 3-viku millibili með 100 ug af vektor, pSARS-S eða pSARS{{ 8}}S, fylgt eftir með rafporun. Miltafrumum var safnað í viku 4 eftir fyrstu bólusetningu og magn seyttra IFN- (A, E), IL-2 (B, F), IL-5 (C, G) og IL -13 (D, H) voru metin eftir endurörvun með raðbrigða SARS-CoV-2 S próteini. Mótefnatítrar eru sýndir sem meðaltal ± SEM. *bls<0.05 by the Mann-Whitney test.

Fyrirbyggjandi virkni DNA bóluefna gegn SARS-CoV-2 áskorun

Til að kanna verndandi virkni pSARS2-S bólusetningar, voru sýrlenskir ​​hamstrar bólusettir tvisvar með 100 ug DNA með 3-viku millibili og smitaðir í nef með SARS-CoV-2 veirunni í viku 7 (Mynd 6A). Eftir bólusetningu var sermi í viku 4 og viku 6 safnað fyrir mótefnatítra (IgG) og hlutleysandi mótefnatítra. Bólusetning með pSARS2-S olli hærra magni and-Spike mótefnatítra en ptRBD bólusetning í viku 4 (1584.9 á móti 50.1) og viku 6 (1995.3 á móti 63.1) í hömstrum (Mynd 6B). Í samræmi við and-Spike mótefnatítrana jók sermi pSARS2-S-ónæmishamstra upp mjög háa hlutleysandi mótefnatítra (6,5 í viku 4 og 6,4 í viku 6 (log2)), en sermi af vektor- eða ptRBD-ónæmdir hamstrar gerðu það ekki (Mynd 6C). Eftir áskorunina með SARS-CoV-2 var fylgst með líkamsþyngd hamstsins á hverjum degi. Fyrri rannsóknir leiddu í ljós að veirumagn í lungum hamstra náði háu stigi 3 dögum eftir áskorun [30]. Því var helmingi hamstra úr hverjum hópi fórnað á 3. degi og veirumagn í lungum greind. Líkamsþyngd bólusettra hamstra minnkaði smám saman og hlutfall líkamsþyngdar sem tapaðist var 11,1% 6 dögum eftir áskorun. Aftur á móti verndaði pSARS2-S bólusetning hamstra gegn líkamsþyngdartapi (Mynd 6D). Ennfremur sýndu smitveirutítrar og fjöldi veiru-RNA-eintaka í pSARS2-S hópnum 2,29 og 1,37 log10 lækkun samanborið við vektorviðmiðunarhópinn (Mynd 6E og 6F). Þessar niðurstöður bentu til þess að pSARS2-S bólusetning veiti vörn gegn SARS-CoV-2 sýkingu í sýrlenskum hamstum.

Fig 6. Prophylactic efficacy of SARS-CoV-2 S DNA vaccine in SARS-CoV-2-infected hamsters. (A) Time course of DNA vaccination and SARS-CoV-2 challenge. Syrian hamsters were intramuscularly immunized twice at a 3-week interval with 100 μg of control, pSARS-S or pSARS2-S, followed by electroporation. Serum samples were collected by retroorbital blood sampling at weeks 4 and 6 after the first immunization. At 4 weeks after the second immunization, Syrian hamsters were intranasally challenged with 105 TCID50 SARS-CoV-2. (B) Antibodies against the SARS-CoV-2 full-length spike protein were evaluated by ELISA. (C) Vaccine-induced neutralizing activity against SARS-CoV-2 was evaluated by neutralization assay. (D) Body weight change (%) of the hamsters was recorded every day after the SARS-CoV-2 challenge. Virus titers (E) and viral RNA copies (F) in the lungs of SARS-CoV-2-infected hamsters at 3 days post-challenge were determined by TCID50 assay and qRT-PCR, respectively. Antibody titers are presented as the mean ± SEM, and neutralization titers are expressed as the geometric mean with a 95% confidence interval. *p<0.05, ***p<0.001 by the Mann-Whitney test.

Mynd 6. Fyrirbyggjandi verkun SARS-CoV-2 S DNA bóluefnis í SARS-CoV-2-sýktum hömstrum.

(A) Tímaferli DNA bólusetningar og SARS-CoV-2 áskorunar. Sýrlenskir ​​hamstrar voru bólusettir í vöðva tvisvar með 3-viku millibili með 100 ug af viðmiðunarefni, pSARS-S eða pSARS2-S, fylgt eftir með rafporun. Sermissýni voru tekin með afturorbital blóðsýni í viku 4 og 6 eftir fyrstu bólusetningu. 4 vikum eftir seinni bólusetninguna fengu sýrlenskir ​​hamstrar 105 TCID50 SARS-CoV-2 í nef. (B) Mótefni gegn SARS-CoV-2 topppróteini í fullri lengd voru metin með ELISA. (C) Hlutleysandi virkni af völdum bóluefnis gegn SARS-CoV-2 var metin með hlutleysingarprófi. (D) Líkamsþyngdarbreyting (%) hamstra var skráð á hverjum degi eftir SARS-CoV-2 áskorunina. Veirutítrar (E) og veiru-RNA-eintök (F) í lungum SARS-CoV-2-sýktra hamstra 3 dögum eftir ögrun voru ákvörðuð með TCID50 prófi og qRT-PCR, í sömu röð. Mótefnatítrar eru sýndir sem meðaltal ± SEM og hlutleysingartítrar eru gefnir upp sem rúmfræðilegt meðaltal með 95% öryggisbili. *bls<0.05, ***p<0.001 by the Mann-Whitney test.

Umræða

Meira en 80 klínískar rannsóknir á COVID-19 bóluefni hafa verið settar af stað og rannsóknir á ónæmisgetu og veiruáskorun hjá dýrum eru mikilvæg skref í þróunarferli bóluefnisins. DNA bóluefni fyrir SARS-CoV-2 sýkingu hafa verið þróuð ákaft fyrir mismunandi afhendingaraðferðir. Raflosun er efnileg nálgun sem getur aukið DNA afhendingu og mótefnavaka ónæmisvaka in vivo. Greint hefur verið frá tveimur DNA bóluefnisrannsóknum, af Yu o.fl. [13] og Smith o.fl. [12]. Yu et al. found that rhesus macaques immunized with naked DNA encoding full-length S protein (without electroporation) exhibited >3.1 log10 lækkun á veirumagni í berkju- og lungnaskolun eftir áreiti samanborið við viðmið. Smith o.fl. komist að því að bólusetning á músum og naggrísum með INO-4800 (kóðar S-prótein í fullri lengd) með rafporun gæti framkallað hlutleysandi mótefni gegn SARS-CoV-2 sýkingu og hindrað bindingu S-próteins við ACE2 viðtaka. ekki veita dýraárásargögn. Í þessari skýrslu metum við mismunandi afbrigði fyrir DNA-bóluefnisframbjóðendur og komumst að því að S-próteinið í fullri lengd (pSARS2-S) hentar best fyrir frekari ónæmisfræðilegar rannsóknir. Þó að SARS-CoV og SARS-CoV-2 deili 76% samlíkingu í S próteinum [31, 32], pSARS-S ónæmisaðgerð getur ekki framkallað mótefni gegn RBD SARS-CoV-2 S próteins eða hlutleysandi mótefnatítra gegn SARS-CoV-2 sýkingu (Mynd 2). Reyndar gegna and-RBD mótefni mikilvægu hlutverki við að hindra veirusýkingu. Hins vegar myndaði bólusetning með RBD eingöngu (ptRBD) háa hlutleysandi mótefnatítra í músum en ekki í hömstrum (myndir.2Hog6C). Við veltum því fyrir okkur að þessi niðurstaða gæti stafað af því að merkjapeptíðið (vefja-plasmínógenvirkjari) gæti ekki auðveldað seytingu RBD próteins í hömstrum. Nákvæmt fyrirkomulag krefst frekari rannsókna í framtíðinni. Við tókum einnig fram að ptRBDTM (sem kóðar brot úr RBD yfir í himnusvæði S) ónæmisaðgerð olli lægri hlutleysandi mótefnatítra en ptRBD ónæmisaðgerð (myndir.2HogS1C). Niðurstöðurnar gætu endurspeglað óstöðuga uppbyggingu RBD-TM próteinsins. Til að rannsaka Th1/Th2 ónæmissvörun frekar, voru miltisfrumur úr bólusettum músum örvaðar með SARS-CoV-2 S próteini. Við komumst að því að pSARS2-S ónæmisaðgerð olli sterkri Th1-hlutdræg ónæmissvörun með hærra magni IFN- -seytingar eftir örvun (Mynd 5), en pSARS-S bólusetning framkallaði aðeins lítið magn af IFN- -seytingu. Þessi gögn gáfu til kynna að víxlviðbrögð T-frumuviðbragða milli topppróteins SARS-CoV og SARS-CoV-2 sé ekki mikil (Mynd 5). Ennfremur leiddi IFN-ELISPOT prófun í ljós að færri T frumu svör greindust gegn S1 svæðinu í C57BL/6 og BALB/c músum sem voru bólusettar með pSARS-S (S2 mynd), sem einnig er studd af rannsókn Smith [12]. Þessi gögn gáfu til kynna að SARS bóluefnið gæti ekki haft fulla verndandi áhrif gegn SARS-CoV-2 sýkingu. Þróun DNA bóluefna er mikilvæg fyrir skjót viðbrögð við heimsfaraldri kórónavírussýkingu. Þess vegna gæti árangur DNA bóluefnisins gegn SARS-CoV-2 verið beitt á aðra smitsjúkdóma sem eru að koma upp.

Mismunandi smíðin sem notuð voru í SARS-SoV-2 DNA bóluefninu ollu mismunandi stigum hlutleysandi mótefnatítra. tPA leiðtogaröðin hefur verið notuð til að auka mótefnavaka tjáningu og seytingu í DNA bóluefnum [21, 33–35]. Hins vegar jók tPA leiðtogaröðin ekki marktækt mótefnatítra í þessari skýrslu. Til að auka enn frekar virkni bóluefnisins væri hægt að nota mismunandi leiðararaðir til að skipta um innfædda leiðararöð topppróteinsins. IgE leiðtogaröðin var notuð í INO-4800 DNA bóluefninu og MERS-CoV bóluefninu [5, 12]. Að auki getur breytta topppróteinröðin einnig aukið ónæmingargetu bóluefnisins. Stöðugt toppprótein hefur verið hannað með því að stökkbreyta fúrínstaðnum og öðrum svæðum til að mynda forblöndunarbyggingu (S-2P) sem getur aukið tjáningu topppróteinsins ~10-falt [36]. Tilvalið DNA bóluefni ætti að hámarka plasmíð DNA byggingu og afhendingarkerfi til að auka prótein tjáningu.

Desert ginseng—Improve immunity

cistanche tubulosa-bæta ónæmiskerfið

Dýralíkön eru mikilvæg fyrir þróun COVID-19 bóluefna. Nokkur dýralíkön hafa verið notuð til að meta virkni COVID-19 bóluefna, þar á meðal prímata sem ekki eru menn [13, 37], erfðabreyttar ACE2 manna mýs [38], og sýrlenskir ​​hamstrar [39]. Sýrlenskur hamstur ACE2 hefur mikla líkingu við ACE2 úr mönnum og spáð var meiri bindandi sækni hans við S prótein SARS-CoV-2 en ACE2 í músum [40]. Þetta er ástæðan fyrir því að erfðabreyttar ACE2 mýs úr mönnum voru notaðar sem SARS-CoV-2 áskorunarlíkön, en ekki villigerðar mýs. SARS-CoV-2 smitrannsóknir hafa sýnt að vírusinn getur á skilvirkan hátt smitað barnalega hamstra með beinni snertingu eða með úðabrúsum [41]. Sýking í nefi af SARS-CoV-2 getur endurtekið og framkallað meingerð í lungum sýrlenskra hamstra [30]. This study and previous reports also showed that SARS-CoV-2 infection caused approximately a 10% reduction in the initial body weight of hamsters. Clinical manifestations of patients with COVID-19, including changes in smell and taste, and severe respiratory distress, might be accompanied by weight loss (>5% lækkun frá grunnlínu), sem tengdist lengri sjúkdómstíma [42]. Þessar niðurstöður benda til þess að sýrlenski hamsturinn sé einnig hentugt dýralíkan til að meta COVID-19 bóluefni. Byggt á tiltækum dýralíkönum völdum við hamstra sem SARS-CoV-2 áskorunarlíkan til að meta virkni bóluefnisins. Gögnin okkar sýndu að bólusetning með pSARS2-S, en ekki ptRBD, getur framkallað háa títra and-Spike IgG mótefna og hlutleysandi mótefnatítra (Mynd 6B og 6C). Samkvæmt því mynduðu pSARS2-S-ónæmdir hamstrar, en ekki ptRBD-ónæmir hamstrar, ónæmissvörun gegn SARS-CoV-2 áskoruninni. Við tókum fram að ptRBD ónæmisaðgerð gæti framkallað mikið magn hlutleysandi mótefnatítra í músum en ekki í hömstrum. Misvísandi niðurstöður geta verið vegna þess að RBD eitt og sér kemur ekki stöðugt fram hjá hömstrum. Hamstralíkanið var einnig notað til að meta adenovirus sermisgerð 26 (Ad26) bóluefni gegn COVID-19 sem byggir á vektor. Ein bólusetning með bóluefninu sem byggir á Ad26 vektor sem tjáir stöðugt SARS-CoV-2 toppprótein sem framkallaði hlutleysandi mótefnasvörun og verndaði gegn SARS-CoV-2 sýkingu olli þyngdartapi, dánartíðni að hluta og veiruafritun í lungum [39]. Þessar niðurstöður gáfu til kynna að hamstralíkanið henti til að meta virkni COVID-19 bóluefna.

Mikið af SARS-CoV-2 bóluefnisþróunarstarfi byggist á rannsóknarreynslu MERS-CoV og SARS-CoV. Á heimsvísu hafa nokkur COVID-19 bóluefni verið samþykkt til nýrrar notkunar í desember 2020, þar á meðal COVID-19 bóluefni sem byggjast á RNA- og adenóveiruferjurum. Rætt hefur verið um kosti og galla mismunandi bóluefna [43]. Adenóveiru bóluefni geta framkallað sterkari ónæmissvörun en DNA og mRNA bóluefni, en bóluefnisvirkni þeirra gæti minnkað með fyrirliggjandi ónæmi gegn ad vektorum [44]. Í samanburði við DNA bóluefni þarf mRNA bóluefni ofurlágt hitastig til geymslu og flutnings [45]. Þess vegna gæti DNA bóluefnið verið hugsanlegur bóluefnisvettvangur, sérstaklega við notkun í neyðartilvikum.

Rannsókn okkar bendir á möguleikann á DNA bóluefni fyrir menn. Frekari rannsóknir gætu kannað virkni þessa DNA bóluefnis sem gefið er með inndælingu í húð (ID), sem er þægilegra fyrir klíníska notkun, vegna þess að nálin fyrir im inndælingu er um það bil 18 mm djúp hjá mönnum og hefur áhrif á fleiri vefi en ID inndælingu með EP. Ennfremur ætti að prófa virkni bóluefnisins á öldruðum músum sem fyrirmynd fyrir aldraða menn, vegna þess að þetta þýði verður sérstaklega fyrir alvarlegum áhrifum þegar það er sýkt af SARS-CoV-2. Fyrri rannsóknir sýndu að Th2 frumusvörun hefur tengst auknum öndunarfærasjúkdómi (VAERD) eftir bólusetningu óvirkra veirubóluefna gegn RSV [46], mislingaveira [47], og SARS-CoV [27, 48]. Aftur á móti er greint frá minna alvarlegum tilfellum af SARS-CoV sem stafar af örvun Th1 frumusvörunar [49]. Þess vegna benda hinar sterku þ1-hlutdrægu ónæmissvörun sem DNA bóluefnið framkallar til þess að ólíklegt sé að aukaverkanir séu stórt vandamál [50]. Að auki hafa áhyggjur af próteinbundnum bóluefnum vaknað vegna notkunar álsalts eða olíu-í-vatns fleyti-gerðar hjálparefna, sem leiða til 2-hlutdrægra ónæmissvörunar og auka hugsanlegar aukaverkanir [51, 52]. Í stuttu máli, COVID-19 DNA bóluefnið gæti gegnt stóru hlutverki við að hafa hemil á heimsfaraldri COVID-19 í náinni framtíð.

Heimildir

  1. Pak A, Adegboye OA, Adekunle AI, Rahman KM, McBryde ES, Eisen DP. Efnahagslegar afleiðingar COVID-19 faraldursins: Need for Epidemic Preparedness. Front Public Health. 2020;8:241. pmid: 325743072. Miðstöð fyrir kerfisvísindi og verkfræði (CSSE) [Internet]. COVID-19 mælaborð. Johns Hopkins háskólanum. [vitnað 2021 11. febrúar]. Fáanlegur frá:
  2. 3.Buchholz UJ, Bukreyev A, Yang L, Lamirande EW, Murphy BR, Subbarao K, o.fl. Framlag byggingarpróteina kransæðavíruss alvarlegs bráðs öndunarfæraheilkennis til verndar ónæmis. Proc Natl Acad Sci US A. 2004;101(26):9804–9. pmid: 15210961
  3. 4. Yang ZY, Kong WP, Huang Y, Roberts A, Murphy BR, Subbarao K, o.fl. DNA bóluefni framkallar SARS kransæðaveiruhlutleysi og verndandi ónæmi í músum. Náttúran. 2004;428(6982):561–4. pmid: 15024391
  4. 5. Muthumani K, Falzarano D, Reuschel EL, Tingey C, Flingai S, Villarreal DO, et al. Tilbúið samsvörun DNA bóluefni gegn toppa próteini framkallar verndandi ónæmi gegn kórónuveirunni í Miðausturlöndum í ómannlegum prímötum. Sci Transl Med. 2015;7(301):301ra132. pmid: 26290414
  5. 6. Krammer F. SARS-CoV-2 bóluefni í þróun. Náttúran. 2020;586(7830):516–27. pmid: 32967006
  6. 7. Khalaj-Hedayati A. Hlífðarónæmi gegn SARS undireiningabóluefnisframbjóðendum Byggt á Spike Protein: Lessons for Coronavirus Vaccine Development. J Immunol Res. 2020;2020:7201752. pmid: 32695833
  7. 8.Lu B, Tao L, Wang T, Zheng Z, Li B, Chen Z, o.fl. Húmorísk og frumuónæmissvörun framkölluð af 3a DNA bóluefnum gegn alvarlegu bráðu öndunarfæraheilkenni (SARS) eða SARS-líkri kransæðaveiru í músum. Clin Vaccine Immunol. 2009;16(1):73–7. pmid: 18987164
  8. 9.Bower JF, Yang X, Sodroski J, Ross TM. Framleiðsla hlutleysandi mótefna með DNA bóluefnum sem tjá leysanlega stöðuga ónæmisbrestsveiru af tegund 1 hjúp glýkópróteinþrímera sem eru samtengdir við C3d. J Virol. 2004;78(9):4710–9. pmid: 15078953
  9. 10. Zakhartchouk AN, Viswanathan S, Moshynskyy I, Petric M, Babiuk LA. Hagræðing á DNA bóluefni gegn SARS. DNA frumu Biol. 2007;26(10):721–6. pmid: 17665998
  10. 11.Gary EN, Weiner DB. DNA bóluefni: besti tíminn er núna. Curr Opin Immunol. 2020;65:21–7. pmid: 32259744
  11. 12. Smith TRF, Patel A, Ramos S, Elwood D, Zhu X, Yan J, o.fl. Ónæmingargeta DNA-bóluefnis við COVID-19. Nat Commun. 2020;11(1):2601. pmid: 32433465
  12. 13.Yu J, Tostanoski LH, Peter L, Mercado NB, McMahan K, Mahrokhian SH, o.fl. DNA bóluefnisvörn gegn SARS-CoV-2 í rhesus macaques. Vísindi. 2020;369(6505):806–11. pmid: 32434945
  13. 14.Jorritsma SHT, Gowans EJ, Grubor-Bauk B, Wijesundara DK. Afhendingaraðferðir til að auka frumuupptöku og ónæmingargetu DNA bóluefna. Bóluefni. 2016;34(46):5488–94. pmid: 27742218
  14. 15. Kudchodkar SB, Choi H, Reuschel EL, Esquivel R, Jin-Ah Kwon J, Jeong M, et al. Hröð viðbrögð við smitsjúkdómi sem er að koma upp — Lærdómur af þróun tilbúins DNA bóluefnis gegn Zika veiru. Örverur smitast. 2018;20(11–12):676–84. pmid: 2955534516.Adam L, Tchitchek N, Todorova B, Rosenbaum P, Joly C, Poux C, et al. Meðfædd sameinda- og frumuundirskrift í húðinni á undan langvarandi T-frumuviðbrögðum eftir rafskauta DNA bólusetningu. J Immunol. 2020;204(12):3375–88. pmid: 32385135
  15. 17. Lin F, Shen X, McCoy JR, Mendoza JM, Yan J, Kemmerrer SV, o.fl. Ný frumgerð tæki til að gefa DNA bóluefni sem er aukið með rafskautum, samtímis í bæði húð og vöðva. Bóluefni. 2011;29(39):6771–80. pmid: 21199706
  16. 18. Williams M, Ewing D, Blevins M, Sun P, Sundaram AK, Raviprakash KS, o.fl. Aukin ónæmingargeta og verndandi verkun fjórgilds dengue DNA bóluefnis með því að nota rafporun og gjöf innan húðar. Bóluefni. 2019;37(32):4444–53. pmid: 31279565
  17. 19. Ramakrishnan MA. Ákvörðun á 50% endapunktstítra með einfaldri formúlu. Heimurinn J Virol. 2016;5(2):85–6. pmid: 27175354
  18. 20.Corman VM, Landt O, Kaiser M, Molenkamp R, Meijer A, Chu DK, o.fl. Greining á 2019 nýrri kransæðaveiru (2019-nCoV) með rauntíma RT-PCR. Euro Surveill. 2020. pmid:31992387
  19. 21. Kou Y, Xu Y, Zhao Z, Liu J, Wu Y, You Q, o.fl. Merkaröð vefjaplasmínógenvirkja (tPA) eykur ónæmingargetu MVA-undirstaða bóluefnis gegn berklum. Immunol Lett. 2017;190:51–7. pmid: 28728855
  20. 22. Xia S, Zhu Y, Liu M, Lan Q, Xu W, Wu Y, o.fl. Samrunakerfi 2019-nCoV og samrunahemla sem miða á HR1 lén í topppróteini. Cell Mol Immunol. 2020;17(7):765–7. pmid: 32047258
Þér gæti einnig líkað