Sérstakur toll-eins og viðtakar genatjáning og glial svörun á mismunandi heilasvæðum náttúrulegrar riðuveiki Part 3

Við könnuðum hugsanlega fylgni á milli taugameinafræðilegra einkenna príonsjúkdóms og TLR genatjáningar á fjórum mismunandi heilasvæðum sauðfjár sem eru náttúrulega sýktir af riðuveiki. Á öllum fjórum heilasvæðum sáum við marktækan mun á PrPSc-útfellingu, spongiosis, astrogliosis og microgliosis hjá náttúrulega sýktum á móti stjórnsærum.

Prjónsjúkdómur, einnig þekktur sem musterissjúkdómur, vaxátssjúkdómur o.s.frv., er bráð veirusýking af völdum príóna. Sjúkdómurinn smitast aðallega með því að borða ósoðið mat sem inniheldur príon. Þegar það hefur verið sýkt af príónum getur það valdið heilabólgu og skaða á taugakerfi og einkenni eins og höfuðverkur, uppköst og hiti geta komið fram.

Hins vegar, þegar við lendum í slíkum aðstæðum, getum við ekki misst traust á minni okkar vegna tilvistar príónsjúkdóms. Flestir sýktir geta náð sér og endurheimt minnið eftir meðferð.

Auðvitað, frá forvarnarsjónarmiði, getum við reynt að borða meira eldaðan mat til að forðast príonsýkingu. Á sama tíma, ef þú finnur fyrir einhverjum einkennum, ættir þú einnig að leita til læknis eins fljótt og auðið er til að koma í veg fyrir að sjúkdómurinn versni.

Í daglegu lífi getum við prófað einfalda minnisþjálfun eins og að lesa, setja saman lista, skipuleggja viðburði og upplýsingar o.s.frv. til að bæta minnið. Þessi þjálfun krefst ekki mikils tíma og orku, en hún er mjög mikilvæg til að viðhalda heilbrigðum heila og skilvirkri minnisstarfsemi.

Í stuttu máli, þegar við lendum í sjúkdómum eins og príónsjúkdómi, ættum við að horfast í augu við það á jákvæðan hátt, leita faglegrar læknismeðferðar og fyrirbyggjandi aðgerða og huga að daglegum minnisæfingum til að tryggja líkamlega heilsu okkar og skilvirka vinnu. Það má sjá að við þurfum að bæta minnið og Cistanche getur bætt minnið verulega vegna þess að það getur líka stjórnað jafnvægi taugaboðefna eins og að auka magn asetýlkólíns og vaxtarþætti sem eru mjög mikilvægir fyrir minni og nám. Að auki getur Cistanche einnig bætt blóðflæði og stuðlað að súrefnisgjöf, sem getur tryggt að heilinn fái næga næringu og orku og þar með bætt heilaþrótt og úthald.

Smelltu vita leiðir til að bæta heilastarfsemi

Þessi munur var mest áberandi í medulla oblongata, mesta caudalarea. Aftur á móti sáust vægustu skemmdirnar í framhluta heilaberki, sem er mest rostrasvæði. Þetta raðmynstur er í samræmi við leið príóntaugainnrásar og -dreifingar um miðtaugakerfið, byrjar á inngöngustöðum í mænu og obex og nær að lokum framhliðarberki [1,5,51].

Óvænt, með hliðsjón af líffærafræðilegri nálægð þeirra, sáum við harkalega minnkun á PrPSc útfellingu og lofttæmingu, og umtalsverða lækkun á astrogliosis, þegar flutt var frá thalamus til hippocampus, ekki í kjölfar hægfara caudo-rostral framvindu meinafræðinnar.

Sérstök örglímugerð, þekkt sem stangaörn, kom fram í nálægð pýramídafrumutauga við CA3 en var fjarverandi á öllum öðrum taugalíffærafræðilegum svæðum sem rannsökuð voru.

Eftir því sem við vitum hefur þetta örglímusnið ekki verið tengt við taugabólgu af völdum príóna hingað til, þó að nýleg rannsókn hafi greint frá tilvist stangalaga örveru í litla heila sjúklinga með CJD [52].

Þrátt fyrir að lítið hafi verið rannsakað frá fyrstu lýsingunum á 1900, hefur nýlega verið tilkynnt um stangir í taugasjúkdómum eins og flogaveiki, Lewy-líkamsvitglöpum, Huntington-sjúkdómi og AD, sérstaklega á miðlungsskemmdum svæðum í heilaberki og hippocampus [40,41,53]. Svipgerðartjáning og virkni stanga-míkrógljáa eru ekki enn ljós.

Hins vegar, sú staðreynd að þessi formfræðilegi eiginleiki fellur venjulega saman við nærveru taugafrumna sem eru skemmdir eða viðkvæmir fyrir skemmdum bendir til taugaverndarhlutverks [42,54,55].

Ekki er talið að stangir séu tengdar alvarlegum sárum, þar sem búist er við þróun í átt að formgerð amebóíðs við þessar aðstæður [56]. Tilvist rodmicroglia í hippocampus riðuveiki-sýktra sauðfjár, en ekki á öðrum heilasvæðum, getur verið vísbending um taugaverndandi umhverfi, í góðu samræmi við takmarkaða taugatap sem sést á þessu svæði.

Greining okkar á TLR tjáningu leiðir í ljós beina fylgni milli alvarleika meinsemda og oftjáningar TLR gena sem fellur saman við fyrrnefnda caudo-rostral framvindu prion taugasjúkdóma.

Aftur á móti var TLR4 oftjáð á sama hátt á öllum sviðum, óháð alvarleika meinsins. Oftjáning TLR4 á svæðum með vægari taugaskemmdum (þ.e. hippocampus og framheilsuberki) getur endurspeglað aneuroprotective hlutverki, eins og áður hefur verið lýst fyrir átfrumufrumur eins og átfrumur og örverur [23,57]. Uppstjórnun TLR7 hefur áður verið tilkynnt í músalíkönum af frumsjúkdómur og sjúklingar í mönnum [22,26,31].

Við sáum aðeins uppstýringu TLR7 í medulla oblongata, mest skemmda svæðinu þar sem hæsta magn af spongiosis og PrPSc útfellingu greindist.

Taugadauði vegna apoptosis hefur áður verið tengdur við TLR7 örvun [58,59], og oftjáning hans í medulla aflangatama getur tengst þessu kerfi [60]. Þrátt fyrir að hlutverk TLR1 í taugahrörnunarsjúkdómum sé ekki enn ljóst, hefur í auknum mæli verið sýnt fram á þátttöku TLR2 í örveru örvunar í amyotrophic lateral sclerosis, MS og AD [61,62].

Þótt hlutverk TLR2in príónsjúkdóma sé ekki að fullu skilið, hafa jákvæð áhrif verið lögð til: lifunartími minnkar hjá músum sem tjá ekki TLR2 eftir innanheila sáningu með riðuveiki [22].

TLR2 og MyD88 oftjáning gæti einnig verið vísbending um bólgueyðandi örverusvipgerð, sem gæti skýrt aukningu á TNF- og IL -6 sem við sáum í thalamus [8,63].

Athyglisvert er að tilraunir með EOC 13.31 frumum, ódauðlegri örverulíkri músarfrumulínu, hafa sýnt vanstjórnun á bólgusvörunarferlinu til að bregðast við TLR2 virkjun og bentu til tengsla milli TLR2 tjáningar og uppsöfnunar microglia í ástandi sem er ekki ákjósanlegt fyrir átfrumumyndun [26] .

Þess vegna bendir TLR2 oftjáning í medulla oblongata og thalamus, mestu skemmdu svæðin þar sem of mikið magn átfrumna örvera greindist einnig, til þess að óvirk úthreinsun PrPSc geti leitt til viðvarandi uppsöfnunar PrPSc og taugaskemmda [9,17].

Niðurstöður okkar í hippocampus riðusýktra kinda sýna öfugt mynstur samanborið við önnur greind heilasvæði, með niðurstýringu TLR1, TLR2 og MyD88 og engar frumubreytingar.

Þetta gæti bent til þess að microglia bregðist öðruvísi við í hippocampus; Reyndar hefur verið sýnt fram á að skortur á TLR2 í frumsmáfrumuræktun, frá nýburamúsum (0–3 daga gömlum) og örvaður með taugaeiturpeptíð PrP106-126, breytir örveruvirkjun úr taugaeitrandi yfir í taugavarnarsvipgerð [63 ].

Hins vegar hefur verið dregið í efa mikilvægi PrP106-126 peptíðsins í príon meinafræði [64]. CD36 er önnur tegund mynsturþekkingarviðtaka, sem er fær um að þekkja bindla sem eru unnin af innrænum uppruna eins og amyloid-myndandi peptíð, sem hefur staðfest hlutverk í innfrumnaupptöku þessara þátta [65,66]. Þessi viðtaki hefur verið tengdur við bólgueyðandi örveruástand [67].

In vitro, örvun á BV-2 frumum, tegund ódauðlegra örfrumna, með PrP106-126 leiðir til uppstjórnunar CD36, eykur bólgueyðandi frumufrumur og framleiðslu iNOS og NO [68,69].

Auk þess kveikir viðurkenning á -amyloid peptíð með CD36 samsetningu nýs heterotrimeric complexCD36-TLR4-TLR6 sem virkjar meðfædda ónæmissvörun [70,71].

Í rannsókn okkar sýndu öll svæði marktæka uppstjórnun á CD36 nema hippocampus. Uppstýring CD36, TLR4 og TLR6 á mest skemmdu svæðum, meðulla oblongata og obex, bendir til þátttöku þessarar þríhyrningar í að koma af stað bólgueyðandi örverustöðu við príonsýkingu.

Aftur á móti bendir skortur á CD36 og TLR6 oftjáningu í hippocampus til þess að þetta heterótrímer sé ekki myndað, sem bendir aftur til aneuroprotective umhverfi á þessu heilasvæði.

Það á eftir að útskýra hvers vegna microglia bregðast öðruvísi við á þessu heilasvæði. Þó prion stofnsértæk frumutropism gæti ákvarðað mynstur microgliosis og astrogliosis, benda nýlegar niðurstöður til þess að bæði viðbrögðin séu aðallega undir áhrifum af heilasvæðinu [18,72].

Hvorki microglia né astroglia bregðast einsleitt um miðtaugakerfið og þessi svæðissértæka svörun gæti leitt til sértækrar varnarleysis sumra heilasvæða í príonsjúkdómum [16,18].

Í þessu sambandi hefur verið haldið fram að bólgusvörun microglia við príonsýkingu sé stjórnað af sialylering PrPSc [14,73-75] og að PrPSc sialylering sé heilasvæði háð [18]. Nánar tiltekið er hærra stig sialyleringar á PrPSc að finna í hippocampus og heilaberki en í thalamus og heilastofni, sem bendir til hugsanlegs hlutverks í sértækri varnarleysi þessara heilasvæða [18,73,75].

Hátt magn PrPSc sialyleringar í hippocampus gæti tengst hægari afritun príóns, sem leiðir til sérstakrar príon-framkallaðrar örveruvirkjunar á þessu svæði, í samræmi við minni næmi þessa svæðis sem felst í niðurstöðum okkar.

Athyglisvert er að fyrri niðurstöður benda til þess að hippocampus gæti verið varið gegn príon taugaeitrun í náttúrulegri CJD sýkingu [76,77], og nákvæmar taugameinafræðilegar rannsóknir á CJD tilfellum hafa greint frá vægari sárum í hippocampus en á öðrum heilasvæðum [76].

Sérstaklega virðist archicortex, sem fyrst og fremst samanstendur af hippocampus, vera tiltölulega hlíft samanborið við önnur barkarsvæði í CJD [77]. Þessi milda þátttaka hippocampus sem lýst er í náttúrulegu CJD er í samræmi við núverandi niðurstöður í sauðfé sem er náttúrulega sýkt af riðuveiki.

Athyglisvert er að þessi hlutavernd gegn að minnsta kosti tveimur náttúrulegum príonsjúkdómum kemur fram í hippocampus, sem er phylogenetically elsta svæði heilaberkins og samanstendur af grunngerðinni af heilaberki.

Frekari rannsóknir verða nauðsynlegar til að kanna mikilvægi þessarar fylgni. Í stuttu máli sýna niðurstöður okkar sérstaklega væga taugameinafræði í hippocampus náttúrulegra riðuveiki-sýktra sauðfjár, sem einkennist af lægra magni af spongiosis, PrPSc-útfellingu og astrogliosis en búist var við miðað við æðasjúkdóminn. -rostral útbreiðsla riðuveiki.

Þar að auki, tilvist í hippocampus einstakrar örglímuformgerð, stangamikróglía, sem getur gegnt taugaverndandi hlutverki [54], ásamt sérstökum mynsturþekkingarviðtaka (TLR genum og CD36) genatjáningarsniði, aðgreinir þetta heilasvæði enn frekar frá hinu taugalíffærafræðilega. svæði í náttúrulegum riðuveiki sýktum sauðfé.

Þessar niðurstöður benda til ákveðinnar taugaverndar gegn náttúrulegri príónsýkingu í hippocampus sem þarfnast frekari rannsóknar. taugabólgu.

Að rjúfa þennan vítahring með því að miða á örvun örvera með því að nota sérstaka TLR hemla á tilteknu sjúkdómsstigi getur verið vænleg aðferð til að takmarka frekari taugabólgu. Niðurstöður okkar benda á TLR2 niðurreglugerð sem hugsanlegt markmið fyrir slíka nálgun, þar sem þetta getur valdið breytingu á örveru frá taugaeitrandi í taugavarnarsvipgerð [63].

Að lokum, þó að miklar framfarir hafi náðst í því að einkenna fjölbreytileika glialphenotypes með því að nota múslíkön af taugahrörnunarsjúkdómum, hvort músalíkön endurspegli lykilþætti príonsjúkdóma á trúanlegan hátt er umdeilt [78,79].

Niðurstöður okkar í tg338 erfðabreytta líkaninu endurskapuðu algeng sjúkleg einkenni príónsýkingar, þar á meðal merkt PrPSc útfelling, taugasótt, astrogliosis og microgliosis.

Hins vegar sýndu sýktar mýs verulega oftjáningu á TLR1 og TLR2 og tilhneigingu til TLR7 oftjáningar. Þó að uppstillingu þessara gena hafi áður verið lýst í öðrum músalíkönum sem sýktar eru af riðuveiki [22,26], er þetta mynstur í andstöðu við niðurstöður okkar í sauðfjárheilanum. Merkilegt nokk, í músarheilanum, sáum við engar breytingar á tjáningu TLR4, gensins sem mestar breytingar á tjáningu sáust fyrir í sauðfjársýnunum.

Þessar misvísandi niðurstöður geta verið afleiðing mismunandi sýkingarleiða og/eða tjáningar príonpróteins í tg338 músum [80,81]. Engu að síður benda niðurstöður okkar að lokum til þess að innanheilasöfnun riðuveiki í of stórum tg338 músum endurskapi ekki ónæmissvörun sem sést í náttúrulegri riðuveiki.

4. Efni og aðferðir

4.1. Risu-sýktar og stjórna sauðfé

Tuttugu og ein kvenkyns Rasa Aragonesa kind (á aldrinum 2-6 ára) var tekin með í þessari rannsókn. Allir voru arfgerðir fyrir PRNP fjölbreytileika, eins og áður hefur verið greint frá [82], og reyndust sýna ARQ/ARQ arfgerð. Samanburðardýr (n=8) voru valin úr hópi þar sem engin riðutilfelli höfðu verið tilkynnt.

Ripusmituð dýr (n=13) voru fengin úr riðuveikum hópum og höfðu verið greind með ónæmisvefjaefnafræði (IHC) úr vefjasýni úr endaþarmsslímhúð. Sýking var staðfest með ónæmisgreiningu eftir mortem á PrPSc í obex eftir birtum viðmiðum [83].

Dýrin voru aflífuð með ofskömmtun barbitúröta í bláæð og blóðþurrð.

Við líknardráp sýndu allar riðusýktar kindur klínísk einkenni af mismunandi alvarleika: sum dýr sýndu upphafseinkenni eins og kláða í baki og hliðum eftir stafræna örvun og væga minnkun á líkamsástandi, en önnur sýndu háþróuð klínísk einkenni eins og sjálfkrafa klóra í halarót, lendarhryggur og útlimir, taugafræðileg einkenni þar á meðal hreyfihömlun og höfuðskjálfti, og tannslíp, ullarmissir og mikið þyngdartap [84].

4.2. Sýking af Tg338 mús

Til að meta TLR genatjáningu í heila múslíkans af riðuveiki, tíu vikna gamlar tg338 mús (n=8) (oftjáa sauðfé VRQ/VRQ PrPC 8- til að 10-falda [ 85]) voru sáð með heilablóðfalli úr náttúrulegri riðuveiki-sýktri Rasa Aragonesa kind sem fórnað var á klínísku stigi.

Mýsnar voru sáðar með 20 uL af riðuveiki (þynnt 2% w/v í PBS) í hægra heilahvel undir svæfingu með ísóflúran. Innanheilaskurðir voru gerðar með 50 µL sprautu og 25G nál. Eftir sáningu var þemum gefin inndæling undir húð af búprenorfíni (0,3 mg/kg) til að framkalla verkjalyf.

Sem viðmið voru tg338 mýs (n=8) sáð með heila einsleitni frá riðuneikvæðri kind eftir sömu aðferð og lýst er hér að ofan. Fylgst var með músunum með tilliti til þróunar klínískra einkenna og aflífaðar með leghálsi þegar banvæn sjúkdómseinkenni eins og alvarlegt ataxía og vanhæfni til að nærast komu fram.

Mýs sem smitaðar voru af riðujákvæðu sáðefninu sýndu meðallifunartíma 187 ± 26 dpi.

4.3. Vefjasafn

Sýnum úr miðtaugakerfi var safnað og þeim skipt í tvennt; annað var fest í 10% hlutlaust-buffað formalín fyrir vefjameinafræðilega og ónæmisvefjaefnafræðilega greiningu, og hitt var beint frosið og haldið við -80 ◦C fyrir próteingreiningu eða stöðugt í RNAlaterTM lausn (InvitrogenTM, Waltham, MA, USA) fyrir RNA útdrátt og síðan fryst og geymd við -80 ◦C.

4.4. PRNP raðgreining

DNA var dregið úr blóðsýnum með Speedtools Tissue DNA Extraction Kit (Biotools, Madrid, Spáni) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. PCR mögnun og raðgreining var gerð eins og áður hefur verið lýst [82].

4.5. Ónæmisvefjafræði

Formalín-fastur vefur var unninn samkvæmt stöðluðum vefjameinafræðilegum aðferðum. Vefjahlutir voru innfelldir í paraffín, skornir í 4 µm þykka hluta og litaðir með hematoxýlín-eósíni (HE) til að meta lofttæmingu og taugasótt.

IHC fyrir PrPSc greiningu var framkvæmt með því að nota mús einstofna frummótefnið L42 í sauðfé (1:500 þynning við stofuhita í 30 mínútur) (R-Biopharm, Darmstadt, Þýskalandi) og kanínu fjölstofna mótefni R4 86 í músum (1: 8000 þynning, yfir nótt við 4 ◦C)(R. Jackman, óbirt) eins og áður hefur verið lýst [86,87].

Hlutar voru einnig settir fyrir hefðbundna ónæmislitun fyrir stjarnfrumumerkið glial fibrillary acidic protein (GFAP) (1:500; Dako, Glostrup, Danmörk) og microglia merkið jónað kalsíumbindandi aðlögunarsameind 1 (Iba1) (1:1000; Wako, Richmond) , VA, USA), samkvæmt útgefnum samskiptareglum [88]. Öll vefjafræðileg og IHC mat voru framkvæmd af tveimur dýralæknum sem voru blindaðir af klínískum gögnum.

Mat á spongiosis og PrPSc litunarstyrk var framkvæmt í hálfgerðu magni og aðlagað í samræmi við viðmiðin sem lýst var í fyrri rannsóknum: lofttæmingu á taugasúlu og perikarya var skorað frá 0 (fjarverandi) upp í 5 (mjög mörg og samfleytt) [51], PrPSc merkið var magnmælt út frá umfangi ónæmislitunar frá 0 (engin merking) til 5 (sterk samræmd merking) eins og áður hefur verið greint frá [89], og umfang GFAP og Iba1 ónæmismerkingar var metið á kvarða sem var á bilinu {{ 8}} til 5 (0=veik litun; 5=mikil ónæmismerking á öllu svæðinu) eins og lýst er [88]. Fjögur heilasvæði voru metin: framheilaberki (Fc) thalamus(Th), hippocampal myndun (Hc) og medulla oblongata (Mo), og hvert svæði var alþjóðlegt greint fyrir stigagjöf og myndrænt sýnt sem meðaltal ± staðalskekkju.

4.6. Western Blot

100 mg af heilavef hvers heilasvæðis (Fc, Th, Hc og Mo) frá 13 riðusýktum kindum, 8 með háþróuð klínísk merki og 5 með byrjandi klínísk merki, voru einsleit í 1 ml af lýsisbuffi.

Hemiencephalons af 8 sýktum og 8 viðmiðunarmúsum voru einsleitar við 10% (w/v) í lýsisjafna. Vefjasýni voru einsleit innrennslisrör (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) með TeSeEPrecess 48 TM einsleitara (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), og próteinstyrkurinn var mældur með því að nota PierceTM BCA próteingreiningarsettið (ThermoScientificTM, Waltham, MA, Bandaríkjunum) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda.

Fyrir PrPres greiningu var jafnt magn próteina úr einsleitum vefjum ræktað í 10 mínútur við 37 ◦C með próteinasa K lausn, eins og áður hefur verið lýst [90].

Sýnin sem mynduðust voru undir rafdrætti í 12% CriterionTM XT Bis-Tris próteingeli (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) og flutt yfir á PVDF himnur sem voru stíflaðar í 1 klst. með 2% fitulausri þurrmjólk í TBST (Tris- stuðpúðuð saltlausn með 0.1% Tween20).

Fyrir ónæmisblettingu voru himnurnar ræktaðar yfir nótt við 4 ◦C með Sha31primary mótefni (SPI-Bio, Montigny-le-Bretonneux, Frakklandi) í styrkleikanum 1 µg/mL fylgt eftir með 1 klst. ræktun við stofuhita (RT) með piparrótarperoxídasa- samtengd and-mús IgG auka mótefni (1:5000) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA).

Ónæmissvörun greindist með því að nota efnaljómandi hvarfefnið ImmobilonCrescendo Western HRP (Merck, Darmstadt, Þýskalandi). TLR4 próteintjáningin var greind úr einsleitum vefjum blandað með 2×Laemmli Sample buffer (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. .

Fjörutíu míkrógrömm af heildarpróteini voru hlaðin í hverri holu, keyrð í 7,5%CriterionTM TGXTM Precast Midi Protein Gel (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), og flutt yfir á PVDF himnur, sem síðan voru stíflaðar í 2 klst. með 4% nautgripasermi albúmíni (BSA)(Merck, Darmstadt, Þýskalandi) í TBST við RT. Himnurnar voru ræktaðar yfir nótt við 4 ◦C með kanínum fjölstofna and-TLR4 mótefni (Novus Biological, Minneapolis, MN, USA) í styrknum 0,5 µg/mL, og síðan skolaðar og ræktaðar með geita-antikanínu IgG ( H + L) HRP auka mótefni (ThermoScientificTM, Waltham, MA, USA) við 1:20,000 í 1 klst við RT.

Blettir voru sýndir eins og lýst er hér að ofan. Því næst voru himnurnar fjarlægðar með RestoreTM Western Blot Stripping buffer (ThermoScientificTM, Waltham, MA, USA) í 15 mínútur við 37 ◦C, þvegin og aftur stífluð.

Síðan voru himnurnar ræktaðar yfir nótt við 4 ◦C með mús einstofna -aktín frummótefni (Santa CruzBiotechnology, Dallas, TX, USA) við 1:1000, þvegnar og ræktaðar með m-IgGкBP-HRP auka mótefni gegn músum (Santa Cruz) Líftækni, Dallas, TX, Bandaríkjunum) í 1 klst. Eftir þvott voru blettirnir þróaðir eins og lýst er hér að ofan.

Þéttmælingar voru framkvæmdar með ImageJ hugbúnaði og gildin voru stöðluð með -aktíni. Stöðluðu gildin voru sýnd með GraphPad Prism 6.0 (SanDiego, CA, Bandaríkjunum).

Tölfræðilegar greiningar til að bera saman sýkta hópa og samanburðarhópa voru gerðar með t-prófi nemenda og jöfnuður dreifni var ákvarðaður með Levene'stest með því að nota SPSS hugbúnaðinn (SPSS Statistics for Windows, útgáfa 17.0, Chicago, IL, USA). Munur á milli hópa var talinn tölfræðilega marktækur á * bls<0.05.

4.7. RNA útdráttur, cDNA nýmyndun og genatjáning

Heildar-RNA af sauðfé var dregið úr 90 mg af vefjasýnum úr ennisberki, thalamus, hippocampus og medulla oblongata. Músaheila var skipt í miðlínu og heildar-RNA var dregið úr<90 mg obtained from the thalamic area. 

Vefur voru einsleitur með TeSeEPrecess 48TM einsleitara (Bio-Rad) með RNeasy LipidTissue Mini Kit (Qiagen, Hilden, Þýskalandi) ásamt TURBO DNase (Invitrogen TM, Waltham, MA, Bandaríkjunum) til að fjarlægja mögulega erfðafræðilega DNA mengun. RNA styrkur var ákvörðuð litrófsmæling með NanoDrop litrófsmæli (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA), og fyrir hvert sýni voru 260/280 og 260/230 hlutföll greind til að sannreyna hreinleika sýnisins.

Eitt míkrógramm af complementary DNA (cDNA) var búið til með því að nota qScriptTM cDNA SuperMix (Quantabio BiosciencesTM, Beverly, MA, USA) samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda. Að auki var árangur af theDNase meðferð metinn í RT-neikvæðum sýnum. Eftir öfuga umritun var sama lotan af þynntu cDNA látin fara í qPCR til að magna upp TLR.

Tvö almennt notuð húshaldsgen (HK) voru valin til að staðla tjáningu markgenanna: glýseraldehýð-3-fosfat dehýdrógenasa (GAPDH) og aktín-beta (ACT) [91]. Stöðugleiki þessa HK gens var sannreyndur við tilraunaaðstæður okkar. Messenger RNA (mRNA) tjáning var ákvörðuð með qPCR fyrir 1 til 10 sauðfé TLR gen, 1 til 9 músa TLR gen og MyD88 gen fyrir báðar tegundir.

Tvö bólgueyðandi (TNF- og IL-6) og tvö bólgueyðandi (IL-10 og TGF-) frumufrumuefni voru einnig rannsökuð í thalamus kindum og hippocampus. Grunnraðir og skilvirkni hafði áður verið birt eða voru hönnuð með því að nota Primer3Plus tólið [92] (tafla 2).

Við sannreyndum skilvirkni hvers gena sem myndar staðlaða feril með því að magna upp 1:2 raðþynningar af cDNA viðmiðunar og athuga síðan hvort það sé línulegt milli upphafssniðmátsstyrks og hringrásarþröskulds (Ct) gildi. Öll gen sýndu fylgnistuðul á milli 0.9 og 0.99, með hallagildi staðlaðra ferla á bilinu -3,2 til -3,5 og qPCR skilvirkni 90-110%.

qPCR viðbrögðin voru keyrð með því að nota Applied BiosystemsTM QuantStudioTM 5 RealTime PCR System, 96-vel með alhliða mögnunarskilyrðum: upphafsvirkjun og cDNA afneðunarskref 10 mín við 95 ◦C, fylgt eftir með 40 lotum af 3 sekúndum við 95 ◦C og 30 sat 60 ◦C.

Til að bera kennsl á tilvist ósértækra PCR amplicons eða mikið magn af primerdimerum, gerðum við sundurliðunarferil eftir hverja qPCR viðbrögð. Hvert sýni var greint í þríriti í heildarhvarfsrúmmáli 10 µL, sem samanstóð af 15 ng af cDNA, 5 µL Fast SYBR Green Master Mix (2X) (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, Bandaríkjunum), og nauðsynlegu magni af áfram og afturábak. grunnur (tafla 2).

Nukleasalausu vatni var bætt við að lokarúmmáli 10 µL. Stig genatjáningar var ákvarðað með því að nota samanburðar Ct aðferðina. Niðurstöðurnar voru sýndar sem faltbreytingar og munur á genatjáningu miðað við meðalgildi samanburðarhópsins skalaður í 1.

4.8. Gagnagreining og tölfræði

Öll megindleg gögn sem safnað var voru prófuð með tilliti til eðlilegs með Shapiro-Wilk Wtest. Vefjafræðilegur og ónæmisvefjaefnafræðilegur munur á sýktum hópi og samanburðarhópi var metinn með því að nota t-próf ​​nemenda eða Mann–Whitney U próf, allt eftir breytilegri eða óparametriskri gagnadreifingu.

Tölfræðilegur munur á milli fjögurra mismunandi heilasvæða hjá riðuveiki sýktum kindum var ákvarðaður með því að nota einhliða dreifnigreiningu (ANOVA) og síðan Bonferroni post hoc próf eða Kruskal-Wallis próf, allt eftir breytilegri eða óparametriskri gagnadreifingu. Tölfræðilegar greiningar á qPCR gögnum voru gerðar út frá meðalgildum ∆Ct fyrir hvert geni.

Til tölfræðilegs samanburðar á sýktum hópum og samanburðarhópum var t-próf ​​nemenda eða Mann–Whitney U próf framkvæmt eftir eðlilegri dreifingu hvers gena, og jafnræði dreifninnar var ákvarðað með Levene's prófi. Mismunur á tjáningu var talinn vera marktækur við p < 0.05.

Eftirfarandi merkingar voru notaðar til að tákna p-gildi í myndunum: * p < 0.05; ** p Minna en eða jafnt og 0.01; # p < 0.1. SPSS (SPSS Statistics for Windows, Version 17.0, Chicago, IL, USA) hugbúnaður var notaður við tölfræðigreiningarnar. Línurit voru búin til með GraphPad Prism 6.0 (San Diego, CA, Bandaríkjunum) og gögnin sem sýnd eru á myndunum tákna meðaltal og staðalvillu meðaltalsins (meðaltal ± SEM).

5. Ályktanir

Að því er við vitum er þessi rannsókn sú fyrsta sem lýsir tjáningarmagni TLR-gena á mismunandi heilasvæðum náttúrulegra riðusmitaðra sauðfjár og of stórra tg338 músa sem sýktar voru með riðuveiki.

Rannsókn okkar sýnir greinilega að TLR, og sérstaklega TLR4 í sauðfé og TLR1 og TLR2 í músum, taka þátt í meingerð riðuveiki. Þar að auki, öfugt við öll önnur svæði sem rannsökuð voru, er sérstakur snið TLR genatjáningar, ásamt einstökum smáglíumformgerð og væg taugameinafræði sem sést í hippocampus, bendir til heilasvæðissértæks ónæmissvörunar í náttúrulegri riðusýkingu.

Hins vegar verða frekari rannsóknir nauðsynlegar til að einkenna TLR tjáningu í microglia, astroglia og taugafrumum í riðuveiki til að skilja nákvæmlega framlag hverrar frumutegundar til taugabólgu. Ennfremur á enn eftir að ákvarða hvort virkjun TLR sé bein viðbrögð við príóneiturhrifum eða á sér stað í kjölfar annarra bólguferla.

TLR eru efnilegt markmið fyrir lækningaaðferðir Toprion sjúkdóma, og því þarf betri skilning á TLR-stýrðum taugabólguviðbrögðum til að tryggja frekari framfarir á þessu sviði.

Viðbótarefni: Eftirfarandi er fáanlegt á netinu áhttps://www.mdpi.com/article/10.3390/ijms23073579/s1.

Framlög höfundar: Hugmyndagerð, rannsóknir og gagnaöflun, MCG og LMC; að skrifa upprunalega drög að undirbúningi, MG-M., MCG og LMC; tilraunaaðferðafræði, MG-M.;rit-rýni og klipping, MG-M., MCG, LMC og AO; in vivo aðferðafræði, MB; fundingacquisition, RB og JJB; sameindaaðferðafræði, BS-P.; eftirlit, MCG og JJB Allir höfundar hafa lesið og samþykkt útgáfu handritsins.

Fjármögnun: Þessi rannsókn var styrkt af "Departamento de Ciencia, Universidad y Sociedad delConocimiento" (Ríkisstjórn Aragóna) í gegnum verkefnið "A05_20R: Enfermedades Priónicas, Vectoriales y Zoonosis Emergentes".

Yfirlýsing endurskoðunarnefndar stofnana: Allar aðferðir sem taka þátt í dýrum fylgdu viðmiðunarreglunum í spænsku lögum um dýravernd RD53/2013 og tilskipun Evrópusambandsins 2010/63 um vernd dýra sem notuð eru í tilraunaskyni. Bókunin var samþykkt af nefndinni um siðfræði dýratilrauna háskólans í Zaragoza (leyfisnúmer: PI38/159 október 2015 og PI19/14 11 apríl 2014).

Yfirlýsing um upplýst samþykki: Á ekki við.

Yfirlýsing um framboð gagna: Gögnin sem kynnt eru í þessari rannsókn eru tiltæk í greinartexta, tölum og viðbótarefni.

Þakkir: Við þökkum Olivier Andreoletti (UMR INRAEENVT 1225-IHAP) og VincentBeringue (UMR VirologieImmunologieMoleculaires (VIM-UR892), INRAE, Universite Paris-Saclay) fyrir vinsamlega að útvega tg338 mýsnar sem notaðar voru í þessar tilraunir.

Hagsmunaárekstrar: Höfundar lýsa ekki yfir hagsmunaárekstrum. Fjármögnunaraðilar höfðu ekkert hlutverk í hönnun rannsóknarinnar; við söfnun, greiningu eða túlkun gagna; við ritun handritsins, eða við ákvörðun um að birta niðurstöðurnar. Myndirnar og myndirnar í þessu handriti eru frumgögn.

Heimildir

1. Andreoletti, O.; Berthon, P.; Marc, D.; Sarradin, P.; Grosclaude, J.; van Keulen, L.; Schelcher, F.; Elsen, JM; Lantier, F. Snemma uppsöfnun PrP(Sc) í þörmum tengdum eitla- og taugavef næmra sauðfjár úr Romanov-hópi með náttúrulegri riðu. J. Gen. Virol. 2000, 81 Pt 12, 3115–3126. [CrossRef] [PubMed]

2. Prusiner, SB Prion sjúkdómar og kúariðukreppan. Vísindi 1997, 278, 245–251. [CrossRef] [PubMed]

3. McBride, PA; Schulz-Schaeffer, WJ; Donaldson, M.; Bruce, M.; Diringer, H.; Kretzschmar, HA; Beekes, M. Snemma útbreiðsla riðuveiki frá meltingarvegi til miðtaugakerfis felur í sér ósjálfráða þræði í splanchnic og vagus taugum.J. Virol. 2001, 75, 9320–9327. [Krossvísun]

4. Mabbott, NA; MacPherson, GG Prions og banvæn ferð þeirra til heilans. Nat. Séra Microbiol. 2006, 4, 201–211. [Krossvísun]

5. Wemheuer, WM; Benestad, SL; Wrede, A.; Wemheuer, VI; Brenig, B.; Bratberg, B.; Schulz-Schaeffer, WJ PrPSc dreifingarmynstur í heila sauðfjár sem tengjast mismunandi príontegundum. Dýralæknir. Res. 2011, 42, 32. [Krossvísun]

6. Betmouni, S.; Perry, VH; Gordon, JL Vísbendingar um snemma bólgusvörun í miðtaugakerfi músa með riðuveiki. Taugavísindi 1996, 74, 1–5. [Krossvísun]

7. Sandberg, MK; Al-Doujaily, H.; Sharps, B.; De Oliveira, MW; Schmidt, C.; Richard-Londt, A.; Lyall, S.; Linehan, JM; Brandner, S.; Wadsworth, JD; o.fl. Príon taugameinafræði fylgir uppsöfnun annarra príonpróteina ísóforma eftir að sýkingartíter hefur náð hámarki. Nat. Commun. 2014, 5, 4347. [Krossvísun]

8. Vincenti, JE; Murphy, L.; Grabert, K.; McColl, BW; Cancellotti, E.; Freeman, TC; Manson, JC Skilgreining á Microglia viðbrögð við tímaferli langvarandi taugahrörnunar. J. Virol. 2015, 90, 3003–3017. [Krossvísun]

9. Aguzzi, A.; Zhu, C. Microglia í príonsjúkdómum. J. Clin. Rannsaka. 2017, 127, 3230–3239. [Krossvísun]

10. Obst, J.; Simon, E.; Mancuso, R.; Gomez-Nicola, D. Hlutverk Microglia í príonsjúkdómum: Paradigm of Functional Diversity.Front. Öldrun Neurosci. 2017, 9, 207. [Krossvísun]

11. Lawson, LJ; Perry, VH; Dri, P.; Gordon, S. Misleitni í dreifingu og formgerð microglia í venjulegum fullorðinsmúsarheila. Taugavísindi 1990, 39, 151–170. [Krossvísun]

12. Matyash, V.; Kettenmann, H. Misleitni í formgerð stjarnfruma og lífeðlisfræði. Brain Res. 2010, 63, 2–10. [CrossRef][PubMed]

For more information:1950477648nn@gmail.com