Uppgötvun og auðkenning á hugsanlegum virkum innihaldsefnum Bletilla Striata gegn sortuefnavaldandi áhrifum

ali.ma@wecistanche.com

Yiyuan Luo1, Juan Wang1, Shuo Li1, Yue Wu1, Zhirui Wang1, Shaojun Chen1 og Hongjiang Chen1,2*

Ágrip

Bakgrunnur:Bletilla striata er aðallyf margra klassískra húðhvítunarformúla í hefðbundinni kínverskri læknisfræði (TCM) og er mikið notað í snyrtivöruiðnaði undanfarið. Hins vegar eru virku innihaldsefni þess enn óljós og trefjarætur þess eru ekki notaðar á áhrifaríkan hátt. Markmið þessarar rannsóknar er að uppgötva og bera kennsl á hugsanlega and-melanógenandi virk efnisþætti þess með sebrafiskalíkani og sameindatengingu.

Aðferðir:Theandoxunarefnivirkni var metin með 2,2-dífenýl-1-píkrýlhýdrasýl (DPPH) radical-hreinsivirkni, 2,2'-asínó-bis-(3-etýlbentíasólín-6-súlfónsýru) (ABTS) ) róttæka hreinsunarvirkni og járnminnkandiandoxunarefnikraftgreiningu (FRAP). Vörueyðandi virknin var metin aftýrósínasahamlandistarfsemiin vitro og melanín hamlandi í sebrafiskum. Efnasniðin voru unnin með ofurafkastamikilli vökvaskiljun ásamt fjórpóla tíma-flugtíma tandem massagreiningu (UPLC-Q-TOF-MS/MS). Á sama tíma voru mögulegir virk efni gegn sortuvaldandi áhrifum tímabundin auðkennd með sameindatengingu.

Niðurstöður:95 prósent etanólútdráttur af B. striata trefjarótum (EFB) hafði sterkustu DPPH, ABTS, FRAP og týrósínasa hindrandi virkni, með IC50 5,94 mg/L, 11,69 mg/L, 6,92 mmól FeSO4/g, og 58,92 mg/L, í sömu röð. Að auki, EFB og 95 prósent etanól þykkni af B. striata hnýði (ETB) dró verulega úr melanínmyndun sebrafiskahembryos á skammtaháðan hátt. 39 efnasamsetningar, þar á meðal 24 stilbenoids, voru auðkennd með semingi frá EFB og ETB. Sameindatenging benti til þess að 83 (þar af 60 stilbenoids) og 85 (þar á meðal 70 stilbenoids) efnasambönd sýndu sterkari bindishækni í týrósínasa og adenýlat sýklasa.

Niðurstaða:Núverandi niðurstöður studdu rökin fyrir notkun EFB og ETB sem náttúruleg húðhvítandi efni í lyfja- og snyrtivöruiðnaði.

Lykilorð: Bletilla striata, andoxunarefni, virkni gegn sortuvaldandi áhrifum, UPLC-Q-TOF-MS/MS, sebrafiskur, sameindakví

Smelltu til að sjá aukaverkanir og ávinning fyrir andoxunarefni

Bakgrunnur

Bletilla striata (Thunb.) Reichb. f. er jurtarík ævarandi planta sem er víða dreifð í Asíu, svo sem Kína, Kóreu og Japan [1]. Þurrkaður hnýði B. striata, einnig þekktur sem Baiji, sem fyrst var skráður í Shennong's Classic of Materia Medica, hefur verið mikið notaður sem hefðbundin kínversk lyf (TCM) í þúsundir ára í Kína. Í kínverskum lyfjaskrám kemur fram að það hafi getu til að dragast saman við blæðingu og verkjastillingu, þess vegna var það mikið notað til að meðhöndla blóðþurrð, blæðingarhrörnun, áverka blæðingar, sár, bólgu og sprungna húð [2, 3]. Lyfjafræðilegar rannsóknir sýndu fram á að B. striata bjó yfir víðtækri líffræðilegri virkni, svo sem sáragræðslu [4, 5], sársvörn [6, 7], hemostatic [8],andstæðingur-bólga[9], andoxunarefni[10], bakteríudrepandi [11], veiru gegn inflúensu [12], og öldrun [13]. Á sama tíma inniheldur B. striata ýmsa flokka efnasamsetninga, þ.m.tfjölsykrur[14], bíbensýl, fenantren, antrakínón,flavonoids, og 2-ísóbútýlmalöt [3, 15] o.s.frv.

B. striata er aðallyf margra klassískra formúla fyrir húðhvíttun í TCM [16] og það er mikið notað í snyrtivöruiðnaði nýlega [17]. Hins vegar eru virku innihaldsefni þess enn óljós og jafnvel sumar rannsóknarniðurstöður voru andstæðar. Til dæmis, rannsóknarniðurstöður sem Chenet al. benti til þess að 95 prósent etanól þykkni af B. striata hafði meiri týrósínasa hamlandi virkni en vatnsþykkni þess með hömlunarhraða upp á 68,36 prósent in vitro[18], en niðurstaða Huang o.fl. sýndi að hamlandi virkni B. striata vatnsþykkni á tyrosinasa var sterkari en 95 prósent etanólútdráttar innan hömlunarhraða 62 prósent in vitro [19]. Rannsóknarniðurstöður Luetal.[20]og Linghuetal.[21] sýndu fram á að bæði vatn og 95 prósent etanólútdráttur af B. striata, sérstaklega klóróformhlutun þess, gæti hamlað B16-frumuvexti og framkallað frumufrumu hans á styrkleikaháðan hátt.

Þar sem in vitro prófin á týrósínasahömlun og sortuæxlisfrumulínum fólu ekki í sér flóknar lífeðlisfræðilegar aðstæður í lífi, og frásog, efnaskipti, dreifingu og útskilnað prófsýnisins, sýndu mörg sýnanna marktæka hamlandi virkni gegn týrósínasa og sortuæxlisfrumulínum í engu að síður sýndi hann lítinn árangur eða jafnvel árangurslaus in vivo [22,23]. Glabridínið sýndi marktæka týrósínasahamlandi virkni með IC50 0.43μmól/L, sem var 176 sinnum sterkara en kojínsýru. Engu að síður voru það engin hamlandi áhrif á litarefni sebrafiska in vivo [24].

Á sama tíma voru B. striata trefjarætur (FB) aukaafurðirnar sem mynduðust við vinnslu B. striatatuber (TB). Nútíma rannsóknir benda til þess að FB inniheldur svipuð efnasambönd með berkla og með hærra innihaldi fenóls [25]. Að auki voru bakteríudrepandi [26], andoxunarefni og and-tyrosinasa virkni FB þykkni sterkari en TB þykkni [25]. Hins vegar voru auðlindir FB ekki notaðar á áhrifaríkan hátt og voru yfirgefin í ræktuðu landi, sem leiddi til sóunar á FBauðlindum og umhverfismengun [27].

Sebrafiskur (Danio rerio), lítill suðrænn ferskvatnsfiskur, er vaxandi dýralíkan fyrir lyfjafræði

og eiturefnarannsóknir in vivo, með mörgum kostum, þar á meðal litlum tilkostnaði, stuttum líftíma, miklu gagnsæi, auðvelt að viðhalda, mikilli frjósemi og krefjast færri prófsýnis [28, 29]. Að auki hefur sebrafiskur melanín litarefni á yfirborðinu, sem gerir einfalda athugun á litarefnisferlinu kleift og var mikið notaður í rannsókninni gegn sortuvaldandi [28, 30].

Í þessari rannsókn bárum við saman andoxunar- og týrósínasahamlandi virkni óhreinsaðs fjölsykru og 95 prósent etanólútdráttar af berklum og FB in vitro, og and-melanógenandi virkni í sebrafiskalíkani. Á sama tíma voru hugsanlegir virk efni gegn sortuvaldandi áhrifum tímabundnir greindir með sameindatengingu. Við komumst að því að 95 prósent etanólútdráttur af berklum (ETB) og FB(EFB) hefur verulega andoxunar- og and-týrósínasavirkni og getur dregið úr melanínmyndun sebrafiskafósturvísa á skammtaháðan hátt. Þannig er hægt að nota ETB og EFB sem náttúruleg húðhvítunarefni í lyfja- og snyrtivöruiðnaði.

Aðferðir

Efni og hvarfefni

Týrósínasi, 3-(3,4-díhýdroxýfenýl)-L-alanín(L-DOPA) og arbútín voru keypt frá Aladdin hvarfefnisfyrirtækinu (Shanghai, Kína).2,2-dífenýl{{8 }}píkrýlhýdrasýl (DPPH), 2,2'-asínó-bis-(3-etýlbentíasólín-6-súlfónsýra) (ABTS),6-hýdroxý-2,5,7 ,8-tetrametýlkróman-2-karboxýlsýra (Trolox) og 2,4,6-tris (2-pýridýl)-s-tríazín (TPTZ) voru keypt frá Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, Bandaríkin). Asetónítríl og metanól (HPLC einkunn) voru keypt frá Tedia (Fairfield, OH, Bandaríkjunum). Afjónað vatn var búið til með Milli-Q vatnskerfinu (18,2 MΩ, Millipore, Bandaríkjunum).

Aðferð við söfnun og útdrátt plantna

B. striata var safnað frá Quzhou YiNianTang Agriculture and Forestry Technology Co., Ltd. (Quzhou, Zhejiang, Kína). Skírteinissýni voru afhent í Herbarium of Zhejiang Pharmaceutical College (aðild nr. 190615). Öll plöntunni var skipt í hnýði og trefjarætur. Í kjölfarið voru þau skorin í litla bita og þurrkuð með lofttæmi í frostþurrkun.

Þurrkuðu sýnin og sýnin í duftformi (TB og FB) voru dregin út með bakflæði með 95 prósent etanóli þrisvar sinnum (1,5 klst í hvert skipti). Útdrátturinn var síaður með því að nota What man síupappír (nr.1). Síuvökvinn var þéttur til þurrkunar í snúningsuppgufunarbúnaði (Hei-VAP, Heidolph, Þýskalandi) við 50 gráður og var síðan þurrkaður með lofttæmifrystiþurrku. Afrakstur etanólútdráttar berkla (ETB) og FB (EFB) var 5,21 og 6,53 prósent, í sömu röð. Drögin voru notuð til að draga út hráu fjölsykruna með því að dreifa henni í 80 gráðu vatni í 4 klst og útfellingu með etanóli [31]. Fjölsykruávöxtun berkla (PTB) og FB (PFB) var 14,75 og 6,45 prósent, í sömu röð.

cistanche þykkni

Efnagreining

Efnagreiningin var framkvæmd með ofurafkastamikilli vökvaskiljun ásamt fjórpóla tíma-flugtíma tandem massagreiningu (UPLC-Q-TOF-MS/MS). Litskiljunin var gerð á Waters Acquity UPLC tem (Waters Corp., Milford, MA, Bandaríkjunum) með WatersBEH Shield RP C18 súlu (100×2.1mm, 1.7μm) at3{ {43}} gráðu. Hreyfanlegur fasi samanstóð af 0,1 prósent maurasýru í vatni (A) og asetónítríl (B), með línulegum halla: 0–3mín, 5–16 prósent B; 3–8 mín, 16–30 prósent B; 8–10 mín, 30–35 prósent B; 10–15 mín, 35–55 prósent B; 15–18 mín., 55–80 prósent B; 18–19 mín., 80–5 prósent B; 19–20 mín., 5 prósent B. Rennslishraði var 0,3 mL/mín og inndælingarrúmmál 2 μL.

TOF-MS/MS tilraunirnar voru gerðar með því að nota AB SCEIX Triple TOF 5600 massagreiningu (AB SCIEX, Foster City, CA, Bandaríkjunum) búin rafúðajónun (ESI). MS uppgötvunin var framkvæmd með neikvæðri jónunaraðferð. Færibreyturnar voru stilltar sem hér segir: uppspretta og upplausnarhitastig voru 100 gráður og 450 gráður í sömu röð; straumhraði upplausnargass var 900L/klst.; háræðaspenna var 2kV; keiluspenna var 40 V; árekstraorka var 22 eV; og allt skannalitrófið var frá 100 til 2000 Da.

Andoxunarefni mælir DPPH radical scavenging virkni

DPPH radical scavenging virknin var ákvörðuð í samræmi við Ali et al. með smá breytingum [32]. Í stuttu máli var 50 μL prófsýnislausn blandað saman við 150 μLDPPH etanóllausn (0,2mM) í 96-brunnsplötum og var haldið í myrkri í 30 mín. . Frásog blöndunnar við 517nm (A1) var metið með örplötulitrófsmæli (Thermo Fisher Scientific, Ameríku). Eyðulausnin án prófunarsýnis blandað með DPPHethanol lausn var stillt sem jákvæði hópurinn (A0). Eyðulausnin án DPPH blandað við prófunarlausnina var stillt sem núllhópurinn (A2). Allar tilraunir voru gerðar í þríriti. DPPH radical scavenging rate var reiknað með eftirfarandi formúlu:

DPPH radical scavenging hlutfall ( prósent ) {{0}} [A0-(A1-A2)]/A0 × 100 prósent .

ABTS róttæk hreinsunarvirkni

ABTS róttæka hreinsunargetan var mæld með aðferðinni sem lýst er af Ali o.fl. [32]. Í stuttu máli var 7mMABST vatnslausn blandað saman við 2,45mM kalíumpersúlfat í hlutfallinu 1:1 (v/v), og ræktað við stofuhita í myrkri í 16 klst til að fá ABST plús stofnlausnina. Stofnlausnin var þynnt með fosfatbúðuðu saltvatni (PBS) til að stilla gleypni (0.72±0.2) við 734nm. 20μL prófunarsýnum í mismunandi styrkleika var blandað vandlega saman við 180μL ABTS plús lausn. Hvarfgjarnu blöndurnar voru hafðar í myrkri í 5 mín og í kjölfarið mæld gleypni (B1) við 734nm. Frásog blöndunnar án prófunarsýnis og ABST plús voru stillt sem B og B , í sömu röð. Allar tilraunir voru gerðar í þríriti. ABTS radicalscavenging hlutfall var reiknað út samkvæmt eftirfarandi formúlu:

ABTS róttækar hreinsunartíðni ( prósent ) {{0}} [B0-(B1-B2)]/B0 × 100 prósent .

Járnafoxandi andoxunarefnisgreining (FRAP)

Virkni sem minnkar járn var ákvörðuð samkvæmt aðferðum Kosakowska et al. [33]. 300mM asetatbuffi, 10mM TPTZ (2,4,6-tris (2-pýridýl)-s-tríazín) og 20mM FeCl3 var blandað saman við (v/v/v) hlutfallið 10:1:1 til að undirbúa virka hvarfefnið. 100μL af hverri prófunarlausn var blandað saman við 100μL TPTZ vinnuhvarfefni, ræktað við 37 gráður í 20 mínútur og gleypni var ákvörðuð við 593 nm. Á sama tíma var röð af FeSO4 staðallausnum á styrkleikasviðinu 0–1000 ug/mL notuð til að útbúa kvörðunarferilinn. Járnafoxunargetan var reiknuð út í myndun ákafa Fe2 plús -TPTZ bláa flókins. Niðurstöðurnar voru gefnar upp sem Fe2 plús andoxunargeta (mmól FeSO4/g af útdrætti).

Týrósínasa hamlandi virkni

Týrósínasa hindrandi virkni var ákvörðuð með litrófsmælingu með L-DOPA sem hvarfefni [34]. Í stuttu máli var 50 μL sýnislausnum í mismunandi styrkjum blandað saman við 50 μL týrósínasa (200 einingar/mL, uppleyst í pH 6,8 fosfatbuffi} holu) í {{7} buffer} plötur og ræktaðar í 15 mínútur við 25 gráður. Hvarfið var síðan hafið með því að bæta við L-DOPA (50 μL). Eftir ræktun í 30 mínútur við 25 gráður var gleypni við 490 nm (Aa) ákvarðað með því að nota multiskan sky microplate litrófsmæli (ThermoFisher Scientific, Ameríku). Á sama tíma greindist frásog sýnisholanna án týrósínasa (Ab) og samanburðarholanna með ensími en án sýnis (Ab). Týrósínasa hindrandi virknin var reiknuð út með jöfnunni eins og hér að neðan:

Týrósínasa hindrandi hlutfall ( prósent )=[1− (Aa − Ab)/Ac] × 100 prósent.

IC50 var reiknað út með því að nota GraphPad Prism jöfnuna eins og hér að neðan:

Y=mín plús (hámark − mín)/1 plús 10(x−logIC50)×Hlíðarhalli

X táknaði þéttni tálmans; Y táknaði hömlunargögnin ( prósent ) ásamt lágmarks(mín) og hámarksgildum (max) þeirra; Hæðarhalli er hallaþátturinn.

Cistanche hamlar virkni tyrosinasa.

Melanín hamlandi í sebrafiskum

Villigerð AB línu sebrafiskur (útvegaður af Hunter Bio-technology, Inc., Hangzhou, Zhejiang héraði) var geymdur í fiskvatni (0,2 prósent skyndisjávarsalt í afjónuðu vatni, pH 6,9–7,2, leiðni 48{ {18}}–510 mS/cm, og hörku 53,7–71,6 mg/L CaCO3) í 14/10 klst. ljós/dökku ljósatímabili við stöðugt hitastig 28±0,5 gráður, og fóðraði lifandi saltvatnsrækju tvisvar á dag. Sebrafiskahembryos voru fengnir úr náttúrulegri hrygningu og þeim safnað innan 30 mín. Sebrafiskagreiningin var viðurkennd af Samtökum um mat og faggildingu rannsóknardýraverndar (AAALAC). Þessi rannsókn var samþykkt af IACUC (Institutional Animal Careand Use Committee) hjá Hunter Biotechnology, Inc. og IACUC samþykkisnúmerið var 001458.

Fósturvísar á 6 klst. eftir frjóvgun (hpf) stigi voru meðhöndlaðir með hverjum útdrætti í sex styrkjum (10, 30, 62,5,125, 250 og 500 mg/L) í 72 klst. til að meta hámarks óbanvænan styrk (MNLC) ). Fyrir vikið voru MNLCs af öllum útdrættinum meira en 62,50 mg/L.10 fósturvísar voru settir í 6-brunn og voru útsett sýni í styrkleika 10 og 30 mg/L frá 6 hpf til 54 hpf (48 klst. ). DMSO (0,05 prósent, rúmmál / rúmmál) andarbútín (10 og 30 mg/L) var notað sem venjulegt og jákvætt viðmið, í sömu röð.

Samstilltum fósturvísum var safnað og fylgst með þeim undir stereómíkrósjá (SZX7, Olympus, Japan) búin stafrænni myndavél (VertA1, Kína). Melanínsöfnun, í beinni fylgni við sebrafisklitunarsvæðin, var reiknuð út með GNUImage Manipulation Program (GIMP útgáfa 2.10.2) og gefin upp sem prósenta miðað við neikvæða samanburðinn (melanínsöfnun 100 prósent) [28, 30].

Sameindabryggjurannsókn

158 efnasambönd einangruð úr B. striata í bókmenntum[2], þar á meðal 19 glýkósíð, 28 bíbensýl, 19 fenan-þren, 18 biphenanthrenes, 23 dihydrophenanthrenes, 5 anthocyanins, 11 sterar, 8 triterpenoids, 5nolicnoquines, 5-nolicnoquines. og 10 önnur efnasambönd, voru notuð sem bindlar. 3D mannvirkin voru teiknuð af ChemBio3D og voru fínstillt með MM2 og Autodock Tools. 3D kristalbygging týrósínasa (PDBID:5M8N) og adenýlatsýklasa (PDB auðkenni:5IV3) var sótt í RCSB próteingagnabanka (www.rcsb.org/pdb/home/home.do). Allar vatnssameindir og heteróatóm voru fjarlægðar úr kristalbyggingunum með því að nota Chimera og MGL Tools. Að lokum, Autodock

Vina var notað til að festa viðtakapróteinið með litlu sameindunum. Færibreytur tengingarstaðarins fyrir pro-tein viðtaka voru stilltar sem -36.700, 7.034, -19.104, og - 17.467, - 22.807, 2.786, í sömu röð, í samræmi við upprunalega bindilinn mímósín og LRE1 [35]. Til að ná meiri útreikningsnákvæmni voru búnar til 20 tæmandi færibreytur fyrir hvern viðtaka, og sköpulag með hæstu sækni var valin sem endanleg tengibygging og sýnd í Pymol2.3. Á sama tíma voru upprunalegu bindlarnir mímósín og LRE1 teknir sem jákvæða stjórnin [36].

Í sílikó ADMET spá

3 efstu höggin frá B. striata voru með betri bindisækni við týrósínasa og adenýlat sýklasa, voru undirgefin ADMET greiningu. QikProp í Schrodingersuite var notað til að reikna út eðliseiginleika þeirra og lyfjatengda eiginleika, þar á meðal mólmassa (MW), spáð oktanól/vatns skiptingarstuðul (QPlogPo/w), spáð vatnsleysni (QPlogS), spáð Caco-2 fruma. gegndræpi fyrir þarma-blóðþröskuld (QPPCaco), spáð heila/blóðskiptingarstuðull (QPlogBB), spáð gegndræpi í húð (QPlogKp), spáð IC50 fyrir stíflu á HERGK plús rásum (QPlog HERG) og spáð frásog manna um munn. Eiginleikarnir voru metnir út frá fimmureglu Lipin-ski og bókmenntum [37, 38].

Sameindavirki uppgerð

Til þess að kanna stöðugleika og kraftmikla sveiflur bindil-próteinsamstæðunnar undir líkt líffræðilegu umhverfi og sannreyna frekar niðurstöður úr tengingu, voru efnasamböndin blestrin D (75) valin sem bindill fyrir sameindavirkni (MD) hermirannsóknina, byggt á niðurstaða sameindatengingar. Fléttan af blestrin D með týrósínasa og adenýlatsýklasa var gerð MD-hermun og keyrð í 100ns, með TIP3P vatnsstillingu. Rótmeðalkvaðratfrávik (RMSD) gildi próteinhryggjarliðsatóma miðað við upphaflega uppbyggingu voru reiknuð út til að skoða próteinstöðugleika á eftirlíkingartímabilinu [39].

Niðurstöður

Efnasamsetning

Dæmigert grunntoppsskiljun ETB og EFB voru sýnd á mynd 1. PeakView hugbúnaðurinn var notaður til að bera kennsl á innihaldsefnin. Sameindaformúlunni var nákvæmlega úthlutað innan massavillu 10ppm. Nákvæm mólþungi og brotin voru notuð til að bera kennsl á efnisþættina í samræmi við bókmenntir og gagnagrunninn fyrir frjálsa efnafræðilega uppbyggingu, svo sem ChemSpider og Massbank. Fyrir vikið voru 39 efnasamsetningar, þar á meðal 24 stilbenóíð (bíbensýl, fenantren og afleiður þeirra), 6 glýkósíð, 4 fenólsýrur, 3 kínón, 1 steri og 1 annað efnasamband auðkennt með semingi úr EFB og ETB. Á sama tíma var hlutfallsleg hálf-magngreining þeirra framkvæmd með því að mæla hámarksflatarmál hvers efnasambands í MS-ham með útdregnum jónaskiljunum [40]. Ítarlegar upplýsingar um auðkenninguna og hlutfallslegt innihald þeirra (hápunktur hitakorts, því dekkri liturinn, því hærra er styrkur) voru teknar saman í töflu 1.

Andoxunargeta

Það er vel þekkt að útfjólublá A (UVA) geislun getur framkallað framleiðslu á hvarfgefnum súrefnistegundum (ROS) og miðlað óhóflegri sortumyndun í húðfrumum. Náttúrulegt pólýfenól var hemlar ROS-myndunar og gæti verið ábyrgt fyrir sortueyðandi virkni plöntuþykkna [41 , 42]. Þannig, í þessari rannsókn, var andoxunargeta metin með DPPH, ABTS radical scavenging virkni og FRAPassay. Niðurstöðurnar (tafla 2 og mynd 2) sýndu að EFB (IC50=5.94mg/L) hefur sterkustu DPPHradical-hreinsandi virkni in vitro samanborið við PTB(IC50=548.24 mg/L) , PFB (IC50=285.81 mg/L) og ETB(IC50=65.25mg/L). Svipuð tilhneiging kom fram í ABTS og FRAP prófi. 95 prósent etanólútdrættir berkla og PB höfðu sterkari andoxunarvirkni in vitro en hráar fjölsykrur þeirra. Að auki sýnir EFB sterkari andoxunarvirkni en ETB, sem var í samræmi við fyrri rannsóknarniðurstöður [25].

Týrósínasa hamlandi virkni

Týrósínasi var lykilhlutfallstakmarkandi ensímið í melanínlífmyndunarferli og var mikið notað til að bera kennsl á möguleika náttúrulegra vara með and-melanogenese áhrif [43]. Niðurstöðurnar (mynd 3) sýndu að ETB og EPB höfðu sterkari týrósínasa hamlandi virkni en PTB og PPB in vitro, sem var í samræmi við fyrri rannsóknarniðurstöður [25]. EFB sýndi sterkari týrósínaseinhömlun á skammtaháðan hátt (á milli 20 og 200 mg/L) með IC50=58.92mg/L en ETB(IC50=75.44mg/L) og jákvæða efnasambandinu arbutin(IC{ {11}}.02 mg/L).

Melanín hamlandi í sebrafiskum

Zebrafish are recognized as a highly advantageous vertebrate model system to evaluate anti-melanogenesis activity, as it possesses similar organ systems and gene sequences to human beings [28]. Therefore, zebrafish was used to evaluate the anti-melanogenesis activity. As shown in Fig. 4, a large number of melanin (black spots) deposited in the zebrafish embryo in the control and 0.05% DMSO group. The microscopy images showed there was no significant difference in total melanin content between two groups (p>{{0}}.05), sem gefur til kynna að 0,05 prósent DMSO ökutækisins hafi ekki haft áhrif á melanínframleiðslu í fósturvísum sebrafiska. Hins vegar, eftir útsetningu fyrir prófuðum sýnum og arbútíni í 48 klst, sýndu fósturvísar sebrafiska mismikla melanínútfellingu (myndir 3B, 4), að undanskildum PFB 10 mg/L hópnum. Það er áberandi að hlutfallslegt melanín innihald í ETB 10mg/L (78,38 prósent) og 30 mg/L (64,72 prósent) hópum var marktækt lægra en í PTB 10mg/L (93,06 prósent) og 30mg/L (82,02 prósent) hópum (p.<0.01). it="" demonstrated="" that="" the="" anti-melanogenesis="" activity="" of="" etb="" was="" superior="" to="" that="" of="" ptb,="" which="" was="" consistent="" with="" the="" tyrosinase="" inhibitory="" activity.="" whereafter,="" it="" is="" noteworthy="" that="" the="" anti-melanogenesis="" activities="" of="" etb="" (81.65,="" 75.61%)="" and="" efb="" (78.38,="" 64.72%)="" were="" stronger="" than="" that="" of="" arbutin="" (93.57,="" 81.48%)="" at="" the="" same="" dose="" of="" 10="" mg/l="" and="" 30="" mg/l="" (p="" <="" 0.01="" or="">

Sameindabryggju

Týrósínasi er hraðatakmarkandi ensímið í nýmyndun melaníns: hýdroxýlering týrósíns í 3,4-díhýdroxýfenýlalanín (DOPA) og oxun DOPA todopaquinon. Þess vegna hefur týrósínasi verið talinn mikilvægt markmið fyrir þróun sortumyndunarhemla [44]. Að auki er adenýlatsýklasi lykilensím í sortumyndun af völdum cAMP. Binding melanótrópín alfa fjölpeptíðs (-MSH) við MC1R viðtaka olli virkjun adenýlatsýklasa, aukningu á cAMP stigi, uppstýrði tjáningu tyrosínasa gens og jók í kjölfarið melanín myndun [45]. Þess vegna gerðum við sameindatengingarrannsókn á 158 efnasamböndunum sem voru einangruð frá B. striata áður [2], með týrósínasa og adenýlsýklasa. Bindandi orka rannsakaðra bindla með týrósínasa og adenýlatsýklasa var tekin saman í töflu S1. Það voru 83 (þar á meðal 60 stilbenoids) og 85 (þar af 70 stilbenoids) efnasambönd sem sýndu sterkari bindisækni í týrósínasa og adenýlat sýklasa, samanborið við upprunalegu bindlana mímósín (− 6,4 kkal/mól) og LRE,51 kcal (mól) og LRE. /mól). 1,8-bis(p-hýdroxýbensýl)-4-metoxýfenantren-2,7-díól (56), blestrin D (75) og 2,7-díhýdroxý -1,6-bis(p-hýdroxýbensýl)-4-metoxý-9,10-díhýdrófenantren (93) voru efstu þrír bindlarnir í átt að týrósínasa, með bindingarorku −10,2, 10,0 og 9,7 kcal/mól, í sömu röð. Þó blestrin D(75), blestrin B (73) og 3,3'-díhýdroxý-5-metoxý-2,5',6-tris(p-hýdroxýbensýl)bíbensýl (42) voru þrír efstu bindlarnir í átt að adenýlsýklasa, með bindiorku - 12,1, - 11,9 og - 11,6 kcal/mól, í sömu röð. Fræðileg bindishækni þeirra og milliverkanir bindill og amínósýru voru teknar saman í töflu 3.

Það var athyglisvert að blestrin D (75), biphenanthrene efnasamband, fór inn í bindipokann af týrósínasa og adenýlatsýklasa (mynd 5), og sýndi marktæka bindisækni í bæði týrósínasa og adenýlatsýklasa. Van der Walls víxlverkanirnar stuðla að heildarorkuvíxlverkunargildi, á meðan framleiðir hýdroxýlhópur vetnistengi með amínósýruleifum Glu 451, Arg114 af tyrosinasa og Val 167 af adenýlatsýklasa, í sömu röð (tafla 3 og mynd S1). Efnasamband 93 sýndi einnig marktæka bindishækni í átt að týrósínasa með myndun 6 vetnistengja með amínósýruleifum Glu232, Glu451, Ser106, Cys113, Lys223 og Gln236.

Í sílikó ADMET spá

Spágildi nokkurra mikilvægra þátta ásamt ásættanlegu bili þeirra voru tekin saman í töflu 4. Fyrir utan QPlogS 3,3', 5-trímetoxýbíbensýl, blestrin B og blestrin D, og ​​QPlogBBof 3,3',{{6} }trímetoxýbíbensýl, allir aðrir útreiknaðir ADMET eiginleikar þriggja efstu högganna voru innan væntanlegra marka, á meðan var QPlog HERG af öllum þremur efstu höggunum minna en -5, sem gefur til kynna að þau gætu verið lyfjahæf til notkunar hjá mönnum. QPlog Kp af öllum þremur efstu höggunum fyrir bæði týrósínasa og adenýlatsýklasa, að 3,3′,5-trímetoxýbíbensýli, voru á hagstæðu bili, sem gefur til kynna að þessi efnasambönd geti auðveldlega komist inn í húðina.

Sameindadynamísk uppgerð

RMSD söguþráðurinn sýndi að RMSD gildi prótein-bindilsamstæðunnar sveifluðust ekki verulega yfir allt uppgerðatímabilið. RMSD gildi (mynd 6A) blestrin D með týrósínasa og ad-nýlat sýklasa flóknu voru ákvörðuð á bilinu 1,5 til 2,8 Å, og frá 2.0 til 3.6Å, í sömu röð. TheRMSF gildi sem endurspeglar sveigjanleika hverrar eftirlíkingar. Leifarnar með hærra RMSF-gildi sýndu að þær voru sveigjanlegri (mynd 6B). RMSF gildi amínósýruleifanna á lykkjusvæðum reyndust vera mjög sveiflukennd. Þó að virku efnaleifarnar héldu litlu RMSF gildi (minna en 1.0Å), eins og Arg114, Val167, Tyr226, Leu229 og Arg230in týrósínasa, og Val167, Leu102, Phe45, Lys95 og Leu166 í,nýlasa sem gefur til kynna að bindivasarnir hafi verið stöðugir. Sameindavíxlverkanir blestríns D við týrósínasa og adenýlatsýklasa voru sýndar á mynd 7.

Bindandi frjáls orka var reiknuð út með sameinda aflfræði-almenntuðu yfirborðsflatarmáli (MM-GBSA) aðferð [39]. Spáð bindandi orka blestrin D við týrósínasa og adenýlatsýklasa var -96,94 kcal/mól og -139,69 kcal/mól, í sömu röð, sem gefur til kynna að bindandi milliverkanir hafi verið sjálfkrafa (tafla 5). Ennfremur voru framlög sem studdi bindilbindingu óskautuð lausnarvíxlverkun, van der Waals og rafstöðueiginleikar.

Það var athyglisvert að gerðir og innihald efnaþáttanna í EFB voru meira en í ETB. Toppflatarmál allra auðkenndra efnasambanda í EFB voru um það bil tvöfalt af því í ETB. Mili-tarine var algengasta efnasamböndin bæði í EFB og ETB, sem hafði umtalsverða andoxunar-, bólgueyðandi og taugavarnarvirkni, og var valið sem efnamerki fyrir gæðaeftirlit á B. striata í kínversku lyfjaskránni 2020 útgáfu [46]. Hlutfallslegt hámarksflatarmál militarine í EFB (38,39×106) var aðeins hærra en í ETB (30,48×106). Gastrodín er vel þekkt efnasamband í mörgum kínverskum jurtalyfjum, svo sem Gastrodia elata, sem hefur verulegan týrósínasahamlandi og róttæka hreinsunaráhrif [30]. Hlutfallslegt hámarksflatarmál gastrodins í EFB (1,43 × 106) var aðeins lægra en í ETB (2,17 × 106).

95 prósent etanólútdrættir af berklum og PB höfðu sterkari andoxunarvirkni in vitro en óhreinar fjölsykrur þeirra. Að auki sýnir EFB sterkari andoxunarvirkni en ETB, sem var í samræmi við fyrri rannsóknarniðurstöður [25]. Þetta fyrirbæri má rekja til þess að EFB inniheldur hærra magn andoxunarefna, svo sem militarine og stilbenoids (náttúruleg plantna fjölfenól). Til dæmis, hlutfallslegt toppflatarmál 4,8,4',8'-tetrametoxý-[1,1'-bífenantrens]-2,7,2',7'-tetróls, tvífenantren með fjórum fenólhýdroxýlhópum, var 9,15×106 í FB, en það var 0,01×106 inTB.

Í þessari rannsókn sýndu PPB og PTB lítilsháttar týrósínasahamlandi virkni á skammtaháðan hátt. Hins vegar sýndi það fram á að engin virkni var greind í vatnskennda útdrættinum af PB (inniheldur PPB) [25]. Þetta fyrirbæri getur stafað af mismunandi undirbúningi sýna. Vatnsútdrátturinn af PB var notaður til að meta týrósínasa hindrandi virkni í tilraun Jiangs [25], en í þessari rannsókn var vatnskenndur útdráttur útfelldur með etanóli til að fá hráa fjölsykruna.

Nýlega hefur sebrafiskalíkanið verið mikið notað við mat á áhrifum gegn sortumyndun in vivo [47, 48]. Arbu-tin, hýdrókínón glúkósíð efnasamband sem fyrir eru ýmsar plöntur, sem hefur verið notað í viðskiptalegum tilgangi í snyrtivöruiðnaðinum, var sett sem jákvæð viðmiðun. Virkni ETB og EFB gegn sortumyndun var sterkari en arbútíns, sem gefur til kynna að ETB og EFB er hægt að nota sem húðlýsandi efni í snyrtivöruiðnaði.

Hlutfallslegt toppflatarmál blestrin D í EFB(1,91 × 106), er um það bil fjórfalt það sem er í ETB(0.46 × 10 ). Hlutfallslegt hámarksflatarmál efnasambands 56 (8,73 × 106) og 93 (0,64 × 106) í EFB er einnig marktækt hærra en í ETB (minna en 0,01 × 106 og 0,10 × 106). Þetta gæti verið ein af ástæðunum fyrir því að EFB sýnir sterkari and-melanogenic áhrif en ETB. Það er athyglisvert að efstu þrír bindlar til týrósínasa og adenýlsýklasa tilheyra allir stilbenóíðum (bíbensýlum, fenanthrenum og afleiðum þess). Stilbenoids eru náttúruleg fjölfenól plantna, sem hefur vakið mikinn áhuga á síðustu árum vegna ótrúlegrar lífvirkni þeirra eins og bólgueyðandi, sýklalyfja og andoxunarvirkni [49]. Resveratrol er algengasta stilbenoid. Fyrri rannsóknir bentu til þess að resveratrol og afleiður þess geta verulega hamlað hvatavirkni, genatjáningu og breytingar á týrósínasa eftir þýðingu. Þannig sýndu þau sig mögulega gagnleg sem húðlýsandi og öldrunarefni í snyrtivörum [41, 50].

Cistanche sýndi sig mögulega gagnlegt sem húðlýsandi og öldrunarefni í snyrtivörum.

Fyrir frekari upplýsingar, vinsamlegast smelltu á myndina.

Ályktanir

Í þessari rannsókn var kerfisbundið könnuð andoxunarefni og and-melanógenandi virkni hráu fjölsykrunnar úr B. striatatuber (PTB) og trefjarótum (FPB), og 95 prósent etanólútdrætti af B. striata hnýði (ETB) og trefjarótum (EFB). . Niðurstöðurnar sýndu að EFB bjó yfir sterkustu DPPH, ABTS róttæka hreinsunarvirkni og járnjárnminnkandi virkni. Að auki geta ETB og EFB dregið verulega úr virkni týrósínasa in vitro og melanínmyndun sebrafiskafósturvísa á skammtaháðan hátt. Sameindatenging benti til þess að það væri mikill fjöldi efnasambanda, aðallega stilbenoids, sem sýndu sterkari bindishækni í týrósínasa og adenýlatsýklasa, samanborið við bindisækni upprunalega bindilsins. Núverandi niðurstöður studdu rökstuðning fyrir notkun ETB og EFB sem náttúruleg húðhvítandi efni í lyfja- og snyrtivöruiðnaði.