Aðgreining, nýru, nýrnamyndun, nýrnaforfaðir,

Tengiliður:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

ÁSTANDUR

Nephron gjöf, skilgreind á fósturtímabilinu, ræður heilbrigði nýrna og tengdrar hjarta- og æðakerfis allt lífið. Við sýnum hér að þrátt fyrir neikvæð áhrif þess ánýrnavöxtur, erfðafræðileg aukning á GDNF lengir nýrnasjúkdómaáætlunina umfram eðlilega stöðvun þess. Fjölþrepa vélræn greining leiddi í ljós að umfram GDNF viðheldur nýrnaforfrumum og nýrnamyndun með aukinni tjáningu á seyttum skotmörkum þess og aukinni WNT merkingu, sem leiðir til tvíþættra áhrifa á viðhald nýrnaforfeðra. Óeðlilega hátt GDNF in fósturvísa nýru upregularþekkt markmið þess en einnig Wnt9b og Axin2, með samhliða hraðaminnkun á nýrnaforfrumnafjölgun. Lækkun á GDNF stigum eftir fæðingunýrun verða eðlilegþvagrásarknappinn og skapar leyfilegt umhverfi fyrir framhald nýrnasjúkdómsins, eins og sýnt er fram á formfræðilega og sameindalega eðlilega sjálfendurnýjun og aðgreiningu nýrnaforfeðra eftir fæðingu. Þessar niðurstöður sýna að umfram GDNF hefur tvífasa áhrif á nýrnafrumur í músum, sem geta svarað GDNF skömmtum á fósturskeiði og eftir fæðingu. Niðurstöður okkar benda til þess að skynjun á merkjavirknistigi sé mikilvægur búnaður þar sem GDNF og aðrar sameindir stuðla að líftíma nýrnaforfeðra.

cistanche tubulosa vs deserticola viðbótfyrirnæring fyrir nýru

KYNNING

Spendýrsnýra er óendurnýjandi blóðsíunarlíffæri með nauðsynlega afeitrun og saltajafnvægi.

Nýrunin sem sinna þessum aðgerðum fæðast á fósturtímabilinu, þar sem nýrun fullorðinna sýnir aðeins takmarkaða viðgerðargetu eða jöfnunarauklastækkun (hypertrophy) (Chawla og Kimmel, 2012; Rinkevich o.fl., 2014; Romagnani o.fl., 2013). Meðfæddur lítill nýrnamassi er almennt viðurkenndur áhættuþáttur fyrir háþrýstingi, próteinmigu, gauklakölkun og nýrnasjúkdóm á lokastigi (Bertram o.fl., 2011; Hoy o.fl., 2008) og hefur því mikil áhrif á heilsu nýrna allt lífið. Nýrnasjúkdómnum lýkur á milli meðgönguvikna 35-37 hjá mönnum og eftir fæðingu dags (P) 3 í músum (Hartman o.fl., 2007; Hinchliffe o.fl., 1991; Ryan o.fl., 2018), en aðferðirnar sem stuðla að til stöðvunarinnar eru illa skilin. Því hefur verið haldið fram að stigssértækar breytingar á vaxtarmynstri (Cebrián o.fl., 2004) og innri aldursskynjun frumna (Chen o.fl., 2015a) komi við sögu. Sameindafræðilega taka SMAD boð af völdum beinformunarpróteina (BMP) (Brown o.fl., 2015), hamartín (Tsc1) (Volovelsky o.fl., 2018) og míkróRNA-stjórnun (Yermalovich o.fl., 2019) þátt í ákvörðun nýrnavaldandi áhrifa. lengd dagskrár. Hins vegar hefur mýkt nýrnasjúkdómsins ekki verið kannað að fullu. Nephrons aðgreina sig frá nephron progenitor (NP) laug, einnig þekkt sem metanephric eða cap mesenchyme. NPs sem tjá einstaka efnisskrá merkja, þar á meðal SIX2, glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) og CITED1, eru aðeins til staðar í fósturnýrum þar sem þeir umlykja hvern þvagrásarknapp (UB) frá stofnun þess (Boyle o.fl., 2008; Self o.fl., 2006). Nýrnamyndunarferlið er samstillt við UB greiningu, sem samtímis viðheldur sjálfsendurnýjun í óaðgreindum NP þýði og örvar hlutmengi NPs til að gangast undir hægfara umskipti milli mesenchyme-til-þekju í gegnum vel skilgreind undanfarastig (pretubular aggregates, PA; nýrnablöðrur , RV; kommulaga bolir, CSB; S-laga bolir, SSB), sem að lokum aðgreinast í starfræn nýrung (Kobayashi o.fl., 2008; Lindström o.fl., 2018). Jafnvægið í sjálfsendurnýjun á móti aðgreiningu innan NP þýðisins er háð merkjum sem miðla gagnkvæmum inductive vefjasamskiptum sem eiga sér stað á milli UB og nærliggjandi mesenchyme. Metanephric mesenchyme og NP-afleidd merki, eins og GDNF og fibroblast growth factors (FGFs), stjórna UB formgerð, þar sem fósturnýrun vex að stærð, nær lögun sinni og kemur á söfnunarrásakerfinu (Costantini og Kopan, 2010). GDNF-virkjað RET merkjagjöf í UB ábendingunum stjórnar umritunarsniði sem ber ábyrgð á eftirliti með söfnun gönguleiða og UB formgerð (Kurtzeborn o.fl., 2018; Li o.fl., 2019; Lu o.fl., 2009; Ola o.fl. , 2011; Riccio o.fl., 2016). GDNF-stýrð umrit samanstanda einnig af seyttum próteinum, eins og WNT11 og CRLF1, með sýndan möguleika á að stjórna nýrnasjúkdómnum (O'Brien o.fl., 2018; Schmidt-Ott o.fl., 2005). Aðrir UB-afleiddir nýrnamyndunarstýringar eru WNT9b og FGF-bindlar sem hafa áhrif á viðhald og aðgreiningu NP (Barak o.fl., 2012; Carroll o.fl., 2005; Kiefer o.fl., 2012). Við höfum áður greint frá því að erfðafræðileg truflun á Gdnf 3′ óþýða svæðinu veldur 3- að 6-föld aukinni tjáningu innræns GDNF og leiðir til nýrnavanvaxta vegna UB greiningargalla (Kumar o.fl., 2015). Ólíkt dánartíðni nýbura í Gdnf útsláttinum, lifa Gdnfhyper/hyper mýsnar allt að 3 vikur og hafa leitt í ljós mikilvægu hlutverki GDNF við að safna sjálfsendurnýjun frumna í rásum (Costantini, 2012; Kumar o.fl., 2015; Li o.fl., 2019). Hér sýnum við fram á að umfram GDNF, þrátt fyrir neikvæð áhrif þess á heildar nýrnavöxt, getur aukið líftíma NP og styrkt þannig enn frekar nýviðurkennda mýkt nýrna spendýra.

LYKILORÐ:Aðgreining, nýru, nýrnamyndun, nýrnafrumur, mús

NIÐURSTÖÐUR

Nýrnakerfi fósturvísa fer eftir GDNF

Staðbundið fyrirkomulag SEX2-jákvæðra NPs í fósturvísi og snemma eftir fæðingunýrufylgir staðalímyndalegu mynstri sem er vel lýst, þar sem upphaflegi fjölfrumulaga vefurinn þynnist með tímanum án þess að hafa mikil áhrif á heildarskipulag sess (Short o.fl., 2014). NPs í Gdnfhyper/hyper nýrum var dreift um óeðlilega breiðan UB sem þynnra lag (mynd 1A-F; mynd S1A, B). Magngreining á NPs við E11.5 leiddi í ljós upphaflega aukningu, sem var tímabundið eðlileg við E12.5 en minnkaði verulega við E14.5 í Gdnfhyper/hyper nýrum (mynd 1E-G; mynd S1C-F). Mítósagreining sýndi fram á að bæði innrænt aukið og utanaðkomandi viðbót GDNF veldur marktækri lækkun á pHH3 auk NPC (mynd 1H; mynd S1G). Samanlagt sýna gögnin að umfram GDNF, sem starfar fyrst og fremst í UB, þar sem viðtakar þess eru tjáðir (Pachnis o.fl., 1993), veldur hröðu falli í NP frumufjölgun við snemma nýrnaþroska.

Það er vitað að ótímabær eða hröð NP aðgreining getur valdið hnignun NP frumna í sess þeirra (Kobayashi o.fl., 2008; O'Brien, 2018). Til að meta þetta var nýrnamyndun skoðuð með litun með LEF1 og cyclin D1, sem merkja elstu sérhæfðu frumurnar og nýrun sem gangast undir fulla þekjuvæðingu (Lindström o.fl., 2015). Þetta sýndi almenna fækkun á fyrri fjölda nýrnaforvera og benti til minni nýrnaaðgreiningar í Gdnfhyper/hyper fósturvísisnýru(Mynd 2). Glomerular density mat studdi þetta enn frekar og sýndi lægri heildarþéttleika í hypodysplastic Gdnfhyper/hyper nýrum en í villigerð (WT) nýrum (mynd S1G). Athyglisvert er að greining á heilaberki innan heildar mældu svæðisins, og sérstaklega hlutföllum heilaberki, leiddi í ljós aðeins hærra en WT hlutföll í Gdnfhyper/hyper (tafla 1; 17 prósent í Gdnfhyper/hyper, 12 prósent í WT). Þetta bendir til þess að þrátt fyrir snemmtæka hröðun á sjálfsendurnýjun og aðgreiningu NP hafa nýrun sem standa frammi fyrir umfram GDNF meðan á líffæramyndun stendur með áframhaldandi nýrnamyndun eftir fæðingu með minniháttar aukningu á nýjustu fæddu nýrungunum, sem eru mest staðsett í heilaberki (Rumballe o.fl., 2011; Short o.fl., 2014).

Ofgnótt GDNF lengir líftíma NP laugarinnar eftir fæðinguMargar múslíkön með skort ánýrnavöxtur, annað hvort vegna UB formgerða og/eða nýrnasérgreiningar, deyja strax eftir fæðingu (Kuure og Sariola, 2020). Þrátt fyrir verulega vanvöxt, óeðlilegt formgerð UB og alvarlega truflun á nýrnamyndun fósturvísa (mynd 2), lifa Gdnfhyper/hyper mýs allt að 3 vikum eftir fæðingu (Kumar o.fl., 2015; Li o.fl., 2019), sem gefur möguleika að kanna nýrnamyndun eftir fæðingu.

Eins og komið hefur fram (O'Brien, 2018), leiddi greining okkar á NP þýðunum við P1-P10 í ljós stórkostlegt tap í WT nýrum við P3, þar sem SIX2-jákvæðni greindist aðallega í

aðgreinandi nýrnaforvera, og aðeins 10 prósent af greindu UB oddunum (veggskotunum) voru lokuð með nýrnaforfrumum (NPC) (mynd 3A, n=2 nýru). Hins vegar greindust SIX 2-jákvæð NP í 59 prósentum Gdnfhyper/hyper sess við P3 (mynd 3B, n=2 nýru). Á sama hátt greindust PAX2-jákvæðar NP í NP veggskotum Gdnfhyper/hyper nýrna við P3, en PAX2-jákvæðu frumurnar voru eingöngu staðbundnar í aðgreindum nýrnaforverum í WTnýru(Mynd 3C,D).

Nýrnamyndun í Gdnfhyper/hyper eftir fæðingunýrusýndi marktækan bata frá því í fósturnýrum, eins og sýnt er með svipuðum nýrnaforverumynstri í WT og Gdnfhyper/hyper nýrum (mynd 3E-H; samanber mynd 2). Loksins,

við komumst að því að ~18 prósent af NP sessunum voru með SIX 2-jákvæðar NPCs á P4, og skuldbundnir NPCs voru til staðar í Gdnfhyper/hypernýruþar til P6, en framdir NPCs greindust í WT

nýruaðeins fram að P4 (mynd 4; mynd S1H). Þetta sýnir fram á að líftími NP in vivo er ekki fyrirfram ákveðinn og bendir til þess að mótun á vaxtarþáttastigum, sérstaklega GDNF, stuðli að tímasetningu síðustu nýrna aðgreiningarbylgjunnar.

Við gerðum þá tilgátu að viðvarandi NPCs í Gdnfhyper/hyper nýrum eftir fæðingu gætu annaðhvort stafað af almennum jöfnunaraðferðum sem orsakast af UB greiningargöllum sem leiða til nýrnavandamáls (Kumar o.fl., 2015; Li o.fl., 2019) eða að öðrum kosti stafa af GDNF-sértæku áhrif á NP íbúa. Til að greina á milli valkostanna voru NPs eftir fæðingu greind í öðrum líkönum um nýrnavandamál. Fgf9;20-vantarnýrusýna svipaða þynningu á NP frumulögum í fósturvísum (Barak o.fl., 2012) og greinist í Gdnfhyper/hypernýru, en okkur tókst ekki að greina SIX2- og/eða PAX2-jákvæðar frumur í NP sessum þeirra eftir fæðingu (Mynd S2). Til að útskýra þetta frekar, greindum við næst Hoxb7Cre; Mek1fl/fl; Mek2 plús /− nýru (Ihermann-Hella o.fl., 2014) þar sem, líkt og Gdnfhyper/hyper mýs, stafar nýrnaskortur af skertri UB greiningu. Þetta líkan skorti einnig merki um langvarandi nýrnamyndun, eins og greint var með nærveru SIX2- og/eða PAX2-jákvæðra frumna í NP sessum sínum eftir fæðingu (mynd S3), sem styður þá skoðun að nýrnavanvöxtur sé slíkt er ekki nóg til að viðhalda nýrnamyndun eftir fæðingu.

Birt gögn sýna einnig fram á að nýrnabilun ein og sér getur ekki stutt við viðhald NP eftir fæðingu (Kuure og Sariola, 2020), sem bendir ennfremur til virks hlutverks fyrir GDNF. Hins vegar getum við ekki alveg útilokað að umfram vaxtarþættir aðrir en GDNF hafi sömu áhrif.

Viðvarandi NPs eftir fæðingu viðhalda nýrnasjúkdómnum umfram eðlilega stöðvun þess

Viðvarandi NPs eftir fæðingu viðhalda nýrnasjúkdómnum umfram eðlilega stöðvun þess

Næst, aðgreiningarmöguleikar viðvarandi NPs í Gdnfhyper/hyper eftir fæðingunýruvar skoðað. Ki67 greining leiddi í ljós sambærilegt útbreiðslumynstur eftir fæðingu í WT og Gdnfhyper/hyper nýrum þar til P4 (mynd 5A, B). Frá P5 og áfram fækkaði Ki67-jákvæðum frumum í barkaraðgreiningarsvæði WT nýrna (mynd 5C,E,G). Slík lækkun á útbreiðslu barkar greindist ekki í Gdnfhyper/hyper nýrum, sem sýndu virkan hringrás frumur í nýrnaforveralíkum byggingum við P7 (mynd 5D,F,

H) en ekki lengur við P12 (Mynd S4A,B).

Greining nýrna aðgreiningar eftir fæðingu sýndi fram á of mikið magn nýrnaforvera í Gdnfhyper/hypernýruþar til P7, en þau greindust í WT nýrum aðeins upp að P4 (mynd 6; mynd S4C-F). Slík þrálát nýrnamyndun eftir fæðingu tókst hins vegar ekki að auka gauklaþéttleika frá því sem er á seinni stigum fósturvísa (mynd S5A-C; 6,4±2,1 á móti 10,2±1,2, í sömu röð; meðaltal±sem). Hlutfall cortical glomeruli í Gdnfhyper/hyper nýrum við P7 (59 prósent) er 1,5× hærra

Mynd 1. Nephron forfeður tæmast í fósturvísis Gdnf hyper/hypernýru. (A,B) Nephron progenitor (NP) merki SIX2 (rautt) staðsetur sig á mesenchyme cappping ureteric bud (UB) (calbindin, green) í WT (A; n=4 nýrum) og Gdnfhyper/hyper (B; n=5 nýru) nýru við E11.5. (C,D) E12.5 WT (C) og Gdnfhyper/hyper (D) nýru ræktuð in vitro í 24 klst og lituð fyrir SIX2 (rautt) til að sjá NP íbúa og kalbindín (grænt) fyrir UB (n{{9} } nýru/ meðferð, þrjár sjálfstæðar tilraunir). (E,F) NPs eru mikið í E14.5 WT nýrum (E; 42.6/odd), en í Gdnfhyper/hyper nýra eru NPs greinilega minnkað (F; örvar, 29.8/odd) (n=207 fyrir WT og 431 fyrir Gdnfhyper/hyper tips greind í níu nýrum/arfgerð).

Hvítar örvar benda á NP frumurnar (rauðar).

(G) Greining á SIX2-jákvæðu NP magni í WT og Gdnfhyper/hypernýrusýnir sambærilegar upphaflegar NP-laugar við E12,5. Gögn eru sett fram sem meðalmagn af SIX2-jákvæðum NPs±sem samanborið við WT gotfélaga, sem eru stillt á 100 prósent og endurspegla niðurstöður sem fengust úr fjórum óháðum gotum (WT: 100±15,61 prósent, n{{ 7}}; Gdnfhyper/hyper: 124,74±33,89 prósent, n=5; P=0.533, tvíhliða t-próf ​​í SPSS). (H) Hlutfall fjölgandi SIX2-jákvæðra NPs í Gdnfhyper/hyper nýrum við E12.5 sýnir marktæka lækkun samanborið við WT nýra. Gögn eru sett fram sem meðalhlutfall SIX2-jákvæðra NPs±sem fjölgandi samanborið við WT gotfélaga sem eru stillt á 100 prósent og endurspegla niðurstöður sem fengust úr þremur sjálfstæðum gotum (WT: 100±9,04 prósent, n{{ 25}}; Gdnfhyper/hyper: 56,94±12,67 prósent , n=5;

*P=0.024, tvíhliða t-próf ​​í SPSS). Mælikvarðarstikur: 100 µm.

en í WTnýru(39 prósent) (Tafla 1) sem styður þá skoðun að viðvarandi NP-hópur eftir fæðingu í Gdnfhyper/hyper nýrum framkalli ný nýrun eftir eðlilega nýrnamyndun.

Gdnfhyper/hyper mýs með langvarandi nýrnamyndun í nýrum með alvarlega vanvirkni í nýrum sýna engin merki um æxli eða æxlismyndun á stuttum líftíma (Kumar o.fl., 2015; Turconi o.fl., 2020).

Gdnfwt/hyper nýru sýna vægari fósturvísa fækkun NPCs en Gdnfhyper/hypernýru. Þessar mýs lifa eðlilegum líftíma og sýna ekki æxlinýrus og önnur líffæri (Turconi o.fl., 2020) (Mynd S6A-D, n=62). Tvöföld aukning á GDNF við fósturvísismyndun nær hins vegar ekki að viðhalda NP þýðinu í Gdnfwt/hyper nýrum eftir fæðingu (mynd S6E,F), sem bendir til þéttingar

Mynd 2. Áhrif umfram GDNF á nýrnamyndun fósturvísa. (A) LEF1 (rautt), merki um fortúbulaga einingar, fjarlægar nýrnablöðrur og S-laga líkama, í WT E14.5 nýrum. (B) E14.5 Gdnfhyper/hyper kidney sýnir mjög fá LEF1-jákvætt aðgreiningarnephron forefni og dæmigerð gnægð þvagvefs þvagrásar (UB) sem greinist með calbindin litun (grænn).

(C) Cyclin D1 (rautt) litar alla forvera aðgreiningar nýra (stjörnur merkja kringlulaga einingar og kommulaga líkama, örvar benda á S-laga líkama), sem sést mikið við hlið UB þekju (grænt) í E14.5 WTnýru.

(D) Marktækt færri aðgreiningar nýrnaforefni greinast í E14.5 Gdnfhyper/hypernýru. (E,F) Cyclin D1 (rautt) staðsetning í E16.5 WT (E) og

Gdnfhyper/hyper (F) nýru. Calbindin (grænt)

litun sýnir UB þekju á öllum myndum. Fyrir hverja litun á tilteknu stigi n=3 nýru/arfgerð. Mælikvarðarstöng: 100 µm.

Tafla 1. Magngreining á gauklaþéttni í Gdnfhyper/hyper nýrum við E18.5 og P7

Gögn eru meðalmagn nýrna á hvern rúmmetra mm±sem (n=4 nýru/ arfgerð, að meðaltali átta glærur greindar fyrir hvert nýra með 125 µm millibili til að koma í veg fyrir endurtekningarfjölda sömu glomeruli). Hlutfall cortical glomeruli í WT nýrum við E18.5 er 12 prósent, en í Gdnfhyper/hyper nýrum er það 17 prósent. Við P7 eykst hlutfall gaukla í heilaberki enn frekar í Gdnfhyper/hypernýru,sem bendir til þess að nýrnafrumur séu enn virkir aðgreiningar.

þröskuldsmörk fyrir getu GDNF til að móta nýrnasjúkdómaáætlunina.

Viðvarandi nýrnamyndun eftir fæðingu fer eftir breytingum á GDNF-örvuðum merkjum

Gdnf tjáning tapast úr WT nýrum með P2 (www.gudmap.org), en mRNA þess og prótein eru enn til staðar í Gdnfhyper/hyper

Viðvarandi nýrnamyndun eftir fæðingu fer eftir breytingum á GDNF-örvuðum merkjum

Gdnf tjáning er týnd frá WTnýruaf P2 (www.gudmap.org), en mRNA þess og prótein eru enn til staðar í Gdnfhyper/hyper

nýrueins seint og P7 (mynd 7A-D). Íhaldssamur GDNF viðtakakomplex er aðeins tjáður í þekjuvef UB ábendinga (Costantini, 2012;

Golden o.fl., 1999). Vegna staðsetningar viðtaka í vefnum sem liggur að NPC þýðinu grunaði okkur að áhrif aukins innræns GDNF á nýrnamyndun hljóti að vera miðluð.

í gegnum UB-afleidda, seytta, GDNF-háða sameind(ir) (http://www.signalpeptide.de/index.php) (Lu o.fl., 2009; Ola o.fl., 2011; Schmidt-Ott o.fl., 2005) (tafla 2), eða aðrar sameindir, tjáning þeirra gæti breyst vegna of stórs UB.

Tjáningargreining á UB-afleiddum, seyttum GDNF-markmiðum leiddi í ljós verulega uppstjórnun á Crlf1, Srgn og Wnt11 í Gdnfhyper/hyper nýrum við E14.5 (mynd 7E). Einnig er Wnt9b tjáning verulega aukin (mynd 7E). Frekari greining á WNT/ - catenin boðmarkmiðum (Clevers og Nusse, 2012) í E14.5 stjórn og Gdnfhyper/hyper nýrum sýndi marktæka uppstjórnun á kanónískt mark Axin2 (P=0.003371), en NP-tjáð WNT markmið (Karner o.fl., 2011) sýndu tilhneigingu til að minnka reglugerðir, sem endurspeglar líklega minnkaðan heildarfjölda NPCs (Mynd S7A). Saman gefa þetta til kynna að ekki aðeins aukin GDNF-örvuð merkjasending heldur einnig aukin Wnt9- og Wnt11-framkölluð merkjasending með þekktum aðgerðum í NPC-reglugerð taki þátt í að miðla gagnkvæmum samskiptum frá stökkbreyttum UB til aðliggjandi NP-hóps kl. E14.5 (Karner o.fl., 2011; Kiefer o.fl., 2012; Nagy o.fl., 2016; O'Brien o.fl., 2018).

Mynd 3. Aðgreining nýrna þegar nýrnamyndun er hætt. (A) P3 WT nýra hefur tapað SIX 2-jákvæðum nýrnaforfrumum (NP) í heilaberki eins og sýnt er af tapi á frumum í hlífðarmesenchyme (ör). Þess í stað staðsetur SIX2 sig á hliðarmesenchyme og snemma nýrnaforvera (örvahausa).

Magngreining á 48 NP veggskotum (greindar ábendingatölur) leiddi í ljós aðeins fimm veggskot með NPs. (B) Cap mesenchyme jákvætt fyrir SIX2 er enn til staðar í Gdnfhyper/hyper nýrum við P3 (örvar). Magngreining á 107 NP veggskotum (greint ábendinganúmer) leiddi í ljós 63 veggskot með NP frumum. (C,D) PAX2 (rautt) og calbindin (grænt) litun í WT (C) og Gdnfhyper/hyper

(D) nýru við P3. Örvar benda á stöðuna þar sem NP frumur haldast í Gdnfhyper/hypernýru.

(E,F) Sambærilegt magn af cyclin D1-jákvæðum (rauðum) nýrnaforefnum í P3 WT (E) og Gdnfhyper/hyper

(F) nýru. (G,H) Sýning á LEF1-jákvæðum nýrnaforverum (rautt) og þvagvef (grænt) sýnir svipaða áframhaldandi nýrnamyndun í WT

(G) og Gdnfhyper/hyper (H) nýru. Fyrir hverja litun

n=3 nýru/arfgerð. Mælikvarðarstikur: 100 µm.

Sameindalýsing á P5 Gdnfhyper/hypernýrusýndi viðvarandi uppstjórnun á Crlf1, Etv4, Etv5, Cited1 og Uncx4.1 (einnig þekkt sem Uncx), en sýndi einnig aukna tjáningu á mögulegum sessþáttum Lama1 (Rayagiri o.fl., 2018), nýrnasérgreiningarhvata Wnt4 (Stark o.fl. , 1994) og WNT merkjaörvi R-spondin 1 (Rspo1) (mynd 7F; mynd S7B). Slík umritunarsnið bendir til aukinna UB-afleiddra áhrifa á NPs, sem virðast gangast undir aðgreiningarbylgju sem byggist á minni Fgf9 og Fgf20 tjáningu og breyttri staðsetningu SIX2 plús frumna (myndir 4C, D og 7F). Við prófuðum virkni hvort marktækasta aukningin á Crfl1, Wnt11 og Wnt9b tjáningum gæti hugsanlega haft áhrif á nýrnasjúkdóminn í músum. CRLF1, í flóknu lífeðlisfræðilegu bindli kardíótrófín-líkt frumukín, veldur aðgreiningu í einangruðum nýrna-mesenchyme ræktun frá rottum (Schmidt-Ott o.fl., 2005). Einkenni Crfl1-knockout nýrna leiddi í ljós sambærilega nýrnastærð og nýrnamyndun og WT nýrum (Mynd S6C-F), sem bendir til ómissandi CRLF1 virkni in vivo. Framlag aukinnar kanónískrar WNT merkja til svipgerða af völdum umfram GDNF var prófað næst. IWR1 hamlar tankýrasa 1 og 2, sem eru nauðsynlegir fyrir eðlilegan nýrnaþroska (Chen o.fl., 2009; Huang o.fl., 2009; Karner o.fl., 2010). IWR1 meðferð létti UB þjórfé númer og formgerð í viðurvist umfram GDNF (mynd S8). Að lokum spurðum við hvort marktækt aukin Wnt11 tjáning í Gdnfhyper/hyper nýrum stuðli að langvarandi nýrnasjúkdómsáætlun í Gdnfhyper/hyper músum með því að fara yfir Wnt11 útsláttarsamsætu við Gdnfhyper bakgrunninn. Þetta tókst ekki að mynda tvöfalda arfhreinu

Mynd 4. Nephron forfeður eru viðvarandi í Gdnfhyper/hyper nýrum eftir fæðingu. (A,B) Staðsetning nýrnafruma (NP) merkis SIX2 (rautt) í WT við P4 (A) og P6 (B) sýnir tap á NPs í WT nýrum þar sem SIX2 finnst aðeins í veik jákvæðum nýrnablöðrum (stjörnum) . (C) Í Gdnfhyper/hyper kidneys á P4 staðsetur SIX2 einnig við NPs sem lokar þvagrásarbrum (grænar) ábendingar (örvar) (n=315 ábendingar í WT og 245 í Gdnfhyper/hyper greind í fjórum nýrum/arfgerð). (D) Staðsetning SIX2 (rauðs) og kalbindíns (græns) í P6 Gdnfhyper/hyper nýrum leiðir í ljós viðvarandi NP frumur (13; * gefur til kynna aðgreiningar nýra) í stökkbreyttu nýra (n=3 nýrum/arfgerð) . Magngreining á NP frumu sessum sýndi mjög fáar ábendingar, sem höfðu enga SEX2-jákvæða NP í WT nýrum, en 81 prósent sess í Gdnfhyper/hyper nýrum (n=2, 16 veggskotum) fylgdu með SIX2-jákvæðni í boðuðum og aðgreindum nýrnaforverum. Mælikvarðarstöng: 100 µm.

Gdnfhyper/hyper;Wnt11−/− afkvæmi (Tafla 3; n=95; P=0.005 Gdnfwt//hyper;Wnt11 plús /− ræktun). Þessar niðurstöður benda til dauða fósturvísa fyrir Gdnfhyper/hyper;Wnt11−/− stökkbrigði og neyddu okkur til að einbeita okkur að Gdnfhyper/hyper;Wnt11 plús /− nýrum. Fjarlæging á einni Wnt11 samsætu í Gdnfhyper/hyper bakgrunni bætti örlítið UB formgerð og minnkaði nýrnastærðina enn frekar en í Gdnfhyper/hyper nýrum, sem endurspeglar líklega minni myndun söfnunarrása blaðra við lækkun Wnt11 skammta (mynd S9A-C). Hins vegar jókst SIX2-jákvæð NP-þýði (29,8 NPC/odd á móti 40,7 NPC/odd við E14,5 og 20,3 NPC/odd á móti 30,9 við P0) og nýrnamyndun var bætt á aðgreiningarsvæði í barkar á Gdnfhyper/hyper ;Wnt1 plús /− nýru (mynd 8; mynd S9D-F; ber einnig saman við mynd 1F). Þessar niðurstöður benda því til þess að aukið GDNF gildi auki nokkur bud-afleidd GDNF/Ret markmið, sem, ekki ein heldur í samsetningu hvert við annað og ásamt auknum kanónískum WNT merkjum, stjórna NPCs í fósturnýrum.

UMRÆÐA Nýrnafrumufjöldi er skilgreindur á fósturskeiði og getur verið mjög mismunandi milli einstaklinga. NP stækkun og líftími hefur mikil áhrif á endanlega nýrnagjafa, og því er mikilvægt að bera kennsl á stjórnunaraðferðir sem stjórna sjálfsendurnýjun NP. Hér sýnum við að taugasímaþátturinn GDNF, sem þekktur er fyrir að hefja nýrnaþroska og stjórna UB formgerð (Costantini, 2010; Kurtzeborn o.fl., 2018; Li o.fl., 2019), er, þrátt fyrir neikvæð áhrif á nýrnavöxt, fær að lengja nýrnasjúkdóminn umfram eðlilega stöðvun þess. Niðurstöður okkar sýna að umfram GDNF hefur tvífasa áhrif á sjálfsendurnýjun og viðhald NP. Byggt á greiningu okkar leggjum við til líkan af því hvernig umfram GDNF í Gdnfhyper/hyper nýrum virkar

með aðferðum sem fela í sér breytingar á framvindu frumuhrings og getu til að skynja magn vaxtarþátta. Upphaflega í nýrum í fósturvísum veldur hátt GDNF-gildi hraðri lækkun á NP-tölum á hvern sess, sem er dæmigert fyrir mörg múslíkön með aðal skort á UB (Carroll og Das, 2013; Chen o.fl., 2015b; Costantini og Kopan, 2010; Liu o.fl., 2018). Ótímabær NP lækkun sem sést í þessum áður birtu líkönum stafar venjulega af ótímabærri aðgreiningu þeirra, sem er ekki raunin í Gdnfhyper/hyper nýrum. Þess í stað er umfram GDNF fær um að viðhalda virkum frumuhring í nýrnaberki eftir fæðingu verulega lengur en sést í WT nýrum. Fjölgun á sér stað í NP frumum, sem viðhaldast lengur en í WT nýrum, og þær halda áfram að framleiða ný nýrun. Í framtíðinni verður áhugavert að sjá hvort hægt verði að gefa umfram GDNF á þann hátt sem er hagstæður fyrir áframhaldandi nýrnamyndun eftir fæðingu án þess að hafa alvarleg áhrif á UB formgerð til að skekkja heildarvöxt líffæra. Gögnin okkar sýna að snemma lækkun á fósturvísum NPs af Gdnfhyper/hyper nýrum stafar af minni frumufjölgun frekar en aukinni ótímabærri aðgreiningu. Þessi frumubúnaður er studdur af sameindabreytingum sem greindust í þekktum GDNF markmiðum (Crlf1, Wnt11 og Srgn) (Lu o.fl., 2009; Ola o.fl., 2011) og í mikilvægum eftirlitsaðilum fyrir NP frumuviðhaldsmerkjaboð (Wnt9b, Wnt11 og þeirra umritunarmarkmið) (Karner o.fl., 2011; Kiefer o.fl., 2012; O'Brien o.fl., 2018). Fyrri athugun á langlífi og seiglu NP frumna með því að eyða NP þýðinu með barnaveiki eiturefni A, eða með því að trufla MAPK/ERK virkjun, sem bæði leiddi til hröðrar hnignunar NP frumna án jákvæðra áhrifa á líftíma þeirra (Cebrián o.fl., 2014) ; Ihermann-Hella o.fl., 2018), ásamt niðurstöðum okkar benda til þess að fjölgun NP frumna gegni í eðli sínu stórt hlutverk við að skilgreina heildarlíftíma þeirra. Sammála sýna NP frumur í nýrum seint í fósturvísi marktækt minni útbreiðsluhraða og hraða aðgreiningu, en ígræðsla gamalla NP frumna í nýrun á fyrri stigum lengir líftíma þeirra (Chen o.fl., 2015a). Byggt á niðurstöðum okkar leggjum við til að GDNF stuðli að því hvernig NP frumur skynja þroskaaldur sinn og að lokum líftíma þeirra. Í venjulegu nýra er GDNF tjáning mikil við upphaf nýrnamyndunar og á virka vaxtarskeiðinu, en skýr lækkun á GDNF gildi á sér stað í nýrum í seint fósturvísum, sem leiðir til tjáningartaps snemma eftir fæðingu (Mynd 7 og 9) . GDNF gildi í fyrstu Gdnfhyper/hyper nýrum eru óeðlilega há, sem virðist hamla NP frumufjölgun, líklega vegna greindra frumu- og sameindabreytinga innan stökkbreyttu UB eins og breyttrar WNT feril

(Mynd 7E,F; Mynd S7A,B), sem hefur þekkt áhrif á NPC líffræði (Karner o.fl., 2011; Kiefer o.fl., 2012; Nagy o.fl., 2016; O'Brien o.fl., 2018). Svipað og WT nýru, minnkar magn Gdnf mRNA og GDNF prótein í Gdnfhyper/hyper nýrum eftir fæðingu þar sem Gdnf er meðhöndlað á stigi eftir umritun sem gerir innræna tímabundna stjórnun tjáningarinnar (Kumar o.fl., 2015). Líklega dregur þetta úr GDNF tjáningu að því marki sem er leyfilegt fyrir sjálfsendurnýjun og aðgreiningu NP-frumna, sem greinast sem viðvarandi nýrnasjúkdómur í nýrum eftir fæðingu (mynd 9). Slík nýviðurkennd vaxtarþáttaháð mýking í nýrnaaðgreiningu ber von um notkun þess í endurnýjunartilgangi í framtíðinni. Fyrstu vísbendingar um möguleikann á að lengja aðgreiningartímabil nýrnafruma komu frá tilraunum sem hindra BMP/

Mynd 5. Viðvarandi útbreiðslu barkar í Gdnfhyper/hyper nýrum eftir fæðingu. (A,B) Ki67 litun í P4 WT (A) og Gdnfhyper/hyper (B) nýrum sýnir svipað mynstur fjölgunarfrumna í nýrum í heilaberki (rauðar örvar) beggja arfgerða. (C,D) Í P5 WT nýrum (C) minnkar Ki67-jákvæðni verulega í heilaberki (rauð ör), en Gdnfhyper/hyper nýru (D) sýna enn mjög mikla útbreiðslu (rauðar örvar). (E,F) Fjölgun í WT cortical nýra (E) minnkar enn frekar við P6, en það er enn mjög virk í Gdnfhyper/hyper nýrum (F). (G,H) Ki67-jákvæðar fjölgunarfrumur staðsetja sig í merg nýrnapíplum (svört ör) í P7 WT nýrum (G) en virk fjölgun greinist enn í nýrnabyggingum (rauðar örvar) í Gdnfhyper/hyper nýrum. (H). Fyrir hvert stig eftir fæðingu, n=3 nýru/arfgerð. Mælikvarðarstöng: 1 mm.

P7 aðeins í Gdnfhyper/hyper nýrum. (A,B) Nephron forveramerki LEF1 (rautt) í WT (A) og Gdnfhyper/hyper (B) nýrum við P4 sýnir áframhaldandi nýrnamyndun í báðum arfgerðum (örvar) (n=2 nýrum/arfgerð). (C,D) P5 WT nýru (C) sýna mjög fáar LEF1-jákvæðar frumur í heilaberki, en næg nýrnamyndun greinist í Gdnfhyper/hyper nýrum (D; örvar; n=4 nýrum/ arfgerð) . (E,F) LEF1 er ekki lengur til staðar í heilaberki WT nýrna við P6 (E), en nóg nýrnaforefni finnast enn í Gdnfhyper/hyper nýrum (F) (n=3 nýrum/arfgerð). (G) Cyclin D1 (hvítt) og JAG1 (rautt) staðsetja sig að aðgreindum fjarpíplum nýrunga (gul ör og örvaroddur) í P7 WT nýrum (n=3 nýrum). (H) Í P7 Gdnfhyper/hyper nýrum staðsetjast cyclin D1 og JAG1 í kommulaga (örvahaus) og S-laga (ör) líkama nýrnaforvera í barkaraðgreiningarsvæðinu, og sýna þannig viðvarandi nýrnamyndun á þessu seint stigi eftir fæðingu (n{ {19}} nýru). Mælikvarðarstikur: 100 µm.

SMAD1/5 merki, sem leiddi til örlítið stærri nýru með fleiri nýrum en í nýrum sem fengu ökutæki (Brown o.fl., 2015). Minni skammtur af Tsc1, sem kóðar mTOR hemla, heldur NP frumum í einn dag til viðbótar, án þess að tilkynnt hafi verið um áhrif á fjölda NP frumna í fósturvísum (Volovelsky o.fl., 2018). Langvarandi nýrnamyndun kom einnig fram hjá músum með oftjáningu á Lin28, Lin28b eða óvirkjuð Let-7 (Let-7a1; Let-7d; Let-7f1) (Urbach o.fl. ., 2014; Yermalovich et al., 2019), sem einnig sýna annað hvort beina æxlismyndun eða virkjun Igf2 eða H19h staðanna sem tengjast nýrnakrabbameini hjá börnum Wilms æxli (Chen o.fl., 2018; Ogawa o.fl., 1993). Þess má geta að engar breytingar á pSMAD1/5 staðsetningum eða gildum greindust í Gdnfhyper/hyper nýrum, sem eru vanþroskandi og samrýmast lífi í þrjár vikur.

Þessi rannsókn beinist að lýsingu á GDNF virkni í nýrnamyndun, sem hefur áður verið skoðuð með því að minnka innrænan Gdnf skammt og leiðir til minni nýrnagjafa (Cullen-McEwen o.fl., 2001, 2003). Kanóníska viðtakakomplexið fyrir GDNF er myndað af RET týrósínkínasa og samviðtaka hans GFRa1, sem eru eingöngu samtjáðir aðeins í UB þekjuvef (Costantini, 2012; Golden o.fl., 1999; Pachnis o.fl., 1993) . GDNF er lykilþáttur fyrir UB tipfrumur (Chi o.fl., 2009; Riccio o.fl., 2016; Shakya o.fl., 2005). Við höfum áður sýnt fram á að umfram GDNF stækkar söfnunarleiðir forfeðra á kostnað þvagrásarbolslengingar, sem leiðir til stækkaðs odds og stutts stofnsvipgerðar vegna galla í hreyfanleika forvera og styttri frumuhringslengd (Li o.fl., 2019). Á fósturvísum stigum samanlögð áhrif óeðlilegra

Mynd 7. Tjáningargreining á mikilvægum nýrnaþróunarstýringum. (A) In situ blendingargreining á Gdnf við P4 getur ekki greint nein afrit í WT nýrum (n=3 nýrum). (B) Gdnf tjáning er viðhaldið í P4 Gdnfhyper/hyper nýra og staðsetur sig á aðgreiningarsvæði í heilaberki þar sem nýrnaforfrumum er viðhaldið (rauður örvar) vegna umfram GDNF (n=3 nýra). (C) qRT-PCR greining á Gdnf afritum í Gdnfwt/ko, WT, Gdnfwt/hyper og Gdnfhyper/hyper nýrum við P7 (n=3 nýru/arfgerð). Gdnf tjáning í Gdnfhyper/hyper nýrum er marktækt hærri en í WT (P=0.036) og Gdnfwt/ko (P=0.038) (meðaltal±sem, tvíhliða t-próf ​​í SPSS ). (D) ELISA greining á GDNF próteinimagni í P7 nýrum (n=5 nýrum/ arfgerð) (meðaltal±sem). (E,F) qRT-PCR byggð magngreining á hlutfallslegu tjáningarstigi valinna gena við E14 (E) og við P5 (F) (n=3 nýru/arfgerð á tilteknu stigi). UB-afleidd seytt GDNF-markmið eru skráð fyrir ofan strikalínuna, en aðrir þekktir nýrnamyndunarstýringar eru sýndir fyrir neðan línuna. Gdnfhyper/hyper nýru sýna marktæka uppstjórnun á Crlf1 (*P=0.019), Srgn (*P=0.021), Wnt11 (**P=0.001) og Wnt9b ( **P=0.01) við E14, en við P5, marktækt aukin genatjáning inniheldur Crlf1 (**P=0.009), Etv4 (**P=0.{{ 39}}), Etv5 (*P=0.03), Lama1 (*P=0.014) og Wnt4 (*P=0.026). Aftur á móti er umritun Sostdc1 (**P=0.000), Fgf9 (**P=0.001) og Fgf20 (**P=0.001) ) er marktækt minnkað í Gdnfhyper/hyper nýrum við P5. Mælikvarðarstöng: 100 µm.

hátt GDNF, afbrigðilegar UB-odds formgerð framkallaðar lífeðlisfræðilegar breytingar og tengdar sameindabreytingar á GDNF-markmiðum og WNT-leiðinni virðast sameiginlega ýta NP-frumum í átt að minnkaðri fjölgun. Við sýnum hér að stækkað UB-odds formgerð batnar með tímanum en er viðvarandi við væg form allt að P4 í Gdnfhyper/hyper nýrum eftir fæðingu (mynd 5). UB þjórfé frumur eru enn til staðar í P5 Gdnfhyper/hyper nýrum, sem tjá mikið magn GDNF-stýrðra þjórfrumna Crlf1, Etv4, Etv5 og Lama1, NPC-tjáð kanónísk WNT-markmið Cited1 og Uncx4.1, auk WNT-örva R -spondin1 (Mynd 7E,F; Mynd S7A,B) (Karner o.fl., 2011; Lu o.fl., 2009; Vidal o.fl., 2020). Slíkar sameindabreytingar í UB eftir fæðingu veita því líklega hagstætt umhverfi fyrir viðvarandi NP sjálfsendurnýjun umfram P2/P3. Við auðkenndum UB-afleidd seytt CRLF1 og WNT11 sem GDNF markmið sem ásamt auknu kanónísku WNT

merkjasendingar, auk aukinnar Wnt9b tjáningar, miðla áhrifum þess á NP reglugerð. Gögnin okkar benda einnig til þess að virkni CRLF1 sé óþörf með öðrum frumukínum þar sem óvirkjun þess hefur ekki áhrif á nýrnaaðgreiningu. Bæði WNT9b og WNT11 stjórna mörgum þáttum NPC og nýrnamyndunar (Carroll o.fl., 2005; Karner o.fl., 2011; Majumdar o.fl., 2003; Nagy o.fl., 2016; O'Brien o.fl., 2018). Uppstjórnun UB-tjáðs Wnt9b, sem vitað er að stjórnar mörgum þáttum nýrnamyndunar, í Gdnfhyper/hyper nýrum getur líkt eftir þvingaðri tjáningu þess í NPs, sem truflar viðhald þeirra á móti aðgreiningarjafnvægi (Kiefer o.fl., 2012) og stuðlar þannig vélrænt að. að ójafnvægi NP sjálfsendurnýjunar í Gdnfhyper/hyper nephrogenese. Þetta er stutt af bættri oddsformgerð á kanónískri WNT hömlun með IWR1 í heilum nýrum sem standa frammi fyrir umfram GDNF.

Tafla 2. Seytt GDNF markgen sem geta haft áhrif á nýrnasjúkdómaáætlun

Niðurstöður okkar sýna að IWR1 hömlun sjálf hefur mikil áhrif á NPC, sem eru dreifðir og lauslega festir við UB ábendingar. Kanónísk WNT hömlun í NPC sjálfum stuðlar líklega að því að ekki tekst að auka svipgerð þeirra í viðurvist umfram GDNF. Þetta er stutt af erfðafræðilegum tilraunum okkar þar sem lækkun á UB-tjáðri Wnt11 tjáningu í Gdnfhyper/hyper bakgrunni bætti NP viðhald og aðgreiningu, en tókst ekki að bjarga að fullu nýrnavandamálinu af völdum umfram GDNF. Þetta gæti að minnsta kosti að hluta til verið vegna þess að ekki tókst að gera báðar Wnt11 samsæturnar óvirkar í Gdnfhyper/hyper bakgrunni vegna fósturskemmda Wnt11−/− (Nagy o.fl., 2016). Þannig gæti ein Wnt11 samsæta sem eftir er jafnvel aukið GDNF-fallið eins og áður var lagt til (Majumdar o.fl., 2003) og þannig að hluta til bannað fulla björgun nýrnamyndunar. Núverandi rannsókn okkar getur ekki útilokað þann möguleika að sum áhrif GDNF á NPs séu vegna GDNF merkja sem ekki eru kanónísk, þar sem hugsanlegir aðrir merkjaviðtakar þess eru tjáðir af NPs (Brodbeck et al., 2004; Enomoto et al., 2004; Keefe Davis o.fl., 2013; Paratcha o.fl., 2003). Hins vegar, bæði eyðing á NCAM eða tjáningu á Gfra1 í UB eingöngu (með því að setja það undir stjórn Ret promoter) viðhalda eðlilegri nýrnasvipgerð (Cremer o.fl., 1994; Heuckeroth o.fl., 1999; Keefe Davis o.fl., 2013; Rossi o.fl., 1999; Sariola og Saarma, 2003). Þetta bendir til þess að, að minnsta kosti ein og sér, séu hvorki NCAM né GFRa1 nauðsynleg fyrir nýrnasjúkdómaáætlunina. Í stuttu máli benda tilraunir okkar til þess að GDNF, sem hefur verið, og er nú, í klínískum rannsóknum á Parkinsonsveiki (Kirkeby og Barker, 2019), gæti haft möguleika á að þjóna sem tilvonandi leið til að bæta nýrnagjafa í framtíðinni. Frekari tilrauna er þörf til að finna mögulegar leiðir til að virkja of mikið GDNF boð án skaðlegra áhrifa á nýrnavöxt

EFNI OG AÐFERÐIR

Dýr

Dýraumönnun og rannsóknir voru framkvæmdar í samræmi við siðareglur um dýratilraunir sem og tilskipanir Evrópusambandsins (tilskipun 2010/EU/63), og voru samþykktar af National Animal Experiment Board of Finnland. Mýsnar voru geymdar í einstökum loftræstum búrum með mat og vatni að vild. Besta rakagjöf og upphitun var stöðugt veitt í löggiltri tilraunadýramiðstöð Háskólans í Helsinki. Áður hefur verið lýst kynslóð og arfgerð Gdnfhyper (Kumar o.fl., 2015) og Fgf9;20 (Barak o.fl., 2012) músalíkönum. Gdnfhyper;Wnt11− hvolpar eru úr krossa á C57BL6 Wnt11−

Tafla 3. Yfirlit yfir arfgerðir afkvæma úr Gdnfwt//hyper;Wnt11 plús /− millikrossum

(Nagy o.fl., 2016) og Gdnfhyper línur, og voru arfgerð eins og áður hefur verið lýst (Kumar o.fl., 2015; Nagy et al., 2016 ). Allar músalínurnar sem notaðar voru í rannsóknunum voru viðhaldnar á 129Ola/ICR/C57bl6 þrefaldan blönduðan bakgrunn. Kynslóð Crlf knockout músa hefur verið lýst áður (Alexander o.fl., 1999). PCR arfgerð var framkvæmd með nýsértæku grunnsetti (5'-AGAGGCTATTCGGCTATGACTG-3' og 5'-CCTGATCGACAAGACCGGCTTC-3′) ásamt genasértækum grunnsettum fyrir Crlf1 (5'TGCTGGTAATAGG) 18}}′ og 5′-GACCCTATCTGCGTTTTCCA-3′). Vefjasöfnun Fósturvísar voru sviðsettir í samræmi við forsendur Theiler (1989) eins og áður hefur verið lýst (Kuure o.fl., 2005) og safnað eftir leghálslosun þungaðra kvenna við djúpa svæfingu með CO2. Ungum fósturvísa og eftir fæðingu var fórnað með afhausun. Vefur var krufður í Dulbecco's miðli ásamt 0,2 prósenta sermi albúmíni úr nautgripum (BSA) fylgt eftir með festingu með 4 prósent paraformaldehýði (PFA) eða líffæraræktun. Líffæraræktun Nýru einangruð úr E11.5 og E12.5 músafósturvísum voru sett við loft-vökva tengi sem studd var af Transwell® pólýester himnukerfi (Costar) og ræktuð við 37 gráður í rakaðri 5 prósent CO2 andrúmslofti með nýrnaræktunarmiðli [F12 :DMEM (1:1) auk Glutamax (Gibco)] ásamt 10 prósenta sermi úr nautgripafóstri og penicillín-streptomycini (Ihermann-Hella og Kuure, 2019). Fyrir in vitro ræktun með 100 ng/ml utanaðkomandi GDNF (ProSpec Ltd) (Sainio o.fl., 1997) sem miðar að NPC magngreiningu, var hver þvagfrumuæðablokk sem innihélt metanephros, endanlegt nýrnagrundvöllur, helmingaður meðfram linea mediana ventralis. Helmingur hvers sýnis var ræktaður með utanaðkomandi GDNF á meðan hinn helmingurinn gegndi hlutverki viðmiðunar. WNT hömlunartilraunir voru fyrst prófaðar með 50-100 ng/ml GDNF og 50-100 µM IWR1 (I0131-25, Sigma-Aldrich). Byggt á þessum skammtaháðartilraunum var ákjósanlegur styrkur 50 ng/ml GDNF og 75 µM IWR1. Vefjafræði og ónæmislitun Fyrir rannsóknir sem rannsaka áhugamerkið á paraffínsneiðum voru nýru krufin úr fósturvísum eða hvolpum á tilgreindum stigum, fylgt eftir með vefjavinnslu og skurði eins og áður hefur verið lýst (Li o.fl., 2019). Að minnsta kosti fimm hlutar úr hverju nýra og þrjú til fimm mismunandi nýru fyrir hverja arfgerð voru notaðir í hverri greiningu. Nákvæm sýnishornsnúmer eru tilgreind í myndsögunum. Hematoxylin og Eosin (H&E) og ónæmisvefjafræði sem gerð var á paraffínsneiðum var lokið eins og áður hefur verið lýst (Li o.fl., 2019). Í stuttu máli var krufði vefurinn festur yfir nótt með 4 prósent PFA (pH 7,4), fylgt eftir með þurrkun og paraffínvæðingu með sjálfvirkri vefvinnslu (Leica ASP 200). Hlutar með 5 µm þykkt voru útbúnir og afvaxaðir í Xylene, fylgt eftir með endurvötnun áður en þeir voru litaðir með Harris H&E eða fóru í hita-framkallaða mótefnavaka í mótefnavaka endurheimt buffer (10 mM sítrat; pH 6,0). Fyrir ónæmislitun var 3 prósent BSA notað til að blokka (1 klst við stofuhita) fylgt eftir með 30 mín 0,5 prósent vetnisperoxíðmeðferð fyrir litningalitun. Hlutar voru síðan ræktaðir með frummótefnum yfir nótt við plús 4 gráður, fylgt eftir með tegundasértækum aukamótefnum í 2 klst. við stofuhita. Litningagreining var útfærð með EnVision Detection System-HRP (DAB) setti (Dako).

Mynd 8. Erfðafræðileg lækkun á Wnt11 stigi bjargar að hluta til tapi nýrnaforfeðra í Gdnfhyper/hyper nýrum. (A) SEX 2-jákvæð nýrnaforfaðir (NP, rauð) eru fáir í E14.5 Gdnfhyper/hyper nýrum (meðaltal 29,8 NPs/odd í 552 oddum sem greindir voru í níu nýrum). (B) Gdnfhyper/hyper;Wnt11 plús /− nýru sýna aukningu á almennu magni NPs á hverja sess í fjarveru einni Wnt11 samsætu (meðaltal 40.7 NPs/odd í 107 ábendingum sem greind voru í fjórum nýrum ). (C,D) PAX2-jákvæðar frumur í Gdnfhyper/hyper (C) og Gdnfhyper/hyper;Wnt11 plús /− (D) nýru sýna svipað mynstur og magn við E14.5. (EH) Við P0 sýnir SIX2 litun framfarir á NP tölum með því að fjarlægja eina Wnt11 samsætu (meðaltal 20,3 NPs/ábendingar í 610 Gdnfhyper/hyper ábendingum á móti meðaltali 30,9 NPs/ábendingar í Gdnfhyper/hyper plús /W−n; ábendingar greindar í sex nýrum/arfgerð), sem er studd af PAX2 litun. Dreifing SIX2-jákvæðra NPs (A′,B′,E′,F′) og PAX2- jákvæðra frumna (C′,D′,G′,H′) er sýnd án kalbindíns ( grænt) merki, sem sýnir UB þekjuvef í öllum nýrum. Kvarðarstikur: 200 µm.

E11.5 og E12.5 nýru sem voru undirgefin ónæmisflúrljómunarlitun í heilu lagi voru fest og gegndræp með 100 prósent ísköldu metanóli í 10 mínútur fyrir ræktun yfir nótt með frummótefnum. Ræktun með samsvarandi tegundasértækum aukamótefnum var framkvæmd á öðrum degi eftir kröftugan þvott með PBST (0,1 prósent Tween 20 í PBS). Upplýsingar um aðal- og aukamótefnin sem notuð eru í þessari rannsókn eru skráð í töflu S1. In situ blending In situ blending var framkvæmd eins og áður hefur verið lýst (Ihermann Hella o.fl., 2014). Í stuttu máli, and-sense RNA rannsaka gegn Gdnf exonum var umritað og blandað á þykka hluta úr P4 nýrum (10-15 hlutar/nýra, n=3 nýru/arfgerð) innbyggð í 4 prósent lágbræðslu agarósa (NuSieve GTG, Lonza). BM Purple var notað til litmælingaviðbragða

ELISA GDNF próteinmagn í P7.5 nýrum var mælt með ELISA eins og áður hefur verið greint frá (Kumar o.fl., 2015). GDNF Emax® ónæmispróf (Promega) var notað með sýrumeðferð þegar ELISA var framkvæmd. Í smáatriðum, fyrir hverja arfgerð, voru þrjú nýru greind strax eftir að hafa verið krufin. Eftir að hafa mælt próteinstyrkinn með DC próteingreiningu (Bio-Rad), var 25 µg af heildarpróteini sett í brunninn á ELISA plötu. Hvert sýni var greint í tvíriti.

Myndgreining Ónæmislitun og in situ blending á köflum voru mynduð með því að nota annað hvort Zeiss AxioImager með HXP 120V flúrljómunarljósgjafa, Hamamatsu Orca Flash 4.0 LT B&W myndavél og Zeiss AxioCam 105 litamyndavél , eða með Leica DM5000B með Leica EL 6000 málmhalíð ljósgjafa og Hamamatsu Orca-Flash4.0 V2 sCMOS myndavél. Ónæmisflúrljómunarlitun í heild sinni var mynduð með Zeiss AxioImager með Zeiss ApoTome forritinu. Myndataka í heild sinni fyrir mælingar á ósnortnum nýrnastærð var framkvæmd með Leica MZFLIII með Leica DFC7000T myndavél. Magngreiningar byggðar á ónæmislitun og myndgreiningu. Magngreining á gauklaþéttni var reiknuð út frá raðhlutum E18.5 og P7 nýrna. Nýrun voru sneidd í gegnum og hlutar til að mæla gaukla voru teknir á 125 µm fresti til að forðast endurtekningarfjölda gaukla. Fjöldi glomeruli í hverjum hluta var talinn handvirkt og flatarmál hvers nýra var mælt með Fiji ImageJ hugbúnaði (V1.51) með því að útlína útlínur handvirkt. Til að reikna út gauklaþéttleika, heildarfjölda gaukla

Mynd 9. Skýringarmynd af áhrifum umfram GDNF á nýrun í músum. (A) Í nýrum fósturvísa sem gangast undir virkan vöxt, fá nýrnaforfrumurnar (NPC, rauðar) seytt leiðbeiningarmerki (td Wnt11 og Wnt9b) frá þvagrásarknappum (UBT, dökkblár) til að stjórna jafnvægi NP-fjölgunar og sjálfsendurnýjunar. og aðgreining þeirra í peritubular aggregate (PA, bleikur frumuþyrping). (B) Í nýrum eftir fæðingu tapast oddurinn af UB (UB, ljósblár) eins og sameindalega sést af samdrætti í tjáningu td Wnt9b, Wnt11, Crlf1 og Etv4/5, auðkennd með þunnum rauðum stöfum. Smám saman tap á UB-afleiddum seyttum þáttum (Wnt9b, Wnt11 og Crlf1) stuðlar að minnkandi NP-fjölgun og sjálfsendurnýjun. Samhliða minnkar GDNF og FGF gildi, sem fellur saman við hraða NP aðgreiningu. Þetta saman tæma NP laugina fljótt sem leiðir til þess að nýrnamyndun hættir. (C) Ofgnótt GDNF í nýrum í fósturvísum veldur óeðlilegri UBT formgerð og eykur tjáningu á brum-afleiddum, seyttum stjórnsameindum (Crlf1, Sign, Wnt11 og Wnt9b). Of mikil tjáning á seyttum sameindum sem eru afleiddar af brum hefur hamlandi áhrif á NP frumuhringinn sem leiðir til minni fjölgunar og sjálfsendurnýjunar. Fall-in heildar NP tölur hægja á PA aðgreiningu, eins og greinist með minnkaðri Wnt4 tjáningu. (D) Í nýrum eftir fæðingu jafnast UBT formgerðin, og þar með sess sem hún veitir fyrir NPS, þrátt fyrir hærri en WT tjáningu á brum-afleiddum seyttum skotmörkum (Crlf1, Etv4/5 og Lama1). Ásamt eðlilegu Wnt9b og Wnt11 (ekki sýnt) niðurgreiða þessar sameindabreytingar eðlilega NP-fjölgun, sjálfsendurnýjun og aðgreiningu, eins og sést af viðhaldi stórs NP-þýðis, hærri Wnt4-tjáningu og svipað magn nýrnaforvera (bleikir klasar). frumna) eins og í WT fósturnýrum. Með slíkum aðferðum gerir stofnandi GDNF umframmagn undir eigin verkefnisstjóra kleift að halda nýrnasjúkdómnum áfram þar til P7. Dökkgrár texti, óbreytt tjáning; rauður texti, minnkuð tjáning; grænn texti, aukin tjáning.

og fjöldi gaukla í heilaberki var talinn sérstaklega. Meðaltal heildarnýrnaflatarmáls og heildarfjöldi og gauklafjöldi í heilaberki var síðan reiknaður út fyrir hvert sýni. Meðal gaukulþéttleiki var reiknaður út með því að deila meðalgakulfjölda með meðaltalsflatarmáli. Meðaltal cortical glomeruli innan alls meðalsvæðisins var reiknað út með því að deila meðaltal cortical glomerulars með meðaltali mældu heildarflatarmáls. Aðeins glomeruli með heil lögun voru skráð. Magngreining á heildar SIX2-jákvæðum NPS við E11.5 (n=4 fyrir WT, n=5 fyrir Gdnfhyper/hyper) og E12.5 (n=10 nýru/ meðferð, þrjár sjálfstæðar tilraunir) voru byggðar á ónæmisflúrljómunarlitun í heild sinni. Myndirnar voru teknar með notkun Zeiss ApoTome og síðan unnar með Imaris hugbúnaði (Bitplane) með því að nota spot tracking. Allar myndirnar voru unnar með sömu greiningaraðferðum. Til þess að staðla muninn á milli gotanna var meðalmagn SIX2-jákvæðra NPs í WT nýrum innan hvers gots stillt á 100 prósent og magn SIX2- jákvæðra NPs í Gdnfhyper /hyper kidneys var borið saman við meðalmagn í WT nýrum í gotinu. Mítósuvísitala SIX2-jákvæðs NPS í E12.5 nýrum (n=10 nýrum/ meðferð, þrjár óháðar tilraunir) sem ræktaðar voru með utanaðkomandi GDNF voru reiknaðar út á svipaðan hátt til að staðla muninn á milli gota.

Meðalhlutfall SIX{0}}jákvæðra NPs sem fjölgaði í WT nýrum og nýrum sem ræktuð voru án utanaðkomandi GNDF í hverju goti var stillt á 100 prósent og hlutfall SIX sem fjölgaði{{2 }}jákvæð NPs í viðurvist umfram GDNF (Gdnfhyper/hyper kidneys og utanaðkomandi notkun) frá sama goti var teiknað á myndinni eftir samanburð við WT gotfélagana. Mítósuvísitala SIX2-jákvæðs NPS í E11.5 nýrum sem ræktuð voru með utanaðkomandi GDNF var teiknaður sem upprunaleg gögn/gildi. Útreikningur á meðaltali SIX2-jákvæðra NPS á hvern nýrnasneið (E14.5 og P0) og nýrnastig með forverum (P3-P6) voru framkvæmdar með ónæmisflúrljómunarlitun í paraffínsneiðum. Fjöldi SIX2-jákvæðra NPS var talinn með Fiji ImageJ hugbúnaði (V1.51) á hverjum hluta sem valinn var fyrir greiningu með því að nota agnagreiningu og fjöldi ábendinga var talinn handvirkt á samsvarandi hlutum. Fjöldi greindra sýna við E14.5 var þrjú nýru fyrir WT og Gdnfhyper/hyper nýru og tvö nýru fyrir Gdnfhyper/hyper; Wnt11 plús /−. Fjöldi ábendinga sem greind voru á E14.5 var 207 í WT, 431 í Gdnfhyper/hyper, og 107 fyrir Gdnfhyper/hyper; Wnt11 plús /− nýru. Fjöldi greindra sýna við P0 var þrjú nýru á hverja arfgerð og fjöldi greindra odda, sem er sýndur á samsvarandi myndum, er breytilegur frá 10 til 315, sem er lægstur í WT P6 nýrum, þar sem oddarnir eru sjaldan til staðar. UB oddsmælingar voru gerðar með því að nota LAS X forritið í Leica smásjá stýrikerfinu eftir 48 klst ræktun í viðurvist tilgreindra efna og sjónræning á oddunum með E-cadherin mótefni (tafla S1). Ábendingarnar voru mældar frá sex nýrum í hverju ástandi tveggja óháðra tilraunahópa þar sem fjöldi oddanna sem mældur var var: 101 fyrir GDNF, 131 fyrir IWR1 og 115 fyrir 75 µM IWR1 auk 50 ng/ml GDNF. Nýrnastærðarmælingar í tilraunum sem meta áhrif Wnt11 eyðingar í Gdnfhyper/hyper bakgrunni voru gerðar með Fiji ImageJ hugbúnaði (V1.51) á myndum í heilu fjalli með handvirkri rekja útlínur nýrna. Tölfræðileg greining Öll gildi eru sýnd sem meðaltal±sem nema aðaláhrifagreining Gdnf og Wnt11 á nýrnastærð, sem er sýnd sem meðaltal±sd Tölfræðileg marktekt var stillt á P<0.05 for="" all="" the="" analyses.="" independentsamples="" two-tailed="" t-test="" was="" used="" for="" pairwise="" comparisons="" with="" spss="" statistics="" software="" (ibm;="" version="" 25)="" in="" the="" study="" unless="" otherwise="" noted.="" the="" data="" obtained="" via="" in="" vitro="" tissue="" culture="" with="" exogenous="" gdnf="" was="" analyzed="" with="" the="" paired-sample="" t-test="" using="" spss="" statistics="" software.="" the="" impact="" of="" genetically="" modified="" gdnf="" and="" wnt11="" expression="" on="" kidney="" size="" was="" analyzed="" via="" two-way="" anova="" followed="" by="" main="" effects="" test="" with="" spss="" statistics="" software.="" the="" statistical="" significance="" for="" the="" deviation="" of="" gene="" distribution="" from="" mendelian="" ratio="" was="" performed="" using="" the="" χ2="" test="" also="" with="" spss="" statistics="" software.="" the="" data="" obtained="" from="" elisa,="" qrtpcr,="" and="" wnt="" inhibition="" experiments="" were="" analyzed="" with="" one-way="" anova="" followed="" by="" bonferroni="" posthoc="" test="" using="" spss="" statistics="" software.="" reverse="" transcription="" and="" quantitative="" rt-pcr="" (qrt-pcr)="" experiments="" were="" conducted="" as="" previously="" reported="" (kumar="" et="" al.,="" 2015).="" in="" more="" detail,="" 150-500="" ng="" of="" total="" rna="" from="" each="" sample="" (n="3" kidneys/genotype="" at="" the="" given="" stage)="" was="" treated="" with="" rnase-free="" dnase="" i="" (thermo="" fisher="" scientific).="" the="" reverse="" transcription="" reaction="" was="" performed="" with="" random="" hexamer="" primers="" and="" revertaid="" reverse="" transcriptase="" (thermo="" fisher="" scientific)="" immediately="" after="" inactivation="" of="" dnase="" i="" with="" 5="" mm="" edta="" at="" 65°c.="" complementary="" dna="" (cdna)="" was="" diluted="" 10×="" and="" stored="" at="" −20°c="" until="" qrt-pcr.="" for="" qrt-pcr,="" lightcycler="" 480="" sybr="" green="" i="" master="" (roche)="" or="" bio-rad="" c1000="" touch="" thermal="" cycler="" upgraded="" to="" cfx384="" system="" (bio-rad),="" supplied="" with="" sybr="" green="" i="" master="" (roche)="" and="" 250="" pmol="" primers="" were="" loaded="" into="" the="" well="" of="" 384-well="" plates="" with="" a="" total="" volume="" of="" 10="" µl.="" negative="" control="" was="" always="" included="" in="" every="" reaction="" via="" setting="" conditions="" with="" minus-reverse="" transcription="" or="" water.="" a="" combination="" of="" pgk1,="" hprt,="" and="" gapdh="" was="" used="" as="" the="" reference="" genes="" in="" all="" the="" qrt-pcr="" experiments,="" except="" the="" one="" with="" p7.5="" kidneys,="" in="" which="" mouse="" actb="" as="" the="" reference="" gene.="" primer="" sequences="" can="" be="" found="" in="" table="">

Þakkir Við þökkum starfsfólki Biomedicum myndgreiningar- og ljóssmásjárgreiningareininga við Helsinki Institute of Life Sciences (HiLIFE) fyrir dýrmæta hjálp við myndgreiningu og magntengda tækni. Wnt11 mýsnar voru vinsamlegast veittar af prófessor Seppo Vainio (háskólanum í Oulu, Finnlandi) og sendar til tilraunadýramiðstöðvarinnar HiLIFE, háskólans í Helsinki.