Frásog cýtókíns við nýrnaflæði úr mönnum dregur úr seinkun á ígræðslustarfsemi sem tengist bólgugena undirskrift

Tengiliður: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Netfang:audrey.hu@wecistanche.com

John R. Ferdinand1,2|Sarah A. Hosgood2,3|Tom Moore2,3|Ashley Ferro1|Christopher J. Ward1|Tomas Castro-Dopico1|Michael L. Nicholson2,3|Menna R. Clatworthy1,2

1 sameindaónæmiseining, læknadeild háskólans í Cambridge, rannsóknarstofu í sameindalíffræði, Cambridge, Bretlandi

2 National Institute of Health Research Blóð- og ígræðslurannsóknardeild í líffæragjöf, Cambridge, Bretlandi

3 University of Cambridge Department of Surgery, Cambridge, Bretlandi

Ígræðsla er besta meðferðin fyrir flesta sjúklinga með lokastignýrusjúkdómuren skortur á líffærum er mikil áskorun. Normothermic machine perfusion (NMP) hefur verið notað til að endurbæta jaðarlíffæri; Hins vegar er ekki vel skilið hvernig NMP gæti gagnast líffærum. Með því að nota pör af nýrum úr mönnum sem fengust frá sama gjafa, bárum við saman áhrif NMP við áhrif frystigeymslu á heimsvísu.nýruumskrift. Við komumst að því að frystigeymslur leiddi til minnkunar á genatjáningu á heimsvísu, þar á meðal gena í bólguferlum og þeim sem þarf til orkuframleiðsluferla, svo sem oxandi fosfórun (OXPHOS). Aftur á móti, meðan á NMP stóð, var marktæk uppstjórnun á OXPHOS genum, en einnig fjölda ónæmis- og bólguferilsgena. Með því að nota vefjasýni úr nýrum sem gangast undir NMP sem voru ígrædd í kjölfarið komumst við að því að meiri bólgutjáning gena átti sér stað í líffærum með langvarandi seinkaða ígræðslustarfsemi (DGF). Þess vegna notuðum við hem-adsorber (HA) til að fjarlægja bólgueyðandi cýtókín. Þessi veiklaða bólgugenatjáning jók gen í OXPHOS ferlinum og hafði mögulega klínískt mikilvæg áhrif til að draga úr tjáningu á DGF-tengdri genaeinkenni. Saman benda gögn okkar til þess að frásog bólgueyðandi miðla úr gegnflæðinu tákni hugsanlega inngrip sem gæti bætt líffæri líffæra.

LYKILORÐ:klínískar rannsóknir/iðkun, seinkuð ígræðslustarfsemi (DGF), gjafar og gjöf: látnir,nýru(allograft) virkni / truflun,nýrusjúkdómur: ónæmur / bólgueyðandi, nýru

Cistanche jurt sem bætir nýrnastarfsemi

1. INNGANGUR

Nýraígræðsla táknar ákjósanlega meðferð fyrir flesta sjúklinga meðlokastiginýrusjúkdómur, með ávinningi fyrir bæði lífsgæði og magn lífs.1 Líffæraskortur er mikil áskorun og nokkrum aðferðum hefur verið beitt til að fjölga tiltækum nýrum, þar á meðal notkun látinna blóðrásardauða (DCD) gjafa og útbreiddra viðmiðunargjafa (ECD) ), sem bæði tengjast hærri tíðni seinkaðrar ígræðslustarfsemi (DGF) samanborið við látinn heilastofnsdauða (DBD) gjafa.2,3 Í DCD nýrum er útsetning fyrir heitri blóðþurrð í blóðrásarstöðvun verulegan þátt í DGF . DGF kemur fram vegna skemmda eða dauða í blóðþurrðarpíplum, sem getur örvað meðfædda ónæmisvirkjun með NLRP3 bólgueyðandi samsetningu sem leiðir til myndunar interleukin (IL)1 og IL18.4-6 Reyndar hefur tilvist bólgusýtókína í þvagi verið notað sem lífmerki fyrirbráðnýrumeiðsliog DGF.7-9

Normothermic machine perfusion (NMP) gerir ígræddum líffærum kleift að blanda heitum, súrefnisríkum rauðum blóðkornum, í fjarveru ónæmisþátta í blóðrás, þar á meðal komplement og daufkyrninga.10-14 Þetta ferli hefur verið notað til að meta jaðarlíffæri15 og til að " endurnýja" líffæri til að auðvelda ígræðslu nýrna sem var hafnað í upphafi í kjölfar tilboðs frá innlendri líffæraúthlutunarþjónustu.16 Fyrri reynsla okkar af notkun NMP gaf rök fyrir slembiraðaðri samanburðarrannsókn til að meta virkni þess til að koma í veg fyrir DGF í DCD nýrum,17 en aðferðir sem NMP gæti gagnast nýrnaígræðslu eru ekki að fullu skilin. Jafnframt er spurningin um hvort frekari meðferð ánýrumeðan á NMP stendur, til dæmis með því að fjarlægja bólgueyðandi cýtókín og kemókín úr gegnflæðinu, gæti það veitt frekari ávinning í hagræðingu líffærisins fyrir ígræðslu hefur ekki verið fjallað um í nýrum manna, en rannsókn okkar á svínum NMP sýndi lofandi niðurstöður.18

Hér tókum við óhlutdræga nálgun til að takast á við þessar tvær spurningar með því að nota umritunargreiningu á mönnumnýrulífsýni tekin í upphafi og lok NMP til að meta alþjóðlegar breytingar á tjáningu gena. Við notuðum pör af manna nýrum frá einum gjafa til að gera samanburð á áhrifum mismunandi inngripa í líffæri með eins erfðafræðilegan bakgrunn og gátum metið áhrif þessara breytinga á spá um útkomu ígræðslu.

Cistanche þykkni ávinningur: koma í veg fyrir bráðanýrumeiðsli

2. ÚRSLIT

2.1. Pöruð nýru eru erfðafræðilega svipuð og gagnlegt líkan til að meta inngrip

Við rannsökuðum umritunarbreytingar sem tengjast varðveislu líffæra og NMP í tveimur sjálfstæðum rannsóknum, hver með fimm pör af nýrum, sem gerir samtals 10 pör/20 manna nýru. Þar af voru tveir frá DBD og átta frá DCD gjöfum (tafla S1, S2 og mynd S1). Í þessum rannsóknum tókum við vefjasýni úr heilaberki fyrir og eftir inngrip (frystigeymslur eða NMP) og könnuðum umritunarlandslagið með því að nota RNA raðgreiningu (RNA-Seq). Notkun pöruð nýra og pöruð vefjasýni úr þeim samanýruleyfði okkur að stjórna líffræðilegum breytileika og draga þennan rugling til baka úr greiningunni (Mynd S2A). Við staðfestum þaðnýrupör byrja með sameiginlegu umritunarlandslagi (mynd S2B) og með því að beita mismunandi inngripum á hvertnýruí pari getum við rannsakað áhrif inngrips óháð líffræðilegum breytileika.

MYND 1 Nýru sem verða fyrir kæligeymslu sýna takmarkaðar breytingar á genatjáningu samanborið við þau sem gangast undir NMP. Nýrnapar fengust sem ekki hafði verið notað við ígræðslu. Einnnýruvar haldið í kyrrstæðum frystigeymslum og hitt gekkst undir normothermic machine perfusion (NMP). Vefsýni voru tekin úr ytri heilaberki í upphafi og eftir 2 klst. B, Volcano plot sem gefur til kynna breytingu á genatjáningu eftir 2 klukkustundir fyrir tilgreindan hóp miðað við upphafið. Rauðir punktar gefa til kynna misjafnlega tjáð gen með aðlöguðu P-gildi<0.05 and="" the="" experimental="" group="" is="" indicated="" above="" the="" plot.="" c,="" gene="" set="" enrichment="" analyses="" of="" the="" differential="" expressions="" from="" b="" against="" the="" hallmarks="" pathways.="" only="" significant="" pathways="" (fdr="" q="" value=""><0.05) are="" plotted.="" red="" dots="" indicate="" positive="" enrichment="" and="" blue="" negative,="" the="" size="" of="" the="" dot="" is="" inversely="" correlated="" with="" the="" fdr="" q="" value="" and="" the="" position="" indicates="" the="" normalized="" enrichment="" score="" (nes).="" d,="" heatmap="" of="" the="" top="" 20="" significantly="" upregulated="" genes="" during="" nmp,="" genes="" are="" ranked="" by="" log2="" fold="" change.="" e,="" string="" analysis="" of="" the="" top="" 50="" genes="" upregulated="" during="" nmp.="" the="" color="" of="" each="" node="" indicates="" membership="" of="" each="">

MYND 2 Fylgni umrits eftir NMP við lengd seinkaðrar ígræðslustarfsemi. Genatjáning var í tengslum við lengd DGF í vefjasýni sem tekin voru í kjölfar NMP sem hluti af slembiraðaðri klínískri rannsókn. Tjáningarstig þeirra 1000 gena sem hafa mesta fylgni við útkomuna hafa verið teiknuð. B, GSEA var framkvæmt fyrir fylgni frá A á móti aðalmerkjagagnasettinu. Aðeins marktækar leiðir (FDR q gildi<0.05) are="" plotted.="" red="" dots="" indicate="" positive="" enrichment="" and="" blue="" negative,="" the="" size="" of="" the="" dot="" is="" inversely="" correlated="" with="" the="" fdr="" q="" value="" and="" the="" position="" indicates="" the="" normalized="" enrichment="" score="">

2.2. NMP hefur í för með sér aukningu á OXPHOS og genum í bólguferlum samanborið við frystigeymslu

Til að kanna hugsanlega aðferðir sem NMP gæti haft áhrif á nýru tókum við upphaflega fimmnýrupör (n {{0}} DCD gjafar og n=1 látinn heilastofnsdauði [DBD] gjafi, mynd S1, Tafla S1) og gerðu 0 (0 klst) vefjasýni úr heilaberki . Á þessum tímapunkti var nýrun slembiraðað í kyrrstöðugeymslu eða NMP, eins og áður hefur verið lýst 10 (Mynd 1A). Eftir 2 klukkustundir var önnur vefjasýni tekin úr báðum nýrum og RNA-Seq framkvæmd. Þegar genatjáning var borin saman á milli tíma 0- og 2-klukkutíma vefjasýni, komumst við að því að nýru sett í kyrrstöðu kæligeymslur höfðu enga tölfræðilega marktæka breytingu á tjáningu einstakra gena þegar leiðrétt var fyrir margar prófanir (Mynd 1B , vinstri spjaldið). Aftur á móti, á meðan á 2 klukkustundum af NMP stóð, var 956 genum uppstýrt og 353 gen voru niðurstýrð (Mynd 1B, hægri spjaldið). Næst metum við breytingar á tjáningu genahópa innan sameiginlegrar ferils, borum saman tugi eða hundruð gena frekar en eitthvert einstakt gena, og minnkuðum þannig enn frekar áhrif líffræðilegs breytileika milli einstaklinga á greininguna. Þetta leiddi í ljós breytingar á virkni mikilvægum ferlum, þar sem tjáningu hvers einstaks gena innan þeirrar ferils var ekki breytt í nægilega miklu magni til að ná tölfræðilegri marktekt. Þessi auðgunargreining á genasetti (GSEA) sýndi fram á að frystigeymslur höfðu veruleg áhrif á fjölda efnaskiptaferla (Mynd 1C, vinstri spjaldið). Sérstaklega var marktæk minnkun á genum sem taka þátt í oxandi fosfórýleringu (OXPHOS), sem er lykilleið sem þarf til að mynda ATP.19 Aftur á móti var OXPHOS meðal ferlanna sem var marktækt uppstýrt við NMP (Mynd 1C, hægra spjaldið), með hugsanlegum ávinningi fyrir lífvænleika frumna og endurheimt frumujafnvægis. Að auki voru nokkrar leiðir sem taka þátt í ónæmis- eða bólguferlum framkallaðar meðan á NMP stóð, þar sem „TNF boð um NFkB“ sýndi mestu aukninguna. Í samræmi við þetta voru TNF, sem og IL1B og daufkyrninganýting efnafræðinnar CXCL8 (IL8) og CXCL2, meðal mest uppstýrðu gena í 2-klukkutíma NMP vefjasýni (Mynd 1D). Strengjagreining á efstu 50 uppstýrðu genunum leiddi í ljós uppstjórnun lífefnafræðilega skyldra gena sem voru flokkuð í fjóra helstu hnúta; IL8 og daufkyrninga nýliðandi chemokines, Inflammasome-tengd gen, NFkB merki og umritunarstjórnun (Mynd 1E). Athygli vekur að DBD og DCD nýru voru umritunarlega svipuð við grunnlínu (Mynd S2C) og genferlar sem breyttust við NMP voru svipaðar í DBD og DCD nýrum (Mynd S2D). Saman sýnir greiningin okkar að á meðan á NMP stendur er aukin tjáning gena sem stuðla að orkumyndun, með hugsanlega jákvæðum áhrifum fyrir líffærin, en samtímis framkalla bólgueyðandi gena, sem getur verið skaðlegt.

Cistanche tubulosa þykkni: bætir nýrnastarfsemi

2.3. Gen í bólguferli í NMP nýrum sem tengjast langvarandi seinkun á ígræðslustarfsemi

Til þess að tengja umritunarbreytingarnar sem eiga sér stað við kæligeymslu og NMP við klínískar niðurstöður, gerðum við RNA-Seq á vefjasýni sem tekin voru úr 33 DCD nýrum sem höfðu gengist undir NMP sem hluta af slembiraðaðri klínískri rannsókn þar sem nú er verið að meta virkni þess.17 sýni voru fáanleg á undirhópur nýrna slembiraðað í NMP arm rannsóknarinnar sem var síðan ígrædd (tafla S3, mynd S1). DGF er algengara í DCD nýrum og er klassískt skilgreint sem krafa um skilun fyrstu vikuna eftir ígræðslu. Hins vegar, strax eftir ígræðslu, fá sumir sjúklingar einn þátt í skilun vegna blóðkalíumhækkunar, sem endurspeglar ekki endilega tilvist umtalsverðs bráðs pípludreps. Við notuðum því líkan sem tengir genatjáningu við tímann á milli ígræðsluaðgerða og síðustu skilunarlotu (þ.e. lengd DGF). Þetta sýndi marktækari umritunarbreytingar í ígræðslu sem krefjast skilunar umfram fyrstu 24 klukkustundirnar eftir ígræðslu (Mynd 2A), sem og marktæka jákvæða fylgni á milli tjáningar gena í bólguferlum þar á meðal „TNFA merkja um NFkB“ og „bólgusvörun“ ferla og lengd DGF, með meiri auðgun þessara leiða í nýrum sem fengu lengri DGF eftir ígræðslu (Mynd 2B). Aftur á móti hafði lengd DGF neikvæða fylgni við umfang tjáningar "OXPHOS" ferilgena (Mynd 2B). Samanlagt benda þessi gögn til þess að í kjölfar NMP eru nýru sem hafa minni tjáningu á genum í bólguferlinu og meiri tjáningu á „OXPHOS“ ferlisgenum minna næm fyrir langvarandi DGF eftirígræðslu. Þetta myndi styðja þá ályktun að sameindabreytingar sem eiga sér stað við NMP geta haft bæði jákvæð (örvun OXPHOS-ferilgena) og skaðleg (örvun gena bólguferla) áhrif.

2.4. Þvagframleiðsla og nýrnablóðflæði meðan á NMP stendur sýna mismunandi tengsl við OXPHOS og bólguferilgen

Magn þvags sem framleitt er við NMP er ein af fjölmörgum breytum sem eru innifalin í gæðamati skurðaðgerða sem notuð eru til að leiðbeina ákvörðunum um nýtingu líffæra,15 en hvort mikil þvagframleiðsla meðan á NMP stendur gefi í raun góðar horfur fyrir nýrun og undirliggjandi sameindaleiðir sem virkjast í nýru með mikla þvagframleiðslu er óljós. Í samtals 10 nýrum sem gangast undir NMP (NMP eingöngu nýru, tafla S1 og S2, mynd S1), sáum við úrval þvags frá 0 til 340 ml á 2-klst. (Mynd 3A vinstri spjaldið). Athygli vekur að þegar við bárum saman leiðirnar sem breytast við NMP í fimm nýrum í tveimur sjálfstæðum tilraunum, komumst við að því að svipaðar leiðir voru framkallaðar (Mynd S3A) sem staðfestir endurgerðanleika tilraunahönnunar okkar og notagildi þess að bera saman leiðir frekar en einstök gen. Í 2-klukkutíma eftir blóðflæðislífsýni var tjáning 11 gena marktæk fylgni við þvagmagnið sem framleitt var á þessu tímabili. Þar á meðal voru hitaáfallsprótein (HSP), HSPA1A, HSPA1B og HSPH1, sem voru jákvæð fylgni við aukna þvagframleiðslu (mynd 3A hægra spjaldið). Greining á auðgun genasetts sýndi að þvagframleiðsla hafði einnig jákvæða fylgni við „TNF boð um NFkB“ ferilgenin og neikvæð fylgni við OXPHOS gen í vefjasýni eftir útflæði (mynd 3B, S3C). Á sama hátt, í vefjasýnum fyrir gegnflæði, hafði OXPHOS neikvæða fylgni við þvagframleiðslu í þessum nýrum á meðan leiðir tengdar ónæmisvirkjun þar á meðal „TNF boð um NFkB“ og „allograft höfnun“ höfðu jákvæða fylgni við þvagframleiðslu, sem bendir til þess að NMP hafi lítil áhrif á þessa ferla , eða á öðrum leiðum sem greindar eru, í nýrum með mikla þvagframleiðslu (Mynd 3B, S3C-D). Þar sem framköllun bólguferilsgena sást í klínískum sýnum okkar með langvarandi DGF (mynd 2B), ögra þessi gögn þeirri kenningu að mikil þvagframleiðsla eigi sér stað í lífvænlegri, „heilbrigðari“ nýrum og benda til þess að í raun gætu þessi nýru haft meira bólgumöguleika, geta ekki myndað orku og að þetta breytist ekki verulega við NMP.

Nýrnablóðflæði við gegnflæði hefur einnig verið metið sem breytu sem gæti endurspeglað síðari ígræðslustarfsemi.15 Í þeim 10 nýrum sem rannsökuð voru var nýrnablóðflæði eftir 2 klst. gegnflæði breytilegt frá 14,1 til 168,8 ml/mínútu (mynd 3C vinstra spjaldið). Í 2-klukkutíma eftir blóðflæðisvefsýni sýndu átta gen marktæka jákvæða fylgni við aukið nýrnablóðflæði (mynd 3C hægra spjaldið), þar á meðal HSPA1L, en engin bein skörun var á milli þessa genalista og þeirra sem tengdust þvagframleiðslu (Mynd 3A ). Greining á auðgun genasetts sýndi fram á að mikið nýrnablóðflæði hafði jákvæða fylgni við OXPHOS gen í 0-klukkutíma vefjasýni, en öfugt við þær sem hafa mesta þvagframleiðslu, hafði gegnflæði marktæk áhrif, sem leiddi til neikvæðrar fylgni við "OXPHOS" feril gen með 2 klukkustundum (mynd 3D, mynd S4A-B). Nýrnablóðflæði var í neikvæðri fylgni við fjölda ónæmis- og bólgugena í bæði 0- og 2-klukkutíma vefjasýni (Mynd 3D, Mynd S4B), öfugt við þvagframleiðslu (Mynd 3B, Mynd S3C). Saman benda þessi gögn til þess að nýrnablóðflæði og þvagframleiðsla séu ef til vill ekki jafngildir vísbendingar um lífvænlegra nýra, en að hið fyrrnefnda geti með nákvæmari hætti greintnýruólíklegri til að hafa framlengt DGF.

ávinningur og aukaverkanir af cistanche: bólgueyðandi

2.5. Bæta hem-adsorber við gegnflæðisrásina hefur engin áhrif á gegnflæðisbreytur en dregur verulega úr bólgutjáningu gena, þar á meðal NLRP3 og IL1B

Greiningar ánýrugegnflæði hafa sýnt fram á verulega aukningu á styrk bólgueyðandi cýtókína og kemokína meðan á ofkælingu stendur og NMP.20,21 Þessar lífvirku sameindir endurhringast inn í nýrun, með möguleika á að framkalla frekari bólgu. Í ljósi þess að greining okkar á ígræddunýrusýni bentu til þess að framköllun TNF-háðra gena í NMP nýrum tengdist DGF (Mynd 2B), við gerðum tilgátu um að fjarlæging cýtókína og kemokína úr gegnflæðisrásinni gæti dregið úr bólgugena örvun, með hugsanlegum jákvæðum áhrifum fyrir nýrun. Slík nálgun hefur sýnt nokkra virkni hjá sjúklingum með kerfisbundið bólgusvörunarheilkenni,22,23, og tengdist auknu nýrnablóðflæði í svínum nýrum sem gangast undir NMP.18 Til að prófa þetta í nýrum manna, tókum við fimm nýrnapör til viðbótar og gerðum NMP í 4 klukkustundir með vefjasýni tekin við 0, 2 og 4 klukkustundir (Mynd S1). Í hverju tilviki var cýtósól hem-adsorber (HA) sem fjarlægir sameindir með mólmassa 10-50 kDa bætt við gegnflæðishringrás eins nýra innan hvers pars (NMP plús HA) (Mynd 4A). Eins og við var að búast leiddi viðbót HA til lægri styrks ýmissa frumuefna í gegnflæðinu (Mynd 4B) en hafði engin áhrif á nýrnablóðflæði, þvagframleiðslu eða samsetningu, súrefnisneyslu og sýru-basa jafnvægi (Mynd 4C, Tafla S4, S5). Þannig, yfir 4 klukkustundir af NMP, hafði HA engin áhrif á gegnflæðisbreytur sem nú eru notaðar klínískt til að búa til gæðamatsstig en hafði veruleg áhrif á genatjáningu; Eftir NMP var 1794 og 4026 genum uppstýrt eftir 2 og 4 klukkustundir, í sömu röð, þar á meðal TNF og IL6 (Mynd 4D, E). en aðeins helmingur þessarar tölu (n=898 og n=2606) var aukin þegar HA var til staðar (Mynd 4D, Mynd S5A og B). Fjöldi gena sem var lækkaður var einnig minnkaður með því að bæta við HA (Mynd 4D). Eftir 4 klukkustundir af NMP, var 46 genum marktækt uppstýrt og 181 niðurstýrt með því að bæta við HA (Mynd 4F). Þessi veiklaða umritunarsvörun innihélt NLRP3 inflammasome virkjun tengd gen, eins og IL1B, NLRP3 og CASP1 (Mynd 4G, Mynd S4B) og sum daufkyrninga nýliðandi chemokines (Mynd S5C), sem áður tengdust nýrnaskaða í dýralíkönum.24,25 Þetta sýnir að leysanlegir miðlarar losaðir fránýruendurrása og knýja fram de novo tjáningu bólgugena innan líffærisins, en að hægt sé að draga úr því með því að fjarlægja þau úr gegnflæðisrásinni.

MYND 4. Bæta hem-aðsogsefni við gegnumflæðishringrásina í normothermic vél hefur veruleg áhrif á cýtókínmagn í gegnflæði og umritinu en ekki á eðlisfræðilegar breytur skráðar á útbúnaðinum. Par af nýrum úr mönnum var tekið frá sama gjafa, annað parið gekkst undir staðlaða normothermic machine perfusion (NMP) siðareglur í 4 klukkustundir og hittnýrugekkst undir NMP með því að bæta hem-adsorber við hringrásina. Sýni voru tekin fyrir RNA-Seq fyrir gegnflæði (0 klst.), eftir 2 klst. og í lokin (4 klst.). B, Styrkur lykilsýtókína í gegnflæðinu eftir 4 klst af NMP. Línan gefur til kynna nýrnapör. Cýtókínmælingar voru staðlaðar að heildarmagni gegnflæðispróteins. Uppgefið P-gildi er úr pöruðu t-prófi til að draga úr frumudrepum með því að bæta við HA. C, Þvagframleiðsla og nýrnablóðflæði (RBF) yfir gegnumflæðistímann. Greenline gefur til kynna NMP eitt og sér og appelsínugult með því að bæta við hem-adsorber. D, Venn skýringarmynd sem sýnir fjölda gena sem tjáð er marktækt misjafnlega þegar 2-klst eða 4-hr sýnin eru borin saman við pre(0-klst) sýnin. Rauðar skýringarmyndir eru uppstýrðar gen og bláar niðurstýrðar. Gatnamótin eru genin sem eru sýnd með heiðursgildi á báðum tímapunktum í sömu átt. E, log2 staðlað tjáningargildi fyrir tilgreind gen yfir gegnflæði frá vefjaritinu, staðlaðar villustikur eru sýndar. F, Eldfjallalóð fyrir parasamanburð á NMP eingöngu við NMP plús HA eftir 4 klst. Rauður gefur til kynna misjafnlega tjáð gen með aðlöguðu P-gildi<0.05. g,="" as="" for="">

meðhöndla nýrnasjúkdóma cistanche þykkni

2.6. HA tengist minnkun á seinkaðri ígræðslustarfsemi tengdri genaundirskrift

Greining á auðgun genasetts sýndi marktæka lækkun á „TNF boðskap um NFkB“ leið í NMP plús HA nýrum samanborið við NMP eitt sér (Mynd 5A-B). Sérstaklega minnkaði tilvist HA ekki aðeins tjáningu bólgugena innannýruen einnig auknar OXPHOS- og fitusýruefnaskiptaleiðir, sem báðar stuðla að orkumyndun (Mynd 5A-B). Þess vegna myndu breytingar á genatjáningarferlum sem eiga sér stað með HA styðja þá ályktun að áhrif þess séu klínískt gagnleg, þar sem það minnkaði "TNFA boð um NFkB" ferli gen og aukið "OXPHOS" ferli gen, sem bæði tengdust styttri lengd DGF (Mynd 2B).

Til að kanna frekar sambandið á milli umritunarbreytinga á NMP og klínískum niðurstöðum, reyndum við að sjá um genaundirskrift sem er til staðar í nýrum með DGF. Við greindum efstu 100 jákvæðu (UP) og neikvætt (NIÐUR) stýrðu genin (röðuð eftir log fold breytingu) sem tengdust lengd DGF í 33 klínískum rannsóknasýnum (Mynd 5C, Gögn S1). Við fundum marktæka auðgun á genamerkinu sem tengist aukinni lengd DGF í sýnum með meiri þvagframleiðslu (Mynd 5D), sem bendir til þess að mikil þvagframleiðsla meðan á NMP stendur auðkennir nýru í hættu á lengri DGF. Það var engin tölfræðilega marktæk fylgni á milli DGF undirskriftarinnar og genanna sem tengdust hærra nýrnablóðflæði (Mynd 5E). Næst var metið hvort og hvernig viðbót HA við NMP hringrásina hafði áhrif á tjáningu DGF „UP“ og „DOWN“ genaundirskrifta. Merkilegt nokk sýndi þetta að tjáning á genamerkinu sem tengist aukinni lengd DGF minnkaði marktækt með því að bæta við HA og undirskriftin sem tengdist minni lengd DGF var marktæk aukin með því að bæta við HA (Mynd 5F).

Á heildina litið benda umritunarbreytingarnar sem við höfum bent á að NMP hafi hugsanlegan ávinning umfram frystigeymslu hvað varðar áhrif þess á orkumyndun í nýrum. Hins vegar, meðan á gegnflæði stendur, losna sumar lífvirkar sameindir úr nýrum inn í gegnflæðisrásina, sem myndar mögnunarlykkju sem knýr bólgu þegar þær fara aftur inn í nýrun. Fjarlæging þessara sameinda truflar þessa lykkju og getur verið gagnlegt til að draga úr bólgu og auka orkumyndun, auka enn frekar jákvæð áhrif NMP og draga úr næmi fyrir DGF (Mynd 6).

MYND 5 Viðbót á skinkuaðsogsefninu dregur úr DGF-tengdri genaeinkenni. GSEA greining á áhrifum þess að bæta HA við umritið eftir 4 klst. NMP gegn einkennandi ferli erfðamengja. Einungis marktækar leiðir eru teiknaðar. Rauðir punktar gefa til kynna jákvæða auðgun og bláir neikvæðir, stærð punktsins er í öfugri fylgni við FDR q gildi og staðsetningin gefur til kynna staðlað auðgunarstig (NES). B, Auðgunarreitir frá GSEA fyrir lykilleiðir úr Hallmark gagnagrunninum fyrir samanburðinn frá A. Línan gefur til kynna hlaupandi auðgunarstig og fiðlureiturinn gefur til kynna dreifingu meðlimgena genasamstæðunnar í gegnum röðaða genalistann sem notaður er í hverri greiningu. C, Hitakort af efstu fjórum mestu jákvæðu (UP) og neikvæðu (NIÐUR) fylgni við lengd DGF og notuð sem hluti af genatjáningarundirskriftinni fyrir DGF. Full DGF undirskrift gefin upp í viðbótargögnum. DF, DGF tengd genundirskrift var notuð með GSEA til að kanna tjáningu undirskriftarinnar í fylgni 2-klst. þvagframleiðslu við 2-hr umrit (D), fylgni við 2-klst RBF með 2-klst. umriti (E), og áhrifum þess að bæta við HA á umritið eftir 4 klst. (F). Lóðir eins og fyrir A

MYND 6 Myndræn samantekt. A, Við frystigeymslu er umheimslækkun á umritun. Meðan á NMP stendur er tjáning gena í fjölda ferla uppstýrt, þar á meðal oxandi fosfórun (OXPHOS) og bólguferlisgen eins og TNF, IL8 og NFkB. B vinstri spjaldið, Meðan á NMP stendur, losna bólgumiðlarar (gulir hringir) fránýruí gegnflæðislausnina. Þau endurnýta og örva bólgueyðandi genaumritun í nýrum og tengjast minnkun á genum fyrir framleiðslu orkuferla, sem dregur úr ATP. Hægra spjaldið, Tilvist hem-adsorber (HA) brýtur þessa bólgumögnunarlykkju

Cistanche jurt sem bætir nýrnastarfsemi

3. UMRÆÐA

Gögn okkar sýna að frystigeymslur eru áhrifaríkar til að takmarka verulegar breytingar á genatjáningu. Þetta er í samræmi við nagdýralíkön, þar sem nýrun sem geymd voru í allt að 18 klukkustundir í frystigeymslu sýndu litlar breytingar á tjáningu bólgueyðandi frumuefna, þar á meðal IL1 , TNF og IL6.26 Notkun okkar á óhlutdrægri, alþjóðlegri umritunarsniði frekar en mæling á litlum fjölda frambjóðandi gena gerði okkur kleift að greina tjáningu genahópa sem finnast innan ákveðinna ferla. Þetta leiddi í ljós marktæka minnkun á tjáningu OXPHOS og glýkólýsuferils gena í nýrum í kæligeymslu, sem gæti hugsanlega dregið úr getu þessara nýrna til að mynda ATP, í samræmi við fyrri rannsókn sem sýndi minnkað ATP í nýrum í kældum geymslum.27 Fjöldi bólgueyðandi ferlum var einnig lækkað við frystingu, þar með talið TNF virkjun í gegnum NFkB og hvarfgjarnar súrefnistegundir sem gætu verið gagnlegar. Hins vegar getur verið að frystigeymslur setji aðeins tímabundið hald á þessar leiðir og að í kjölfar endurflæðis í viðtakanda myndu svipaðar breytingar á bólgutjáningu gena og sjást í NMP eiga sér stað.

NMP hafði þveröfug áhrif á köldu geymsla á OXPHOS og glýkólýsu ferli gen, aukið tjáningu þeirra, með möguleika á að auka frumu getu til að mynda ATP og endurheimta homeostasis. Athyglisvert hefur einnig verið sýnt fram á að ofkælt súrefnisbætt gegnflæði í nýrum manna eykur ATP gildi samanborið við frystigeymslu 27, þess vegna getur endurheimt súrefnisgjafar verið helsta hvati þessara ferla frekar en normóhita. Engu að síður er líklegt að þessar breytingar séu gagnlegar fyrir líffærið miðað við athugun okkar á neikvæðri fylgni á milli aukinnar tjáningar gena OXPHOS ferlisins og langvarandi DGF.

Í nýlegri grein eftir Hameed et al28 var einnig gerð umritunargreining á NMP í þremur nýrum sem gangast undir NMP. Því miður gerðu höfundar gögnin sín ekki aðgengileg almenningi, þannig að ítarlegur samanburður við gagnasafn okkar er ekki mögulegur. Hins vegar gaf handrit þeirra til kynna örvun á ónæmissvörun tengdum genum meðan á NMP stóð, þar á meðal IL1B, CXCL2 og TNF, sem er í samræmi við niðurstöður okkar.

Í greiningu okkar á nýrum sem gangast undir NMP í tengslum við klíníska rannsókn, tengdum við undirskrift genatjáningar við lengd DGF frekar en DGF tíðni (skilgreint sem þörf fyrir skilun innan fyrstu viku eftir ígræðslu). Athyglisvert var að nýru með DGF í 1 dag eða minna voru mjög svipuð umritunarlega og þau sem voru án DGF, sem endurspeglar líklega skilunarþörf vegna blóðkalíumhækkunar tengdrar aðgerð frekar en DGF í góðri trú. Við komumst að því að lengri DGF tengdist meiri tjáningu TNFA merkja um NFkB feril gen og minni tjáningu gena tengdum OXPHOS. Þessar upplýsingar benda til þess að nýru með aukið OXPHOS og minnkuð ónæmisboð geti haft betri möguleika sem nýru gjafa, en þessi niðurstaða þarfnast staðfestingar í stærri framsýnni rannsókn.

Við metum einnig sameindaferlana sem tengjast þvagframleiðslu og nýrnablóði meðan á NMP stendur. Þessar breytur hafa áður verið notaðar, ásamt fjölda annarra mælikvarða, til að búa til gæðamat á nýrum sem eru gegnsýrð. Hátt gildi þvagframleiðslu og nýrnablóðflæðis hafa verið talin endurspegla lífvænlegri ígræðslu.15 Gögn okkar sýna að leiðir sem tengjast háum þvagframleiðslu og háu nýrnablóðflæði eru mismunandi og í raun sýna þessar breytur andstæð tengsl við bólguferli. . Mikil þvagframleiðsla tengdist meiri tjáningu gena ónæmisferla á meðan mikið nýrnablóðflæði hafði neikvæða fylgni við þessar leiðir. Við komumst einnig að því að DGF genamerkið sem við mynduðum var auðgað í nýrum með mikla þvagframleiðslu meðan á NMP stóð, sem bendir til þess að þessi breytu gæti greint nýrun í hættu á lengri DGF, öfugt við núverandi kenningar. Ein hugsanleg skýring er sú að mjög mikil þvagframleiðsla endurspeglar nýru með meiri pípuskemmdir sem skortir getu til að einbeita þvagi. Þannig getur verið um „Goldilocks-áhrif“ að ræða með tilliti til þvagframleiðslu, þar sem nýru með litla/lítil þvagframleiðslu eru þau sem eru með verulega frávik í myndun síuvökva, þau sem eru með mjög mikla þvagframleiðslu hafa verulegan pípuskemmda sem útilokar þvagstyrk. Þessa tilgátu þyrfti að prófa í stærri fjölda nýrna sem voru síðan ígrædd.

Á 4 klukkustundum af NMP var framkalla bólgugena í nýrum. Hins vegar er rétt að hafa í huga að núverandi klínískar framkvæmdir fela aðeins í sér 1 klukkustund af NMP og þessi áhrif eru ef til vill ekki áberandi á styttri gegnflæðistíma. Hins vegar getur lengri flæði haft ávinning hvað varðar endurheimt súrefnis og orkumyndunar, og í tilraun okkar gætu neikvæð áhrif af örvun ónæmisgena verið að verulegu leyti að engu með því að setja frumu HA í gegnflæðisrásina. Þessar upplýsingar benda til þess að bólgumiðlar sem myndast af nýrum meðan á NMP stendur fari inn í gegnflæðisrásina og geti aukið dauðhreinsaða bólgu og að fjarlæging þeirra bæti framköllun gena í bólguferli sem sést við NMP. Mikilvægt er að við sýndum að viðbót HA hefur áhrif á tjáningu gena sem tengjast verri niðurstöðum klínískt. DGF genaundirskriftin okkar var fengin úr sýnum sem gengu í gegnum NMP sem hluta af klínískri rannsókn sem metur virkni þess, sem gerir okkur kleift að tengja sterklega breytingarnar sem við sáum í pöruðum nýrnarannsóknum okkar við klíníska endapunkta í nýrum sem gangast undir ígræðslu. Hins vegar er þörf á notkun þess í tengslum við klíníska rannsókn til að sanna endanlega gagnsemi notkunar þess á nýru fyrir ígræðslu. HA er ósértækt og getur fjarlægt sameindir sem eru gagnlegar, auk þeirra sem eru skaðlegar líffærinu. Við komumst að því að nettóáhrif HA á nýrnaritmyndina virtust gagnleg, en það gæti verið að betrumbætur til að fjarlægja sérstaklega sannaða, skaðlega miðla gæti verið enn áhrifaríkari.

Nýrnapörin sem við notuðum voru frá sama einstaklingi og voru því erfðafræðilega eins og höfðu upplifað svipað umhverfi alla ævi gjafans. Við staðfestum að tímaritið 0 þeirra væri mjög svipað (Mynd S2 A, B). Hins vegar taka þessar vefjasýni sýni úr litlum hluta nýrna og nýrnapör gætu orðið fyrir ósamhverfum áhrifum af meinafræði, til dæmis blöðrum eða sjúkdómum í smáæðum. Viðbótarfyrirvari er að öllum nýrum sem notuð voru í inngripstilraununum sem kynntar eru hér var hafnað fyrir ígræðslu og sum tákna ígrædd líffæri í neðri enda gæðarófsins. Engu að síður sáum við mjög endurtakanlegar niðurstöður þegar bornar voru saman genaferlar í hópum með fimm nýrum. Við gátum einnig sýnt fram á að nýru frá DCD og DBD svöruðu svipað við gegnflæði. Með því að sameina þetta með okkar yfirsýndu DGF undirskrift eftir NMP, gátum við spáð fyrir um hugsanlegan klínískan ávinning. Þessi tilraunaaðferð gæti verið notuð sem forklínískt tæki til að skima framtíðarinngrip með tilliti til hugsanlegrar meðferðaráhrifa til að gera skynsamlegt val á umsækjendum inngripa fyrir klínískar rannsóknir.

Í stuttu máli gefur rannsókn okkar fyrsta alþjóðlega umritunarsniðið á nýrum manna sem gangast undir NMP, leysir úr mismunandi sameindaferlum sem virkjast í NMP samanborið við frystigeymslu, og sýnir að skaðleg áhrif lífvirkra sameinda sem myndast eða losna úr nýrum við NMP geta snúið við með því að bæta við HA. Ennfremur dró þessi inngrip úr tjáningu gena sem tengdust langvarandi DGF sem gaf sterka vélræna rökstuðning fyrir því að beita slíkri inngrip í framtíðar klíníska rannsókn. Gögnin okkar hafa einnig þýðingu fyrir gegnflæðisaðferðir fyrir utan nýru, þar á meðal við lifur og lungnaígræðslu, sem bendir til þess að fjarlægja ætti lífvirka sameindir úr gegnflæðisefnum í þessu samhengi þar sem NMP er notað í auknum mæli. Að lokum, rannsókn okkar undirstrikar notagildi alþjóðlegrar umritunarsniðs í pöruðunýrutil að meta nýjar inngrip í gegnumstreymt líffæri; umritunarbreytingar koma á undan breytingum á magni próteina (hefðbundið notað sem lífmerki fyrirnýruskaða) og auðvelt er að mæla tugþúsundir genaafrita. Þannig hefur RNA-mæling tilhneigingu til að gefa snemma, viðkvæma útlestur á frumustarfsemi mannlegra líffæra sem eru sótt til ígræðslu sem hægt er að nota við framtíðarrannsóknir.

VIÐTAKNINGAR

Höfundar þakka öllum líffæragjöfum og fjölskyldum þeirra. Clatworthy rannsóknarstofan er þakklát fyrir kjarnaaðstöðuna sem MRC Laboratory of Molecular Biology býður upp á. Þessi vinna var unnin með því að nota auðlindir frá Cambridge Service for Data-Driven Discovery (CSD3) sem rekin er af University of Cambridge Research Computing Service, veitt af Dell EMC og Intel með Tier-2 fjármögnun frá verkfræði- og eðlisvísindarannsóknum Council (fjármagnsstyrkur EP/P020259/1), og DiRAC fjármögnun frá Science and Technology Facilities Council (www. Dirac. ac. Bretlandi).

UPPLÝSINGAR

Höfundarnir hafa enga hagsmunaárekstra að gefa upp eins og lýst er í American Journal of Transplantation.

HÖFUNDARFRAMLAG

JRF, SH, MLN og MRC hönnuðu rannsóknina og túlkuðu gögnin. JRF, SH, TM, CJW, AF og TCD gerðu tilraunirnar. JRF, SH og MRC bjuggu til myndir og töflur. MRC skrifaði aðalhandritið. JRF og SH bjuggu til aðferðirnar og myndsögurnar, JRF, SH og MLN ritstýrðu handritinu.

Cistanche ávinningur: bæta nýrnastarfsemi

Heimildir:
1. Methven S, Steenkamp R, Fraser S. UK Renal Registry 19th Annual Report: Kafli 5 Lifun og dánarorsakir hjá fullorðnum sjúklingum í Bretlandi á nýrnauppbótarmeðferð árið 2015: National and Centre-specific Analyses. Nephron. 2017;137(1):117–150.
2. Summers DM, Johnson RJ, Allen J, o.fl. Greining á þáttum sem hafa áhrif á niðurstöðu eftir ígræðslu nýrna sem gefin voru eftir hjartadauða í Bretlandi: hóprannsókn. Lancet. 2010;376(9749):1303–1311.
3. Summers DM, Johnson RJ, Hudson A, Collett D, Watson CJ, Bradley JA. Áhrif aldurs gjafa og frystigeymslutíma á útkomu hjá viðtakendum nýrna sem gefin voru eftir blóðrásardauða í Bretlandi: hóprannsókn. Lancet. 2013;381(9868):727–734.
4. Friedewald JJ, Rabb H. Bólgueyðandi frumur í blóðþurrðarbráðri nýrnabilun.NýraAlþj. 2004;66(2):486–491.
5. Kono H, Rock KL. Hvernig deyjandi frumur vara ónæmiskerfið við hættu. Nat Rev Immunol. 2008;8(4):279–289.
6. Berry M, Clatworthy MR. Ónæmismeðferð fyrir bráðanýrumeiðsli. Ónæmismeðferð. 2012;4(3):1–12.
7. Parikh CR, Coca SG, Thiessen-Philbrook H, et al. Lífmerki eftir aðgerð spá fyrir um bráðanýrumeiðsli og léleg útkoma eftir hjartaaðgerð fullorðinna. J Am Soc Nephrol. 2011;22(9):1748–1757.
8. Hall IE, Yarlagadda SG, Coca SG, o.fl. IL-18 og NGAL í þvagi spá fyrir um skilun og bata ígræðslu eftirnýruígræðslu. J Am Soc Nephrol. 2010;21(1):189–197.
9. Malyszko J, Lukaszyk E, Glowinska I, Durlik M. Biomarkers of seinked graft function as a form af bráðrinýrumeiðsli ínýruígræðslu. Sci Rep. 2015;5:11684.
10. Hosgood SA, Nicholson ML. Fyrst nýrnaígræðsla hjá mönnum eftir ex vivo normothermic gegnflæði. Ígræðsla. 2011;92(7):735–738.
11. Yong C, Hosgood SA, Nicholson ML. Ex-vivo normothermic gegnflæði við nýrnaígræðslu: fortíð, nútíð og framtíð. Curr Opin líffæraígræðsla. 2016;21(3):301–307.
12. Fisher A, Andreasson A, Chrysos A, o.fl. Athugunarrannsókn á gjafa Ex Vivo lungnaflæði í lungnaígræðslu í Bretlandi: DEVELOP-UK. Health Technol Assess. 2016;20(85):1–276.
13. Slama A, Schillab L, Barta M, o.fl. Hefðbundin lungnaöflun gjafa með normothermic ex vivo lungnaflæði: Tilvonandi slembiraðað klínísk rannsókn. J Hjarta lungnaígræðsla. 2017;36(7):744–753.
14. Nasralla D, Coussios CC, Mergental H, et al. Slembiröðuð rannsókn á varðveislu normothermics í lifrarígræðslu. Náttúran. 2018;557(7703):50–56.
15. Barlow AD, Hamed MO, Mallon DH, o.fl. Notkun á Ex Vivo Normothermic Perfusion til gæðamats á brisi sem er fargað í mönnum. Am J Transplant. 2015;15(9):2475–2482.

16. Hosgood SA, Saeb-Party K, Hamed MO, Nicholson ML. Árangursrík ígræðsla á nýrum úr mönnum sem talin eru óígræðanleg en endurlífguð af Ex Vivo Normothermic Machine Perfusion. Am J Transplant. 2016;16(11):3282–3285.
17. Hosgood SA, Saeb-Party K, Wilson C, Callaghan C, Collett D, Nicholson ML. Bókun um slembiraðaða, stýrða, opna rannsókn á ex vivo normothermic gegnflæði á móti statískri frystingu í gjöf eftir nýrnaígræðslu í blóðrásardauða. BMJ Opið. 2017;7(1):e012237.
18. Hosgood SA, Moore T, Kleverlaan T, Adams T, Nicholson ML. Blóðsog dregur úr bólgusvörun og bætir blóðflæði við nýrnaflæði ex vivo í tilraunalíkani. J Transl Med. 2017;15(1):216.
19. Krebs HA. Saga tríkarboxýlsýru hringrásarinnar. Perspect Biol Med. 1970;14(1):154–170.
20. Hoogland ER, de Vries EE, Christiaans MH, Winkens B, Snoeijs MG, van Heurn LW. Gildi styrkleika lífmerkja í gegnumflæði vél í DCDnýruígræðslur. Ígræðsla. 2013;95(4):603–610.
21. van Balkom BWM, Gremmels H, Ooms LSS, o.fl. Prótein í varðveisluvökva sem spá fyrir seinkun á ígræðslustarfsemi í nýrum frá gjöfum eftir blóðrásardauða. Clin J Am Soc Nephrol. 2017;12(5):817–824.
22. Kogelmann K, Jurczak D, Scheller M, Druner M. Hemoadsorption by CytoSorb in septic patients: a case series. Crit Care. 2017;21(1):74.
23. David S, Thamm K, Schmidt BMW, Falk CS, Kielstein JT. Áhrif brottnáms cýtókína utan líkamans á starfsemi æðahindrana hjá sjúklingi með rotþróalost. J Gjörgæsla. 2017;5:12.
24. Li L, Huang L, Vergis AL, o.fl. IL-17 framleitt af daufkyrningum stjórnar IFN-gamma-miðluðum daufkyrningum í músumnýrublóðþurrðar-endurflæðisáverka. J Clin Invest. 2010;120(1):331–342.
25. Hayama T, Matsuyama M, Funao K, o.fl. Gagnleg áhrif daufkyrninga-elastasahemils á nýrnablóðþurrð-endurflæðisskaða hjá rottum. Ígræðsla Proc. 2006;38(7):2201–2202.
26. Saat TC, Susa D, Roest HP, o.fl. Samanburður á bólgueyðandi, frumuverndandi og áverka genatjáningarsnið í nýrum frá heiladauða og hjartadauða gjöfum. Ígræðsla. 2014;98(1):15–21.
27. Ravaioli M, Baldassare M, Vasari F, o.fl. Aðferðir til að endurheimta stig adenósínþrífosfats (ATP) eftir meira en 20 klukkustundir af köldum blóðþurrðartíma í jaðri mannaNýraGræðlingar. Ann Transplant. 2018;23:34–44.
28. Hameed AM, Lu DB, Patrick E, o.fl. Stutt Normothermic Machine Perfusion endurnýjar fargað nýru. Ígræðsla Bein. 2019;5(11):e502.