Cyclopentanone hefur áhrif gegn sortumyndun og hrukkuvirkni við B16F10 sortuæxli

Tengiliður:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Hee Jin Jung 1, A Kyoung Lee 1,2, Yeo Jin Park 1,2, Sanggwon Lee 1,2, Dongwan Kang 1,2, Young Suk Jung 1,2, Hae Young Chung 1,2 og Hyung Ryong Moon 1, 2,*

Ágrip:Útsetning fyrir útfjólublári (UV) geislun er aðal orsök ytri öldrunar húðar, sem leiðir til oflitunar og hrukkumyndunar í húðinni. Í þessari rannsókn könnuðum við hvítandi áhrif (2E,5E)-2,5-bis(3-hýdroxý-4-metoxýbensýliden)sýklópentanóns (BHCP) á B16F10 sortuæxli og and- hrukkuvirkni á Hs27 fibroblasts frumum. Í ljós kom að BHCP hamlar kröftuglega týrósínasa, með 50 prósenta hömlunarstyrk (IC50) gildi upp á 1,10 μM og 8,18 μM formýkófenólat (L-týrósín) og dífenólasa (L-DOPA), og ensímhvarfarannsóknin leiddi í ljós að BHCP er samkeppnishæfur hímikófenólataður . Ennfremur hamlaði BHCP marktækt melanininnihald og frumu tyrosinasa virkni og lækkaði magn microphthalmia-associated transcription factor (MITF), fosfórýleruðu magni cAMP svörunar frumefnisbindandi (CREB) próteins og tyrosinasa í -melanocyte-örvandi hormóni (-MSH)- B16F10 sortuæxlisfrumur. Þar að auki hamlaði BHCP fosfórun p65 og tjáningu fylkis metallopróteinasa (MMP-1, MMP-9, MMP-12 og MMP-13) í Hs27 trefjakímfrumur örvuð með útfjólubláum geislun. Þess vegna sýna niðurstöður okkar að BHCP gæti verið góður kandídat til að þróa lækningalyf fyrir sjúkdóma sem tengjast oflitun og hrukkum.

Leitarorð: (2E,5E)-2,5-Bis(3-hýdroxý-4-metoxýbensýliden)sýklópentanón (BHCP); týrósínasa hemill; mótefni sortuefna; gegn hrukkum

Cistanche erhrukkuvörn.

1. Inngangur

Húðöldrun er flókið og framsækið ferli sem leiðir til virkni og fagurfræðilegra breytinga í húðinni, þar sem bæði innri og ytri þættir bera ábyrgð [1]. Ytri öldrun húðarinnar stafar af umhverfisáhrifum, svo sem útfjólubláum (UV) geislum, streitu eða reykingum. Hins vegar stafar það aðallega af endurtekinni útsetningu fyrir UV frá sólinni, sem er kallað ljósöldrun. Húðljósmyndun einkennist af grófum og djúpum hrukkum, þykkt, grófleika, litabreytingum og vefjafræðilegum breytingum [2-4].

Týrósínasi (EC 1.14.18.1), sem einnig er þekktur sem pólýfenóloxíðasi, er eitt af fjölvirkum ensímum sem innihalda kopar sem taka þátt í myndun melaníns og finnst víða í náttúrunni [5]. Týrósínasi er venjulega til staðar í meirihluta örvera, plantna, og dýr. Í plöntum virkar týrósínasi með því að oxa mónófenól í dífenól (mýkófenólatvirkni) og tekur þátt í oxun o-dífenóla í o-kínón (dífenólasavirkni), fylgt eftir með oxun kínóna í dökkbrún litarefni [6].

Melanogenesis er umbreyting L-tyrosíns í 3,4-díhýdroxýfenýlalanín (L-DOPA), þar sem L-DOPA breytist í DOPA kínín [7]. Þess vegna gegnir týrósínasi mikilvægu hlutverki í melanínframleiðslu í sortufrumum og hömlun á týrósínasa er aðlaðandi markmið til að bæta litarefnistengda sjúkdóma og fyrir þróun hvítunarefna [8,9]. Melanínmyndun er framkölluð af nokkrum áreiti, svo sem UV og efnum þar á meðal ísóbútýlmetýlxantíni (IBMX) og alfa-melanocyte-örvandi hormóni (-MSH). -MSH binst við viðtaka melanocortin 1 viðtaka (MC1R) og eykur í kjölfarið umfrymishringlaga AMP(cAMP) magn. Aukið cAMP magn virkjar prótein kínasa A (PKA), sem framkallar tjáningu á microphthalmia-associated transscription factor (MITF) með fosfórun á cAMP responseelement-binding próteininu (CREB). MITF örvar tjáningu tyrosinasa, tyrosinasa-tengts próteins (TRP)-1 og TRP-2, sem að lokum leiðir til aukinnar melanínmyndunar [10]. MITF er talinn lykilumritunarþáttur sortumyndunar; Þess vegna hafa margar rannsóknir verið gerðar til að stjórna tjáningu MITF til að hamla sortumyndun [11].

Vitað er að hrukkumyndun er nátengd niðurbroti utanfrumuefnis húðarinnar og útfjólublá geislun virkjar kjarnaþátt-kB (NF-kB) og eykur þar með framleiðslu kollagenbrots og fylkismálmpróteinasa (MMP) [2]. MMP eru sinkháðir endópeptíðasar sem eru mikilvægir við endurgerð utanfrumu fylkisbyggingarinnar í húðinni. Þess vegna er of mikið niðurbrot kollagens og fylkisins af UV-framkölluðum MMPs einkennandi eiginleiki ljósskemmdar húðar og MMPs eru notaðir sem aðalmerki fyrir UV-framkallaða ljósöldrun sem og húðbólgu [12].

Curcumin-líkar diarylheptanoid beinagrindafleiður hafa verið ma andoxunarefni, tilkynnt krabbamein, starfsemi. vinnupallar, þar á meðal (2E,5E)-2,5-bis(3-hýdroxý-4-metoxýbensýliden)sýklópentanón (BHCP) (Mynd 1),að sýna mikið úrval af bólgueyðandi, and-melanogenesis, Sérstaklega, Leow o.fl. [19] greint frá í lífvirkni, og and-tyrosinasa [13-18]dibenzylidene-cyclopentanone 2014 sem gæti stuðlað að verndandi áhrifum á beinsarkmein í mönnum með stjórnun á Wnt/-catenin boðleiðinni. Hins vegar er enn eftir að uppgötva áhrif BHCP gegn sortumyndun og hrukkuáhrifum og sameindaaðferðirnar sem liggja að baki virkni þess hafa ekki enn verið staðfestar með skýrum hætti.

Mynd 1. Uppbygging (2E,5E)-bis(3-hýdroxý-4-metoxýbensýliden)sýklópentanóns (BHCP).

Í þessari rannsókn könnuðum við virkni BHCP gegn sortu og hrukkum og leituðumst við að bera kennsl á gangverkið, sérstaklega með tilliti til melaníninnihalds og virkni týrósínasa í frumum, sem voru könnuð með því að nota týrósínasa hömlunarpróf og greiningu á hreyfihvörfum ensíma. Ennfremur sýndum við fram á að BHCP hefur hamlandi áhrif á sortumyndun og hrukkum sem tengist niðurstýringu CREB/MITF/tyrosinasa í -MSH-framkölluðum B16F10 sortuæxlisfrumum í músum og hömlun á fosfórýleringu á p65 og MMP tjáningu í UV7 framkölluðum fibroblasts úr mönnum.

drekajurtir cistanche

2. Niðurstöður og umræður

2.1. Nýmyndun (2E,5E)-2,5-bis(3-hýdroxý-4-metoxýbensýliden)sýklópentanóns (BHCP)

Lausn af {{0}}hýdroxý-4-metoxýbensaldehýði (100 mg, 0,66 mmól, ísóvanillíni) og sýklópentanóni (0,03 ml, 0,33 mmól) í 1 N HCl-ediksýrulausn (0,02 mL) var hrært við 25 ◦C í 2 klst. Eftir að hafa staðið í 1 dag var hvarfblandan meðhöndluð með köldu vatni í viðurvist lítið magns af metanóli, síuð og þvegin með köldu vatni til að framleiða BHCP (65,9 mg) með 56,9 prósent ávöxtun. BHCP var auðkennt með litrófsfræðilegum aðferðum, þ.m.t. 1H og 13C-NMR, svo og með samanburði við birt litrófsgögn og þunnlagsgreiningu (TLC) greiningu [19]. Uppbyggingin er sýnd á mynd 1.

BHCP: gult myndlaust duft (CHCl3); 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) 5: 9,25 (s, 2H, 2 × OH), 7,28 (s, 2H, 2×vinýlH), 7,14 (d, 2H) , J=2.0 Hz, 2 × 2-H), 7,11 (dd, 2H, J=8.5, 2.0 Hz, 2×6- H), 7,01 (d, 2H, J=8,5 Hz, 2 × 5-H), 3,81 (s, 6H, 2 × OMe), 3,01 (s, 4H, 2 × CH2) ; 13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) 5: 195,5, 149,9, 147,2, 136,0, 133,1, 129,1, 124,3, 117,5, 112,8, 56,3, 26,6; ESI-MS: m/z 351 (M - H)-.

2.2. Hamlandi áhrif BHCP á virkni sveppa tyrósínasa

Eins og sýnt er í töflu 1 hamlaði BHCP týrósínasa með IC50 gildi upp á 1,10 ± 0,12 μMand 8,18 ± 0,44 μM, en kojínsýra (jákvæð viðmiðun) var með IC50 gildi 18,48 ± 11,68 ± 11,9 μd μM fyrir mónófenólasa og dífenólasa, í sömu röð. Í fyrri rannsókn okkar á tilbúnum hugsanlegum hemlum týrósínasa, fundum við verkunarháttinn í gegnum sameindalíkanarannsóknir þar sem 3-hýdroxý- og 4-metoxýhópar bensýlíðens höfðu mikla bindingartilhneigingu í átt að virka týrósínasasvæðinu [20]. Út frá þessari rannsóknarniðurstöðu var sýnt fram á að virkir hópar þess (3-hýdroxý- og 4-metoxýhópar) tengdust marktækri aukningu á týrósínaseinhamlandi virkni.

Tafla 1. Týrósínasa hindrandi virkni og ensímhvarfagreining á BHCP.

Ennfremur var aðferðin sem ber ábyrgð á týrósínasa hömlun með BHCP rannsakað byenzyme hreyfigreiningu í þessari rannsókn (tafla 1 og mynd 2). Lineweaver–Burk reiti voru teiknuð með því að nota gögnin sem fengust úr hreyfirannsóknum og hömlunarfastinn (Ki) var fenginn úr Dixon reitnum. Lineweaver–Burk tvöföldu gagnkvæmu línurnar bentu til hömlunar af samkeppnisgerð. Eins og sýnt er á mynd 2a–c, virkaði BHCP sem samkeppnishemill bæði L-tyrosíns og L-DOPA. Þar að auki eru hleranir á x-ás Dixon reita algengar notað til að ákvarða gerðir af ensímhömlunarföstum (Ki) fyrir ensím-hemla flókið [21,22], þar sem gildi thex-ás gefur til kynna gildi −Ki. Eins og sýnt er á mynd 2b–d voru Ki gildi BHCP 1,7 μMand 10,5 μM sem hvarfefni fyrir L-tyrosine og L-DOPA, í sömu röð. Þar sem Ki gildið táknar styrkinn sem þarf til að mynda ensím-hemla flókið, bendir lægra Ki gildi til árangursríkari hömlunar gegn týrósínasa.

Mynd 2. Lineweaver–Burk (a,c) og Dixon (b,d) plots fyrir týrósínasa ensím hömlun með BHCP.

2.3. Áhrif BHCP á frumulífhæfi B16F10 sortuæxla og Hs27 trefjafrumna

Áður en ákvarðað var hvort BHCP beitti einhverri virkni gegn sortumyndun og hrukkum, skoðuðum við frumueiturhrif BHCP á B16F10 frumur og Hs27 frumur með meðhöndlun með mismunandi styrk BHCP í mismunandi tímabilum og lífvænleiki frumna var mældur með EZ-Cytox prófinu. Eins og sýnt er á mynd 3a,b, drógu allt að 10 μM af BHCP í 48 klst ekki úr lifun hvorki B16F10 frumanna eða Hs27 frumanna. Í kjölfarið voru gerðar frekari in vitro rannsóknir á virkni BHCP gegn sortumyndun og hrukkuvirkni með 1, 5 og 10 μM.

2.4. Hömlun BHCP gegn melaníninnihaldi og frumu tyrosinasavirkni í B16F10 sortuæxlisfrumum

Til að ákvarða hvort BHCP hafi hamlandi möguleika á melaníninnihaldi -MSH-framkallaðra B16F10 frumna, voru frumur formeðhöndlaðar með tilgreindum mismunandi styrk (1, 5 og 10 μM) af BHCP eða kojínsýru (5 mM) í 24 klst. með -MSH í 48 klst. Eins og sýnt er á mynd 4a minnkaði melaníninnihaldið í frumunum sem voru meðhöndlaðar með BHCP í viðurvist -MSH á styrkleikaháðan hátt og sýndi 113 prósent við 1 μM, 106 prósent við 5 μM og 102 prósent við 10 μM, samanborið við samanburðarhópur sem aðeins var meðhöndlaður með -MSH (186 prósent). Athyglisvert er að BHCP (1 μM) hamlaði melaníninnihaldi meira en kojínsýra (5 mM). Ennfremur var gerð frumugreining á týrósínasavirkni til að mæla hamlandi áhrif BHCP á B16F10 frumur. Eins og sýnt er á mynd 4b, lækkaði BHCP á styrkleikaháðan hátt með týrósínasavirkni um 120 prósent við 1 μM, 116 prósent við 5 μM og 105 prósent við 10 μM, samanborið við samanburðarhópinn sem var meðhöndlaður með -MSH eingöngu (181 prósent ). Hindrandi áhrif BHCP voru mun öflugri en kojínsýru; hömlun BHCP við 1 μM var betri en kojínsýru við 5 mM (131 prósent). Þessar niðurstöður benda til þess að BHCP hafi hvítandi áhrif með því að hindra nýmyndun melaníns og innanfrumu týrósínasa nýmyndun í B16F10 sortufrumum.

Mynd 4. Hömlun á melaníninnihaldi (a) og frumu tyrosinasavirkni (b) BHCP á B16F10 sortuæxlisfrumum.

2.5. Áhrif BHCP á tjáningu MITF/tyrosinasa og fosfórýleraðs CREB í B16F10 frumum

MITF, sérstakur umritunarþáttur, gegnir lykilhlutverki í því að virkja sortuvaldandi gen, þar á meðal týrósínasa, sem hvatar hraðatakmarkandi skrefið í lífmyndun melaníns: TRP-1 og TRP-2. Tjáning MITF gæti aukist með fosfórun CREB [23]. CREB er mikilvægurMITF hvatamaður [24,25] og fosfórun CREB í sortufrumum eykur MITF tjáningu með því að bindast CREB (c-AMP svar frumefnisbindandi prótein) í sortufrumum [26]. Til að skýra sameindaleiðirnar sem eru ábyrgar fyrir sortuefnavaldandi áhrifum BHCP á B16F10 frumur, skoðuðum við próteinmagn lykilsameinda, þar á meðal CREB og MITF, sem gegna mikilvægu hlutverki í sortumyndun með Western blot greiningu. Frumurnar voru meðhöndlaðar með BHCP eða kojínsýru og síðan örvaðar með -MSH í 48 klst. Tímabilið fyrir mælingarnar fylgdi aðferðafræðinni sem lýst var í fyrri rannsóknum [27]. Eins og sýnt er á mynd 5, jókst magn tyrosinasa og MITF með -MSH, en BHCP lækkaði þessi próteinmagn. Ennfremur var fosfórun á CREB verulega bæld af BHCP. Vitað er að stjórnun -MSH-framkallaðrar CREB fosfórunar er hugsanlega mikilvæg til að stjórna litarefni [28]. Þessar niðurstöður benda til þess að mótefnavaldandi áhrif BHCP stafa af lækkun MITF og týrósínasa með niðurstýringu fosfórýleraðs CREB. Þessi rannsókn bendir til þess að skýring á hömlunarferli BHCP á týrósínasa og sortumyndun skipti sköpum og verður að rannsaka frekar í framtíðinni. Þrátt fyrir að B16F10 sortuæxli frumulínan sé almennt hentugari til að rannsaka boðefnaferli in vitro, er B16F10 frumulínan af sortuæxli af nagdýrum. Þess vegna verða frekari rannsóknir á sortufrumum manna nauðsynlegar til að staðfesta niðurstöðurnar.

2.6. Áhrif BHCP á UV-framkallaða NF-kB p-p65 virkjun í Hs27 frumum

Við rannsökuðum næst áhrif BHCP á UV-framkallaða tjáningu bólgumiðla sem nota Hs27 trefjafrumur. Það hefur áður verið greint frá því að fosfórun p65 (Ser536) er nauðsynleg fyrir getu þess til að umvirkja gena [29]. Þess vegna var p-p65 (Ser536) og p65 próteinmagn skoðað í kjarnahlutanum með Western blotting. Eins og sýnt er á mynd 6a,b, í Hs27 frumum, jók UV próteinmagn p-p65 (Ser536) í kjarna, en meðferð á BHCP minnkaði p-p65 (Ser536) próteinmagn kjarnans. Að sama skapi minnkaði heildarmagn p65 í umfrymi með UV og endurheimt með BHCP (Mynd 6c,d). Þrátt fyrir að p65 p65 tjáningarstig próteina hafi minnkað í umfryminu og aukist í kjarnanum eftir UV örvun, sneri formeðferð með BHCP þessari þróun við á skammtaháðan hátt. Þessar niðurstöður benda því til þess að hömlun á p-p65 með BHCP gæti stuðlað að verndandi áhrifum á húðlitun og eyðingu kollagen gegn UV.

Mynd 6. Áhrif BHCP á tjáningarmagn p-p65 (Ser536) í UV-örvuðum Hs27 mannatrefjafrumum.

2.7. Áhrif BHCP á tjáningu MMP í Hs27 frumum

MMPs gegna mikilvægu hlutverki í öldrun húðarinnar. UV geislun breytir bandvef húðarinnar með því að hækka tjáningu MMPs [30,31]. MMP-1 er kollagen-niðurbrotsensími sem flýtir fyrir niðurbroti kollagens sem er tilbúið úr prókollageni af tegund I. MMP-9 er matarlímbrotnandi ensím sem brýtur niður kollagenþráða sem skornir eru af MMP-1, sem eykur hrukkuframleiðslu og missi teygjanleika. Til að kanna hrukkuáhrif BHCP gegn UV örvun, ákváðum við magn MMP-1 og MMP-9 próteina með Western blotting. Ennfremur sýndu UV-framkallaðar frumur marktækt hækkað magn af MMP-13, sem kemur af stað niðurbroti á kollageni af gerð I og III í stað MMP-1 [32]. Við rannsökuðum aukningu MMPs (MMP1, MMP9, MMP12 og MMP13) eftir meðferð á UV-völdum Hs27 frumum með BHCP við 1 og 10 μM. Eins og sýnt er á mynd 7 jókst magn MMP-1, MMP-9, MMP-12 og MMP-13 tjáningar eftir UV örvun; hins vegar minnkaði BHCP meðferð tjáningu í skammti -háður háttur. Niðurstöður okkar benda til þess að BHCP gæti stuðlað að því að koma í veg fyrir hrukkumyndun með því að draga úr óeðlilegri framleiðslu MMPs af völdum UV útsetningar. Þessar niðurstöður gefa til kynna að BHCP hamlar MMP tjáningu í Hs27fibroblasts til að koma í veg fyrir kollagen niðurbrot og þar með hrukkuframleiðslu. Þess vegna sýnir BHCP möguleika á notkun sem forvarnar- og meðferðarlyf við húðtengdum sjúkdómum.

cistanche stilkur kostir

3. Efniviður og aðferðir

3.1. Efni og tækjabúnaður

Sveppir týrósínasi (EC 1.14.18.1), -MSH, L-týrósín, 3,4-díhýdroxýfenýlalanín (L-DOPA), dímetýlsúlfoxíð (DMSO) og kojínsýra voru keypt frá Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), fóstursermi, streptomycin og amphotericin voru keypt frá Gibco Life Technologies Inc. (Carlsbad, CA, Bandaríkjunum). Mótefni gegn MITF,CREB, p-CREB, p-p65 (Ser536), p65, tyrosinasa, MMP-1, MMP-9, MMP-12, MMP-13, TFIIB , og -actin voru keyptir frá Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, Bandaríkjunum). Pólývínýlíden tvíflúoríð (PVDF) himnur voru fengnar frá Millipore Corporation (Bedford, MA, Bandaríkjunum). Dauðhreinsuð plastvörur fyrir vefjaræktun voru keypt frá SPL Labware (Seoul, Kóreu). UV ljósgjafinn var útvegaður af Crosslinker 800 röð (UVP, CA, USA) 6 lampaeiningu (8 vött/lampa). }forhúðaðar plötur frá Merck Millipore (Darmstadt, Þýskalandi). NMR litróf voru skráð með Varian Unity INOVA 400 (400 MHz fyrir 1H, 100 MHz fyrir 13C) og Varian Unity AS 500 (500 MHz fyrir 1H) tæki. Greint er frá efnabreytingargildum (δ) með tilvísun til viðkomandi leysiefnaleifa eða deuterated toppa (δH 2,50 og δC 39,51 fyrir DMSO). Lágupplausnarmassagreiningargögn voru fengin með Expression CMS massagreini (Advion, Ithaca, NY, Bandaríkjunum).

3.2. Sveppir Tyrosinasa hindrunarpróf

Sveppir týrósínasa hamlandi virkni var ákvörðuð með því að nota bæði L-týrósín og L-DOPA sem hvarfefni, byggt á aðferð sem lýst er af Jung et al. [23]. Í stuttu máli var 190 μL af tyrosinasa ensími (1000 U þynnt með sveppa tyrosinasa buffer, þar á meðal 1 mM L-tyrosine og L-DOPA lausn) bætt við, í nærveru eða fjarveru efnasambanda (endastyrkur á bilinu 1 til 20 μM, uppleyst í 100 prósent DMSO), í hvern brunn í 96-brunnsplötu, til að fá endanlegt rúmmál upp á 200 μL. Platan var ræktuð við 37 ◦C í 30 mín. Týrósínasavirkni var magngreind með því að mæla gleypni við 492 nm með því að nota örplötulesara (TECAN, Salzburg, Austurríki) og prósentuhömlunin (prósent) var fengin úr eftirfarandi jöfnu:

prósenta hömlun=(Ac − As)/Ac × 100 (1)

þar sem Ac er gleypni eftirlitsins og As er gleypni sýnisins. IC50 gildin voru reiknuð út frá log-línulegu ferlunum og jöfnum þeirra. Meðalniðurstöður fyrir þrjár ákvarðanir eru sýndar. Kojínsýra var notuð sem jákvæð viðmiðun.

3.3. Hreyfifræðileg greining á týrósínasa hömlun

Til að ákvarða hreyfihvörf voru tvær hreyfiaðferðir (Lineweaver-Burk og Dixon plots) notaðar til viðbótar [21,22,33]. Fyrir Lineweaver–Burk tvöfalda gagnkvæma reitur (mynd af 1/ensímhraða (1/V) á móti 1/styrkleika hvarfefnis (1/[S])), var hömlunargerðin ákvörðuð með mismunandi styrkleika L-týrósíns (1, 2, og 4 mM) og L-DOPA (0.5, 1 og 2 mM) sem hvarfefni í nærveru mismunandi styrks BHCP. Styrkur BHCP var sem hér segir:0, 0.5, 1.{{20}} og 2.0 μM fyrir L-týrósín; og 0, 2,5, 5 og 10 μM fyrir L-DOPA. Dixon plottið er myndræn aðferð (samsæri um 1/ensímhraða (1/V) gegn þéttni hemils (I)) til að ákvarða tegund ensímhömlunar og var notuð til að ákvarða sundrunarfastann eða Ki fyrir ensím-hemla flókið. Dixon reitir (stök gagnkvæm lóð) af hömluninni voru fengin í nærveru L-tyrosín hvarfefnis við 1, 2 og 4 mM og {{40}}, 0.5, 1.{ {47}} og 2.0 μM fyrir BHCP; og L-DOPA hvarfefni við {{50}}.5, 1.0 og 2.0 mM og 0, 2.5, 5.0 og 10.0 μM fyrir BHCP.

cistanche plantaer tyrosinasa hemill.

3.4. Frumulínur og frumurækt

Murine B16F10 sortuæxlisfrumur voru fengnar frá Korean Cell Line Bank. Fibroblast frumulínan Hs27 úr mönnum var keypt frá American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, Bandaríkjunum). Þessum frumum var haldið í DMEM sem bætt var við 10 prósent nautgripasermi fósturs, 100 U/ml penicillíni og 100 mg/ml streptomycini í rakaðri 5 prósent CO2 útungunarvél við 37 ◦C. Dermal fibroblasts á 100 mm diski voru meðhöndlaðir með BHCP og útsettir fyrir 50 mJ/cm2UV í sermifríu DMEM (UV ljósgjafa, UVP). Hs27 frumurnar voru ræktaðar í 70–80 prósenta samruna í 100 mm þvermáli plötu og voru notaðar á milli göngunúmera 5 og 15.

3.5. Frumulífvænleikapróf

Lífvænleiki frumna var metinn með því að nota EZ-Cytox kit prófið. Í stuttu máli voru B16F10 frumur og Hs27fibroblasts sáð í 96-brunnsplötu með þéttleikanum 1 × 104 frumur/brunn og ræktaðar við 37 ◦C í 24 klst. Frumunum var gefið ferskt, sermisfrítt DMEM sem innihélt mismunandi styrk (0, 1, 2, 5 og 10 μM) af BHCP og ræktaðar í 24 og 48 klst. Í kjölfarið var 10 μL af EZ-Cytox lausn sett í hvern brunn og frumurnar ræktaðar í 2-4 klst. Frásogsmæling frumna án nokkurrar meðferðar var talin 100 prósent frumulifun. Hver meðferð var framkvæmd tvívegis og hver tilraun var endurtekin þrisvar sinnum.

3.6. Ákvörðun á melaníninnihaldsgreiningu

Áhrif BHCP á -MSH-framkallaða sortumyndun í B16F10 frumum byggðust á áður notuðri aðferð með smávægilegum breytingum [34]. Í stuttu máli var B16F10 frumum (5 × 104 frumur/brunn) í 6-brunnsplötum leyft að vaxa í 70–80 prósent samruna. Frumurnar voru síðan meðhöndlaðar með mismunandi styrk BHCP (1, 5 og 10 μM) eða kojic sýru (5 mM) í 24 klst, og síðan örvað með -MSH (5 mM) í 48 klst. Eftir meðferð voru frumurnar þvegnar tvisvar með ísköldu PBS, leystar upp í 90 μL 1 M NaOH lausn þar á meðal DMSO (5 prósent) við 60 ◦C í 1 klst. og gleypni var mæld við 405 nm með örplötulitrófsmæli (TECAN, Salzburg) , Austurríki). Til að mæla magn melaníns í tilrauninni var hömlunarhraði í meðferðarhópunum reiknaður út frá gleypni þekkts styrks tilbúins melaníns, sem var leiðrétt í heildarmagn próteins sem var til staðar í floti frumulýsanna. Frásog ómeðhöndlaðra frumna var mæld í þrígang.

3.7. Cellular Tyrosinase Activity Assay

Greining á frumu tyrosinasa virkni var framkvæmd með því að mæla hraða oxunar L-DOPA [35]. B16F10 frumur með þéttleikanum 5 × 104/frumur voru settar í 6-brunnsdiska og ræktaðar yfir nótt. Frumurnar voru síðan meðhöndlaðar með ýmsum styrkjum af BHCP (1, 5 og 10 μM) eða kojic sýru (5 mM) í 24 klst, og síðan örvuð með -MSH (5 mM) í 48 klst. Frumurnar voru þvegnar með PBS og ljósaðar í lausn sem innihélt 100 mM af 50 mM fosfatbuffi (pH 6,5), 0,1 mMfenýlmetýlsúlfónýlflúoríð (PMSF) og 1 prósent Triton X-100. Síðan voru frumurnar settar í djúpfrystivél (-80 ◦C) í 30 mín. Eftir að frumurnar voru afþíðaðar voru frumuútdrættirnir hreinsaðir með skilvindu við 12,000 snúninga á mínútu í 30 mínútur við 4 ◦C. Alls var 80 μL af flotinu og 20 μL af L-DOPA (2 mg/ml) bætt við 96-brunnsplötu og gleypni við bylgjulengd 492 nm var mæld á 10 mínútna fresti í 1 klst. við 37 ◦ C með ELISA plötulesara (TECAN, Salzburg, Austurríki).

3.8. Undirbúningur frumu- og kjarnaútdrátta úr Hs27 frumum

Hs27 frumurnar voru þvegnar með ísköldu PBS og safnað. Stuðpúði sem innihélt 10 mM Tris(pH 8.0), 1,5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0,1 prósent NP-40 og próteasahemla var notað til útdráttar frumuþátta með skilvindu við 12,000 snúninga á mínútu við 4 ◦C í 15 mínútur, og kjarnabrot voru dregin út úr kögglum með því að nota jafna sem innihélt 10 mM Tris, 50 mM KCl, 100 mM NaCl og próteasínhemla, ræktuð á ís í 30 mínútur, og síðan skilið við 13,000× g í 30 mínútur við 4 ◦C til að fá kjarnabrot.

3.9. Western Blotting

Lýsatsýni voru soðin í 10 mín. í hlauphleðslubuffi (125 mM Tris-HCl, 4 prósent natríumdódesýlsúlfat (SDS), 10 prósent 2-merkaptóetanól og 0,2 prósent brómófenól blár; pH 6,8) við rúmmálshlutfallið 1:1. Heildarpróteinígildi fyrir hvert sýni voru aðskilin með SDS-pólýakrýlamíð gelelektrófóresis (PAGE) með því að nota akrýlamíð gel eins og byggt var á aðferð sem lýst er af Laemmli [36] og flutt yfir á PVDF himnur við 80 V í 2 klst með því að nota blautflutningskerfið. Himnurnar voru samstundis settar í stíflujafna (5 prósent fitulaus mjólk) í 10 mM Tris, pH 7,5, 100 mMNaCl og 0,1 prósent Tween-20. Blettirnir voru læstir til að koma í veg fyrir ósértæka bindingu við 25 ◦C í 2 klst. Í kjölfarið voru himnurnar ræktaðar með sérstöku aðalmótefni við 4 ◦C yfir nótt, fylgt eftir með ræktun með piparrótarperoxidasa-tengdu aukamótefni við 25 ◦C í 1 klst. . Mótefnamerking var greind með aukinni efnaljómun í samræmi við leiðbeiningar framleiðanda. Próteinmagngreining var framkvæmd með því að nota Davinch-Chemi TM.Chemiluminescence Imaging System CAS-400SM (Core Bio, Seúl, Kóreu). Forlituð próteinmerki voru notuð til að ákvarða mólmassa.

3.10. Tölfræðigreining

Öll gögn eru sett fram sem meðaltal ± SEM Gögnin voru greind með einhliða dreifnigreiningu (ANOVA) fyrir muninn á meðferðum sem fylgt var eftir með Bonferroni post-hoc prófinu. Gildi p < 0.05="" var="" talið="" tölfræðilega="">

4. Niðurstöður

Í stuttu máli sýndu niðurstöður þessarar rannsóknar að BHCP hefur húðhvítandi áhrif með hömlun á tyrosinasa, sem er lykilensím fyrir nýmyndun melaníns í B16F10 melanocytum af völdum -MSH. Ennfremur minnkaði BHCP tjáningu MMP próteinmagns í trefjafrumum af völdum UV, sem búist er við að hafi áhrif gegn hrukkum. Frekari rannsókna er krafist til að staðfesta hvítunar- og hrukkuáhrif BHCP með dýra- og klínískum rannsóknum. Að lokum var greint frá því að BHCP hefði bæði hvítandi og hrukkuáhrif, sem gefur til kynna möguleika þess á þróun lækningalyfja fyrir sjúkdóma sem tengjast oflitun og hrukkum.

hvað er cistanche

Fyrir frekari upplýsingar, vinsamlegast smelltu hér.