CRISPRi-miðluð stillanleg stjórnun á genatjáningarstigi með hönnuðu einstýrðu RNA í Escherichia Coli

ÁSTANDUR

Precise control of gene expression is essential for flux redistribution in metabolic pathways. Although the CRISPR interference (CRISPRi) system can effectively repress gene expression at the transcriptional level, it has still been difficult to precisely control the level without loss of specificity or an increase in cell toxicity. In this study, we developed a tunable CRISPRi system that performs transcriptional regulation at various levels. We constructed a single-guide RNA (sgRNA) library targeting repeat, tetraloop, and anti-repeat regions to modulate the binding affinity against dCas9. Each screened sgRNA could regulate the gene expression at a certain level between fully repressing and nonrepressing states (>45-falt). Þessi sgRNA gerði einnig kleift að stjórna einingum með ýmsum DNA markröðum. Við beittum þessu kerfi til að endurdreifa efnaskiptaflæðinu til að framleiða víólasínafleiður í fyrirsjáanlegu hlutfalli og hámarka framleiðslu lycopene. Þetta kerfi myndi hjálpa til við að flýta fyrir hagræðingarferlum flæðis í efnaskiptaverkfræði og tilbúinni líffræði.

cistanche tubulosa-bæta ónæmiskerfið

Smelltu hér til að skoða Cistanche Enhance Immunity vörur

【Biðja um meira】 Netfang:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

KYNNING

Tegund II Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-tengt (Cas) kerfið er RNA-stýrt DNA klofningskerfi sem samanstendur af CRISPR RNA (crRNA), transvirkjandi CRISPR RNA (tracrRNA) og Cas9 próteini (1) ,2). Cas9 frá Streptococcus pyogenes hefur verið mikið notað í erfðamengiverkfræði vegna vel einkennandi eiginleika þess (3,4). Samstæða spCas9 próteinsins, tracrRNA og crRNA binst og klýfur mark DNA frumrýmið sem er viðbót við 20 núkleótíða (nt) spacer röð crRNAsins í viðurvist 5'-NGG-3' frumrýmis aðliggjandi mótífs (PAM) ) röð (5,6). Til að einfalda kerfið er hægt að nota chimeric single guide RNA (sgRNA) þar sem crRNA og tracrRNA eru sameinuð með gervi tengi sem kallast tetraloop (5). Það gerir kleift að skipta út tveimur aðskildum RNA fyrir eina RNA sameind, sem gerir kerfið viðráðanlegra. Eitt af CRISPR-undirstaða kerfanna, CRISPR truflun (CRISPRi), notar hvataóvirkt Cas9 (dCas9) með því að skipta um ákveðnar amínósýrur úr hverju innkirtlasvæði (7). Þessi breyting gerir ríbonucleoprotein (RNP) flókið sem getur beint og tengst mark-DNA og truflar RNA pólýmerasa (RNAP) til að hindra upphaf eða lengingu umritunar (7). Öfugt við útslátt með CRISPR/Cas9 kerfi, gerir CRISPR kleift að lækka gena afturkræf með því að tjá dCas9 eða sgRNA undir framkallanlegum örva, sem gerir kleift að auka sveigjanleika í genastjórnun (7). CRISPRi kerfið hefur í raun þaggað niður markgen hundraðfalt (7,8). Marksértæk genabæling gerir kleift að greina svipgerð með mikilli afköstum með því að nota sgRNA laug sem vítt erfðamengi (9) eða vísar kolefnisflæði í verkuðum bakteríum í átt að markefnaefnið (10-12). Að auki hefur verið sýnt fram á multiplex CRISPRi í ýmsum hýslum með því að nota ýmsar aðferðir til að tjá stöðugt mörg sgRNA, þar á meðal langar crRNA fylki, samþættingu táhaldsrofa og óendurteknar extralong sgRNA fylki (13-16). Þessar aðferðir við að hamla mörgum genum samtímis hafa verið notaðar til að framkvæma flóknari verkefni, svo sem að draga úr eitruðum milliefnum eða hindra samkeppnisleiðir í gerjun baktería (13,16-19). Hins vegar er algjör kúgun ekki alltaf æskileg fyrir efnaskiptaverkfræði. Genatjáningarstigum ætti að vera nákvæmlega stjórnað til að ná sem bestum ensímvirkni milli vaxtar- og framleiðsluferla, jafnvægi í styrk innanfrumu forvera og forðast uppsöfnun eitraðra milliefna (20-22). Ýmsar aðferðir hafa verið þróaðar til að móta kúgunarvirkni CRISPRi. Nokkrir þættir voru meðhöndlaðir, eins og magn sgRNA og dCas9 próteins eða val á sgRNA. Að stýra tjáningu dCas9 eða bæði dCas9 og sgRNA tjáningu með því að nota örvunarhvata stjórnaði tjáningu markgena meira en 30-falt eða 300-falt, í sömu röð (23,24). Hins vegar hefur komið fram að mótun dCas9 styrks getur leitt til ósamræmis bælingar skilvirkni á mismunandi protospacers (23). Takmarkaður fjöldi tiltækra framkallanlegra verkefna gerir einnig hönnunaráskoranir þrátt fyrir mikla viðleitni (25). Önnur aðferð er innsetning bindilssértæks RNA aptamer í sgRNA, þar sem lítil tengd sameind getur afhjúpað spacer, þannig að gera skammtaháða stjórn á CRISPRi (26). Bindursértæka sgRNA er gagnlegt ef hentugur bindill og aptamer par er til staðar. Fjarlægðin frá upphafsstað umritunar og stefnu dCas9 bindingar hefur einnig áhrif á skilvirkni CRISPRi (7). Að stilla fjarlægðina á milli sgRNA bindistaðarins og upphafsstaðs umritunar getur hagrætt ferlið í efnaskiptaverkfræði (17,27,28). Hybridization skilvirkni milli spacer og protospacer röð breytir einnig RNP flókið bindandi skilvirkni (29-31). Þess vegna var ósamræmi hönnuð utan fræsvæðisins til að breyta ókeypis orkunni kynnt til að auka fjölbreytni CRISPRi skilvirkni (31,32). Hins vegar er nauðsynlegt að hanna sgRNA fyrir hverja nýja markröð og það getur verið krefjandi að ná fram verulegum mun á fríri orku með aðeins misræmi. Þar að auki er möguleiki á aukinni bindingu utan markmiðs (33). Engu að síður er það enn takmarkað við að bæla nákvæmlega margfalda genatjáningu á máta hátt óháð markröðinni. Í þessari rannsókn þróuðum við stillanlegt CRISPRi kerfi sem stjórnar genatjáningu með mikilli nákvæmni og fyrirsjáanleika. Með endurtekinni flúrljómun sem byggir á frumuflokkun á sgRNA safninu sem miðar að tetraloop og hliðarsvæði þess, náðum við uppskriftarbælingarvirkni allt að 45-falt jafnvel þegar mark-DNA er breytt. Þetta kerfi gerir ráð fyrir fyrirsjáanlega endurdreifingu efnaskiptaflæðis án þess að vinna með erfðamengi hýsilsins eða tilbúna ferla, sem gefur efnilegt tæki til að hámarka efnaskiptaferla.

EFNI OG AÐFERÐIR

Bakteríustofnar, plasmíð og hvarfefni

Escherichia coli stofnar og plasmíð sem notuð eru í þessari rannsókn eru skráð í viðbótartöflu S1. Grunnefni sem notuð eru í þessari rannsókn eru skráð í viðbótartöflu S2. Klónunaraðferðum er lýst í viðbótaraðferðunum. Markgen og DNA markraðir þeirra fyrir CRISPR kerfið eru sýndar í viðbótartöflu S3. Mach1-T1R var notað fyrir almenna klónun. Bókasafnið var smíðað með því að nota NEB 5-alpha Electrocompetent E. coli (NEB). Venjulegar ræktanir til að smíða plasmíð og stofna voru framkvæmdar við 37◦C í Luria-Bertani (LB) seyði eða á LB agarplötu sem innihélt viðeigandi sýklalyf (34 g/ml klóramfenikól, 50 g/ml spectinomycin). PCR var framkvæmt með því að nota Q5® High-Fidelity DNA Polymerase (NEB). Plasmíð og PCR vörur voru hreinsaðar með GeneAll® Exprep™ Plasmid SV Kit og Gel SV Kit (GeneAll líftækni). Bælingarvirkni sgRNA stökkbreyttra Yfirnótt ræktunarmiðill var endurnýjaður í OD600 af 0.05 og ræktaður þar til hann náði gildi á milli 0,6 og 0,8. Ræktunarmiðillinn var síðan þynntur í OD600 upp á 0,05 með 20 ng/ml af aTc og ræktaður í 4 klst. Flúrljómun eins nýlendu var mæld við 575 nm/616 nm með Hidex Sense örplötulesara (Hidex), og OD600 gildið var ákvarðað með Jenway 7300 litrófsmæli (Jenway). Hlutfallsleg flúrljómun var reiknuð út sem flúrljómunareiningar á OD600 gildi, með gildi fyrir PC stillt sem 100%.

Áhrif Cistanche tubulosa-meðhöndla hægðatregðu

sgRNA bókasafnsskimun

Sama menningaraðferð og sú sem lýst er hér að ofan var notuð. Ræktunarmiðill var þynntur í [frumu]<10−7 cells/ml in PBS buffer (pH 7.4). The fluorescence distribution was obtained from 100,000 cells from each sample using S3e Cell Sorter (Bio-Rad), and 5000 cells for each fluorescence range were sorted in each iteration. Cells were overnight cultured in fresh media for the next iteration. Samples were obtained after the final iteration and spread to the LB agar plate. Each colony was inoculated into 100 l of LB media and overnight cultured in 96-well microplate shaking at 900 rpm by Hidex Sense microplate reader (Hidex). Overnight culture media was refreshed by diluting 3 l culture media in 97 l fresh media and incubated for 2 h. Culture media was re-diluted by mixing 6 l culture media with 94 l fresh media, and aTc was added. The fluorescence of every single colony was obtained at 575 nm/616 nm by Hidex Sense microplate reader (Hidex) after 6 h of incubation. The OD600 value from the microplate reader was converted to the OD600 value from the spectrophotometer.

RNA útdráttur

Heildar-RNA var dregið út með því að nota RNeasy Mini Kit (Qiagen) eingöngu þegar miRNeasy Mini Kit (Qiagen) fyrir sgRNA magngreiningu, eftir meðferð með RNAprotect Bacteria Reagent (Qiagen) og geymslu við –80◦C. DNA-melting á dálki með því að nota RNase-Free DNase Set (Qiagen) var framkvæmd meðan á útdráttarferlinu stóð. DNA mengun var staðfest með PCR án öfugumritunar. Styrkur og hreinleiki hvers sýnis voru ákvörðuð með NanoDrop One (Thermo Scientific), og gæðin voru metin með því að nota DNA 5K/RNA/CZE 24 LabChip (PerkinElmer) á LabChip GX Touch 24 (PerkinElmer).

cistanche tubulosa-bæta ónæmiskerfið

RT-qPCR greining

Grunnur fyrir RT-qPCR voru annaðhvort fengin úr rannsóknarstofum eða hannaðir með því að nota Primer3Plus tólið (34) og skráðir í viðbótartöflu S4. CysG genið var notað sem viðmiðunargen (35) fyrir allar RT-qPCR tilraunir. Stöðluð ferill var búinn til með því að 10-falt þynna sniðmát úr 107 eintökum/l í 10−1 eintök/l. Mörkin fyrir magngreiningu voru ákvörðuð með því að passa afritafjölda og jákvæða mögnunarhraða við sigmóíðfall og reikna út 95% jákvæða afritatölugildið. Línulega hreyfisviðið var skilgreint sem lægsta afritatalan þar sem afturreiknað Cq breytileiki er minni en 35%. Cq gildi yfir 30 eða þau sem ekki voru mögnuð í samanburði án sniðmáts voru staðfest. Staðlað ferilgögn eru fáanleg í aukatöflu S5 og viðbótarmynd S1. Alls 2,5 ng af heildar-RNA var notað í 10 l RT-qPCR hvarf með Luna® Universal One-Step RT-qPCR Kit (NEB). RT-PCR var framkvæmt í þríriti á StepOnePlus™ RealTime PCR System (Applied Biosystems) með eftirfarandi skrefum: (i) öfug umritun við 55◦C í 10 mínútur, fylgt eftir af eðlisbreytingu við 95◦C í 1 mín; (ii) 40 hitalotur við 95◦C í 10 s og 60◦C í 1 mín; (iii) bræðsluferilgreining við 95◦C í 15 sekúndur og 60◦C í 1 mín., fylgt eftir með rampi frá 60◦C til 95◦C á hraðanum 0,3◦C/mín. Hlutfallsleg magngreining RNA var ákvörðuð með delta-deltaCt aðferðinni (36) og greind með StepOnePlus™ hugbúnaði (Applied Biosystems).

RNA-raðgreining (RNA-seq) og gagnagreining

1.5 in biological duplicate. Total RNA was extracted by the abovementioned method, and ribosomal RNA (rRNA) was depleted using Ribo-Zero plus rRNA Depletion Kit (Illumina). cDNA libraries were constructed using KAPA Stranded RNA-Seq Kits (Kapa Biosystems), with an additional size-selection step using AMPure XP (Beckman Coulter). Adapters and primers used in this study are listed in Supplementary Table S2. The concentration was measured using a Qubit 3.0 Fluorometer (Thermo Scientific), and the size distribution of the cDNA was measured using X-Mark LabChip (PerkinElmer) on the LabChip GX Touch 24 instrument. The average cDNA length ranged from 390 to 450 bps. RNA-Seq was performed as >19M reads of 41 bp paired-end using NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 Cycles) (Illumina) on NextSeq 550 (Illumina). Data analysis was performed using the reference genome of E. coli BL21(DE3) complete genome (Genbank CP001509.3) with FastQC (v0.11.9) (http:// www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) (37), Bowtie (v1.2.3) (38) with trim3 option value of 3, samtools (v1.10) (39), and cufflinks (v2.2.1) (40,41). All samples between replicates had R2 >{{0}}.92 byggt á FPKM (brot á kílóbasa afrita á milljón kortlagt lestur). Mismunandi tjáð gen voru fengin frá þröskuldinum 1,5 (log2-miðað) og 0,01 (q-gildi).

Proviolacein og prodeoxyviolacein framleiðsla og sýnataka

Til framleiðslu á víólasíni og pródeoxývíólasíni var eftirfarandi miðilssamsetning notuð: 10,7 g/l K2HPO4, 5,2 g/l KH2PO4,1g/l NaCl, 1 g/l NH4Cl, 1 g/l MgSO4, { {17}},2 g/l gerþykkni og 1{{20}} g/l glúkósa. Ræktunarmiðill yfir nótt var endurnýjaður í OD600 af 0.1 og ræktaður þar til OD600 náði á milli 0,6 og 0,8. Ræktunarmiðillinn var síðan þynntur að OD600 upp á 0,1 og bætt við 500 ng/ml aTc, 0,05 mM IPTG og 0,1 g/l L-tryptófan að lokarúmmáli 5 ml. Sýni var tekið af 300 l af ræktunarefni og skilið í skilvindu við 14 000 snúninga á mínútu í 5 mínútur til að fá frumukúlu fyrir HPLC greiningu, og 300 l af ræktunarmiðli voru teknir fyrir RNA útdrátt.

HPLC greining

Til greiningar á víólasíni lífgerviferla var frumukillan endursviflaus í {{0}} rúmmálsmetanóli, hljóðlátin í 5 mínútur, skilin í skilvindu og síuð í gegnum 0.22-m nylonsíu. HPLC greining fylgdi aðferð (42) með Poroshell 120 EC-C18, 4,6 × 150 mm, 4 m súlu (Agilent). Tveir hreyfanlegir fasar, A með 0,1% maurasýru í DDW og B með 0,1% maurasýru í asetónítríli, voru notaðir með flæðihraða 0,6 ml/mín með eftirfarandi hallasniði: 95% A í 1,5 mín, rampur A frá 95 % í 2% í 4 mín, halda 2% A í 2 mín, hækka A úr 2% í 95% í 30 sekúndur og halda 95% A í 10 mín. Sýni voru greind með því að nota PDA skynjara og HPLC svæðið var ákvarðað við 600 nm fyrir violacein og 610 nm fyrir prodeoxyviolacein.

Lýkópenframleiðsla og sýnataka

Til framleiðslu á lýkópeni var eftirfarandi miðilssamsetning notuð: 13,56 g/l Na2HPO4,6g/l KH2PO4,2g NH4Cl, 1 g NaCl, 2 ml af 1 M MgSO4, 0,1 ml af 1 M CaCl2 og 4 g/l af glúkósa (22). Notuð voru 27 g/ml klóramfenikól og 50 g/ml spectinomycin. Ræktunarmiðill yfir nótt var endurnýjaður í OD600 af 0.1 í endanlegt rúmmál 5 ml. Þegar OD600 náði á milli 0,5 og 0,6 var aTc bætt við lokastyrkinn 500 ng/ml og þegar OD600 náði á milli 0,9 og 1 var IPTG bætt við lokastyrkinn 0,02 mM. Lycopene var dregið út með asetoni, eins og lýst er í tilvísuninni (22). Styrkur lycopene var fenginn úr gleypni við 475 nm með því að nota Jenway 7300 litrófsmæli með því að nota staðlaðan feril. Sýni var tekið af 300 l af ræktunarmiðli til RNA-útdráttar.

cistanche ávinningur fyrir karla styrkir ónæmiskerfið

NIÐURSTÖÐUR OG UMRÆÐUR

Áhrif stökkbreytinga í sgRNA á bælingarvirkni CRISPR kerfisins

CRISPRi kerfið getur bælt genatjáningu þegar dCas9–sgRNA–DNA þríhliða fléttan binst sterklega saman. Við gerðum þá tilgátu að hægt væri að breyta bælingarvirkni CRISPRi kerfisins í ákveðið stig með því að breyta RNP flóknu mynduninni. Til að mæla kúgunarvirkni CRISPR kerfisins, hönnuðum við flúrljómunarskýrslukerfi sem byggir á erfðarásinni þar sem dCas9 frá S. pyogenes er framkallað af anhýdrótetracýklíni (aTc), og bæði fréttagenið (mCherry) og sgRNA afbrigði eru mynduð (mynd 1A). Þegar aTc hefur verið bætt við miðilinn, hindrar dCas9–sgRNA– DNA þrískiptur flókið umritun á reporter geninu og flúrljómunarstigið sýnir öfugt bælingarvirkni CRISPR kerfisins. sgRNA inniheldur 96 núkleótíð (nts) alls. Spacer svæðið (fyrstu 20 nts) binst við mark DNA röðinni og hin 76 nts stuðla að flóknu myndun og stöðugleika. Þar sem ósamræmi á spacer svæðinu getur tapað sérhæfni og aukið áhrif utan markhóps í CRISPR byggt kerfi (33,43), er hámarkslengd sgRNA sem hægt er að móta 76 nts. Í þessu tilviki ætti að fá bókasafnsstærð 476 (u.þ.b. 1045) en það er of stórt til að hægt sé að smíða það. Þess vegna er nauðsynlegt að þrengja stærð safnsins með því að ákvarða sérstakar stöður á sgRNA. Við könnuðum fyrst hvernig stökkbreytingar í sgRNA á hverju svæði hafa áhrif á bælinguna í CRISPR kerfinu. Fyrri rannsókn greindi frá því að stökkbreytingar í stofn-lykkju 1 (sg mut01 og sg mut02) leiddu til marktækrar minnkunar á kjarnavirkni Cas9, en stökkbreytingar í stofn-lykkju 2 (sg mut03) eða stofn-lykkju 3 (sg) mut04) hafði ekki áhrif á virkni þess (44). Endurbyggt sgRNA (sg mut05) sem inniheldur stökkbreytingar á stofn-lykkju 1 svæðinu og endurtekningu, tetraloop, and-repeat og stilk-loop 2 svæði minnkaði einnig núkleasavirkni (44). Hins vegar, í CRISPRi kerfinu, höfðu öll fimm sgRNA afbrigði lítil áhrif á bælingarvirkni samanborið við villigerð sgRNA (sg WT), þar sem hvert afbrigði sýndi 2-4% flúrljómun miðað við jákvæða samanburðinn án spacer svæði ( sg PC) (Mynd 1B). Þessar niðurstöður benda til þess að myndun dCas9–sgRNA fléttunnar sé minna næm fyrir raðbreytingum á stofnlykkja 1 svæðinu í CRISPRi kerfinu, öfugt við CRISPR/Cas9 kerfið. Við gerðum þá tilgátu að það að fjarlægja svæði sem tengjast stöðugleika fléttunnar geti verið upphafspunktur til að stjórna tjáningu á mörgum stigum frekar. Í þessu skyni bjuggum við til stytt sgRNA (sg trcSL1) sem vantaði tengilinn, stilk-lykkju 2 og stilk-lykkju 3. Þetta stytta sgRNA hefur lágmarksfjölda þátta og sýnt hefur verið fram á að það dregur verulega úr núkleasavirkni í CRISPR/ Cas9 kerfi (5,44). Þegar það var prófað í CRISPRi kerfinu sýndi þetta gallaða stökkbrigði 8% flúrljómunarstig miðað við sg PC, sem bendir til þess að það gæti samt tengst dCas9 og bælt genið sem vekur áhuga á ákveðnu stigi, jafnvel með minnkaðri þrískiptingu stöðugleika (Mynd 1B). Byggingargreiningin á RNP-fléttunni bendir til þess að tengi-, stofn-lykkja 2 og stofn-lykkja 3 svæði sgRNA séu ábyrg fyrir því að koma á stöðugleika í fléttunni með samskiptum sínum við kjarnasvæði dCas9, sem leiðir til verulegrar lækkunar á indel skilvirkni í CRISPR/Cas9 kerfinu (44). Aftur á móti hafa endurtekningar: gegn endurtekningarsvæði og stofnlykkja 1 af sgRNA aðallega samskipti við viðurkenningarlén og PAM-víxlverkandi svæði dCas9 og hafa ekki marktæk áhrif á indel skilvirkni í CRISPR/Cas9 kerfinu (44). Þessi niðurstaða styður þá athugun að sg trcSL1 sýndi marktæka minnkun á núkleasavirkni í CRISPR/Cas9 kerfinu en hafði aðeins lítilsháttar áhrif á bindishækni í CRISPRi kerfinu.

Mynd 1. Kerfisbygging og áhrif á kúgunarvirkni með sgRNA stökkbreytingu. (A) Tvö plasmíðkerfi til að magngreina kúgunarskilvirkni. Eitt plasmíð með p15A uppruna inniheldur dCas9 genið undir aTc-örvandi hvata og mCherry genið undir stofnandi stuðla. Hitt plasmíðið með cloDF13 uppruna inniheldur villigerð eða stökkbreytt sgRNA undir stofnandi virkni. (B) Hlutfallsleg flúrljómun hvers sgRNA stökkbrigðis (sg mut01 ~ sg mut05 og sg trcSL1) og sg WT samanborið við sg PC. +1 til + 20 eru spacer röðin sem binst mCherry geninu. sg PC: sgRNA án spacer sem jákvæður samanburður, sg WT: villigerð sgRNA. Villustikur gefa til kynna staðalfrávik (n=3). P-gildi voru ákvörðuð með óparuðu t-prófi. ns: ekki marktækur, **Bls< 0.01

Breyta skilvirkni flókinna myndunar fyrir tjáningarstýringu á mörgum stigum

Tetraloop er gervi tengill sem tengir crRNA og tracrRNA í CRISPR-Cas9 kerfinu (5). Kristalbygging þrískiptingarinnar, sem samanstendur af dCas9, crRNA og tracrRNA, hefur sýnt að tetraloop og 5 og 3 hliðarsvæði hennar hafa litla snertingu við dCas9 (44). Á sama tíma eru endurtekningar: andstæðingur-endurtaka og stilkur-lykkja 1 svæði mikilvæg fyrir starfræna flókið (44). Þar sem það hefur ekki bein samskipti við dCas9, hefur tetraloopið og hliðarsvæði þess verið könnuð sem hugsanlegir staðir til að þróa sgRNA með viðbótarþáttum, svo sem að innlima aptamer raðir til að ráða fleiri prótein í sgRNA (45,46). Það er líklegt að stökkbreytingar á þessu svæði gætu aukið fjölbreytni í bindishækni milli sgRNA og dCas9 án þess að trufla flókið algjörlega. 12- mer handahófssafn (4 nt af tetraloop svæðinu og 4 nt af 5 og 3 hliðarsvæðum, í sömu röð) var smíðað með því að nota sg trcSL1 sem sniðmát til að lækka enn frekar skilvirkni fléttumyndunar milli sgRNA og dCas9 (Mynd 2A ). Við beittum tveggja þrepa flokkunaraðferð til að fá ýmis sgRNA stökkbrigði sem ná yfir bælingarvirkni milli sg WT (fullkomlega bæla ástand) og sg PC (ekki bæla ástand). Við skiptum upprunalega safninu í smærri söfn með mismunandi styrkleikasvið flúrljómunar og auðkenndum síðan hver fyrir sig flúrljómun hvers sgRNA afbrigðis úr minni safninu. Flúrljómunardreifing upprunalega safnsins sem fæst með frumuflæðismælingu var næstum eins og sg PC (mynd 2B). Hins vegar, eftir þrjú flokkunarskref í röð, hafði hvert safn (hátt, miðlungs og lágt) 63%, 24% og 14% miðgildi flúrljómunarmagns samanborið við sg PC, í sömu röð (Mynd 2B). Áttatíu og tvær nýlendur voru einangraðar úr þessum smærri söfnum, með flúrljómun á bilinu 8% til 104% (Mynd 2C). Þessar niðurstöður benda til þess að stökkbreytt tetraloop og hliðarsvæði þess í sgRNA getur stýrt bindandi sækni milli dCas9 og sgRNA fyrir ýmsa bælingarvirkni. Reverse-umscription quantitative PCR (RT-qPCR) greining á 10 sgRNA stökkbreyttum (sg trcSL1c1–sg trcSL1c10, viðbótartafla S6) með ýmsum flúrljómunarmerkjum milli sg WT og sg PC meðal 82 sgRNA þyrpinga sýndi að flúrskýring jókst með auknu magni flúrskýringa. , sem gefur til kynna að CRISPRi kerfið okkar stjórnar genatjáningu á umritunarstigi (viðbótarmynd S2). Stillanlegt CRISPRi kerfið okkar notar hannað sgRNA, sem getur náð allt að 45-faldri kúgunarstýringu, sem gerir kleift að fínstilla kúgunarvirknina án þess að breyta magni dCas9 eða sgRNA. Athyglisverður kostur við kerfið okkar er að það getur fínstillt bælingarvirkni með sérstökum sgRNA afbrigðum án þess að það geti haft ófyrirséðar afleiðingar, jafnvel þó að frekari klónun sé nauðsynleg. Þar að auki bendir vaxtarferillinn til að kerfið okkar leggi ekki á sig verulega frumuálag (viðbótarmynd S3). Ennfremur sýndi RNA-Seq á þremur sg trcSL1 afbrigðum með mismunandi stigum kúgunarvirkni að tjáning 51 til 83 gena var breytt, öfugt við 262 genin sem breyttust í sg WT (viðbótarmynd S4). Þessar niðurstöður benda til þess að sg trcSL1 afbrigðin hafi jafnvel minni áhrif utan miða en hefðbundið CRISPRi kerfið. Það er sérstaklega viðeigandi í efnaskiptaverkfræðiforritum, þar sem hagræðing efnaskiptaferla felur oft í sér meðferð margra gena. Hæfni til að fínstilla tjáningu gena án þess að valda neikvæðum aukaverkunum getur hraðað hagræðingarferlinu verulega og bætt heildar skilvirkni og framleiðni kerfisins.

Mynd 2. Uppbygging sgRNA safnsins og skimun safnsins. (A) sgRNA vinnupallur notaður í þessari rannsókn. 12-mer sem inniheldur tetraloop og hliðarröð hennar er stökkbreytt af handahófi úr sg trcSL1 til að fá sgRNA safn. (B) Flúrljómunardreifing fengin úr frumuflæðismælingu fyrir (vinstri) og eftir (hægri) flokkun. Hver dreifing inniheldur 100,000 frumur. (C) Flúrljómun einstakra nýlendna fengnar úr (B). Villustikur gefa til kynna staðalfrávik (n=2).

Áhrif magns dCas9 og sgRNA á kúgunarvirkni

Þar sem að breyta magni annaðhvort dCas9 eða sgRNA gæti breytt bælingarvirkni CRISPRi kerfisins (23,24), er nauðsynlegt að kanna áhrif dCas9 og sgRNA magns á kúgunarvirkni. Við prófuðum frammistöðu kerfisins okkar við mismunandi aðstæður með því að breyta magni dCas9 og sgRNA með því að nota tíu sgRNA stökkbrigði (sg trcSL1c1–sg trcSL1c10). Þrír mismunandi styrkir (20, 100 og 500 ng/ml) af hvatanum voru notaðir fyrir dCas9 tjáningu. Í samanburði við dCas9 mRNA gildi þegar 20 ng/ml af hvata var notað, var það aukið enn frekar um 15-falt (100 ng/ml) og 22-falt (500 ng/ml) (viðbótarmynd S5A) ). Það eru áhyggjur af oftjáningu dCas9 þar sem hátt magn dCas9 gæti verið eitrað fyrir frumur (47,48) eða stundum ekki (49). Hins vegar minnkaði vaxtarhraðinn um minna en 10% þegar allt að 500 ng/ml af aTc var notað, samkvæmt vaxtarferlum við mismunandi styrkleika hvata (viðbótarmynd S6). Þetta bendir til þess að magn dCas9 hafi ekki haft eituráhrif á E. coli við prófunaraðstæður. Kúgunarvirkni var lítillega breytt þegar mismunandi magn dCas9 var gefið upp (mynd 3A). Það var í samræmi við fyrri rannsókn að CRISPRi kerfið náði hámarks kúgunarvirkni við [aTc]< 5 ng/ml when the same replication origin and promoter were used for the expression of CRISPRi components (24). We set the inducer concentration to 500 ng/ml to sufficiently supply dCas9 for further applications such as multiple gene regulation. The property that our system is less sensitive to the amount of dCas9 has advantages over the strategy of adjusting inducer concentration, as the dose-dependent induction of dCas9 might be varied due to the promoters, plasmid copy numbers, or host strains (50–53). Additionally, using CRISPR-based systems allows for the simultaneous targeting of multiple genes for editing or repression, making it an effective tool for multiplexing gene regulation (54). Our tunable CRISPRi system allows for the precise modulation of repression efficiency through sgRNA variants. With this approach, it would be possible to target multiple genes with varying levels of repression simultaneously. The previous study reported that stronger promoters for sgRNA expression lead to higher repression efficiency (24). To investigate the effect of the amount of sgRNA on repression efficiency in our system, two different promoters having different strengths were used (BBa J23100; J23100 and BBa K2753055; UPJ23119). Promoter UPJ23119 contains a UP element that interacts with E. coli RNA polymerase and expresses 16-fold more transcript than J23100 (55). However, the exact fold change may vary depending on the plasmids, genes, and host strains used. Our results showed that UPJ23119 doubled sgRNA expression in our system and had higher repression efficiency (Figure 3B and Supplementary Figure S5B). These results suggest that adjusting the amount of sgRNA can further expand the dynamic range of multi-level expression and provide precise modulation of repression efficiency.

Mynd 3. Einkenni og einingakerfi stillanlega CRISPRI kerfisins. (A) Hlutfallsleg flúrljómun við mismunandi aTc styrk (20, 100 og 500 ng/ml). (B) Hlutfallsleg flúrljómun undir mismunandi forvöldum (J23100 og UPJ23119). (C) Hlutfallsleg flúrljómun undir mismunandi protospacers. X-ásinn gefur til kynna hlutfallslega flúrljómun mCherry og y-ásinn gefur til kynna hlutfallslega flúrljómun lacI33-mCherry (rautt) og araC33-mCherry (blátt). 33 bp af viðbótarröðum frá lacI og araC var bætt við 5-enda mCherry (56). (D) Frjáls orka 12-mer og hlutfallsleg flúrljómun. Striklaðar línur gefa til kynna 95% spábil og heilar línur gefa til kynna aðhvarfslínu. Ekki var hægt að fá dG gildi sg trcSL1c2 með því að nota mFold og því útilokað frá greiningunni. (A–D) Allar villustikur gefa til kynna staðalfrávik (n=3).

Einingaeining stillanlegs CRISPRI kerfis

Nálgun okkar með því að nota sértæk sgRNA afbrigði til að viðhalda ákveðnu tjáningarstigi fyrir mark-DNA getur verið notað sem einingakerfi. Til að sýna fram á hagkvæmni stillanlegs CRISPRi kerfis til að miða á mismunandi frumrými, smíðuðum við tvö samrunargen (lacI{{0}}mCherry og araC33-mCherry) með því að bæta við 33 bps af raðir úr lacI og araC til 5 -enda mCherry (56). Erfðamengi E. coli BL21(DE3) (GenBank: CP001509.3) inniheldur tvö eintök af frumrýmisröðinni fyrir lacI33- mCherry og eitt eintak fyrir araC33-mCherry. Hins vegar hafa þessar litningaraðir ekki PAM raðir og því er ekki hægt að miða þær við dCas9-sgRNA flókið (43). Þegar siRNA voru hönnuð til að miða á hvert frumrými, var bælingarvirkni stöðugt viðhaldið fyrir öll frumrými frá lacI33, araC33 og mCherry (Mynd 3C). Þessar niðurstöður benda til þess að stillanlegt CRISPRi kerfi okkar geti í raun stjórnað genatjáningu á ákveðnu stigi óháð frumrúmaröðinni. Ein hugsanleg skýring á því sambandi sem sést á milli RNP-flókamyndunar og kúgunarhagkvæmni er breytingin á frjálsri orku þegar fléttan myndast. Gervi tetraloop tengilinn og hliðarsvæði hans innihalda tvö A: U og G: C Watson-Crick basapör og A: G non-Watson-Crick basapör (44). Þar sem binding crRNA og tracrRNA skiptir sköpum fyrir flókna myndunina, myndu stökkbreytingar sem miða á tetraloop hafa áhrif á bindandi sækni milli dCas9 og sgRNA. Þessa sækni er hægt að reikna út frá frjálsri orkumismun á afmörkuðu og óbundnu ástandi. Hins vegar er krefjandi að reikna fríorku afmörkuðum ríkjum (57). Við gerðum ráð fyrir að heildarbygging og stöðugleiki hins afmarkaða ástands breytist ekki þar sem sgRNA flokkuð úr safninu trufluðu ekki að öllu leyti virkni þess. Þar að auki, tetraloop og hliðarsvæði hennar hafa litla snertingu við dCas9 (44). Þess vegna yrði bindisækni milli dCas9 og sgRNA aðallega fyrir áhrifum af stöðugleika efri uppbyggingu tetraloopsins og hliðarröð hennar. Á grundvelli þessarar hugmyndar reiknuðum við út ókeypis orku tetraloopsins og hliðarröð hennar með því að nota mold (58). Mismunur á frjálsri orku við fellingu vegna stökkbreytinganna er skilgreindur sem munurinn á frjálsri orku stökkbreyttu og villigerðarröðanna. Það væri hægt að reikna það beint út frá frjálsri samfelluorku stökkbreyttra þar sem fellingarorka villigerðarröðarinnar er stöðug við -4,3 kcal/mól. Þegar frjáls orka við að brjóta saman jókst flúrljómunarmerkið (Mynd 3D). Bælingarvirkni var mest þegar fellingarorka svæðisins sem inniheldur tetraloop var nálægt eða undir 0 kcal/mól og minnkaði línulega eftir því sem fellingarorkan fór yfir 0 kcal/mól. Þessi athugun bendir til þess að skilvirkni fléttumyndunar milli dCas9 og sgRNA sé ákvörðuð af aukabyggingu tetraloop svæðisins, sem hjálpar til við að útskýra einingakerfi kerfisins okkar. Bælingarvirkni 85 sgRNA til viðbótar með mismunandi 12-mer raðir úr safninu var mæld til að sannreyna þetta samband frekar. Það sýndi einnig fylgni sem sést frá sg trcSL1 afbrigðum (Mynd 3D og viðbótartafla S7), sem bendir til þess að tetraloop tengilinn gegni mikilvægu hlutverki við að mynda RNP flókið og að stökkbreytingar á þessu svæði geti haft áhrif á skilvirkni CRISPR kerfisins. Að auki sýnir þessi tengsl möguleikann á tölvutengdri hönnun sgRNA afbrigða með æskilegri kúgun.

Notkun stillanlegs CRISPRi kerfis fyrir flæðisendurdreifingu í lífmyndunarferli violacein í E. coli

Redistributing the metabolic flux is an important process in metabolic engineering to maximize the yield of target products (59,60). Because our system could precisely control gene expression by targeting any protospacer, we chose the violacein biosynthetic pathway as a model system for pathway redistribution. Violacein is an indole derivative compound that exhibits a deep purple color, originally produced by Chromobacterium violaceum (Figure 4A) (61). This compound is synthesized from L-tryptophan by five enzymes encoded by vioA, vioB, vioE, vioD, and vioC (62). Along with violacein (V), other indole derivatives such as proviolacein (PV), deoxyviolacein (DV), and prodeoxyviolacein (PDV) with different colors can also be produced (Figure 4A) (62). The production of violacein and deoxy violacein is an enzymatic process mediated by vioC, while the production of PV and PDV is a non-enzymatic process. We expressed the violacein biosynthetic pathway under the IPTG inducible promoter (63), and different trcSL1 variants were designed to target vioD to redirect the flux. It could effectively modulate the expression of vioD at the transcriptional level (Figure 4B). vioC was repressed by sg WT and showed high variation (Supplementary Figure S7), but the absolute copy number was kept at low levels (>100-falt) samanborið við önnur gen þegar þau eru reiknuð út frá stöðluðum ferlum. Aftur á móti hélst tjáning annarra óstýrðra ensíma í violacein ferlinu (vioA, vioB og vioE) óbreytt. Þessar niðurstöður benda til þess að kerfið okkar geti sérstaklega miðað á og stillt tjáningu einstakra gena án þess að hafa áhrif á önnur gen í brautinni. Bein magngreining á PV og PDV var ekki möguleg vegna skorts á stöðlum sem eru fáanlegir í viðskiptum fyrir HPLC greiningu. Þannig mældum við títrana í handahófskenndum einingum með því að nota HPLC toppsvæðið. Títur vörunnar náði hámarki 8 klst. eftir örvun og minnkaði síðan smám saman (viðbótarmynd S8), hugsanlega vegna umbreytingar vörunnar í aðrar aukaafurðir, eins og chromoviridans, með óþekktum aðferð (42,64). Minniháttar toppar sem komu fram á HPLC litrófinu gáfu til kynna tilvist viðbótar minniháttar aukaafurða. Fyrri rannsóknir hafa sýnt fram á að hægt væri að spá fyrir um logaritma títra hverrar afurðar í handahófskenndum einingum með línulegum samsetningum styrkleika hvata hvers gena sem tekur þátt í víólasín lífmyndunarferlinu (42). Þetta log-línulega aðhvarfslíkan var einnig gilt í kerfinu okkar og aukin vioD afrit tengdust aukinni PV framleiðslu (Mynd 4B). Það er vitað að það að móta hvata eða 5 -UTR hvers gena sem tekur þátt í lífmyndunarferli violacein gerði kleift að endurdreifa flæði og fínstillingu ferla (65,66). Kerfið okkar gæti virkað sem önnur aðferð sem sýnir umritunarstýringuna án þess að vinna með hvata sem taka þátt í ferlinu með því að nota tilbúið sgRNA, sem eru stutt og hægt er að setja saman með eins skrefs aðferðum. Skimun í gegnum stillanlega CRISPRi kerfið gerir það mögulegt að beina leiðinni með fyrirsjáanlegu flæði áður en beinlínis er stjórnað hýsilstofnum eða genasnældum, sem hugsanlega flýtir fyrir ferlinu.

Notkun stillanlega CRISPRi kerfisins til að jafna kolefnisflæði í lycopenframleiðandi E. coli

Skilvirk framleiðsla verðmætra efnasambanda í efnaskiptaverkfræði krefst jafnvægis á kolefnisflæðinu. Metýlerýtrítól 4-fosfat (MEP) ferillinn er efnaskiptaferill sem notar einfalda forvera eins og pýrúvat og glýseraldehýð 3-fosfat (GAP) til að framleiða ísóprenoid byggingareiningar, dímetýlallylpýrófosfat og ísopentenýlpýrófosfat (67,68) . Þessar sameindir mynda geranýl pýrófosfat, sem er breytt í farnesýl pýrófosfat (FPP) (67,68). Lýkópen, mjög metið karótenóíð með öfluga andoxunareiginleika og fjölbreytta notkun í ýmsum atvinnugreinum (69), er myndað úr FPP með röð ensímhvarfa frá crtE, crtB og crtI (Mynd 4C) (22,70). GAP forverinn er nauðsynlegur ekki aðeins fyrir MEP leiðina heldur einnig fyrir glýkólýsuleiðina (22). Sýnt hefur verið fram á að minnkað tjáning gapA gensins, sem kóðar glýseraldehýð-3-fosfat dehýdrógenasa (GAPDH) í glýkólýsuleiðinni, eykur lycopenframleiðslu með því að auka GAP safnið (22). Þess vegna miðuðum við á gapA með fimm afbrigðum, þar á meðal þremur sg trcSL1 afbrigðum (sg trcSL1c2, sg trcSL1c5 og sg trcSL1c6) sem sýndu ýmsa kúgunarvirkni, sg PC og sg WT. Hins vegar er gapA nauðsynlegt gen sem ekki er hægt að slá alveg niður (71,72). Tilraunir til að bæla niður gapA með hefðbundnum CRISPRi með því að nota sg WT báru ekki árangur, jafnvel með litlum leka dcas9 undir tet promoter (73). Á hinn bóginn náðist margþætta bæling á tjáningu gapA gena með því að nota stillanlega CRISPRi kerfið án vaxtargalla og leiddi til 2.7-faldrar aukningar með sg trcSL1c6 í framleiðslu lycopene samanborið við stofn sem tjáir gapA gen að fullu. eftir 15 klst af ræktun (Mynd 4D og viðbótarmynd S9). Greint var frá því að aðeins 10% af náttúrulegri tjáningu gapA gensins leiði til aukins hóps GAP án marktækrar breytingar á niðurstreymis umbrotsefnum í glýkólýsuferlinu, eins og 2-fosfóglýserat og 3-fosfóglýserat ( 22). Samanlagt sýna þessar niðurstöður að stillanleg CRISPRi getur nákvæmlega bælt genatjáningu á mörgum stigum án litningatækni.

Mynd 4. Notkun stillanlegs CRISPRi kerfis fyrir violacein biosynthetic ferli. (A) Violacein lífmyndunarferill og plasmíðbyggingin. Fimm gen (vioA, vioB, vioC, vioD og vioE) sem bera ábyrgð á að framleiða violacein voru klónuð inn í dCas9-tjáandi plasmíð. Fjórar helstu vörur (violacein, proviolacein, deoxyviolacein og prodeoxyviolacein) eru framleiddar. sg WT fyrir vioC og fimm sg trcSL1 afbrigði (sg trcSL1c2, sg trcSL1c5, sg trcSL1c6, sg trcSL1c8 og sg trcSL1c9) fyrir vioD, sem sýndu mismunandi bælingarvirkni, voru klónuð inn í hitt plasmíðið. Trp: L-tryptófan, V: víólasín, PV: próvíólasín, PDV: pródeoxývíólasín, DV: deoxývíólasín, PDVA: prótódeoxýfjólusínsýra, PVA: prótófjólasínsýra. (B) Tengsl milli vioD afrita, mCherry flúrljómun og titer PDV og PV. X-ásinn gefur til kynna hlutfallslegt vioD RNA sem fæst úr RT-qPCR, y-ásinn til vinstri gefur til kynna hlutfallslega mCherry flúrljómun frá mynd 3 og y-ásinn hægra megin sýnir hlutfall HPLC svæðisins. Sýni með hæsta vioD RNA gildið voru stillt á 100% til að staðla. (C) Lýkópen lífmyndunarferill og plasmíðbyggingin. Þrjú gen (crtE, crtB, crtI) sem bera ábyrgð á að framleiða lycopene voru klónuð inn í dCas9-tjáandi plasmíð. gapA var miðað við sg trcSL1 afbrigði (sg trcSL1c2, sg trcSL1c5, sg trcSL1c6) og sg PC var klónað inn í hitt plasmíðið. Glc: Glúkósa, GAP: glýseraldehýð 3-fosfat, 1,3-BPG: 1,3-bisfosfóglýserat, DMAPP: dímetýlalýlpýrófosfat, IPP: ísopentenýlpýrófosfat, FPP: farnesýlpýrófosfat. (D) Tengsl milli gapA afrita, mCherry flúrljómunar og lycopene framleiðslu. X-ásinn gefur til kynna hlutfallslegt bil RNA sem fæst úr RT-qPCR, y-ásinn til vinstri gefur til kynna hlutfallslega mCherry flúrljómun frá mynd 3 og y-ásinn hægra megin sýnir titer lycopene. (B, D) Allar villustikur gefa til kynna staðalfrávik (n=3).

NIÐURSTAÐA

Við hönnuðum stillanlegt CRISPRi kerfi sem gæti nákvæmlega stjórnað genatjáningu á æskilegu stigi. Með því að stökkbreyta fjórhyrningunni og hliðarsvæði hennar gætu tilbúið sgRNA sem miða á ýmsar frumrýmisraðir stjórnað geninu á ákveðnu stigi. Við beittum þessu kerfi með góðum árangri til að beina áhugaverðum efnaskiptaflæði í víólasín lífmyndunarferlinu til að framleiða indólafleiður í fyrirsjáanlegu hlutfalli. Að auki höfum við sýnt fram á að notkun stillanlegs CRISPRi leiddi til 2.7-faldrar aukningar á lycopene framleiðslu, sem undirstrikar fjölhæfni kerfisins okkar til að bæta framleiðslu annarra verðmætra efnasambanda. Þetta kerfi myndi flýta fyrir hagræðingarferlunum fyrir flæði áður en varanlegt er meðhöndlað erfðafræðilegar upplýsingar hýsils, eins og að skipta um boðefni eða 5-UTR raðir.

cistanche tubulosa-bæta ónæmiskerfið

HEIMILDIR

1. Sapranauskas, R., Gasiunas, G., Fremaux, C., Barrangou, R., Horvath, P. og Siksnys,V. (2011) Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas kerfið veitir ónæmi í Escherichia coli. Nucleic Acids Res., 39, 9275-9282.

2. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P. og Siksnys,V. (2012) Cas9-crRNA ríbonucleoprotein flókið miðlar sértækri DNA klofningu fyrir aðlögunarónæmi í bakteríum. Frv. Natl. Acad. Sci. Bandaríkin, 109, E2579–E2586.

3. Cong, L., Ran, FA, Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., Hsu, PD, Wu, X., Jiang, W., Marraffini, LA o.fl. . (2013) Multiplex erfðamengi verkfræði með CRISPR/Cas kerfum. Vísindi, 339, 819–823.

4. Ran, FA, Hsu, PD, Wright, J., Agarwala, V., Scott, DA og Zhang, F. (2013) Erfðamengisverkfræði með CRISPR-Cas9 kerfinu. Nat. Protoc., 8, 2281–2308.

5. Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, JA og Charpentier, E. (2012) Forritanlegur tvískiptur-RNA-stýrður DNA innkirtla í aðlögunarhæfni bakteríuónæmis. Vísindi, 337, 816–821.

6. Anders, C., Niewoehner, O., Duerst, A. og Jinek, M. (2014) Uppbyggingargrundvöllur PAM-háðrar mark-DNA viðurkenningar með Cas9 endónukleasa. Náttúra, 513, 569–573.

7. Qi, LS, Larson, MH, Gilbert, LA, Doudna, JA, Weissman, JS, Arkin, AP og Lim, WA (2013) Að endurnýta CRISPR sem RNA-stýrðan vettvang fyrir raðsértæka stjórn á genatjáningu. Cell, 152, 1173–1183.

8. Larson, MH, Gilbert, LA, Wang, X., Lim, WA, Weissman, JS og Qi, LS (2013) CRISPR truflun (CRISPRi) fyrir raðsértæka stjórn á genatjáningu. Nat. Protoc., 8, 2180–2196.

9. McGlincy, NJ, Meacham, ZA, Reynaud, KK, Muller, R., Baum, R. og Ingolia, NT (2021) CRISPR truflunarleiðbeiningarsafn á erfðamengiskvarða gerir yfirgripsmikla svipgerðagreiningu í ger. BMC Genomics, 22, 205.

10. Yoon, J. og Woo, HM (2018) CRISPR truflun-miðluð efnaskiptaverkfræði Corynebacterium glutamicum fyrir hómó-bútýrat framleiðslu. Líftækni. Bioeng., 115, 2067–2074.

11. Cleto, S., Jensen, JV, Wendisch, VF og Lu,TK (2016) Corynebacterium glutamicum efnaskiptaverkfræði með CRISPR truflun (CRISPRi). ACS Synth. Biol., 5, 375-385.

12. Zhang,GQ, Ren,XN, Liang,XH, Wang,YQ, Feng,DX, Zhang,YJ, Xian,M. og Zou, HB (2021) Að bæta örveruframleiðslu amínósýra: frá hefðbundnum aðferðum til nýlegra strauma. Líftækni. Bioproc. E, 26, 708–727.

13. Kim, SK, Seong, W., Han, GH, Lee, DH og Lee, SG (2017) CRISPR truflun-stýrð multiplex bælingu á innrænum keppandi genum til að beina efnaskiptaflæði í Escherichia coli. Örvera. Cell Fact., 16, 188.

14. Ellis, NA, Kim, B., Tung, J. og Machner, MP (2021) Multiplex CRISPR truflun tól fyrir meinvirkni gen spurnar í Legionella pneumophila. Samfélag. Biol., 4, 157.

15. Siu,KH og Chen,W. (2019) Ríbóstýrt táhaldsstýrt gRNA fyrir forritanlega CRISPR-Cas9 virkni. Nat. Chem. Biol., 15, 217–220.

16. Reis, AC, Halper, SM, Vezeau, GE, Cetnar, DP, Hossain, A., Clauer, PR og Salis, HM (2019) Samtímis bælingu margra bakteríugena með því að nota óendurteknar extra langar sgRNA fylki. Nat. Líftækni, 37, 1294-1301.

17. Tian,T., Kang,JW, Kang,A. og Lee, TS (2019) Að beina efnaskiptaflæði með combinatorial multiplex CRISPRi-miðlaðri bælingu fyrir ísopentenólframleiðslu í Escherichia coli. ACS Synth. Biol., 8, 391-402.

18. Gauttam, R., Seibold, GM, Mueller, P., Weil, T., Weiss, T., Handrick, R. og Eikmanns, BJ (2019) Einfalt tvíframkallanlegt CRISPR truflunarkerfi fyrir miðun á margfeldi gena í Corynebacterium glutamicum. Plasmíð, 103, 25–35.

19. Yao, L., Cengic, I., Anfelt, J. og Hudson, EP (2016) Margfeldi genabæling í blábakteríum með því að nota CRISPRi. Acs Synth. Biol., 5, 207–212.

20. Lim,HG, Noh,MH, Jeong,JH, Park,S. og Jung, GY (2016) Besta endurjafnvægi á 3-hýdroxýprópíónsýru framleiðsluferli frá glýseróli í Escherichia coli. ACS Synth. Biol., 5, 1247-1255.

21. Yang, Y., Lin, Y., Li, L., Linhardt, RJ og Yan, Y. (2015) Að stjórna malonyl-CoA umbrotum með tilbúnum andsense RNA til að auka nýmyndun náttúrulegra vara. Metab. Eng., 29, 217–226.

22. Jung, J., Lim, JH, Kim, SY, Im, DK, Seok, JY, Lee, SV, Oh, MK og Jung, GY (2016) Nákvæm forvera endurjafnvægi fyrir framleiðslu ísóprenóíða með fínlegri stjórn á tjáningu gapA í Escherichia coli. Metab. Eng., 38, 401–408.

23. Li,XT, Jun,Y., Erickstad,MJ, Brown,SD, Parks,A., Court,DL og Jun,S. (2016) tCRISPRI: stillanleg og afturkræf, eins skrefs stjórn á tjáningu gena. Sci. Rep., 6, 39076.

24. Fontana, J., Dong, C., Ham, JY, Zalatan, JG og Carothers, JM (2018) Stýrð tjáning sgRNAs lagar CRISPRi í E. coli. Líftækni. J., 13, e1800069.

25. Kim, NM, Sinnott, RW og Sandoval, NR (2020) Lífskynjarar sem byggjast á umritunarþáttum og framkallanleg kerfi í bakteríum sem ekki eru fyrirmyndir: núverandi framfarir og framtíðarstefnur. Curr. Opin. Líftækni, 64, 39–46.

26. Kundert, K., Lucas, JE, Watters, KE, Fellmann, C., Ng, AH, Heineike, BM, Fitzsimmons, CM, Oakes, BL, Qu, J., Prasad, N. o.fl. (2019) Að stjórna CRISPR-Cas9 með bindilvirkjaðri og bindilvirkjaðri sgRNA. Nat. Commun., 10, 2127.

27. Ferreira, R., Skrekas, C., Hedin, A., Sanchez, BJ, Siewers, V., Nielsen, J. og David, F. (2019) Líkanaðstoðuð fínstilling á miðlægum kolefnisefnaskiptum í geri með dCas9-stýrðri reglugerð. ACS Synth. Biol., 8, 2457-2463.

28. Su,T., Guo,Q., Zheng,Y., Liang,Q., Wang,Q. og Qi,Q. (2019) Fínstilling á hemB með því að nota CRISPRi til að auka 5-amínólevúlínsýruframleiðslu í Escherichia coli. Framan. Microbiol., 10, 1731.

29. Zheng, T., Hou, Y., Zhang, P., Zhang, Z., Xu, Y., Zhang, L., Niu, L., Yang, Y., Liang, D., Yi, F. . o.fl. (2017) Sniðgreining á stakri leiðarvísi RNA sérhæfni sýnir misjafna viðkvæma kjarnaröð. Sci. Rep., 7, 40638.

30. Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F. og Marraffini, LA (2013) RNA-stýrð klippingu á erfðamengi baktería með því að nota CRISPR-Cas kerfi. Nat. Líftækni,

31, 233–239. 31. van Gestel, J., Hawkins, JS, Todor, H. og Gross, CA (2021) Computational leiðsla til að hanna leiðbeiningar RNA fyrir mismatch-CRISPRi. STAR Protoc, 2, 100521.

32. Hawkins, JS, Silvis, MR, Koo, BM, Peters, JM, Osadnik, H., Jost, M., Hearne, CC, Weissman, JS, Todor, H. og Gross, CA (2020) Mismatch-CRISPRi sýnir mismunandi tjáningar- og hæfnitengsl nauðsynlegra gena í Escherichia coli og Bacillus subtilis. Cell Syst., 11, 523–535.

33. Fortin, J.-P., Tan, J., Gascoigne, KE, Haverty, PM, Forrest, WF, Costa, MR og Martin, SE (2019) Margfeldi-gena miðun og misræmisþol geta ruglað greiningu á erfðamengi- breiðir CRISPR skjáir. Genome Biol., 20, 21.

34. Rozen,S. og Skaletsky, H. (2000) Primer3 á WWW fyrir almenna notendur og fyrir forritara líffræðinga. Aðferðir Mol. Biol., 132, 365-386.

35. Zhou, K., Zhou, L., Lim, Q., Zou, R., Stephanopoulos, G. og Too, HP (2011) Ný viðmiðunargen til að mæla umritunarviðbrögð Escherichia coli við oftjáningu próteina með magnbundinni PCR. BMC Mol. Biol., 12, 18.

36. Livak, KJ og Schmittgen, TD (2001) Greining á hlutfallslegum genatjáningargögnum með því að nota rauntíma magn PCR og 2(-Delta Delta C(T)) aðferðina. Aðferðir, 25, 402–408.

37. Andrews, S. (2010) FastQC: Gæðastýringartæki fyrir gögn með mikilli afköst. v0.11.9 útg.

38. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M. og Salzberg, SL (2009) Ofurhröð og minnisvirk samstilling stuttra DNA raða við erfðamengi mannsins. Genome Biol., 10, R25.

39. Danecek, P., Bonfield, JK, Liddle, J., Marshall, J., Ohan, V., Pollard, MO, Whitwham, A., Keane, T., McCarthy, SA, Davies, RM o.fl. (2021) Tólf ára SAMtools og BCFtools. Gigascience, 10, giab008.

40. Trapnell, C., Williams, BA, Pertea, G., Mortazavi, A., Kwan, G., van Baren, MJ, Salzberg, SL, Wold, BJ og Pachter, L. (2010) Uppskriftarsamsetning og magngreining með RNA-Seq leiðir í ljós óskilgreind afrit og ísóformaskipti við frumuaðgreiningu. Nat. Líftækni, 28, 511–515.

41. Trapnell, C., Hendrickson, DG, Sauvageau, M., Goff, L., Rinn, JL og Pachter, L. (2013) Mismunagreining á genastjórnun við umritsupplausn með RNA-seq. Nat. Líftækni, 31, 46–53.

42. Lee, ME, Aswani, A., Han, AS, Tomlin, CJ og Dueber, JE (2013) Fínstilling á tjáningarstigi á fjöl-ensímferli í fjarveru háafkastaprófs. Nucleic Acids Res., 41, 10668-10678.

43. Hsu, PD, Scott, DA, Weinstein, JA, Ran, FA, Konermann, S., Agarwala, V., Li, Y., Fine, EJ, Wu, X., Shalem, O. o.fl. (2013) DNA miðuð sérhæfni RNA-stýrðra Cas9 núkleasa. Nat. Líftækni, 31, 827-832.

44. Nishimasu, H., Ran, F., Hsu, P., Konermann, S., Shehata, S., Dohmae, N., Ishitani, R., Zhang, F. og Nureki,O. (2014) Kristalbygging Cas9 í flóknu með leiðar-RNA og mark-DNA. Cell, 156, 935–949.

45. Fu, Y., Rocha, PP, Luo, VM, Raviram, R., Deng, Y., Mazzoni, EO og Skok, JA (2016) CRISPR-dCas9 og sgRNA vinnupallar gera kleift að mynda tvílita lifandi mynd af gervihnattaröðum og endurtekið auðgað einstakir staðir. Nat. Commun., 7, 11707.

46. ​​Khosravi, S., Schindele, P., Gladilin, E., Dunemann, F., Rutten, T., Puchta, H. og Houben, A. (2020) Notkun Aptamers bætir CRISPR-undirstaða lifandi myndgreiningar á plöntutelómerum. Framan. Plant Sci., 11, 1254.

47. Nielsen, AA og Voigt, CA (2014) Multi-inntak CRISPR/Cas erfðafræðilegar hringrásir sem tengjast hýsingarkerfi. Mol. Syst. Biol., 10, 763.

48. Lee, YJ, Hoynes-O'Connor, A., Leong, MC og Moon, TS (2016) Forritanleg stjórn á tjáningu bakteríugena með 44, 2462-2473.

49. Vigouroux, A., Oldewurtel, E., Cui, L., Bikard, D. og van Teeffelen, S. (2018) Að stilla getu dCas9 til að hindra umritun gerir öflugri, hljóðlausri niðurfellingu á bakteríugenum. Mol. Syst. Biol., 14, e7899.

50. Zhang,Y., Shang,X., Lai,S., Zhang,G., Liang,Y. og Wen,T. (2012) Þróun og beiting arabínósa-framkallanlegs tjáningarkerfis með því að auðvelda upptöku örvunar í Corynebacterium glutamicum. Appl. Umhverfi. Microbiol., 78, 5831-5838.

51. Thompson, MG, Sedaghatian, N., Barajas, JF, Wehrs, M., Bailey, CB, Kaplan, N., Hillson, NJ, Mukhopadhyay, A. og Keasling, JD (2018) Einangrun og lýsing á nýjum stökkbreytingum í uppruna pSC101 sem eykur fjölda eintaka. Sci Rep-UK, 8, 1590. 52. Fricke,PM, Link,T., Gatgens,J., Sonntag,C., Otto,M., Bott,M. og Pólland, T. (2020) Stillanlegt L-arabínósa-örvandi tjáningarplasmíð fyrir ediksýrubakteríuna Gluconobacter oxydans. Appl. Örverur. Biotechnol., 104, 9267-9282.

53. Nguyen,TT, Nguyen,NH, Kim,Y., Kim,JR og Park,S. (2021) In vivo lýsing á framkallanlegu stýrikerfi 3-hýdroxýprópíón dehýdrógenasa í Pseudomonas denitrificans. Biotechnol Bioproc E, 26, 612-620.

54. McCarty, NS, Graham, AE, Studena, L. og Ledesma-Amaro,R. (2020) Margföld CRISPR tækni fyrir genabreytingar og umritunarstjórnun. Nat. Commun., 11, 1281.

55. Yan,Q. og Fong, SS (2017) Rannsókn á in vitro umritunarbindingaráhrifum og hávaða með því að nota samsetta hvata ásamt UP frumefnisröðum í Escherichia coli. J. Biol. Eng., 11, 33.

56. Seo,SW, ​​Yang,JS, Kim,I., Yang,J., Min,BE, Kim,S. og Jung, GY (2013) Forspárhönnun mRNA þýðingar upphafssvæðis til að stjórna skilvirkni dreifkjörnungaþýðinga. Metab. Eng., 15, 67–74. 57. Kappel, K., Jarmoskaite, I., Vaidyanathan, PP, Greenleaf, WJ, Herschlag, D. og Das, R. (2019) Blind próf á RNA-prótein bindandi sækni spá. Frv. Natl. Acad. Sci. Bandaríkin, 116, 8336–8341.

58. Zuker, M. (2003) Mfold vefþjónn fyrir kjarnsýrubrot og kynblöndunarspá. Nucleic Acids Res., 31, 3406-3415.

59. Xiong, B., Zhu, Y., Tian, ​​D., Jiang, S., Fan, X., Ma, Q., Wu, H. og Xie,X. (2021) Flæðisendurdreifing miðlægrar kolefnisefnaskipta fyrir skilvirka framleiðslu á l-tryptófani í Escherichia coli. Líftækni. Bioeng., 118, 1393–1404.

60. Yao, R., Li, J., Feng, L., Zhang, X. og Hu,H. (2019) (13)C efnaskiptaflæðisgreining stýrð efnaskiptaverkfræði Escherichia coli fyrir bætta asetólframleiðslu úr glýseróli. Líftækni. Lífeldsneyti, 12, 29.

61. Duran, N. og Menck, CF (2001) Chromobacterium violaceum: endurskoðun á lyfjafræðilegum og iðnaðarsjónarmiðum. Crit. Séra Microbiol., 27, 201–222.

62. Balibar, CJ og Walsh, CT (2006) In vitro lífmyndun violacein úr L-tryptófani með ensímunum VioA-E frá Chromobacterium violaceum. Lífefnafræði, 45, 15444–15457.

63. Gwon, DA, Seok, JY, Jung, GY og Lee, JW (2021) Lífskynjara-aðstoðað aðlagandi rannsóknarstofu þróun fyrir violacein framleiðslu. Alþj. J. Mol. Sci., 22, 6594.

64. Sanchez, C., Brana, AF, Mendez, C. og Salas, JA (2006) Endurmat á violacein lífmyndunarferlinu og tengslum þess við indólókarbazól lífmyndun. Chem. Bio. Chem., 7, 1231-1240.

65. Jones, JA, Vernacchio, VR, Lachance, DM, Lebovich, M., Fu, L., Shirke, AN, Schultz, VL, Cress, B., Linhardt, RJ og Koffas, MA (2015) ePathOptimize: a samsett nálgun fyrir umritunarjafnvægi á efnaskiptaferlum. Sci. Rep., 5, 11301.

66. Zhang, Y., Chen, H., Zhang, Y., Yin, H., Zhou, C. og Wang,Y. (2021) Direct RBS Engineering of the biosynthetic gen cluster fyrir skilvirka framleiðni violaceins í E. coli. Örvera. Cell Fact., 20, 38.

67. Hunter, WN (2007) The non-mevalonate leið í ísóprenoid forvera lífmyndun. J. Biol. Chem., 282, 21573-21577.

68. Rohmer, M. (1999) Uppgötvun mevalónat-óháðrar leiðar fyrir samsöfnunarlífmyndun í bakteríum, þörungum og háplöntum. Nat. Framl. Rep., 16, 565–574.

69. Muller, L., Caris-Veyrat, C., Lowe, G. og Bohm,V. (2016) Lycopene og andoxunarhlutverk þess við að koma í veg fyrir hjarta- og æðasjúkdóma - mikilvæg endurskoðun. Crit. Séra Food Sci. Nútr., 56, 1868–1879.

70. Miura, Y., Kondo, K., Saito, T., Shimada, H., Fraser, PD og Misawa, N. (1998) Framleiðsla á karótenóíðunum lycopene, beta-karótín og astaxanthin í matargerinu Candida utilis. Appl. Umhverfi. Microbiol., 64, 1226-1229.

71. Goodall, ECA, Robinson, A., Johnston, IG, Jabbari, S., Turner, KA, Cunningham, AF, Lund, PA, Cole, JA og Henderson, IR (2018) Nauðsynlegt erfðamengi Escherichia coli K{ {2}}. Mbio, 9, e02096-17.

72. Baba, T., Ara, T., Hasegawa, M., Takai, Y., Okumura, Y., Baba, M., Datsenko, KA, Tomita, M., Wanner, BL og Mori, H. (2006) Smíði Escherichia coli K-12 í ramma, eins-gena útsláttarstökkbrigði: Keio safnið. Mol. Syst. Biol., 2, 2006.0008.

73. Bertram, R. og Hillen, W. (2008) Notkun Tet bælingar í dreifkjörnungastjórnun og tjáningu. Örvera. Líftækni, 1, 2–16.