Samanburður á tveimur greiningarprófum til að greina hlutleysandi mótefni í sermi gegn niðurgangsveiru vegna svínafaraldurs

Ágrip:

Mjólkurframleiðandi ónæmi er mikilvægt til að vernda grísa gegn mörgum sýkla, þar á meðal niðurgangsveiru með svínafaraldrinum. Hlutleysandi mótefnamagn í hringrás í sermi gyltu getur hjálpað til við að ákvarða hvort greinanlegt ónæmissvörun gæti veitt grísum vernd. Hægt er að greina hlutleysandi mótefni með ýmsum greiningargreiningum. Þessi rannsókn lagði mat á greiningareiginleika tveggja hlutleysandi mótefnamælinga fyrir niðurgangsveiruhlutleysandi mótefni gegn niðurgangi í svínafaraldrinum í sermi ögraða gylta. Fjórir meðferðarhópar, viðmiðunarhópar, óbólusettir, bólusettir fyrir áreiti og bólusettir í kjölfar áreitis, samanstóð af 20 gyltum. Sermissýnum var safnað úr hverjum gylltu fyrir og eftir áskorunina með niðurgangsveiru með svínafaraldrinum. Sýni voru metin með tilliti til tilvistar hlutleysandi mótefna með flúrljómandi fókus hlutleysunarprófi og hlutleysunarprófi með mikilli afköst. Greiningarnæmni og sértækni fyrir hlutleysandi fókushlutleysingu og hlutleysunarpróf með háum afköstum fyrir þessa rannsókn voru fínstillt við þynningu 80% og 80% minnkun flúrljómunar í sömu röð og sýndu miðlungs samræmi byggt á kappa tölfræðinni. Hægt er að nota fókusflúrljómunarhlutleysingu og hlutleysunarpróf með háum afköstum til að fylgjast með stöðu hlutleysandi mótefna innan dýra eða dýrastofns. Háhraðaprófið hefur kosti umfram fókusflúrljómunarprófið að því leyti að það hefur meiri sértækni við tilgreinda mörkun og eðli niðurstaðna gerir kleift að greina meira á milli einstakra niðurstaðna.

cistanche viðbót kostir-auka friðhelgi

Lykilorð: PEDV; hlutleysandi mótefni; greiningarprófun

1. Inngangur

Niðurgangsveira vegna svínafaraldurs (PEDV) er alfakórónuveira sem hefur orðið landlæg í Ameríku eftir að hún kom upp í Bandaríkjunum árið 2013 [1–3]. Líföryggisráðstafanir beinast að því að halda sýkla eins og PEDV frá svínahjörðum til að draga úr áhrifum sjúkdóma [4]. Sermispróf er gagnlegt tæki til að ákvarða hvort svín hafi áður verið útsett fyrir og sýkt af sýkingu. Útsetning getur átt sér stað náttúrulega (td inntaka vírushlaðins efnis) eða viljandi (td í bland við útfellandi sáningardýr, sáningu í munn og nef eða magaskolun). Í tilgangi þessarar rannsóknar var útsetning náð með viljandi ögrun með PEDV-jákvæðu vefjajafnvægi frá staðfestu, klínísku faraldri PEDV. Song o.fl. [5] sýndu að sermishlutleysandi mótefnatítrar voru ekki mismunandi á milli gylta sem fengu Vero-frumuveiklað PEDV DR13 bóluefni til inntöku eða í vöðva. Þessi rannsókn sýndi einnig fram á að bólusettar gyltur til inntöku höfðu lægri grísadauða samanborið við bólusetningu í vöðva. Að auki, de Arriba o.fl. [6] sýndi fram á fylgni milli IgA og IgG mótefnaseytandi frumna (ASC) í blóði og meltingarvef tengdum eitlum. Dreifð þekjulaga fylgja gylta kemur í veg fyrir að ónæmisfrumur og mótefni berist til grísa í móðurkviði sem gerir svín agammaglobulinemic við fæðingu [7]. Ónæmi móður er flutt frá gyltum til grísa þeirra með brjóstaseytingu og gegnir mikilvægu hlutverki í vörn gegn garnasýkingum eins og PEDV, TGEV og rótaveiru. Þess vegna treysta grísir á broddmjólk og mjólkurmótefni til verndar gegn þessum sýkla. Immúnóglóbúlín í sermi eru stór þátttakandi í broddmjólk en immúnóglóbúlín í mjólk eru framleidd í mjólkurkirtlinum [8]. Þannig geta hlutleysandi mótefnamælingar hjálpað til við að ákvarða hvort greinanlegt ónæmissvörun í sermi gyltu fyrir fæðingu gæti veitt grísum vernd. Aðferðir hlutleysandi mótefna eru meðal annars samsöfnun, hömlun á innkomu veiru í markfrumuna og hömlun á afritun veiru innan markfrumunnar [9]. Greiningarpróf hafa verið þróuð til að greina hlutleysandi mótefni fyrir PEDV, þar á meðal veiruhlutleysingu (VN), flúrljómandi fókushlutleysingu (FFN) og hlutleysunarpróf með háum afköstum (HTNT) [2,10-13]. Eins og lýst er af Sarmento o.fl. [2], FFN greiningin er framför á VN greiningunni þar sem greiningin er næmari vegna þess að greiningin byggist á greiningu veirumótefnavaka tjáð á yfirborði sýktra Vero frumna á meðan VN greiningin er byggð á frumudrepandi áhrifum af völdum. af veirunni. Að auki er hægt að fá FFN niðurstöður hraðar en VN niðurstöður þar sem það tekur lengri tíma að fylgjast með frumudrepandi áhrifum samanborið við veirutengingu við FFN. HTNT-greiningin er enn frekari framför á FFN-greiningunni þar sem HTNT-greiningin byggir á stafrænni myndfrumumælingu frekar en túlkun tæknimanna til að fá niðurstöðurnar. Þannig að leyfa að lesa heila plötu á innan við 3 mínútum, framleiða magnmælingu á styrk flúrljómunar og möguleika á að geyma myndir til skoðunar. Þannig virtist HTNT henta til notkunar í svínahjörðum í atvinnuskyni. Þessi rannsókn bar saman greiningareiginleika (næmi og sérhæfni) og jákvæð og neikvæð forspárgildi, tveggja hlutleysandi mótefnamælinga fyrir PEDV, FFN og HTNT próf. Þetta byggir á verkum Sarmento o.fl. [2] með því að prófa barnaleg, sýkt og bólusett dýr til að hjálpa til við að staðfesta prófunina til notkunar á greiningarstofu með mikilli afköstum. Byggt á niðurstöðum Sarmento o.fl. [2], núlltilgáta okkar er sú að enginn munur sé á greiningareiginleikum greininganna tveggja til að greina hlutleysandi PEDV mótefni í sermi gylta sem hafa fengið PEDV-áskorun.

cistanche viðbót kostir-auka friðhelgi

2. Efni og aðferðir

2.1. Heimildir og úrval svína

Eins og áður hefur verið lýst af Brown o.fl. [14], þessi rannsókn notaði 4 meðferðarhópa sem vísað er til sem Control, NV (óbólusett), Pre (bólusett fyrir áskorun) og Post (bólusett eftir áskorun). Hver hópur var upphaflega samsettur af 20 viðskiptalegum, blandað, gyltum. Alls voru 60 gyltur valdir úr svínabúi í atvinnuskyni í miðri Iowa sem hafði enga sögu um PEDV. Gylturnar 20 í samanburðarhópnum voru endurnotaðar fyrir NV hópinn. NV hópurinn samanstóð af aðeins 18 svínum þar sem tveir gyltur voru fjarlægðir úr rannsókninni vegna fylgikvilla sem ekki tengdust PEDV áskoruninni.

Sem frekari vísbending um neikvæða stöðu PEDV var 12 ml af blóði safnað með bláæðastungum með 16-mæli, 1.5-tommu nál og 12 ml sprautu. Sermi var safnað úr blóðsýnum með skilvindu við 1.500× g í 8 mínútur (mín), skipt í 1 ml skammta og geymt við -80 ◦C. Sermissýni voru prófuð með wv-ELISA á Iowa State University Veterinary Diagnostic Laboratory (ISU-VDL, Ames, IA, Bandaríkjunum) [15].

2.2. Skipun dýra í meðferðarhópa

Sextíu gyltunum var jafnt skipt í 3 hópa, sem hver samanstendur af 20 kynblanduðum kvendýrum. Til að mynda fjóra meðferðarhópa voru 20 gyltur notaðir í röð fyrir tvo af meðferðarhópunum, CONTROL og NV. Endurnotkun á 20 gylltum leyfði þróun og stjórn á hópi PEDV-jákvæðra gilta sem höfðu orðið fyrir PEDV og minnkaði heildarfjölda dýra sem notuð voru í rannsókninni. Hinir 40 gylltur samanstóð af PRE og POST hópunum, með 20 gylltum innan hvers hóps. Tímalínu atburða eftir meðferðarhópum er lýst í Brown o.fl. [14]. Í stuttu máli var einstökum blóðsýnum safnað einu sinni í viku í hverjum meðferðarhópi eftir áskorunina. Fjallað er um nánari útfærslu í köflum 2.4 og 2.5. Meðferðarhópurinn „PRE“ gyltur voru bólusettir áður en þeir komu á stöðina. Meðferðarhópurinn „POST“ gyltur voru ekki bólusettir fyrr en eftir áskorunina.

2.3. Húsnæði og umhirða svína

Við komu á rannsóknarstöðina voru gyltarnir hýstir í hópi með meðferðarhópi: allir 20 gyltarnir í meðferðarhópi voru í einum kví með fóðri og vatni að vild. Allir pennarnir voru í sama herbergi. Einn penni var skilinn eftir tómur á milli NV PRE og POST hópanna til að lágmarka mengun. Fylgst var með fóðri, vatni, háum og lágum stofuhita og háum og lágum raka til að tryggja samræmi við framleiðslustaðla. Heilsufarsmælingar voru gerðar og skráðar einu sinni á dag til að meta gangferð, svefnhöfgi, samkvæmni saurs og önnur klínísk einkenni sjúkdóms. Eyrnamerki (Integra Hog, Allflex, Dallas, TX, USA) var sett í hægra eyra hvers gyltu til að auðkenna einstök dýr.

2.4. Munnleg áskorun

Eftir 4-daga aðlögunartímabil var hver gylltur í CONTROL útsettur til inntöku fyrir PEDV með því að nota vefjajafnhæfingu sem safnað var frá staðfestu klínísku PEDV-faraldri á ræktunarbúi. Einsleitniefnið var raðgreint af Iowa State University Veterinary Diagnostic Laboratory og reyndist vera bandaríska frumgerð stofnsins, arfhópur G2b. Tíu millilítrum af einsleitu efninu var blandað saman við 590 ml af fosfatbuðruðu saltvatni og 30 ml af blöndunni var gefið á kaldhæðnislegan hátt í hvern gylta. Sáðefnið var staðfest PEDV jákvætt með rauntíma, öfugum transkriptasa pólýmerasa keðjuverkun með CT gildi 19,6 og 14,23 × 107 erfðafræðileg eintök á ml og þróun niðurgangs í gyltum í kjölfar áskorunar. Einstök blóðsýni voru tekin á 7 daga fresti eftir áskorunina með bláæðastungum eins og lýst er hér að ofan til og með 42. dag eftir ögrun. Sermi var safnað og geymt eins og lýst er hér að ofan og sýni voru send til ISU VDL til að greina hlutleysandi mótefni með einbeittu flúrljómandi hlutleysunarprófi og veiruhlutleysunarprófi með mikilli afköstum. Á 60. degi eftir fyrstu áskorun CONTROL voru hinir 40 gylltur fluttir á rannsóknarstöðina og 18 af CONTROL gyltunum urðu NV. Tveir gyltur voru fjarlægðir úr CONTROL vegna aðstæðna sem ekki tengdust rannsókninni. Eftir 3-dag aðlögunartímabils eftir komu, voru 18 gyttur endurskoðaðir (NV) og 40 gyltur (PRE og POST) ögruðu, blóðsýnum var safnað, sermi safnað og sýni send til prófunar eins og lýst er hér .

2.5. Bólusetning gylta

Fjörutíu gylltar höfðu verið eftir á upprunabýlinu og voru komnir á rannsóknarstöðina 8,5 vikum eftir komu CONTROL. Tuttugu gyltur höfðu verið bólusettir 5 og 2 vikum fyrir áskorunina, eins og fyrirtækið sem framleiðir bóluefnið mælti með, með drepnu PEDV bóluefni, arfhópi G2b, (Porcine Epidemic Diarrhea Vaccine, Zoetis, Inc., Florham Park, NJ. , Bandaríkjunum) sem samanstendur af PRE hópnum. Hinir tuttugu voru bólusettir með sama bóluefninu, 1 og 3 vikum eftir PEDV áskorunina sem samanstendur af POST hópnum. Átján af upprunalegu tuttugu CONTROL gyltunum voru eftir í rannsókninni og samanstóð af NV hópnum og fengu ekki bólusetningu fyrir PEDV

cistanche plöntuaukning ónæmiskerfi

2.6. Hlutleysandi mótefnagreiningar

2.6.1. Fluorescent Focus Neutralization (FFN) aðferð

FFN var framkvæmt af Iowa State University Veterinary Diagnostic Laboratory, staðlað aðgerðaferli 9.5324 [16]. Í stuttu máli voru Vero 76 frumur útbúnar með því að skola og rækta með trypsín-etýlendíamíntetraediksýru (EDTA) í 5 mínútur við 37 ◦C. Gerð var 1:20 þynning af frumum og frumufjölgunarmiðli og 200 µL bætt við hvern brunn á 96-brunnsplötu og ræktað í 48 klst. Plötum var hent og skolað með vírusbóluefni. Sermissýni voru hitaóvirkjuð í vatnsbaði við 56 ◦C í 30 mínútur og síðan þynnt í 2-faldri raðþynningu sem byrjaði á 1:10 í plötunni. Stofnveira var þynnt í 100–200 brennisteinsmyndandi einingar á 100 µL og 100 µL bætt við hvern brunn og ræktað í 60 mínútur við 37 ◦C með 5% koltvísýringi (CO2). Prófunarplatan var sturtuð, skoluð og 150 µL af sermi/veirublöndu bætt við samsvarandi brunna og ræktuð í 60 mínútur við 37 ◦C. Sermi/veiru blöndur voru hent og brunnarnir skolaðir með veiru sáningarmiðli. 150 µL af veiru sáningarmiðli var bætt við hvern brunn og ræktaður í 24 klst við 37 ◦C og 5% CO2. Miðill var fjarlægður af plötunni og frumur festar með því að bæta við 80% asetoni, sem hefur verið kælt í ísbaði, í 15 mín. Asetoni var hent og diskurinn var loftþurrkaður. 1:100 þynning af FITC samtengdu PEDV NP einstofna mótefni þynnt í PBS (pH 7,2) var útbúin og 50 µL var bætt í alla brunna og ræktað við 37 ◦C í 60 mínútur. Platan var þvegin með PBS og síðan lesin með flúrljómunarsmásjá (Olympus BX51, 10X hlutfall, FITC sía). Jákvæð brunnur sýnir ekki flúrljómandi veggskjöldur og neikvæðir sýna græna veggskjöldur. Hlutleysandi mótefnatítrar voru gefnir upp sem hæsta sermisþynningin með 90% minnkun á afritun veirunnar samanborið við veiruviðmiðið. Sýni með títra stærri en eða jafnt og 20 voru flokkuð sem jákvæð fyrir PEDV-hlutleysandi mótefni. Hærri titli gefur til kynna hærri styrk hlutleysandi mótefna í sýninu. Dæmi um jákvæð og neikvæð sermisýni eru fáanleg í viðbótarefnum.

2.6.2. Háhraða flúrljómandi hlutleysingarpróf (HTNT) aðferð

HTNT var framkvæmt af Iowa State University Veterinary Diagnostic Laboratory, staðlað aðgerðaferli 9.5324 útgáfa 2 [17]. Sermissýni voru hitaóvirkjuð í vatnsbaði við 56 ◦C í 30 mín. Veirustofninn var raðþynntur 10-falt í vírusbóluefni (DMEM með 2 µg/mL Trypsin-TPCK), fluttur í Vero 81 frumur (ATTC® CCL-81™), og ræktaður við 37 ◦C með 5% CO2 í 5 daga. Síðasta þynningin þar sem frumudrepandi áhrif sáust var notuð til að ákvarða miðgildi sýkingarskammts vefjaræktunar (TCID50) með Spearman og Karber aðferðinni [18]. Hundrað míkrólítra af frumulausn (frumufjölgunarmiðill, trypsín-EDTA og Vero 81 frumur), var þynnt með 100 µL af frumufjölgunarmiðli (DMEM með 10% FBS og 1% penicillín-streptomycin) til að búa til 1:1 þynningu . Blóðkornamælir var notaður til að telja og reikna út þynninguna til að búa til 5 × 104 frumur/brunn og bætt við hverja brunn af tærri botni svartri 96-brunnsplötu (Coring 96 brunna CellBind örplata, Sigma) og ræktað í 48 klst. 37 ◦C með 5% CO2 til að gera frumur samrennandi (100% samrennandi). Hver plata hafði jákvæða stjórn, neikvæða stjórn og veiruviðmiðunarhola. Síðan voru fimm míkrólítrar af hitaóvirkjuðum viðmiðum og sýnum settir í tvöfalda brunna til að þynna 1:40 fyrst um 1:20 með því að bæta við 95 µL af veiru sáningarmiðli, síðan 100 µL af 1:10 þynntri PEDV veiru (3,16 × 105 TCID50/ml). Sermi/veiru blandan var ræktuð í 1 klst við 37 ◦C með 5% CO2. Allar frumuholur prófunarplötunnar voru þvegnar þrisvar sinnum með 150 µL af frumuþvottaefni (DMEM með 1% penicillin-streptomycin), og 150 µL af sermi/veirublöndu og veiruviðmiðum var flutt á prófunarplötuna og ræktað í 90 mínútur við 37 ◦C. Sermi/veirublöndunni var fleygt og plöturnar þvegnar einu sinni með frumuþvottaefni, eins og lýst er hér að ofan, fylgt eftir einu sinni með veiru sáningarmiðli. Veirubóluefni (150 µL) var bætt við hvern brunn og ræktaður í 24 klst við 37 ◦C með 5% CO2. Veiru sáningarmiðlinum var hent og platan þvegin með PBS pH 7,4. Frumur voru festar með því að bæta 4 ◦C, 80% asetoni í hvern brunn og ræktaðar við stofuhita í 15 mín. Aseton var síðan fjarlægt og platan var loftþurrkuð í 30 mín. Hver brunnur var skolaður með PBS pH 7,4. 50 µL af FITC-tengdu PEDV NP einstofna mótefni (SD6-29 klón, Medgene Labs) þynnt 1:100 í PBS pH 7,4 var bætt í hvern brunn og ræktað í 60 mínútur við 37 ◦C. Platan var þvegin fjórum sinnum með PBS pH 7,4, síðasta þvotturinn var látinn vera í plötunni í 5 mínútur og síðan fargað og skipt út fyrir 100 µL af PBS pH 7,4. Plötur voru síðan lesnar með SpectraMax i3× með því að nota SoftMax Pro 6.5 (Molecular Devices, San Jose, CA, USA) með 30 ms lýsingartíma og 20 um brennivíddsstillingar fyrir 541 bylgjulengdir. Sýni með heildarflúorljómun (%FR) meira en eða jafnt og 85% voru flokkuð sem jákvæð fyrir hlutleysandi mótefni [2]. Heildarflúorljómunarlækkun var reiknuð sem 100 - ([Meðalsýni heildarflúorljómunarstyrkur/meðal neikvæður samanburður heildarflúrljómunarstyrkur]) × 100). Hærri heildarflúrljómun gefur til kynna hærri hlutleysandi mótefnastyrk innan sýnanna. Dæmi um jákvæð og neikvæð sermisýni eru fáanleg í viðbótarefnum.

2.7. Greiningareiginleikar: Næmni og sértækni og jákvæð og neikvæð forspárgildi

Greiningarnæmi og sértækni voru reiknuð út fyrir HTNT með því að nota %FR cutoff upp á 70, 75, 80, 85 og 90 og FFN með því að nota sýnisþynningarmörk upp á 20, 40, 80 og 160 til að ákvarða hámarksskerðingu. Optimized var skilgreint sem cutoff þar sem greiningarsérhæfni er hámörkuð með lágmarks tapi á greiningarsérhæfni. Hlutmengi af sjötíu og sex þekktum PEDV-neikvæðum sýnum var valið úr fyrstu tveimur sýnatökustöðum fyrir CONTROL og POST hópana. 36 þekkt PEDV-jákvæð sýni voru valin úr síðustu tveimur sýnatökustöðum fyrir NV hópinn. Stærri skerðing en 85 var notuð til að skilgreina jákvæð sýni, í samræmi við ISU VDL staðlaða vinnuaðferð fyrir greiningu [17]. Greiningarnæmi var metið með því að deila fjölda þekktra jákvæðra sýna sem reyndust jákvætt með heildarfjölda þekktra jákvæðra sýna. Sérhæfni greiningar var metin með því að deila fjölda þekktra neikvæðra sýna sem reyndust neikvæð með fjölda þekktra neikvæðra sýna. Viðmiðunarmörkin sem hámarkuðu greiningarsérhæfni og næmi var valin til samanburðar á greiningu. Í tilgangi þessarar rannsóknar voru greiningarsérhæfni (DSp) og næmi (DSe) hámörkuð, þar sem algildi munarins á næmi og sérhæfnigildum er minnst. Jákvætt forspárgildi (PPV) var metið með því að deila fjölda þekktra jákvæðra sýna sem reyndust jákvætt (TP) með heildarpróf jákvæðra sýna (TP plús falskt jákvæð [FP]). Neikvætt forspárgildi (NPV) var metið með því að deila fjölda þekktra neikvæðra sýna (TN) sem reyndust neikvætt með heildar neikvæðum prófunarsýnum (TN plús falskt neikvætt [FN]).

cistanche tubulosa-bæta ónæmiskerfið

Smelltu hér til að skoða Cistanche Enhance Immunity vörur

【Biðja um meira】 Netfang:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.8. Tölfræðigreining

Engar óákveðnar niðurstöður eða gögn vantaði í þessa rannsókn. Öll gögn voru greind með SAS útgáfu 9.4 (SAS Instit. Cary NC). Notaðar voru 609 athuganir frá 6{{10}} svínum sem tilheyrðu einum af 4 hópum. Tvö möguleg skerðingargildi (40 og 80) fyrir FFN prófið voru skoðuð og borin saman við cutoff upp á 85 fyrir HTNT. Fyrir hvern, var línulegt blönduð áhrifalíkan hæft til að útskýra áhrif hópsins á samræmi FFN og HTNT prófanna, með svínsértækum tilviljunarkenndum áhrifum. Allar pörsamanburðargreiningar á hópum voru gerðar. Ennfremur, fyrir tvö af þremur afmörkunargildum sem notuð voru fyrir FFN prófið, var Cohen's Kappa stuðullinn reiknaður til að ákvarða heildarsamræmi FFN og HTNT prófanna. Kappa-stuðlar voru túlkaðir sem hér segir: minni en 0.0, „lélegt“ samkomulag; milli 0.0 og 0.20, "smá" ​​samkomulag; á milli 0.21 og {{30}}.40, "sanngjarnt" samkomulag; milli 0,41 og 0,60, "hóflegt" samkomulag; milli 0,61 og 0,80, "verulegt" samkomulag; og á milli 0,81 og 1,0, "næstum fullkomið" samkomulag [19]. Marktekt var stillt á p Minna en eða jafnt og 0,05. Box og whisker plots voru þróaðar með því að nota R hugbúnað.

3. Úrslit

Tafla 1 sýnir greiningarnæmni og sérhæfni fyrir FFN og HTNT greiningar á þeim mörkum sem valin eru. Greiningarnæmi og sérhæfni fyrir greiningarnar tvær fyrir þessa rannsókn var fínstillt við þynningu 80% og 80% FR, í sömu röð.

Tafla 1. Greiningarnæmi (DSe), greiningarsérhæfni (DSp), jákvætt forspárgildi (PPV) og neikvætt forspárgildi (NPV) fyrir HTNT og FFN mælingar með því að nota ýmsar skerðingar sem skráðar eru í annarri röð töflunnar. Til dæmis, fyrir HTNT greiningu við 70, DSe=0.97 (97%), DSP=0.91 (91%), PPV=0.83 ( 83%) og NPV=0.95 (95%). U=óskilgreint.

Mynd 1 sýnir kassa- og whisker-rit af HTNT-niðurstöðum eftir dögum eftir áskorun eftir meðferðarhópi rannsóknarinnar. Sýni úr CONTROL og POST hópunum (n=76) voru flokkuð sem neikvæð á dögum −4, 0 og 7 eins og búist var við vegna fyrri stöðu svínanna. NV hópurinn þróaði með sér anamnesískt svar í kjölfar áskorunarinnar. Minni breytileiki kom fram meðal HTNT niðurstöður eins og sést af lækkun á gildissviði í báðum bólusettu hópunum (PRE og POST) eftir áskorunina með PEDV. Þessa minnkuðu breytileika má sjá á mynd 1 þar sem hárhönd og útlínur POST og PRE lóðanna verða styttri 14 dögum eftir áskorun. Mynd 2 sýnir kassa- og whisker-rit af náttúrulegum log-umbreyttum FFN niðurstöðum eftir dögum eftir áskorun eftir meðferðarhópi, sem hafa svipaðar niðurstöður og HTNT prófið. Bæði HTNT (Mynd 1) og FFN (Mynd 2) niðurstöður sýna svörun við áskorun og bólusetningu eins og sést með aukningu á %FR og títrum frá báðum greiningum. Þótt það væri svipað að stærð, minnkaði breytileikinn í niðurstöðum hverrar greiningar í kjölfar einsleitar áskorunar (NV). Minnkandi breytileiki kom einnig fram eftir bólusetningu (PRE og POST). Þessi breytileiki á hlutleysandi mótefnagildum eftir viku eftir útsetningu minnkar í kjölfar bólusetningar og einsleitar áreiti með PEDV (myndir 1 og 2). Svipuð tilhneiging var í minnkun á breytileika hlutleysandi mótefna sem sást í báðum niðurstöðum greininga hjá bólusettum og einsleitum ögruðu meðferðarhópum. Samhljóða áskorun PEDV og annarra bólusetninga framkallaði anamnesísk svörun sem myndaði hærra magn hlutleysandi mótefna með minni breytileika milli svína samanborið við gildi fyrir áskorun og eftir bólusetningu eins og mælt var með báðum greiningum (mynd 1). Byggt á greiningu á greiningarnæmni og sérhæfni voru mörkin 80 (títur) og 85 (%FR) valin til að greina prófunarsamræmi fyrir FFN og HTNT greiningar í sömu röð. Kappa prófið sýndi "hóflegt" samræmi við 0.5257 með 95% öryggisbili upp á 0.461, 0,5904 af greiningunum fyrir cutoff 80 (títur) og 85 (%FR) fyrir FFN og HTNT próf.

Mynd 1. Box-and-whisker plots af HTNT mótefnasvörunarferlum dagana eftir áskorun fyrir hvern meðferðarhóp. Miðstikan táknar miðgildi niðurstaðna eftir viku. Lamir (efst og neðst í kassanum) tákna fyrsta (Q1) og þriðja (Q3) kvartil. Skyggða svæðið táknar interquartile range (IQR). Hárhöndin eru ákvörðuð sem hér segir: Hárhönd=Q3 + 1.5∗IQR; Botnhögg=Q1 + 1.5∗IQR. Ef enginn gagnapunktur er á reiknuðu gildinu er næsti gagnapunktur sem er næst Q1 eða Q3 takmörk whiskersins. Opnir hringir (◦) gefa til kynna útlínur. Skurður 85 er táknaður með strikalínunni við 85 á y-ásnum.

Mynd 2. Kass-og-hvarðarslóðir af FFN mótefnasvörunarferlum dagana eftir áskorun fyrir hvern meðferðarhóp. Miðstikan táknar miðgildi niðurstaðna eftir viku. Lamir (efst og neðst í kassanum) tákna fyrsta (Q1) og þriðja (Q3) kvartil. Skyggða svæðið táknar interquartile range (IQR). Hárhöndin eru ákvörðuð sem hér segir: Hárhönd=Q3 + 1.5∗IQR; Botnhögg=Q1 + 1.5∗IQR. Ef enginn gagnapunktur er á reiknuðu gildinu er næsti gagnapunktur sem er næst Q1 eða Q3 takmörk whiskersins. Opnir hringir (◦) gefa til kynna útlínur. Skurður 40 er táknaður með strikalínunni við ln(40) á y-ásnum.

4. Umræður

Við gerum ráð fyrir að minni breytileiki og anamnesísk svörun tengist einsleitu hjarðónæmi og vernd gegn sjúkdómum, jafnvel þó að klínísk einkenni hafi enn sést í PRE hópnum eins og áður hefur verið lýst [14]. Klínísk áhrif og alvarleiki sjúkdóms hjá þessum dýrum voru ekki metin í tilgangi þessarar rannsóknar. Sjúkdómurinn kemur mismunandi fram hjá fullorðnum og nýburum með alvarlegri klínísk einkenni og dauða hjá nýburum samanborið við fullorðna dýr [1,20]. Þó að hlutleysandi mótefnamagn í blóðrásinni eitt og sér veiti ekki vernd [21], má nota þau til að meta mótefnasvörun eftir viljandi útsetningu eða bólusetningu í hjörðum. Þó að skortur á veiruleysi sé einkennandi fyrir PEDV, hefur verið greint frá veiruhækkun hjá grísum allt að 4 vikna [22,23]. Þannig geta hlutleysandi mótefni í blóðrás haft áhrif á klínískt sjúkdómsferli [21]. Hins vegar væri laktógenískt ónæmi, sérstaklega IgA í brjóstaseytingu, nákvæmari mæling á vörn fyrir grísa [21]. Mælingarnar sem lýst er í þessari rannsókn gætu verið notaðar til að fylgjast með hlutleysandi mótefnum í sermi eftir bólusetningargjöf í hópum gylta eða gylta auk þess að safna brjóstaseytingu til að prófa fyrir mjólkurvaldandi/seytandi IgA. Það væri gagnlegt ef gögnin sem myndast úr þessum mælingum gætu sagt fyrir um magn og stöðugleika mjólkurvakaónæmis sem myndast eftir bólusetningu. Það var hins vegar ekki greint í þessari rannsókn. Sýnt hefur verið fram á að IgG mótefnasvörun í sermi eftir bólusetningu spáir fyrir um IgG svörun í ristil, en engin fylgni var á milli sermishlutleysandi mótefna og brjóstaseytingar [15]. Þó að engin fylgni væri á milli hlutleysandi mótefna í sermi og brjóstaseytingar, var sýnt fram á að bólusett dýr hafi hærra hlutleysandi mótefni í mjólkurseyti samanborið við samanburðardýr [15]. Þess vegna, eins og stutt er af, Bjustrom-Kraft, o.fl. [15], ef hlutleysandi mótefni í sermi eru mikil, getur IgG og IgA í brjóstaseytingu einnig aukist. Þannig að söfnun sermissýna áður en kvendýrin eru flutt í burðarhúsið myndi lágmarka streitu og sársauka sem myndast við söfnun blóðs og brjóstaseytingar utan fæðingar sem getur haft neikvæð áhrif á gyltu og got [24]. Það er mikilvægt fyrir notendur að skilja hvernig skurðgildið getur haft áhrif á greiningarnæmi og sérhæfni greiningar. Ef skerðingargildið er hækkað mun fölskum jákvæðum niðurstöðum fækka og fölskum neikvæðum niðurstöðum fjölgar. Á hinn bóginn mun það að lækka skerðingargildið fjölga fölskum jákvæðum niðurstöðum og fækka fölskum neikvæðum niðurstöðum. Þessi þekking gerir notanda kleift að velja hvaða skerðingargildi hann notar fyrir sérstakar aðstæður. Fyrir þessa rannsókn, byggt á niðurstöðum þessarar rannsóknar og fyrri niðurstöðum sem Sarmento o.fl. [2], við völdum 80% FR fyrir HTNT og þynningu upp á 80 FFN. Við þessi mörk er greiningarsérhæfni hærri fyrir HTNT (97%) samanborið við FFN (76%) og gefur hærra jákvætt forspárgildi frá HTNT samanborið við FFN. Það verður líka að skilja að forspárgildi eru háð algengi sjúkdóma [25,26]. Í þessari rannsókn, miðað við flokkuð sýni, var algengi 32,1% (36 jákvæð og 76 neikvæð sýni). Eftir því sem algengi eykst myndi PPV einnig aukast vegna þess að dýrið (sýnið) sem prófaði er líklegra til að vera jákvætt; eftir því sem algengi minnkar myndi NPV minnka. Myndir 3A og B sýna þetta fyrir HTNT og FFN greiningar á hinum ýmsu mörkum sem metin voru í þessari rannsókn eftir aðferðum sem Erb lýsti [25]. Þess vegna, þegar greiningarniðurstöður eru skoðaðar, ætti að hafa í huga greiningarnæmni og sérhæfni greiningarinnar og skilja algengi innan hópsins ef forspárgildi eru notuð.

Mynd 3. (A). Jákvæð forspárgildi fyrir HTNT (svartar línur) og FFN (gráar línur) greiningar á ýmsum mörkum. Afmörkun 90 er ekki táknuð fyrir HTNT. (B). Neikvæð forspárgildi eða HTNT (svartar línur) og FFN (gráar línur) mælingar á ýmsum mörkum. Afmörkun 20 er ekki táknuð fyrir FFN prófið.

hann HTNT hefur yfirburða greiningarnæmi og sérhæfni samanborið við FFN. Þegar mótefnaniðurstöður eru greindar er þetta tilvalið til að lágmarka fjölda rangra jákvæðra og falskra neikvæðra niðurstaðna. Til dæmis, þegar við notum cutoff 80 fyrir FFN, sáum við næmi upp á 97% og sértækni upp á 76%. Þetta þýðir að það yrðu fáar rangar neikvæðar niðurstöður en það væri mikill fjöldi rangra jákvæðra. Ef niðurstöður eru ranglega flokkaðar sem jákvæðar, þá getur það leitt til rangtúlkunar að hjörð hafi mótefni gegn PEDV þegar þau hafa það í raun ekki. Þar sem HTNT hefur hærri greiningu og sérhæfni yfir mismunandi skerðingar, er það ákjósanlegasta prófið til að greina PEDV mótefni. Niðurstöður frá Sarmento o.fl. [2] sýndi miklu meiri greiningar sérstöðu fyrir FFN og sambærilegt næmi og sértæki fyrir HTNT. Þessar greiningarprófanir sýndu í meðallagi samræmi samkvæmt kappa tölfræði (κ). Einn veikleiki κ er að eitt próf verður að teljast gulls ígildi. Þegar bornar eru saman tvær ófullkomnar mælingar getur þetta skekkt túlkun κ. Fyrir þessa rannsókn, metum við greiningarárangur greininganna í tengslum við κ til að ákvarða að prófið sé sammála en gæti haft mismunandi notagildi. Annar kostur við HTNT umfram FFN prófið er að HTNT niðurstöðurnar eru reiknaðar út frá samfelldum gögnum samanborið við flokkagildin (títrun) frá FFN. Samfelld eðli HTNT gagna gerir ráð fyrir meiri mismunun á niðurstöðum sýna til að lýsa hlutleysandi mótefnastöðu gylta. Eins og greint var frá af Sarmento o.fl. [2], HTNT hefur styttri aflestrartíma á 96 brunna plötu í minna en 4 mínútur sem gerir kleift að snúa niðurstöðum hraðar. Altæk mótefni í hringrás geta stuðlað að vörn grísa gegn PEDV sýkingum [21]. Hins vegar eru engar heimildir til um hversu mikið magn af hlutleysandi mótefni í blóði í gyltunni myndi veita grísum PEDV vernd. Mikið magn mótefna í blóðrás leiðir til hærri styrks í broddmjólkinni og veitir aukna vernd. Frekari mat er réttlætanlegt til að ákvarða tengsl á milli, hvenær á meðgöngu að safna sýnunum, og colostral mótefnavörn gegn PEDV sýkingu. Mjólkur- og slímhúðarónæmi er afar mikilvægt fyrir lifun svína sem verða fyrir PEDV. Mótefni safnast fyrir í mjólkinni um þarma-MG-sIGA ásinn og berast til grísanna til að veita vernd. Langel o.fl. [27] komst að því að gyltur sem urðu fyrir áhrifum á öðrum þriðjungi meðgöngu höfðu marktækt hærra magn af IgA, IgG og hlutleysandi mótefnum í blóðrásinni samanborið við fyrsta og þriðja þriðjung gylta. Að auki, Langel o.fl. [27] komst að því að grísir af gyltum sem voru útsettir fyrir PEDV á öðrum þriðjungi meðgöngu höfðu 100% lifun samanborið við minna en 87,2% á öðrum þriðjungum sem bendir til þess að hátt IgA, IgG og hlutleysandi mótefni í sermi tengist lifun grísa í ljósi PEDV. Þrátt fyrir að mótefni í sermi veiti ekki vernd fyrir PEDV, benda niðurstöður úr rannsókn okkar til að magn hlutleysandi mótefna í sermi tengist vörn gegn PEDV sýkingu. Eins og áður hefur verið greint frá af Brown o.fl. [14], PEDV er úthellt í hægðum eftir einsleita áskorun og bólusetningu á gyltum. Í þessari rannsókn voru notuð sýni úr sömu dýrum og Brown o.fl. [14]. sýnir ennfremur að aukið hlutleysandi mótefni í sermi eftir útsetningu fyrir áreiti eða bólusetningu hefur ekki áhrif á losunarmynstur veirunnar þar sem mótefnamagn jókst eftir áskorun og bólusetningu. Frekari rannsóknir eru nauðsynlegar til að staðfesta hvort magn veirunnar sem losnar í hægðum tengist magni hlutleysandi mótefna sem er til staðar í sermi [21].

cistanche ávinningur fyrir karla styrkir ónæmiskerfið

5. Ályktanir

Núlltilgáta þessarar rannsóknar var sú að enginn munur væri á greiningareiginleikum tveggja PEDV-hlutleysandi mótefnamælinga, FFN og HTNT. Niðurstöður sýna að þessar mælingar eru í meðallagi sammála út frá kappa tölfræðinni á meðan það er breytileiki í greiningareiginleikum þeirra og forspárgildum byggt á cutoff fyrir greiningu. Þessar mælingar gætu verið notaðar til að mæla bólusetningarsvörun hjörð. Takist ekki að hafna núlltilgátunni sýnir að HTNT er ákjósanlegasta prófið til að greina PEDV-hlutleysandi mótefni í sermi. Eftir bólusetningu í bæði PRE og POST hópnum, fannst þessi rannsókn meirihluti niðurstaðna jákvæðar. Í PRE hópnum fylgdi minni breytileiki meðal niðurstaðna einnig áskoruninni. Þessar niðurstöður benda til þess að svínalæknar gætu mælt sermishlutleysandi mótefni til að ákvarða hvort PEDV bóluefni séu gefin á réttan hátt í hjörðinni.

Heimildir

1. Saif, L.; Wang, Q.; Vlasova, A.; Jung, K.; Xiao, S. Coronaviruses. In Diseases of Swine, 11. útgáfa; Zimmerman, JJ, Ed.; Wiley Blackwell: Hoboken, NJ, Bandaríkin, 2019.

2. Sarmento, LV; Poonsuk, K.; Tian, ​​L.; Mora-Diaz, JC; Main, RG; Baum, DH; Zimmerman, JJ; Gimenez-Lirola, LG Greining á niðurgangsveiru-hlutleysandi mótefni með svínafaraldri með því að nota frumugreiningu með mikilli afkastagetu. J. Vet. Diagn. Rannsaka. 2020, 32, 324–328. [Krossvísun]

3. Stevenson, GW; Hoang, H.; Schwartz, KJ; Burrough, ER; Sun, D.; Madson, D.; Cooper, VL; Pillatzki, A.; Gauger, P.; Schmitt, BJ; o.fl. Tilkoma niðurgangsveiru af svínafaraldrinum í Bandaríkjunum: Klínísk einkenni, skemmdir og erfðafræðilegar veirur. J. Vet. Diagn. Rannsaka. 2013, 25, 649–654. [Krossvísun]

4. Kim, Y.; Yang, M.; Goyal, SM; Cheeran, MC; Torremorell, M. Mat á líföryggisráðstöfunum til að koma í veg fyrir óbeina sendingu niðurgangsveiru með svínafaraldri. BMC dýralæknir. Res. 2017, 13, 89. [Krossvísun]

5. Söngur, DS; Ó, JS; Kang, BK; Yang, JS; tungl, HJ; Jú, HS; Jang, YS; Park, BK Virkni til inntöku Vero frumu veiklaða svínafaraldurs niðurgangsveiru DR13 stofns. Res. Dýralæknir. Sci. 2007, 82, 134–140. [CrossRef] [PubMed]

6. de Arriba, ML; Carvajal, A.; Pozo, J.; Rubio, P. Slímhúð og altæk ísótýpa-sértæk mótefnasvörun og vörn í hefðbundnum svínum sem verða fyrir illvígri eða veiklaðri niðurgangsveiru vegna svínafaraldurs. Dýralæknir. Immunol. Ónæmispatól. 2002, 85, 85–97. [CrossRef] [PubMed]

7. Furukawa, S.; Kuroda, Y.; Sugiyama, A. Samanburður á vefjafræðilegri uppbyggingu fylgju í tilraunadýrum. J. Toxicol. Pathol. 2014, 27, 11–18. [CrossRef] [PubMed]

8. Bourne, FJ; Curtis, J. Flutningur immúnóglóbína IgG, IgA og IgM úr sermi yfir í brodd og mjólk í gyltu. Ónæmisfræði 1973, 24, 157-162. [PubMed]

9. Parren, PW; Burton, DR Veirueyðandi virkni mótefna in vitro og in vivo. Adv. Immunol. 2001, 77, 195–262. [Krossvísun]

10. Bjustrom-Kraft, J.; Woodard, K.; Gimenez-Lirola, L.; Rotolo, M.; Wang, C.; Sun, Y.; Lasley, P.; Zhang, J.; Baum, D.; Gauger, P.; o.fl. Niðurgangsveiru (PEDV) uppgötvun og mótefnasvörun í svínum í atvinnuskyni. BMC dýralæknir. Res. 2016, 12, 99. [Krossvísun]

11. Ó, JS; Söngur, DS; Yang, JS; Söngur, JY; tungl, HJ; Kim, TY; Park, BK Samanburður á ensímtengdri ónæmissogandi prófun með hlutleysingarprófi í sermi fyrir sermisgreiningu á niðurgangsveirusýkingu í svínafaraldri. J. Vet. Sci. 2005, 6, 349–352. [Krossvísun]

12. Okda, F.; Liu, X.; Singrey, A.; Clement, T.; Nelson, J.; Christopher-Hennings, J.; Nelson, EA; Lawson, S. Þróun á óbeinni ELISA, blokkandi ELISA, flúrljómandi örkúluónæmisgreiningu og flúrljómandi fókus hlutleysandi prófun fyrir sermisfræðilegt mat á útsetningu fyrir norður-amerískum stofnum af svínafaraldarsveiru. BMC dýralæknir. Res. 2015, 11, 180. [CrossRef] [PubMed]

13. Chen, Q.; Li, G.; Stasko, J.; Thomas, JT; Stensland, WR; Pillatzki, AE; Gauger, PC; Schwartz, KJ; Madson, D.; Yoon, KJ; o.fl. Einangrun og lýsing á niðurgangsveirum með svínafaraldri sem tengjast 2013 sjúkdómsfaraldri meðal svína í Bandaríkjunum. J. Clin. Örverur. 2014, 52, 234–243. [Krossvísun]

14. Brown, J.; Rademacher, C.; Baker, S. Virkni bóluefnis gegn niðurgangsveiru gegn svínafaraldrinum í atvinnuskyni við að draga úr lengd veirulosunar hjá gyltum. JSHAP 2019, 27, 256–264.

15. Bjustrom-Kraft, J.; Woodard, K.; Giménez-Lirola, L. Mótefnasvörun í sermi og brjóstaseytingu í niðurgangi-ónæmisgúllum vegna svínafaraldurs í kjölfar bólusetningar gegn niðurgangi við svínafaraldur. JSHAP 2018, 26, 34–40.

16. Iowa State University. Aðferð við niðurgangsveiru (PEDV) flúrljómandi fókus hlutleysunarpróf (FFN). Sermi 2017, 1–7.

17. Iowa State University. Aðferð við niðurgangsveiru (PEDV) High-Throughput Virus Neutralization Test (HTNT). Sermi 2017, 1–16.

18. Hierholzer, JC; Killington, RA; Kangro, HO; Mahy, BWJ veirufræðiaðferðahandbók; Academic Press: London, Bretlandi, 1996; bls. 21.

19. Thrusfield, M. Veterinary Epidemiology, 2. útg.; Blackwell Science LTD: Hoboken, NJ, Bandaríkjunum, 1995; bls. 479.

20. Lee, C. Niðurgangsveira með svínafaraldrinum: Nýkomin og endurkomin svínaveira. Virol. J. 2015, 12, 193. [Krossvísun]

21. Poonsuk, K.; Gimenez-Lirola, LG; Zhang, J.; Arruda, P.; Chen, Q.; Correa da Silva Carrion, L.; Magtoto, R.; Pineyro, P.; Sarmento, L.; Wang, C.; o.fl. Spilar mótefni í hringrás hlutverki í verndun grísa gegn niðurgangsveiru vegna svínafaraldurs? PLoS ONE 2016, 11, e0153041. [Krossvísun]

22. Niederwerder, MC; Nietfeld, JC; Bai, J.; Peddireddi, L.; Breazeale, B.; Anderson, J.; Kerrigan, MA; An, B.; Oberst, RD; Crawford, K.; o.fl. Staðsetning vefja, losun, flutningur vírusa, mótefnasvörun og úðabrúsa svínafaraldursniðurgangsveiru eftir sáningu á 4-vikukömlum fóðursvínum. J. Vet. Diagn. Fjárfestu. 2016, 28, 671–678. [Krossvísun]

23. Madson, DM; Arruda, PH; Magstadt, DR; Burrough, ER; Hoang, H.; Sun, D.; Bower, LP; Bhandari, M.; Gauger, PC; Stevenson, GW; o.fl. Einkenni svínafaraldurs niðurgangsveiru einangruð US/Iowa/18984/2013 sýkingu í 1-daggömlum keisaraskurði úr broddgrísum. Dýralæknir. Pathol. 2016, 53, 44–52. [Krossvísun]

24. Mainau, E.; Manteca, X. Verkir og óþægindi af völdum fæðingar hjá kúm og gyltum. Appl. Anim. Hegðu þig. Sci. 2011, 135, 241–251. [Krossvísun]

25. Erb, HN Fyrri líkur (forprófið besta giska) hefur áhrif á forspárgildi greiningarprófa. Dýralæknir. Clin. Pathol. 2011, 40, 154–158. [CrossRef] [PubMed]

26. Tenny, S.; Hoffman, MR Algengi. Í StatPearls; StatPearls Publishing: Treasure Island, FL, Bandaríkjunum, 2022. 27. Langel, SN; Paim, FC; Alhamo, MA; Buckley, A.; Van Geelen, A.; Lager, KM; Vlasova, AN; Saif, LJ Meðgöngustig við svínafaraldur Niðurgangur Veirusýking þungaðra svína hefur áhrif á ónæmi móður og mjólkurvaldandi ónæmisvernd nýbura á brjósti. Framan. Immunol. 2019, 10, 727. [CrossRef] [PubMed]